CN106967802A - 鉴别蛋白类生化原料粗品中动物源性成分的试剂盒及其方法和引物对 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴别蛋白类生化原料粗品中动物源性成分的试剂盒及其方法和引物对。所述试剂盒包括PCR反应体系，所述PCR反应体系至少包括一种引物对，所述的引物对针对所述动物、特别是偶蹄目动物的细胞色素氧化酶亚基I基因设计。该试剂盒具有操作简便、成本低、准确性高以及重复性好等优点，特别能够区分猪及牛、羊等反刍类源性动物成分。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种鉴别蛋白类生化原料粗品中动物源性成分的试剂盒及其方法和引物对。
背景技术
近年来，随着药典标准的提高，多种生化原料粗品需明确动物种属来源。2016年10月19日，国家食品药品监督管理总局发布《药品生产质量管理规范生化药品附录(征求意见稿)》，其中第四十条关于种属鉴别提到，生化药品的原材料来源应相对稳定，应明确动物的种属及器官组织。必要时对原材料的动物种属进行鉴别。此处的“动物”是指非人动物。目前动物来源的生化原料药物有100多种，主要来源是猪，其次是牛、羊、家禽等。
动物源性成分鉴别有物理学、化学、免疫学和分子生物学等方法。由于生产过程中的提取、纯化等工艺，不能用常规的理化方法来鉴别生化原料的种属来源，而分子生物学方法如聚合酶链式反应(PCR)法具有快速、灵敏、特异性强的特点，已在肝素等生化药品或原料药的动物源性成分检测中有所应用。2014年FDA发布名为《多重荧光定量PCR检测原料药中反刍动物DNA用于监控肝素粗品质量》的指导原则，从肝素原料药中残留DNA的提取、纯化到反刍源性成分的实时荧光PCR检测各方面做了详细介绍。但鉴于肝素是一种多糖，指导原则中所述DNA提取方法不适用于蛋白类生化原料粗品，且指导原则所述方法仅可区分猪源性成分和反刍源性成分，而对于牛、羊等反刍源性成分无法进一步区分；另外，该实时荧光PCR检测试剂及实时荧光PCR检测仪的价格昂贵，并需要定期校准维护仪器，成本较高、难以在基层实验室推广使用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为克服现有技术中存在的针对原料粗品中残留DNA的检测方法不能区分反刍类动物源性成分以及现有检测方法对仪器的要求高、试剂成本高，不利于大规模推广应用等缺陷，提供一种鉴别蛋白类生化原料粗品中动物、特别是偶蹄目动物源性成分的试剂盒、方法以及引物对。该试剂盒具有操作简便、成本低、准确性高以及重复性好等优点，特别能够区分猪及牛、羊等反刍类源性动物成分。
现有的动物来源的生化原料粗品的制备方法通常会残留动物的DNA，利用该DNA进行动物物种的鉴定成为本领域的常规技术。然而DNA的残留量不甚明确，如果直接进行DNA的提取，可能会因为含量过低，无法提取到有效量的DNA；而如果利用现有的灵敏度高、特异性强的荧光定量PCR又会存在检测成本高，不利于推广应用等缺陷，且其灵敏度过高，大大低于原料粗品中DNA的含量，造成不必要的浪费。因此选定合适的检测方法成为鉴别蛋白类生化原料粗品中动物源性成分的难点，特别是在保证鉴定结果特异性高的条件下还需尽量保证灵敏度。本发明付出创造性劳动后发现，因前期处理工艺不同，蛋白类生化原料粗品中DNA的残留量的数量级可能经常会在1皮克以上，针对该残留量，只要引物设计合理则普通PCR的检测限度即可达到。故在确定检测方法后，需要确定能够区分偶蹄目中不同物种的特异性DNA；同时还需兼顾能达到上述灵敏度。经本申请发明人诸多试验和研究，从众多基因和DNA中筛选出上述动物中细胞色素氧化酶亚基I基因，该特异性DNA具有分子量小、结构简单稳定以及不与组蛋白结合因而裸露等特点；并且拷贝数多，可达数千到上万个的特点；基本符合本发明的上述要求。进一步地，又针对该基因设计并筛选出了特定引物对，进行普通PCR时也达到了上述最佳效果。
本发明解决上述技术问题的技术方案之一是：一种鉴别蛋白类生化原料粗品中动物源性成分的试剂盒，其包括PCR反应体系，所述PCR反应体系至少包括一种引物对，所述的引物对针对所述动物、特别是偶蹄目动物的细胞色素氧化酶亚基I基因设计；其中，
针对猪细胞色素氧化酶亚基I基因设计的所述引物对的正向引物是序列如SEQ IDNO.1所示的核酸，反向引物是序列如SEQ ID NO.2所示的核酸；
针对牛细胞色素氧化酶亚基I基因设计的所述引物对的正向引物是序列如SEQ IDNO.3所示的核酸，反向引物是序列如SEQ ID NO.4所示的核酸；
或者，针对羊细胞色素氧化酶亚基I基因设计的所述引物对的正向引物是序列如SEQ ID NO.5所示的核酸，反向引物是序列如SEQ ID NO.6所示的核酸。
本发明中，上述蛋白类生化原料粗品指的是生物医药领域中，蛋白类生化药品的原材料。
较佳地，所述PCR反应体系还包括PCR反应缓冲液、2’-脱氧核苷三磷酸和Taq酶；较佳地，所述PCR反应体系中Mg2+的浓度为2mM；4种所述2’-脱氧核苷三磷酸的浓度均为0.2mM；所述Taq酶的活力单位为0.025U/μl。
在本发明一较佳实施例中，所述反应缓冲液为Ex Taq缓冲液，所述Taq酶为TakaraEx Taq酶。
本发明解决上述技术问题的技术方案之二是：一种鉴别蛋白类生化原料粗品中动物源性成分的方法，其包括以下步骤：
1)提取待检样品中的DNA；
2)利用本发明上述试剂盒中的PCR反应体系扩增上述DNA；
3)电泳检测PCR产物。
步骤1)中，可用于蛋白类生化原料粗品中残留DNA提取的试剂盒有生工生物的Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒和Thermo公司的GMO提取试剂盒，理论上说，与上述提取试剂盒提取原理相同的任何市售试剂盒均可用于本发明蛋白类生化原料粗品中残留DNA的提取。
步骤2)中，所述扩增的PCR反应程序为：(1)95℃预变性3min；(2)95℃变性30s：(3)57℃退火30s；(4)72℃延伸50s；(5)步骤(2)-(4)循环40次；(6)72℃延伸10min；(7)4℃终止。
步骤3)中，所述电泳为本领域常规的电泳，用于分离PCR扩增得到的目的产物；较佳地，上述电泳为琼脂糖凝胶电泳。
本发明解决上述技术问题的技术方案之三是：一种鉴别蛋白类生化原料粗品中动物源性成分的引物对，所述引物对针对猪细胞色素氧化酶亚基I基因设计，其正向引物是序列如SEQ ID NO.1所示的核酸，反向引物是序列如SEQ ID NO.2所示的核酸；所述引物对针对牛细胞色素氧化酶亚基I基因设计，其正向引物是序列如SEQ ID NO.3所示的核酸，反向引物是序列如SEQ ID NO.4所示的核酸；或者，所述引物对针对羊细胞色素氧化酶亚基I基因设计，其正向引物是序列如SEQ ID NO.5所示的核酸，反向引物是序列如SEQ ID NO.6所示的核酸。
本发明解决上述技术问题的技术方案之四是：上述引物在制备鉴别蛋白类生化原料粗品中动物源性成分的试剂盒中的应用。
本发明中，所述动物均选自偶蹄目动物中的一种或者多种；较佳地，所述偶蹄目动物包括猪、牛和羊。
本发明中，上述猪细胞色素氧化酶亚基I基因优选EU623453.1基因，牛细胞色素氧化酶亚基I基因优选DQ487094.1基因，羊细胞色素氧化酶亚基I基因优选EU834864.1基因。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：利用本发明的试剂盒通过PCR扩增反应及电泳检测分析等一系列步骤准确地鉴别蛋白类生化原料粗品的不同种属来源，特别能够区分反刍类源性动物如牛和羊的成分，对猪源性成分的检测限可达1pg、对牛源性成分的检测限为1pg、对羊源性成分的检测限可达10pg，并且具有操作简便、成本低、准确性高以及重复性好等优点，其中，成本仅为2元/样品，远低于荧光PCR检测的成本——200元/样品，极其便于推广应用。为医药采购把关提供可靠的检验结果，为监督药品规范生产，保障用药安全提供技术支持。
附图说明
图1为猪、牛、羊源性引物对猪、牛、羊单物种基因组DNA PCR扩增产物的电泳图。图中M为DNA标准分子量，N为空白对照。
图2为猪、牛、羊源性引物对猪、牛、羊多物种混合基因组DNA PCR扩增产物的电泳图。图中M为DNA标准分子量，N为空白对照，1～7依次是以猪，牛，羊，猪+牛，猪+羊，牛+羊，猪+牛+羊为模板的PCR扩增产物。
图3为猪、牛、羊源性引物对猪、牛、羊基因组DNA梯度稀释液PCR扩增产物的电泳图。图中M为DNA标准分子量，N为空白对照3～8依次为模板浓度1ng/μL、10-1ng/μL、10-2ng/μL、10-3ng/μL、10-4ng/μL、10-5ng/μL的PCR扩增产物。
图4为猪、牛、羊源性引物对糜蛋白酶原粗品中残留DNA PCR扩增产物的电泳图；图中M为DNA标准分子量，N为空白对照，1～3为三批次糜蛋白酶原粗品，猪、牛、羊为阳性对照。
图5为对比引物组1对猪、牛、羊基因组DNA梯度稀释液PCR扩增产物的电泳图。图中M为DNA标准分子量，N为空白对照，3～6依次为模板浓度1ng/μL、10-1ng/μL、10-2ng/μL、10- 3ng/μL的PCR扩增产物。
图6为对比引物组2对猪、牛、羊基因组DNA梯度稀释液PCR扩增产物的电泳图。图中M为DNA标准分子量，N为空白对照，3～7依次为模板浓度1ng/μL、10-1ng/μL、10-2ng/μL、10- 3ng/μL、10-4ng/μL的PCR扩增产物。
图7为对比例3猪、牛、羊源性引物对猪、牛、羊基因组DNA梯度稀释液PCR扩增产物的电泳图。图中M为DNA标准分子量；N为空白对照；1～6依次为模板浓度100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、10-1ng/μL、10-2ng/μL、10-3ng/μL的PCR扩增产物。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
细胞裂解液、蛋白酶K以及DNA吸附柱均来自Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒，该试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；
用于提取糜蛋白酶原粗品中残留基因组DNA的试剂盒为Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒B518251，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；
用于PCR扩增反应的Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液以及脱氧核糖核苷三磷酸均购自大连宝生物有限公司。
实施例1原料粗品中残余的基因组DNA的提取
(1)将蛋白类生化原料粗品研磨成粉末，每25mg样品粉末加入180μL细胞裂解液1，再加入20μL蛋白酶K溶液，震荡混匀后，56℃水浴2h至细胞完全裂解；(2)加入裂解液200μL后充分颠倒混匀，70℃水浴10min；(3)水浴结束后，5000rpm离心5min，吸取上清液至新管；(4)在上清液中加入无水乙醇200μL，充分颠倒混匀；(5)将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液全部加入吸附柱中，静置2min，再10000rpm室温离心1min，倒掉收集管中废液；(6)若溶液体积较大，重复步骤(5)进行多次反复加载；(7)将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500μL洗液1(使用前按标示比例加入乙醇)，10000rpm离心30s，倒掉收集管废液；(8)将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500μL洗液2(使用前按标示比例加入乙醇)，10000rpm离心30s，倒掉收集管废液；(9)将吸附柱重新放回收集管中，于12000rpm室温离心2min，离去残留的洗液2，将吸附柱打开盖子于室温中放置20min，以彻底晾干吸附材料中残留的洗液2；(10)取出吸附柱，放入一个新的离心管中，加入50μL洗脱液静置3min，12000rpm室温离心2min，收集DNA溶液。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。
实施例2PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测
(1)引物设计
设计猪、牛、羊源性种属特异性引物，分别为：
a.针对猪细胞色素氧化酶亚基I基因EU623453.1设计引物对Sus：
正向引物：5’–GGCACCCTGTACCTACTATTTGG–3’(详见SEQ ID NO.1)；
反向引物：5’–ATTCCGAATCCTGGTAAGATGAG–3’)详见SEQ ID NO.2)；
b.针对牛细胞色素氧化酶亚基I基因DQ487094.1设计引物对Bos：
正向引物：5’–GAGAGTAGTAGTAGTACGGCGGTAAT–3’(详见SEQ ID NO.3)；
反向引物：5’–CATCCTCTATAGTTGAAGCTGGG–3’(详见SEQ ID NO.4)；
c.针对羊细胞色素氧化酶亚基I基因EU834864.1设计引物对Ovis：
正向引物：5’–TAGATCTAACTATTTTCTCCCTACATCTG–3’(详见SEQ ID NO.5)；
反向引物：5’–GGTGTTGGTATAGGATAGGGTCTC–3’(详见SEQ ID NO.6)；
(2)PCR扩增
a.PCR反应体系
以实施例1所得待测样品的残留基因组DNA为模板，采用上述设计的猪、牛、羊源性种属特异性引物分别进行PCR扩增，反应体系表1：
表1.反应体系
| DNA模板 | 1μL |
| 正向引物(10μmol/L) | 1μL |
| 反向引物(10μmol/L) | 1μL |
| 2×premix Taq(Ex Taq version 2.0) | 12.5μL |
| 双蒸水 | 至25μL |
b.PCR扩增程序
①95℃预变性3min；②95℃变性30s：③57℃退火30s；④72℃延伸50s；⑤步骤②-④循环40次；⑥72℃延伸10min；⑦4℃终止。
(3)琼脂糖凝胶电泳检测
取20μL上述PCR扩增产物加入4μL上样缓冲液(含有0.25％溴酚蓝、0.25％二甲苯苯胺以及60％甘油)，采用质量百分比浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳，电压120V，电泳40min，蓝光切胶仪下观察。
若待检样品扩增出713bp DNA条带，则判定为猪源性成分；若待检样品扩增出253bp DNA条带，则判定为牛源性成分；若待检样品扩增出273bp DNA条带，则判定为羊源性成分。
实施例3猪、牛、羊源性引物分别对猪、牛、羊单物种基因组DNA进行PCR扩增
猪、牛、羊基因组DNA为Zyagen公司产品PG-313、BG-313、SG-313，浓度为1000ng/μL。将猪、牛、羊基因组DNA用双蒸水稀释成浓度为100ng/μL，作为DNA模板；设置空白对照，用1μL双蒸水代替DNA模板。
(1)PCR扩增
采用实施例1和2中的引物、PCR体系以及扩增程序进行PCR扩增。
(2)琼脂糖凝胶电泳检测
取10μL PCR扩增产物加入2μL上样缓冲液(含有0.25％溴酚蓝、0.25％二甲苯苯胺、60％甘油)，采用质量百分比浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳，电压120V，电泳40min，蓝光切胶仪下观察，结果见图1。
结果显示本发明设计的猪、牛、羊源性成分鉴别引物仅对相应物种的基因组DNA进行扩增，对另外两个物种无扩增，且可得到分子量大小为713bp的猪源特异性扩增条带，253bp的牛源特异性扩增条带和273bp的羊源特异性扩增条带。
实施例4猪、牛、羊源性引物分别对猪、牛、羊多物种混合基因组DNA进行PCR扩增
(1)DNA模板的配制：
将猪、牛、羊基因组DNA按照如下组合进行混合，使不同组合的猪、牛、羊每种动物的最终DNA浓度为50ng/μL，作为样品模板。
DNA样品的不同组合为：猪，牛，羊，猪+牛，猪+羊，牛+羊，猪+牛+羊；同时设置空白对照，用1μL双蒸水代替DNA模板。
(2)PCR扩增
采用实施例1和2中的引物、PCR体系以及扩增程序进行PCR扩增。
(3)琼脂糖凝胶电泳检测：
取20μL PCR扩增产物加入4μL上样缓冲液(含有0.25％溴酚蓝、0.25％二甲苯苯胺、60％甘油)，采用质量百分比浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳，电压120V，电泳40min，蓝光切胶仪下观察，结果见图2。
结果显示本发明设计的各种属特异性引物均能很好的从总DNA混合模板中扩增出其对应物种的特异性条带，很好的验证了复杂总DNA模板条件下各物种种属特异性引物的有效性和特异性。
实施例5猪、牛、羊源性引物分别对猪、牛、羊基因组DNA的检测灵敏度实验
(1)DNA模板的配制：
将猪、牛、羊基因组DNA用双蒸水进行10倍梯度稀释，得到梯度稀释液浓度依次为：1ng/μL、10-1ng/μL、10-2ng/μL、10-3ng/μL、10-4ng/μL、10-5ng/μL的DNA模板；同时设置空白对照，用1μL双蒸水代替DNA模板。
(2)PCR扩增：采用实施例1和2中的引物、PCR体系以及扩增程序进行PCR扩增。
(3)琼脂糖凝胶电泳检测：
取20μL PCR扩增产物加入4μL上样缓冲液(含有0.25％溴酚蓝、0.25％二甲苯苯胺、60％甘油)，采用质量百分比浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳，电压120V，电泳40min，蓝光切胶仪下观察，结果见图3。
结果显示本发明设计的猪源特异性引物对猪基因组DNA的检测限为1pg，牛源特异性引物对牛基因组DNA的检测限为1pg，羊源特异性引物对羊基因组DNA的检测限为10pg。
实施例6糜蛋白酶原粗品中猪、牛、羊源性动物成分的检测
(1)糜蛋白酶原粗品中残留基因组DNA的提取
①将糜蛋白酶原粗品研磨成粉末，称取250mg样品粉末加入1800μL细胞裂解液1，再加入200μL蛋白酶K溶液，震荡混匀后，56℃水浴2h至细胞完全裂解；②加入2000μL裂解液2后充分颠倒混匀，70℃水浴10min；③水浴结束后，5000rpm离心5min，吸取上清液至新管；④在上清液中加入2000μL无水乙醇，充分颠倒混匀；⑤将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液全部加入吸附柱中，静置2min，再10000rpm室温离心1min，倒掉收集管中废液；⑥若溶液体积较大，重复步骤⑤进行多次反复加载；⑦将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500μL洗液1(使用前按标示比例加入乙醇)。10000rpm离心30s，倒掉收集管废液；⑧将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500μL洗液2(使用前按标示比例加入乙醇)。10000rpm离心30s，倒掉收集管废液；⑨将吸附柱重新放回收集管中，于12000rpm室温离心2min，离去残留的洗液2，将吸附柱打开盖子于室温中放置20min，以彻底晾干吸附材料中残留的洗液2；⑩取出吸附柱，放入一个新的离心管中，加入50μL洗脱液静置3min，12000rpm室温离心2min，收集DNA溶液。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。
(2)PCR扩增：采用实施例1和2中的引物、PCR体系以及扩增程序进行PCR扩增。
(3)琼脂糖凝胶电泳检测：
取10μL PCR扩增产物加入2μL上样缓冲液(含有0.25％溴酚蓝、0.25％二甲苯苯胺、60％甘油)，采用质量百分比浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳，电压120V，电泳40min，蓝光切胶仪下观察，结果见图4。
结果显示使用本发明设计的种属特异性引物检测糜蛋白酶原粗品为牛源，无猪、羊源性成分污染。
同理，本发明的上述检测方法也可用于检测禽类、马、驴等动物源性的生化原料粗品样品中是否混有猪、牛、羊源性成分，在此不具体赘述。
对比例1
(1)将猪、牛、羊基因组DNA用双蒸水进行10倍梯度稀释，得到梯度稀释液浓度依次为：1ng/μL、10-1ng/μL、10-2ng/μL、10-3ng/μL的DNA模板，余同实施例5。
(2)PCR扩增：
采用下述引物(对比引物组1)：
针对猪牛羊同一靶基因，即猪EU623453.1、牛DQ487094.1、羊EU834864.1，设计不同于上述实施例的引物组。
猪源正向引物：GGCACCCTGTACCTACTATTTGGTG(详见SEQ ID NO.7)；
反向引物：ATTCCGAATCCTGGTAAGATGAGAAT(详见SEQ ID NO.8)；
牛源正向引物：GAGAGTAGTAGTAGTACGGCGGTAATTATTAC(详见SEQ ID NO.9)；
反向引物：CATCCTCTATAGTTGAAGCTGGGGC(详见SEQ ID NO.10)；
羊源正向引物：TAGATCTAACTATTTTCTCCCTACATCTGG(详见SEQ ID NO.11)；
反向引物：GGTGTTGGTATAGGATAGGGTCTCC(详见SEQ ID NO.12)。
PCR体系同实施例5，PCR扩增程序中的退火温度由57℃变为63℃，余同实施例5。
(3)琼脂糖凝胶电泳检测同实施例5，结果见图5。
结果显示上述猪源特异性引物对猪基因组DNA的检测限为10pg，牛源特异性引物对牛基因组DNA的检测限为10pg，羊源特异性引物对羊基因组DNA的检测限为100pg。
对比例2
(1)将猪、牛、羊基因组DNA用双蒸水进行10倍梯度稀释，得到梯度稀释液浓度依次为：1ng/μL、10-1ng/μL、10-2ng/μL、10-3ng/μL、10-4ng/μL的DNA模板，余同实施例5。
(2)PCR扩增：
采用下述引物(对比引物组2)：
针对猪牛羊同一靶基因，即猪EU623453.1、牛DQ487094.1、羊EU834864.1，设计不同于上述实施例的引物组。
猪源正向引物：GGCACCCTGTACCTACTATTTGGTGC(详见SEQ ID NO.13)；
反向引物：ATTCCGAATCCTGGTAAGATGAGAATGT(详见SEQ ID NO.14)；
牛源正向引物：GAGAGTAGTAGTAGTACGGCGGTAATTATTACG(详见SEQ ID NO.15)；
反向引物：CATCCTCTATAGTTGAAGCTGGGGCA(详见SEQ ID NO.16)；
羊源正向引物：TAGATCTAACTATTTTCTCCCTACATCTGGC(详见SEQ ID NO.17)；
反向引物：GGTGTTGGTATAGGATAGGGTCTCCTC(详见SEQ ID NO.18)。
PCR体系同实施例5，PCR扩增程序中的退火温度由57℃变为65℃，余同实施例5。
(3)琼脂糖凝胶电泳检测同实施例5，结果见图6。
结果显示上述猪源特异性引物对猪基因组DNA的检测限为100pg，牛源特异性引物对牛基因组DNA的检测限为10pg，羊源特异性引物对羊基因组DNA的检测限为100pg。
实施例中的引物组与两个对比引物组在引物设计时，均靶向同一基因，只有引物长度发生变化，因此退火温度相应变化，其余实验条件均与本发明上述实施例5的反应条件相同。其中本发明引物组的检测灵敏度最高。
对比例3
(1)将猪、牛、羊基因组DNA用双蒸水进行10倍梯度稀释，得到梯度稀释液浓度依次为：100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、10-1ng/μL、10-2ng/μL、10-3ng/μL的DNA模板，余同实施例5。
(2)PCR扩增：
采用实施例5中的引物。
a.PCR反应体系(其中Taq DNA聚合酶为上海生工生物公司产品)
表2 反应体系
| DNA模板 | 1μL |
| 正向引物(10μmol/L) | 1μL |
| 反向引物(10μmol/L) | 1μL |
| 10×PCR反应缓冲液 | 2.5μL |
| 脱氧核糖核苷三磷酸(10mmol/L) | 0.5μL |
| Taq DNA聚合酶(5U/μL) | 0.5μL |
| 双蒸水 | 至25μL |
b.PCR扩增程序
①95℃预变性3min；②95℃变性30s：③57℃退火30s；④72℃延伸50s；⑤步骤②-④循环30次；⑥72℃延伸10min；⑦4℃终止。
(3)琼脂糖凝胶电泳检测：
取10μL PCR扩增产物加入2μL上样缓冲液(含有0.25％溴酚蓝、0.25％二甲苯苯胺、60％甘油)，采用质量百分比浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳，电压120V，电泳40min，蓝光切胶仪下观察，结果见图7。
结果显示本发明设计的猪源特异性引物对猪基因组DNA的检测限为1ng，牛源特异性引物对牛基因组DNA的检测限为0.1ng，羊源特异性引物对羊基因组DNA的检测限为1ng。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
<110> 上海上药第一生化药业有限公司
<120> 鉴别蛋白类生化原料粗品中动物源性成分的试剂盒及其方法和引物对
<130> P1710185C
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sus正向引物
<400> 1
ggcaccctgt acctactatt tgg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sus反向引物
<400> 2
attccgaatc ctggtaagat gag 23
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Bos正向引物
<400> 3
gagagtagta gtagtacggc ggtaat 26
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Bos反向引物
<400> 4
catcctctat agttgaagct ggg 23
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ovis正向引物
<400> 5
tagatctaac tattttctcc ctacatctg 29
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ovis反向引物
<400> 6
ggtgttggta taggataggg tctc 24
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 对比引物组1-猪源正向引物
<400> 7
ggcaccctgt acctactatt tggtg 25
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 对比引物组1-猪源反向引物
<400> 8
attccgaatc ctggtaagat gagaat 26
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 对比引物组1-牛源正向引物
<400> 9
gagagtagta gtagtacggc ggtaattatt ac 32
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 对比引物组1牛源反向引物
<400> 10
catcctctat agttgaagct ggggc 25
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 对比引物组1-羊源正向引物
<400> 11
tagatctaac tattttctcc ctacatctgg 30
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 对比引物组1-羊源反向引物
<400> 12
ggtgttggta taggataggg tctcc 25
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 对比引物组2-猪源正向引物
<400> 13
ggcaccctgt acctactatt tggtgc 26
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 对比引物组2猪源反向引物
<400> 14
attccgaatc ctggtaagat gagaatgt 28
<210> 15
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 对比引物组2-牛源正向引物
<400> 15
gagagtagta gtagtacggc ggtaattatt acg 33
<210> 16
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 对比引物组2-牛源反向引物
<400> 16
catcctctat agttgaagct ggggca 26
<210> 17
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 对比引物组2-羊源正向引物
<400> 17
tagatctaac tattttctcc ctacatctgg c 31
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 对比引物组2-羊源反向引物
<400> 18
ggtgttggta taggataggg tctcctc 27
Claims (10)
1.一种鉴别蛋白类生化原料粗品中动物源性成分的试剂盒，其包括PCR反应体系，其特征在于，所述PCR反应体系至少包括一种引物对，所述的引物对针对所述动物的细胞色素氧化酶亚基I基因设计；其中，
针对猪细胞色素氧化酶亚基I基因设计的所述引物对的正向引物是序列如SEQ IDNO.1所示的核酸，反向引物是序列如SEQ ID NO.2所示的核酸；
针对牛细胞色素氧化酶亚基I基因设计的所述引物对的正向引物是序列如SEQ IDNO.3所示的核酸，反向引物是序列如SEQ ID NO.4所示的核酸；
或者，针对羊细胞色素氧化酶亚基I基因设计的所述引物对的正向引物是序列如SEQID NO.5所示的核酸，反向引物是序列如SEQ ID NO.6所示的核酸。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应体系还包括PCR反应缓冲液、2’-脱氧核苷三磷酸和Taq酶；较佳地，所述PCR反应体系中Mg2+的浓度为2mM；
和/或，4种所述2’-脱氧核苷三磷酸的浓度各为0.2mM；
和/或，所述Taq酶的活力单位为0.025U/μl。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液为Ex Taq缓冲液，所述Taq酶为Takara Ex Taq酶。
4.如权利要求1～3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述动物选自偶蹄目动物中的一种或者多种；较佳地，所述偶蹄目动物包括猪、牛和羊。
5.一种鉴别蛋白类生化原料粗品中动物源性成分的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
1)提取待检样品中的DNA；
2)利用权利要求1～4任一项所述试剂盒中的PCR反应体系扩增上述DNA；
3)电泳检测PCR产物。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)所述扩增的PCR反应程序为：(1)95℃预变性3min；(2)95℃变性30s：(3)57℃退火30s；(4)72℃延伸50s；(5)步骤(2)-(4)循环40次；(6)72℃延伸10min；(7)4℃终止。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3)所述电泳为琼脂糖凝胶电泳。
8.一种鉴别蛋白类生化原料粗品中动物源性成分的引物对，其特征在于，所述引物对针对猪细胞色素氧化酶亚基I基因设计，其正向引物是序列如SEQ ID NO.1所示的核酸，反向引物是序列如SEQ ID NO.2所示的核酸；
所述引物对针对牛细胞色素氧化酶亚基I基因设计，其正向引物是序列如SEQ ID NO.3所示的核酸，反向引物是序列如SEQ ID NO.4所示的核酸；
或者，所述引物对针对羊细胞色素氧化酶亚基I基因设计，其正向引物是序列如SEQ IDNO.5所示的核酸，反向引物是序列如SEQ ID NO.6所示的核酸。
9.如权利要求8所述的引物对在制备鉴别蛋白类生化原料粗品中动物源性成分的试剂盒中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述动物选自偶蹄目动物中的一种或者多种；较佳地，所述偶蹄目动物包括猪、牛和羊。
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