CN103421890A - 牛源性肉制品分子鉴定试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于肉制品分子检测技术领域，具体涉及一种牛肉源性肉制品的分子鉴定方法、试剂盒及应用。本发明步骤如下：(1)引物设计：根据普通牛TNFRSF10A基因序列设计特异引物，该引物的序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。(2)建立PCR扩增反应方法，即以引物对普通牛基因组DNA进行扩增，得特异扩增片段。(3)对PCR扩增产物进行分析：采用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分析，根据凝胶成像观察是否出现目的片段，判定是否含有普通牛基因组DNA成分。本发明特点是：简便，快速，特异性强，且成本较低，适合基层单位应用。
Description
技术领域
本发明涉及动物分子生物学领域，具体涉及一种牛肉源性肉制品的分子鉴定方法，专用试剂盒及应用。本发明的分子鉴定方法和试剂盒与PCR反应有关。
背景技术
随着肉制品的普及度和覆盖度不断增加，为追求利益，市场上常常充斥着“挂羊头卖狗肉”的现象，肉制品来源的安全性成为消费者关心的焦点问题之一，因此对肉制品的来源进行鉴定并建立便捷的检测方法是解决这一问题的关键。目前国外已发表有关于饲料中动物源性的检测方法，其采用线粒体上的tRNALys及ATP酶ATPase subunits8and6亚基8和亚基6序列作为检测使用的目标序列。然而该目标序列从序列水平特异性并不优异，针对普通牛设计的引物检测结果中牛和羊的均有扩增产物，且在其他物种中有非特异性条带扩出。如何有效地判别出肉制品是否属于牛肉，并建立一种简单易行的检测方法具有紧迫性。
为了寻找为牛所特异的检测序列，我们从种内一致性和稳定性、种间特异性、拷贝数等方面进行牛基因组特异序列基因的筛选，经过非牛物种(水牛、山羊、绵羊、猪、人、鼠等)及不同的牛品种中的检测筛选在牛中特异的，在其他物种中不存在的基因片段作为检测分子。通过核酸数据库(EMBL、GenBank及Ensembl)查找普通牛的基因组序列，并通过BLAST分析及PCR扩增验证，确定牛特异基因。具体步骤为：a.基于Ensembl基因组数据库的BLAST筛选工作：首先采用BLASTP与多物种蛋白序列库(无亢余蛋白库，nr)进行比对筛选具有特异蛋白的基因；b.以筛选后基因的编码序列对非牛基因组序列进行BLASTN比对搜寻核酸特异序列；c.BLASTN牛基因组确定候选基因拷贝数情况；d.比对dbSNP数据库排除突变较多的基因。通过以上四步得到序列特异，拷贝数确定且序列保守的候选基因，并最终选定以牛肿瘤凋亡因子超家族受体成员10A，TNFRSF10A(tumor necrosis factor receptor superfamily 10a)作为检测使用的特异分子。
在不同物种间，TNFRSF10A基因的序列同源性低，通过BLAST比对发现，牛TNFRSF10A第八外显子区段具有序列特异性(BLASTN/BLASTP比对已知数据库)。同时由于该序列为编码蛋白序列，其突变率低，物种内保守性高。通过序列比对确定该基因的拷贝数恒定，符合牛特异基因的选择要求。通过进一步的PCR验证最终选定以牛TNFRSF10A基因作为检测使用的基因。
发明内容
本发明的目的在于建立一种有效、精准、可靠的牛源性肉制品分子鉴定方法，该方法与PCR反应有关。本发明还包括利用本发明的方法和试剂组合物组装的适用于检测牛源性肉制品的鉴定试剂盒及试剂盒的应用，本发明制备的试剂盒能快速鉴定肉制品是否含有普通牛源性成分，为市场监管提供一种快速方便的试剂盒。本发明的方法和试剂盒可以在肉品检测中作为标准检测方法使用。
本发明通过以下技术方案实现：
一种牛肉源性肉制品的分子鉴定方法，包含PCR反应，具体步骤如下所述：
1)采集牛源肉品试样，于-20℃下保存备用；
2)利用苯酚-氯仿粗提法提取步骤1)所述牛源肉品的基因组DNA；
3)设计的特异引物PCR扩增牛TNFRSF10A基因片段，其引物序列如序列表SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：3所示；
4)扩增得到牛TNFRSF10A基因的核苷酸序列，该序列如序列表SEQ ID NO：1所示；
5)利用反应试剂和反应程序进行PCR反应，对PCR反应产物进行电泳检测；
6)在上述PCR反应的同时，设置阴性对照、阳性对照；
7)对PCR扩增产物进行检测和结果判定，若普通牛TNFRSF10A基因特异性序列得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，判定为样品中检测出普通牛源性成分，若普通牛TNFRSF10A基因特异性序列未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，判定为样品中未检测出牛TNFRSF10A基因即牛源性成分；
其中：
步骤5)所述的PCR反应的试剂如下：
反应总体积：20.0μL；
双蒸水：11.4μL；
10×PCR缓冲液：2.0μL，室温，pH为8.3-9.0；延伸温度72℃；
25mmol/L的氯化镁溶液：2.0μL，终浓度为2.5mmol/L；
各2.5mmol/L的dNTPs混合溶液：1.6μL；
10μmol/L的SEQ ID NO：2所示的引物0.4μL，终浓度为0.2μmol/L；
10μmol/L的SEQ ID NO：3所示的引物0.4μL，终浓度为0.2μmol/L；
5U/μL的Taq DNA聚合酶：0.2μL，终浓度为0.05U/μL；
20ng/μL的受检样品DNA模板：2.0μL，终浓度为2.0ng/μL；
步骤5)所述的PCR反应程序如下：
94℃预变性5min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸10s，30次循环；72℃延伸3min；
步骤6)所述的阴性对照为非牛属动物水牛、绵羊或山羊和非牛科哺乳动物人、猪、小鼠的 基因组DNA；
步骤6)所述的阳性对照为牛科牛属普通牛、奶牛、肉牛、黄牛的基因组DNA。
申请人研制了一种适用于牛肉源性肉制品的检测的PCR试剂盒，包含下列试剂组合物：dNTP；
25mmol/L的MgCl2溶液；
10×PCR缓冲液；
各2.5mmol/L的Tag聚合酶；
阳性DNA模板；
阴性DNA模板；
SEQ ID NO：2所述的引物；
SEQ ID NO：3所述的引物，和
双蒸水；
上述阳性DNA模板为牛科牛属普通牛、奶牛、肉牛、黄牛的基因组DNA；
阴性DNA模板为非牛属动物水牛、绵羊或山羊，非牛科哺乳动物人、猪、小鼠的基因组DNA；
包含下列PCR反应程序的说明书：
94℃预变性5min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸10s，30次循环；72℃延伸3min；
显然，本发明的试剂盒中还包含上述分子鉴定牛源制品的分子鉴定方法和程序编制的使用操作说明书，可以看作是本试剂盒的一个重要部分。
本发明通过使用设计的特异引物对牛TNFRSF10A特异性第八外显子序列片段的扩增结果判别肉制品来源是否为普通牛(Bos taurus)，为牛肉制品来源判别的分子诊断环节提供技术支撑。
本发明中检测结果可用琼脂糖凝胶电泳呈现；利用肉制品提取DNA的方法可用苯酚-氯仿法提取法，也可使用公认的、具有相同效力的其他提取方法。
本发明特点是：简便，快速，特异性强，且成本较低，适合基层单位应用。
更详细的技术方案见《具体实施方式》所述。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1是扩增得到的牛TNFRSF10A基因片段的核苷酸序列，序列长度为190bp。
序列表SEQ ID NO：2是扩增牛TNFRSF10A基因片段的正向引物的DNA序列。
序列表SEQ ID NO：3是扩增牛TNFRSF10A基因片段的反向引物的DNA序列。
图1：是本发明的技术流程图。
图2：是TNFRSF10A基因特异序列在普通牛不同品种中的保守性检测结果。以普通牛中的 中国荷斯坦奶牛、西门达尔牛(乳肉兼用)和中国5个黄牛品种(秦川牛、渤海黑牛、大别山牛、复州牛、鲁西黄牛)的DNA为模板，扩增TNFRSF10A的特异片段，所有测试样品即所有普通牛中的不同品种都得到特异性扩增，且一致性良好。表明所扩增片段在普通牛不同品种中具有保守性。泳道中编号说明如下：M：为100bp marker；1-3：空白对照；4-6：中国荷斯坦奶牛；7-9：西门塔尔牛；10-12：秦川牛；13-15：鲁西黄牛；16-18：复州牛；19-21：大别山牛；22-24：渤海黑牛。
图3：是TAFRSF10A基因特异序列在普通牛中具有物种特异性的检测结果。以普通牛(中国荷斯坦牛)、牛科非牛属动物(水牛、绵羊、山羊)、非牛科哺乳动物(人、猪、小鼠)的DNA为模板，扩增TNFRSF10A的特异片段，所有测试样品中仅在普通牛中得到扩增产物，非普通牛均无扩增产物。结果表明所扩增片段在普通牛中具有特异性。泳道中编号说明如下：M：为100bp marker；1-3：空白对照；4-6：普通牛；7-9：猪；10-12：山羊；13-15：绵羊；16-18：水牛；19-21：小鼠；22-24：人。
具体实施方式
实施例1
1.试样的制备与保存
1.1取样
采集普通牛肉制品试样1g，于-20℃下保存备用。
1.2DNA模板制备
DNA模板制备采用常用的苯酚-氯仿粗提法(参见：萨姆布鲁克J，弗里奇E F，曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南[M].第2版.金冬雁，黎孟枫译.北京：科学出版社，1999.465-467)或者公认的、具有相同效力的其他提取DNA方法，这些方法都是报道的常用方法。
2.引物设计
本实施例的引物DNA序列如表1和序列表SEQ ID NO：2和3所示。
表1本发明设计的PCR扩增引物
| 引物名称 | 引物序列 |
| TNFR-F | 5′-CAGTGAGGACATCAGCCTAGAGT-3′ |
| TNFR-R | 5′-CTGCTCCTAGCCATCAGTGGA-3′ |
预期扩增片段大小为190bp，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
3.PCR检测
3.1试样PCR反应
3.1.1在PCR反应管中依次加入反应试剂(见表2所示)，混匀，再加25μL石蜡油(有热盖设备的PCR仪可不加)。
3.1.2将PCR管放在离心机上，500g～3000g离心10s，然后取出PCR管，放入PCR仪中。
3.1.3进行PCR反应。程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸10s，共进行30次循环；72℃延伸3min。
3.1.4反应结束后取出PCR管，对PCR反应产物进行电泳检测。
3.2对照PCR反应
3.2.1在试样PCR反应的同时，设置阴性对照、阳性对照。各对照PCR反应体系中，除模板外其余组分及PCR反应条件与4.1相同，且阴性、阳性对照DNA模板浓度也应达到试样DNA模板浓度要求。
3.2.2以非牛属动物(水牛、绵羊、山羊)及非牛科哺乳动物(人、猪、小鼠)基因组DNA作为PCR反应体系的阴性对照模板。
3.2.3牛科牛属普通牛(奶牛、肉牛、黄牛)基因组DNA作为PCR反应体系的阳性对照模板。
4.PCR扩增产物的检测及结果判定
按20g/L的质量浓度称量琼脂糖，加入1×TAE缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液。每100mL琼脂糖溶液中加入5μLEB溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入1×TAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取12μLPCR产物与3μL加样缓冲液(称取250.0mg溴酚蓝，加入10mL水，在室温下溶解12h；称取250.0mg二甲基苯腈蓝，加10mL水溶解；称取50.0g蔗糖，加30mL水溶解。混合以上三种溶液，加水定容至100mL，在4℃下保存)混合后加入凝胶点样孔，同时在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准，接通电源在2V/cm～5V/cm条件下电泳15min后检测。
电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标准判断扩增条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。
5结果分析与表述
5.1对照检测结果分析
阳性对照的PCR反应中，牛TNFRSF10A特异性序列得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而阴性对照及空白对照中除引物二聚体外没有任何扩增片段，表明PCR反应体系工作正常。
5.2样品检测结果分析和表述
5.2.1若普通牛TNFRSF10A基因特异性序列得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，表明样品中检测出普通牛源性成分，表述为“样品中检测出普通牛源性成分”。
5.2.2若普通牛TNFRSF10A基因特异性序列未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，表明样品中未检测出牛TNFRSF10A基因，表述为“样品中未检测出普通牛源性成分”。
实施例2试剂盒的组装
1、该试剂盒中的试剂组合物如表2所述：
表2PCR反应体系(即反应试剂)
2、含有标准的如上所述PCR方法的操作说明书1份。
3、试剂盒组成、储存和稳定性测试见表3。
表3本发明的试剂盒组成、储存条件和稳定性测试
经试验，本发明组装的试剂盒在常温下储存12个月不会影响其使用效果。
本发明的试剂盒的应用方法如下所述：
1、依据以下的PCR反应体系加样，于200μL的EP管(见表4)：
表4PCR反应体系加样成分和用量
2、依据上面PCR扩增条件上样；
3、反应结束后取5μLPCR扩增产物，用3.0％的琼脂糖凝胶电泳(电泳技术参数：电压3V/cm-5V/cm，电泳时间20min-30min)，用常规溴化乙淀染色，用上述两个扩增产物分开点样，凝胶成像系统检测结果(均为常规方法)。
每个反应需设置阴性对照和阳性对照，反应体系及试剂与受测样品与上面的实施例相同。
Claims (4)
1.一种牛肉源性肉制品的分子鉴定方法，包括PCR反应，其特征在于下列步骤：
1)采集牛源肉品试样，于-20℃下保存备用；
2)利用苯酚-氯仿粗提法提取步骤1)所述牛源肉品的基因组DNA；
3)设计的特异引物PCR扩增牛TNFRSF10A基因片段，其引物序列如序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；
4)扩增得到牛TNFRSF10A基因的核苷酸序列，该序列如序列表SEQ ID NO：1所示；
5)利用反应试剂和反应程序进行PCR反应，对PCR反应产物进行电泳检测；
6)在上述PCR反应的同时，设置阴性对照、阳性对照；
7)对PCR扩增产物进行检测和结果判定，若普通牛TNFRSF10A基因特异性序列得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，判定为样品中检测出普通牛源性成分，若普通牛TNFRSF10A基因特异性序列未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，判定为样品中未检测出牛TNFRSF10A基因即牛源性成分；
其中：
步骤5)所述的PCR反应的试剂如下：
反应总体积：20.0μL；
双蒸水：11.4μL；
10×PCR缓冲液：2.0μL，室温，pH8.3-9.0；延伸温度72℃；
25mmol/L的氯化镁溶液：2.0μL，终浓度为2.5mmol/L；
各2.5mmol/L的dNTPs混合溶液：1.6μL；
10μmol/L的SEQ ID NO：2所示的引物0.4μL，终浓度为0.2μmol/L；
10μmol/L的SEQ ID NO：3所示的引物0.4μL，终浓度为0.2μmol/L；
5U/μL的Taq DNA聚合酶：0.2μL，终浓度为0.05U/μL；
20ng/μL的受检样品DNA模板：2.0μL，终浓度为2.0ng/μL；
步骤5)的PCR反应程序如下：
94℃预变性5min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸10s，30次循环；
72℃延伸3min；
步骤6)所述的阴性对照为非牛属动物水牛、绵羊或山羊，非牛科哺乳动物人、猪、小鼠的基因组DNA；
步骤6)所述的阳性对照为牛科牛属普通牛、奶牛、肉牛、黄牛的基因组DNA。
2.适用于权利要求1所述方法的牛肉源性肉制品的PCR鉴定试剂盒，其特征包含下列试剂组合物：
dNTP；
25mmol/L的MgCl2溶液；
10×PCR缓冲液；
各2.5mmol/L的Tag聚合酶；
阳性DNA模板；
阴性DNA模板；
SEQ ID NO：2所述的引物；
SEQ ID NO：3所述的引物，和
双蒸水；
上述阳性DNA模板为牛科牛属普通牛、奶牛、肉牛、黄牛的基因组DNA；
阴性DNA模板为非牛属动物水牛、绵羊或山羊，非牛科哺乳动物人、猪、小鼠的基因组DNA；
PCR反应程序如下：
94℃预变性5min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸10s，30次循环；
72℃延伸3min。
3.如权利要求2所述的牛肉源性肉制品的PCR鉴定试剂盒，其特征还包含权利要求1所述方法的操作说明书。
4.权利要求2或3所述的试剂盒在检测肉源性制品中的应用。
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