CN105256013A - 一种同步检测猪羊牛动物源性成分的微滴pcr引物体系及检测方法 - Google Patents

Abstract

一种同步检测猪羊牛动物源性成分的微滴PCR引物体系及检测方法，包括如下步骤：以样品总DNA为模板，利用所述引物对I、引物对II和引物对III组成的微滴PCR引物体系进行微滴PCR扩增实验，反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果。其中，所述样品总DNA模板为猪、羊、牛物种肉产品中的一种以上。本发明公开了一种快速、准确、灵敏的微滴PCR同步检测3种动物源性成分的方法，能有效缩短实验时间，大大提高效率，且节省成本，从而有效鉴定猪羊牛制品的真伪及掺假情况。此外，本发明设计的微滴PCR引物体系配合相关试剂制成试剂盒，方便使用，同时为工业化生产及应用提供了可能。

Description

一种同步检测猪羊牛动物源性成分的微滴PCR引物体系及检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种同步检测猪羊牛动物源性成分的微滴PCR引物体系及检测方法。

背景技术

我国是世界动物源性食品生产和消费大国。2013年国民经济和社会发展统计公报显示，全年猪牛羊禽肉产量8373万吨，比上年增长1.8％，其中猪肉产量5493万吨。我国作为猪肉生产消费大国，猪肉产品却难以进入国际市场。为确保食品成分的真实性，质检“十二五”规划纲要明确指出，需重点加强开展食品掺假鉴别技术研究。其中猪肉的掺假不仅侵害消费者利益，还可能因某些宗教食品中含有非清真成分引起纠纷，不利于维护社会安定。如果问题产品出口到国外更会损害我国食品企业的整体形象。

目前，为了确定肉及肉制品的真实性，已经研发出了包括基于核酸的分子生物学技术，如PCR、实时定量PCR和分子指纹技术，基于蛋白质分子结构的免疫分析技术，红外光谱技术以及质谱技术等动物源性成分鉴别方法。基于动物种属间遗传信息的差异从核酸分子水平上动物进行肉种鉴定以及对动物源性食品进行检验研究，是目前动物源性成分研究的最有效手段。作为鉴别的检测靶点而被广泛使用。目前，以检测DNA为基础的方法主要有：核酸探针杂交、PCR-RFLP分析、DNA指纹分析、PCR特异扩增。其中，PCR特异扩增法最为简便、准确、灵敏，在实际检测中应用最为广泛，其它分析法由于操作难度大，在实际检测中较少应用。

针对动物源性食品中存在的问题，我国近些年也加强了肉类安全性的认识，制定了《传染病防治法》、《动物防疫法》、《食品卫生法》、《进出口商品检验法》等相关的法律法规。2007年以来，国家标准化管理委员会颁布了关于动物源饲料中动物成分(牛、绵羊、山羊、猪、兔、鹿、马、驴、狗、骆驼)定性检测国家标准。这些检测标准目前主要集中在利用传统的常规PCR技术，而且只能对动物源性肉及肉制品进行单一种的定性检测。在肉类食品样本实际检测过程中，对于成分不明确或混合的加工制品，需要通过多次检测试验才能确定，其周期长、工作量大、成本高。在未来的动物源性肉及肉制品的检测中，这类检测技术已经越来越不能胜任一次处理几种甚至十几种动物源制品的特殊需要，尤其是大数量的加工产品进入商品化生产时，需要更有效的、快速的检测方法。

在肉类食品样本实际检测过程中，对于成分不明确或混合加工制品，需要通过多次检测或多重检测试验才能确定。多重PCR技术能够实现同时扩增多个目标基因，微滴PCR就是PCR技术和乳化技术相结合的最先进的PCR技术，是将PCR反应体系分隔成10⁹个独立的微滴，每个微滴含有一个或两个模板和引物，同时平行地进行扩增，消除了多重PCR的固有缺陷，提高了目标扩增的通量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同步检测猪羊牛动物源性成分的微滴PCR引物体系及检测方法，快速且高特异性检测猪羊牛肉制品的真伪及其是否有掺假，大大提高效率，节约时间，而且节省检测成本，特别适用于猪羊牛制品的快速防伪鉴定。

为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种同步检测猪羊牛动物源性成分的微滴PCR引物体系，包括如下猪特异性引物对I、羊特异性引物对II、牛特异性引物对III：

(1)对猪12SrRNA基因进行扩增生成猪特异性扩增片段的猪特异性引物对I：

正向引物：5’-CTACATAAGATATCCACCACA-3’；

反向引物：5’-ACATTGTGGATCTTCTAGGT-3’；

(2)对羊细胞色素c氧化酶亚基III(cytochromecoxidasesubunitIII)基因进行扩增生成羊特异性扩增片段的羊特异性引物对II：

正向引物：5’-TACACTGTACAGGCATCAG-3’；

反向引物：5’-CGTGAAGTAGTAGGAGAGTA-3’；

(3)对牛TNFRSF10A基因进行扩增生成羊特异性扩增片段的牛特异性引物对III：

正向引物：5’-CAGTGAGACTCAGCCTAGAGT-3’；

反向引物：5’-CTGCTCCTAGATCAGTGGA-3’。

本发明所述的一种同步检测猪羊牛动物源性成分的微滴PCR检测方法，其包括如下步骤：

1)以待检样品总DNA为模板，配制含有猪特异性引物对I、羊特异性引物对II和牛特异性引物对III组成的引物体系的PCR水相体系和PCR油乳化剂体系，PCR水相体系和PCR油乳化剂体系混合制备水包油的微滴PCR体系，进行微滴PCR扩增；其中，所述待检样品总DNA模板来自猪、羊、牛物种肉产品中的一种或多种。

2)反应结束后，将微滴PCR产物高速离心，水相油相分离，取下层水相的扩增产物进行电泳，根据琼脂糖凝胶电泳进行判定。

3)结果判定：待检样品扩增出290bp条带的，判定待检样品为猪源性成分阳性；待检样品扩增出370bp条带的，判定待检样品为羊源性成分阳性；待检样品扩增出190bp条带的，判定待检样品为牛源性成分阳性。

进一步，所述PCR水相体系包括：

优选的，所述PCR水相体系包括：

所述PCR油乳化剂体系包括：

优选的，所述PCR油乳化剂体系包括：

所述水包油的微滴PCR体系的制备方法：所述水包油的微滴PCR体系的制备方法：在磁力旋转下，将PCR水相体系以20-35μl/s的速度加入到PCR油乳化剂体系中，混匀，静置，形成均匀的水油乳化剂，其中，PCR油乳化剂体系与PCR水相体系的体积比为1.5-2.5：1。具体制备方法为：室温下，将200-600μlPCR油乳化剂体系添加到西林瓶中，磁力旋转下；取100-300μlPCR水相体系以20-35μl/s加入到PCR油乳化剂体系中，混匀5min，静置2min，形成均匀的水油乳化剂，以50μl/管分装入PCR管，进行微滴PCR扩增。

所述水包油的微滴PCR体系反应程序为：依次进行90-100℃下预变性5-20min，90-100℃变性20-60s，50-60℃退火30-60s，71-73℃延伸60-120s，进行30-50次循环，71-73℃下延伸5-20min，最后在4-20℃下保持＞1min后结束。

优选的，所述水包油的微滴PCR体系反应程序为：依次进行95℃下预变性10min，94℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸90s，进行35次循环，72℃下延伸l0min，最后在4℃下保持1min后结束。

所述微滴PCR产物高速离心、水相油相分离具体步骤为：微滴PCR结束后，将微滴PCR产物离心，使水相油相分离，弃上部油相，取下层水相的扩增产物进行电泳。

更优选的，所述PCR水相体系包括：

更优选的，所述PCR油乳化剂体系包括：

本发明通过分析猪、羊和牛3种动物线粒体DNA中的遗传不保守区域基因(包括12SrRNA，cytochromecoxidasesubunitIII和TNFRSF10A)，进行序列测定及比对后，根据各序列上的特异碱基位点分别设计了各物种的特异性PCR引物对，其仅对相应的物种总DNA模板有扩增信号，对其他物种没有目的扩增信号，本发明各物种的特异性引物对即引物对I、引物对II、引物对III的熔解温度相近，退火温度的梯度设置在引物理论熔解温度值上下5℃的范围内，猪、羊和牛3种动物特异性引物的选择，是多重PCR在同一PCR体系与同一反应程序中高效扩增的关键技术，且扩增特异性片段大小不一且能够通过电泳分开，非常适合猪羊牛的多重PCR检测。

本发明关键是利用制备“油包水”技术，即水包油的微滴PCR体系的制备方法，这就需要不同的PCR水相体系和PCR油乳化剂体系，按照不同的比例制备水包油的微滴PCR体系。而且，水包油的微滴PCR体系不同于多重PCR体系。因此，水包油的微滴PCR体系也要相应的微滴PCR体系反应程序，才能避免了普通多重PCR不同引物和模板间的相互干扰，产生扩增效率的不一致和非特异性产物的出现。

本发明所述微滴PCR检测方法用于单物种总DNA模板进行猪、羊、牛的物种检测，且所述微滴PCR检测方法用于多物种混合总DNA模板进行猪、羊、牛中两种以上的物种检测。所述微滴PCR检测方法尤其适用于检测猪、牛、羊产品的真伪及掺假鉴定。

本发明还提供了一种含有所述微滴PCR引物体系的同步检测猪羊牛动物源性成分的微滴PCR试剂盒。

本发明所述的微滴PCR检测用试剂盒，包括所述猪特异性引物对I、羊特异性引物对II、牛特异性引物对III。将本发明所述微滴PCR引物体系以及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。其中所述相关试剂可以为本发明中所述的特定PCR反应体系中除了总DNA模板以外的其他试剂；也可以为其他适用的除样品总DNA模板外的试剂，如用于PCR反应的一些常规试剂，或由本领域技术人员经有限次实验得到的常规试剂的组合物等。此外本发明试剂盒中还包括有实施本发明所需的基本用具。

本发明所述微滴PCR试剂盒可用于单物种总DNA模板进行猪、羊或牛的物种检测，且所述微滴PCR试剂盒可用于多物种混合总DNA模板进行猪、羊、牛中两种以上的物种检测。所述微滴PCR试剂盒尤其适用于猪、牛、羊产品的真伪及掺假鉴定。

本发明所述检测方法中进行琼脂糖凝胶电泳结束后判定结果时，判定依据为所述引物对I、引物对II和引物对III分别扩增出的DNA片段大小。

本发明的有益效果是：

1.通过本发明优化的特定微滴PCR反应体系及反应程序，采用统一的PCR检测方法，可以一次性检测3个动物物种，简化了检测流程，建立了快速高效且特异性高的检测方法，从而能有效缩短实验时间；由于本方法经一次PCR即可鉴别3种动物源性成分，不需要对每种动物源性成分分别进行确证鉴定，节省了实验时间，加快了检出速度。

2.本发明的微滴PCR引物体系及微滴PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，较普通PCR更为快速、简便，可实现对3种动物源性成分的快速、准确、特异的检测和分析，从而有效的鉴定猪羊牛肉制品的真伪及掺假情况，为猪羊牛肉制品的质量控制提供了现代分子生物学的检测手段。

3.本发明所述微滴PCR引物体系配合相关试剂制成试剂盒，方便使用，同时为工业化生产及应用提供了可能，具有极好的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1中样品模板的最终DNA浓度为500ng/μl时进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；

图2为本发明实施例2中样品模板的最终DNA浓度为50ng/μl时进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；

图3为本发明实施例3中样品模板的最终DNA浓度为5ng/μl时进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；

其中，1和2、猪，3和4、牛，5和6、羊，7和8、猪+牛+羊，9和10、猪+牛，11和12、猪+羊，13和14、羊+牛，N、阴性对照，M代表标准核酸分子量标签(2000为DNA标准分子量，自上向下依次为2kb，1kb，750bp，500bp，250bp和100bp)。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图进一步详细描述本发明的技术方案。

实施例1

以猪、羊、牛3种动物的总DNA样品按照不同组合混合后，使不同组合的猪羊牛每种动物的最终DNA浓度为500ng/μl，作为样品模板。

1)混合总DNA样品的处理：将猪、羊、牛3种动物的总DNA样品按照不同组合混合后，使不同组合的猪、羊、牛每种动物的最终DNA浓度为为500ng/μl，作为样品模板，并将引物稀释至10μmol/L。

总DNA样品的不同组合为：猪，羊，牛，猪+羊，猪+牛，羊+牛，猪+牛+羊。

2)PCR水相体系的配制：在1.5ml离心管中加入如下各反应组分：双蒸水108μl，l0*PCR反应缓冲液20μl，10mg/mL牛血清蛋白(BSA)20μl，2.5mMeach的dNTPs16μl，2.5U/μl的Taq酶8μl，总DNA模板4μl，10μM猪特异性引物对I、羊特异性引物对II、牛特异性引物对III的正向引物各4μl和10μM猪特异性引物对I、羊特异性引物对II、牛特异性引物对III的反向引物(猪羊牛)各4μl，最终特定PCR水相体系为200μl。

3)PCR油乳化剂体系的配制：在1.5ml离心管中加入如下各反应组分：山梨糖醇酐油酸酯18μl、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯2μl、聚乙二醇辛基苯基醚0.2μl、硅油379.8μl，最终特定PCR油乳化剂体系为400μl。

4)水包油的微滴PCR体系制备方法：室温下，将400μlPCR油乳化剂体系到2ml西林瓶中，磁力旋转1000r/min；取200μlPCR水相体系以25μl/s加入到油乳化剂体系中，混匀5min，静置2min，形成均匀的水油乳化剂，以50μl/管分装入PCR管，进行微滴PCR扩增。

5)PCR反应程序的制定：依次进行95℃下预变性10min，94℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸90s，进行35次循环，72℃下延伸l0min，最后在4℃下保持1min后结束。

6)微滴PCR产物高速离心水相油相分离：微滴PCR结束后，将微滴PCR产物在5000rmp离心5min，使水相油相分离，弃上部油相，取下层水相的扩增产物进行电泳。

7)2wt％琼脂糖凝胶电泳：将6)中所得下层水相的扩增产物进行2wt.％琼脂糖凝胶电泳，凝胶中加入溴化乙锭(EB)进行染色，然后再120V下电泳30分钟，当溴酚蓝条带迁移至凝胶边缘时停止电泳，则凝胶成像。样品模板最终DNA浓度为500ng/μl所得凝胶成像结果分别如图1所示。

以各物种特异性引物对分别与500ng/μl混合总DNA模板进行微滴PCR扩增反应，用猪、羊、牛的特异性引物的微滴PCR反应体系和检测方法，分别扩增7种不同组合的基因组，空白对照用1μlH₂O代替DNA模板，每个反应重复2次。由图1可知，各物种特异性引物均能很好的从总DNA混合模板中扩增出其对应物种的特异性大小的条带，很好的验证了复杂总DNA模板条件下各物种特异性引物的有效性和特异性。

实施例2

以猪、羊、牛3种动物的总DNA样品按照不同组合混合后，使不同组合的猪羊牛每种动物的最终DNA浓度为50ng/μl，作为样品模板。

1)混合总DNA样品的处理：将猪、羊、牛3种动物的总DNA样品按照不同组合混合后，使不同组合的猪、羊、牛每种动物的最终DNA浓度为为50ng/μl，作为样品模板，并将引物稀释至10μmol/L。

总DNA样品的不同组合为：猪，羊，牛，猪+羊，猪+牛，羊+牛，猪+牛+羊。

2)PCR水相体系的配制：在1.5ml离心管中加入如下各反应组分：双蒸水116μl，l0*PCR反应缓冲液20μl，10mg/mL牛血清蛋白(BSA)16μl，2.5mMeach的dNTPs12μl，2.5U/μl的Taq酶9μl，总DNA模板3μl，10μM猪特异性引物对I、羊特异性引物对II、牛特异性引物对III的正向引物各4μl和10μM猪特异性引物对I、羊特异性引物对II、牛特异性引物对III的反向引物(猪羊牛)各4μl，最终特定PCR水相体系为200μl。

3)PCR油乳化剂体系的配制：在1.5ml离心管中加入如下各反应组分：山梨糖醇酐油酸酯16μl、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯1.6μl、聚乙二醇辛基苯基醚0.16μl、硅油382.24μl，最终特定PCR油乳化剂体系为400μl。

4)水包油的微滴PCR体系制备方法：室温下，将300μlPCR油乳化剂体系到2ml西林瓶中，磁力旋转1000r/min；取200μlPCR水相体系以35μl/s加入到油乳化剂体系中，混匀5min，静置2min，形成均匀的水油乳化剂，以50μl/管分装入PCR管，进行微滴PCR扩增。

5)PCR反应程序的制定：依次进行95℃下预变性10min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸90s，进行30次循环，72℃下延伸l0min，最后在4℃下保持1min后结束。

6)微滴PCR产物高速离心水相油相分离：微滴PCR结束后，将微滴PCR产物在5000rmp离心5min，使水相油相分离，弃上部油相，取下层水相的扩增产物进行电泳。

7)2wt％琼脂糖凝胶电泳：将6)中所得下层水相的扩增产物进行2wt.％琼脂糖凝胶电泳，凝胶中加入溴化乙锭(EB)进行染色，然后再120V下电泳30分钟，当溴酚蓝条带迁移至凝胶边缘时停止电泳，则凝胶成像。样品模板最终DNA浓度为50ng/μl所得凝胶成像结果分别如图2所示。

以各物种特异性引物对分别与50ng/μl混合总DNA模板进行微滴PCR扩增反应，用猪、羊、牛的特异性引物的微滴PCR反应体系和检测方法，分别扩增7种不同组合的基因组，空白对照用1μlH₂O代替DNA模板，每个反应重复2次。由图2可知，各物种特异性引物均能很好的从总DNA混合模板中扩增出其对应物种的特异性大小的条带，很好的验证了复杂总DNA模板条件下各物种特异性引物的有效性和特异性。

实施例3

以猪、羊、牛3种动物的总DNA样品按照不同组合混合后，使不同组合的猪羊牛每种动物的最终DNA浓度为5ng/μl，作为样品模板。

1)混合总DNA样品的处理：将猪、羊、牛3种动物的总DNA样品按照不同组合混合后，使不同组合的猪、羊、牛每种动物的最终DNA浓度为为5ng/μl，作为样品模板，并将引物稀释至10μmol/L。

总DNA样品的不同组合为：猪，羊，牛，猪+羊，猪+牛，羊+牛，猪+牛+羊。

2)PCR水相体系的配制：在1.5ml离心管中加入如下各反应组分：双蒸水90μl，l0*PCR反应缓冲液20μl，10mg/mL牛血清蛋白(BSA)24μl，2.5mMeach的dNTPs18μl，2.5U/μl的Taq酶7μl，总DNA模板5μl，10μM猪特异性引物对I、羊特异性引物对II、牛特异性引物对III的正向引物各4.5μl和10μM猪特异性引物对I、羊特异性引物对II、牛特异性引物对III的反向引物(猪羊牛)各4.5μl，最终特定PCR水相体系为200μl。

3)PCR油乳化剂体系的配制：在1.5ml离心管中加入如下各反应组分：山梨糖醇酐油酸酯20μl、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯2.4μl、聚乙二醇辛基苯基醚0.24μl、硅油377.36μl，最终特定PCR油乳化剂体系为400μl。

4)水包油的微滴PCR体系制备方法：室温下，将500μlPCR油乳化剂体系到2ml西林瓶中，磁力旋转1000r/min；取200μlPCR水相体系以20μl/s加入到油乳化剂体系中，混匀5min，静置2min，形成均匀的水油乳化剂，以50μl/管分装入PCR管，进行微滴PCR扩增。

5)PCR反应程序的制定：依次进行95℃下预变性10min，94℃变性30s，60℃退火60s，72℃延伸90s，进行50次循环，72℃下延伸l0min，最后在4℃下保持1min后结束。

6)微滴PCR产物高速离心水相油相分离：微滴PCR结束后，将微滴PCR产物在5000rmp离心5min，使水相油相分离，弃上部油相，取下层水相的扩增产物进行电泳。

7)2wt％琼脂糖凝胶电泳：将6)中所得下层水相的扩增产物进行2wt.％琼脂糖凝胶电泳，凝胶中加入溴化乙锭(EB)进行染色，然后再120V下电泳30分钟，当溴酚蓝条带迁移至凝胶边缘时停止电泳，则凝胶成像。样品模板最终DNA浓度为5ng/μl所得凝胶成像结果分别如图3所示。

以各物种特异性引物对分别与5ng/μl混合总DNA模板进行微滴PCR扩增反应，用猪、羊、牛的特异性引物的微滴PCR反应体系和检测方法，分别扩增7种不同组合的基因组，空白对照用1μlH₂O代替DNA模板，每个反应重复2次。由图3可知，各物种特异性引物均能很好的从总DNA混合模板中扩增出其对应物种的特异性大小的条带，很好的验证了复杂总DNA模板条件下各物种特异性引物的有效性和特异性。

本发明所述检测方法以各物种特异性引物对分别与不同浓度(500ng/μl、50ng/μl、5ng/μl和0.5ng/μl)混合总DNA模板进行微滴PCR扩增反应，很好的验证了本发明微滴PCR反应体系和检测方法具有很好的灵敏性和有效性。

实施例4微滴PCR检测用试剂盒

根据上述实施例一中所述的微滴PCR反应体系，本发明所述引物体系可以配合相关试剂组装成不同组合的试剂盒，可用于对猪羊牛物种检测及相关肉产品的真伪及掺假鉴定。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims (10)

1.一种同步检测猪羊牛动物源性成分的微滴PCR引物体系，包括如下猪特异性引物对I、羊特异性引物对II和牛特异性引物对III：

1)对猪12SrRNA基因进行扩增生成猪特异性扩增片段的猪特异性引物对I：

正向引物：5’-CTACATAAGATATCCACCACA-3’；

反向引物：5’-ACATTGTGGATCTTCTAGGT-3’；

2)对羊细胞色素c氧化酶亚基III基因进行扩增生成羊特异性扩增片段的羊特异性引物对II：

正向引物：5’-TACACTGTACAGGCATCAG-3’；

反向引物：5’-CGTGAAGTAGTAGGAGAGTA-3’；

3)对牛TNFRSF10A基因进行扩增生成羊特异性扩增片段的牛特异性引物对III：

正向引物：5’-CAGTGAGACTCAGCCTAGAGT-3’；

反向引物：5’-CTGCTCCTAGATCAGTGGA-3’。

2.一种同步检测猪羊牛动物源性成分的微滴PCR检测方法，其包括如下步骤：

1)以待检样品总DNA为模板，配制含有如权利要求1所述微滴PCR引物体系的PCR水相体系和PCR油乳化剂体系，将PCR水相体系和PCR油乳化剂体系混合制备水包油的微滴PCR体系，进行微滴PCR扩增；其中，所述待检样品总DNA模板来自猪、羊、牛物种肉产品中的一种或多种；

2)反应结束后，将微滴PCR产物高速离心，水相油相分离，取下层水相的扩增产物进行电泳，根据琼脂糖凝胶电泳进行判定；

3)结果判定：待检样品扩增出290bp条带的，判定待检样品为猪源性成分；待检样品扩增出370bp条带的，判定待检样品为羊源性成分；待检样品扩增出190bp条带的，判定待检样品为牛源性成分。

3.根据权利要求2所述的微滴PCR检测方法，其特征在于，所述PCR水相体系包括：

4.根据权利要求2所述的微滴PCR检测方法，其特征在于，所述PCR油乳化剂体系包括：

5.根据权利要求2所述的微滴PCR检测方法，其特征在于，所述水包油的微滴PCR体系的制备方法：在磁力旋转下，将PCR水相体系以20-35μl/s的速度加入到PCR油乳化剂体系中，混匀，静置，形成均匀的水油乳化剂，其中，PCR油乳化剂体系与PCR水相体系的体积比为1.5～2.5：1。

6.根据权利要求2所述的微滴PCR检测方法，其特征在于，所述水包油的微滴PCR体系的反应程序为：依次进行90-100℃下预变性5-20min，90-100℃变性20-60s，50-60℃退火30-60s，71-73℃延伸60-120s，进行30-50次循环，71-73℃下延伸5-20min，最后在4-20℃下保持＞1min后结束。

7.如权利要求2-6任一项所述的微滴PCR检测方法在用于单物种总DNA模板进行猪、羊或牛的物种检测中的应用。

8.如权利要求2-6任一项所述的微滴PCR检测方法在用于多物种混合总DNA模板进行猪、羊、牛中两种以上的物种检测中的应用。

9.如权利要求2-6任一项所述的微滴PCR检测方法在猪、牛、羊产品的真伪及掺假鉴定中的应用。

10.一种含有如权利要求1所述的微滴PCR引物体系的同步检测猪羊牛动物源性成分的微滴PCR试剂盒。