CN112501310B

CN112501310B - 一种牛源性成分的lamp检测引物组、试剂盒和方法

Info

Publication number: CN112501310B
Application number: CN202011435657.2A
Authority: CN
Inventors: 杨立桃; 瞿展; 李�荣; 徐文婷; 张大兵
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2020-12-10
Filing date: 2020-12-10
Publication date: 2022-08-12
Anticipated expiration: 2040-12-10
Also published as: CN112501310A

Abstract

本发明公开了一种牛源性成分的LAMP检测引物组及检测方法。该方法包括以下步骤：1)设计合成引物；所述引物由上游内部引物FIP、下游内部引物BIP、上游外部引物F3和下游外部引物B3组成，所述引物的碱基序列如SEQ ID No：1～4；2)制备牛属北美野牛、奶牛、牦牛、水牛的DNA稀释液；3)配制LAMP反应体系并设定反应条件；4)进行LAMP方法特异性检测；5)进行LAMP方法灵敏度检测；6)通过电泳是否有梯形条带来确定待检样品是否属于牛源性。本发明建立的方法具有快速、高效、灵敏、准确等优点，在动物源性成分食品监管和检验检疫工作中有实际应用价值，尤其适用于基层实验室和现场检测的推广和应用。

Description

一种牛源性成分的LAMP检测引物组、试剂盒和方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及动物源性成分特异性的检测方法，具体涉及一种牛源性成分的LAMP检测引物组、试剂盒和检测方法。

背景技术

动物源性成分的鉴定方法主要包括蛋白质鉴定(放射免疫法、色谱法等)和分子生物学鉴定(PCR方法等)两大类。应用蛋白质鉴定方法时，当肉类经过切碎、蒸煮、熏烤等加工过程后，肉中蛋白质结构通常被破坏，物种特有的蛋白质或抗原决定部位也遭到破坏。所以，通过蛋白质鉴定方法鉴别肉类品种的可靠性较差。相比之下，检测DNA 的鉴定方法更可靠，因为DNA在所有组织细胞中都一样，不用考虑DNA是从肌肉、脂肪还是其他组织中提取的。由于分子生物学鉴定中的PCR法反应时间短，具有较高的灵敏度、特异性和可操作性，目前已成为肉制品种属鉴别最常用的方法，但普通PCR 法扩增后需要凝胶电泳进行结果分析，所用染液EB为强致癌物质，因此存在一定的操作安全隐患，并且还存在非特异性扩增导致的假阳性问题。常规的动物源性成分的检测主要采用普通PCR方法和TaqMan实时荧光定量PCR方法。普通PCR方法由于操作繁琐、耗时长、易污染环境等缺点已逐渐被TaqMan实时荧光定量PCR取代。TaqMan实时荧光定量PCR灵敏度高、特异性好，但需昂贵的荧光PCR仪和配套的试剂，不能普遍适用于检验检疫一线的基层实验室和现场检测。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是由日本学者Notomi研发的基因诊断技术，该方法针对目的基因的6个区段设计引物，提高了检测的特异性，同时该方法的扩增效率较普通PCR高，很大程度地提高了灵敏度。因此可以应用该技术尝试实现多靶标的动物源性成分的现场快速检测，而不需要依赖额外复杂的实验设备及其他条件，有很大的实际应用前景。

LAMP技术以其特异性强、灵敏度高、快速、准确和操作简便等优点，现已应用于致病微生物、病毒、寄生虫的鉴定，转基因和动物源成分检测等多方面。目前对于这一技术的运用有对于微生物病原体的检验上，如大肠杆菌、沙门氏菌、分支杆菌、口蹄疫病毒等。Denschlag等人用该技术检测了致突镰刀菌的Hyd5，Qingchao Li等验证了应用LAMP技术转基因水稻中的cry1Ab基因优于qPCR方法，刘少宁等建立了一种能够快速区分出绵羊肉中掺入狐狸源性成分的环介导等温扩增方法，徐淑菲等根据羊cytB 基因设计特异性引物，动物GenieⅡ等温扩增荧光检测系统，建立了检测羊源性成分的 LAMP方法。目前关于动物源性成分LAMP检测技术的应用多数是针对单靶标检测的，且大部分方法是基于线粒体DNA靶序列的，而同一细胞中线粒体的拷贝数不定，该技术的高灵敏度可能会导致无论反应工作与否都得到阳性结果，因此有必要建立基于牛属共有基因组DNA序列的LAMP检测方法。

但是，目前依然尚无基于牛核基因组DNA序列的LAMP方法，用于检测牛源性成分的报道或者专利。因此有必要建立针对牛核基因组DNA序列的牛源性成分的LAMP 检测技术。

通过对专利文献的检索发现，中国发明专利申请CN201610652748公开了一种用于检测牛源性成分的LAMP引物及其设计方法；包括以下步骤：步骤1，登陆NCBI网站，查找猪、羊、牛等动物的线粒体基因序列；步骤2，用DNAman软件对各种动物的线粒体基因序列进行比对，找出牛特异性序列；步骤3，设计引物，引物的设计原则包括Tm 值、引物末端的安定性、GC含量、引物之间的距离、二级结构；步骤4，建立LAMP检测方法，优化引物工作浓度、内外引物浓度比和反应温度。具有操作简便、快速，特异性强，灵敏度高等优点,只需不到10分钟，就可检测出牛源性成分。然而，其针对的是牛线粒体DNA序列设计，由于线粒体DNA拷贝数不恒定其数量高，容易引起检测结果的假阳性。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术存在的不足，提供一种牛源性成分的LAMP检测引物组、试剂盒和检测方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种牛源性成分的LAMP检测引物组，包括一对外引物、一对内引物。其核苷酸序列分别如下所示：

正向外引物F3：5’-ACGAATCATGCTGCTCAACT-3’(SEQ ID NO:1)；

反向外引物B3：5’-ATCAGCCACGTGATCAGTG-3’(SEQ ID NO:2)；

正向内引物FIP:

5’-TGTCGGCTCATCTGCTTGACAATAATCAAGCACGTGACCAGG-3’(SEQ ID NO:3)；

反向内引物BIP：

5’-TGTCATGCAGATGAGCCGGCAGAGTCACGTGATCAGGGC-3’(SEQ ID NO:4)。

其中，所述正向内引物FIP包含F1c和F2：

F1c：5’TGTCGGCTCATCTGCTTGACAA3’

F2：5’TAATCAAGCACGTGACCAGG3’。

其中所述反向内引物BIP包含B1c和B2：

B1c：5’TGTCATGCAGATGAGCCGGC3’

B2：5’AGAGTCACGTGATCAGGGC3’。

本发明还涉及一种牛源性成分LAMP检测试剂盒，所述检测试剂盒包括上述的检测引物组。

优选的，所述检测试剂盒还包含DNA聚合酶、LAMP反应液、阳性对照和阴性对照。

优选的，检测引物组中外引物、内引物的摩尔比为1:8。

优选的，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。

优选的，所述LAMP反应液含有25mM MgSO₄、2mM dNTPs、5M甜菜碱(Betaine)、 10×Thermol Mg²⁺free Buffer缓冲液。

优选的，阳性对照为2％琼脂糖凝胶电泳出梯状条带的DNA，阴性对照为DEPC水。

本发明还涉及一种牛源性成分的LAMP检测方法，采用上述的检测引物组进行检测，包括如下步骤：

S1、提取待检样品DNA；

S2、环介导等温扩增反应：配制25μL反应体系，含有0.1μM F3，0.1μM B3，0.8μMFIP，0.8μM FIP，4mM MgSO₄，0.4mM dNTPs，0.7M甜菜碱，1×Thermol Mg²⁺free Buffer 缓冲液，0.32U Bst聚合酶，待检DNA 1～100ng，用DEPC水补齐到25μL；然后63～65℃ 扩增反应45～60min；

S3、结果分析：通过琼脂糖凝胶电泳分析是否出现梯状条带判定结果；如电泳出现梯状条带即为阳性，否则，为阴性；

与现有技术相比，本发明具有高特异性、高灵敏度、快速高效、操作简便等有益效果，具体如下；

1)高特异性：

本发明根据牛属共有基因组DNA序列设计了4条特异性引物，应用上述4条引物，扩增靶序列的6个区域，6个区域中任何区域与引物不匹配的均不能进行核酸扩增，因此其特异性极高，且很稳定，不容易形成引物二聚体，保证反应顺利进行；

2)高灵敏度：最低检测极限可达到0.2ng/μL；

3)快速高效：整个扩增只需要45～60min即可；

4)操作简便：不需要复杂的仪器，只需要恒温水浴锅即可反应；

5)结果分析：通过琼脂糖凝胶电泳分析是否出现梯形条带对检测结果进行判读。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1是牛源性成分LAMP特异性检测的跑胶结果图；图中，泳道M，DL2000 DNAmarker；泳道1，北美野牛；泳道2，奶牛；泳道3，牦牛；泳道4，水牛；泳道5，猪；泳道6，绵羊；泳道7，山羊；泳道8，驴；泳道9，马；泳道10，骡子；泳道 11，猫；泳道12，鼠；泳道13，鸡；泳道14，鸭；泳道15，鹅；泳道16，水稻；泳道17，拟南芥；泳道18，玉米；泳道19，大豆；泳道20，小麦；泳道21，大麦；泳道22，棉籽；泳道23，空白对照；

图2是牛源性成分LAMP的灵敏度跑胶结果；图中，泳道M，DL2000 DNA marker；泳道1，20ng/μL；泳道2，10ng/μL；泳道3，2ng/μL；泳道4，0.2ng/μL；泳道5，0.02ng/μL；泳道6，0.002ng/μL；泳道7，空白对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

下列实施例中未注明具体条件或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用仪器或者试剂未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：LAMP检测方法的建立

牛源性成分LAMP(Loop-mediated isothermal amplification,环介导等温扩增)检测方法，包括LAMP反应引物组、LAMP反应液、Bst DNA聚合酶、阳性对照和阴性对照。

(1)LAMP引物设计：基于牛基因组DNA共有序列设计为靶序列(SEQ ID NO.5)，利用软件设计LAMP引物。本实施例引物及荧光探针的浓度都为10μM/L。引物序列见表1。

表1牛源性特异性的LAMP引物序列表

(2)LAMP反应液：25mM MgSO₄、2mM dNTPs、5M甜菜碱(Betaine)、10×Thermol Mg²⁺free Buffer缓冲液。

(3)Bst DNA聚合酶

(4)阳性对照为：北美野牛、奶牛、牦牛、水牛的DNA样品；

(5)阴性对照为18种不同的动物和植物，即猪、绵羊、山羊、驴、马、骡子、猫、鼠、鸡、鸭、鹅、水稻、拟南芥、玉米、大豆、小麦、大麦和棉籽的DNA和DEPC水。

(6)结果判断：通过琼脂糖凝胶电泳分析是否出现梯状条带判定结果；如电泳出现梯状条带即为阳性，否则，为阴性；

实施例2：牛源性成分LAMP特异性检测

用上述建立的LAMP检测方法对牛源性成分进行检测：

(1)待检样品DNA的提取：采用天根血液组织细胞基因组提取试剂盒(DP304-03)提取待检样品的DNA；提取制备4种牛属品种北美野牛、奶牛、牦牛、水牛和18种不同的动物和植物，即猪、绵羊、山羊、驴、马、骡子、猫、鼠、鸡、鸭、鹅、水稻、拟南芥、玉米、大豆、小麦、大麦和棉籽的DNA。采用常规的DNA提取手段，并将其稀释至20ng/μL。

(2)环介导等温扩增反应：25μL反应体系，含有0.1μM F3，0.1μM B3，0.8μM FIP，0.8μM FIP，4mM MgSO₄，0.4mM dNTPs，0.7M甜菜碱，1×Thermol Mg²⁺free Buffer缓冲液，0.32U Bst聚合酶，待检DNA 1～100ng，用DEPC水补齐到25μL；然后63～65℃ 扩增反应45～60min。

(3)结果分析：将扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，200V，25min。2％琼脂糖凝胶电泳出梯状条带的为牛属不同品种的样品，无条带的为其他样品或空白对照。从图 1可知，只有牛属的泳道出现梯状条带，其他物种以及空白对照均无条带，而三个协同实验的验证结果均与本实验一致，说明建立的LAMP方法具有良好的特异性，可用于牛属不同种特异性检测。

实施例3：牛源性成分LAMP灵敏度检测

(1)引物合成、牛的DNA 提取见实例1和2。

(2)制备牦牛DNA模板稀释梯度：将模板用DEPC水依次稀释成6个浓度梯度 (20ng/μL、10ng/μL、2ng/μL、0.2ng/μL、0.02ng/μL、0.002ng/μL)。

(3)将上述6个浓度梯度进行LAMP扩增，并用DEPC水设置阴性对照。配置LAMP 反应条件见实施例2。

(4)观察实验结果：将扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，200V，25min。2％琼脂糖凝胶电泳出梯状条带对应的最低拷贝数就是该方法的检测限。图2显示，除了 0.02ng/μL泳道，0.002ng/μL泳道和空白对照没有条带外，其他泳道均出现梯状条带。说明本实验建立的LAMP方法的灵敏度高，达到了0.2ng/μL。

与现有技术相比，本申请的引物设计特殊之处在于牛核基因组上单拷贝基因序列的选择，根据特异的序列设计的引物保证了本发明中的检测结果的准确性和精确性。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 一种牛源性成分的LAMP检测引物组、试剂盒和方法

<130> DD11299

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acgaatcatg ctgctcaact 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atcagccacg tgatcagtg 19

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgtcggctca tctgcttgac aataatcaag cacgtgacca gg 42

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgtcatgcag atgagccggc agagtcacgt gatcagggc 39

<210> 5

<211> 297

<212> DNA

<213> 牛(Bovine)

<400> 5

ggacctcagg aggcaatact caaagagctg agcagacacg aaccacgcaa tcagcaggca 60

ataagcatgg agctcagcag tgacgaatca tgctgctcaa ctggcaataa tcaagcacgt 120

gaccaggcag gaatcacgca gctcagctgg caattgtcaa gcagatgagc cgacaggaat 180

cacgcagctc agatggcaat tgtcatgcag atgagccggc aggaatcacg cagctcagca 240

ggccctgatc acgtgactct gcaggcactg atcacgtggc tgatcaagtc cagatca 297

Claims

1.一种牛源性成分的LAMP检测引物组，其特征在于，基于牛基因组DNA共有序列设计为靶序列，利用软件设计所述引物组，所述靶序列如SEQ ID NO.5所示，所述引物组包括一对外引物、一对内引物：

正向外引物F3：5’ACGAATCATGCTGCTCAACT3’；

反向外引物B3：5’ATCAGCCACGTGATCAGTG3’；

正向内引物FIP:

5’TGTCGGCTCATCTGCTTGACAA-TAATCAAGCACGTGACCAGG3’；

反向内引物BIP：

5’TGTCATGCAGATGAGCCGGC-AGAGTCACGTGATCAGGGC3’。

2.一种牛源性成分的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括权利要求1所述的检测引物组。

3.根据权利要求2所述的牛源性成分的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包含DNA聚合酶、LAMP反应液、阳性对照和阴性对照。

4.根据权利要求2所述的牛源性成分的LAMP检测试剂盒，其特征在于，检测引物组中外引物、内引物的摩尔比为1:8。

5.根据权利要求3所述的牛源性成分的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。

6.根据权利要求3所述的牛源性成分的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应液含有25mM MgSO₄、2mM dNTPs、5M甜菜碱（Betaine）、10×Thermol Mg²⁺ free Buffer 缓冲液。

7.根据权利要求3所述的牛源性成分的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为2％琼脂糖凝胶电泳出梯状条带的DNA，阴性对照为DEPC水。

8.一种牛源性成分的LAMP检测方法，其特征在于，采用权利要求1所述的检测引物组进行检测，所述方法包括如下步骤：

S1、提取待检样品DNA；

S2、环介导等温扩增反应：配制25μL反应体系，含有0.1μM F3，0.1μM B3， 0.8μM FIP，0.8μMBIP，4 mM MgSO₄，0.4 mM dNTPs，0.7M甜菜碱，1×Thermol Mg²⁺ free Buffer 缓冲液，0.32U Bst聚合酶，待检DNA 1~100ng，用DEPC水补齐到25μL；然后63~65℃扩增反应45~60min；

S3、通过琼脂糖凝胶电泳分析是否出现梯状条带判定结果；如电泳出现梯状条带即为阳性，否则，为阴性。