KR102603588B1 - Dna 추출을 위한 침전제 조성물 및 이것이 적용된 dna 추출방법 - Google Patents

Dna 추출을 위한 침전제 조성물 및 이것이 적용된 dna 추출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미생물 DNA 순수분리를 저해하는 물질들을 효과적으로 제거하는 침전제 조성물 및 이것이 적용된 고농도, 고순도 DNA 추출방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 시료 중의 세포를 용해하여 이로부터 DNA를 추출하는 과정에서 DNA 순수분리를 저해하는 불순물들을 침전시켜 제거하기 위한 용도로 사용되는 것으로서, 2.0~3.0 %(w/v) Phosphotungstic acid hydrate (순도 65.0~70.0%), 1.2~1.8 %(w/v) Zinc acetate dihydrate, 13.0~19.0 %(v/v) Acetic acid 및 나머지가 물인 것을 특징으로 하는 불순물 침전제 조성물, 상기 침전제 조성물이 적용된 DNA 추출방법 및 이렇게 추출된 DNA의 증폭방법에 관한 것이다.

Description

DNA 추출을 위한 침전제 조성물 및 이것이 적용된 DNA 추출방법{Precipitant Composition for DNA extraction, and Method for DNA Extraction thereby}
본 발명은 예를 들면, 유화 식품과 같은 시료로부터 미생물 DNA를 추출하는 데 사용되는 침전제 조성물 및 이것이 적용된 DNA 추출방법에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로는 미생물 DNA 순수분리를 저해하는 물질들을 효과적으로 제거하는 침전제 조성물 및 이것이 적용된 고농도, 고순도 DNA 추출방법에 관한 것이다.
식품안전사고가 증가하면서 식품 안전성은 인류의 공통과제로 전 세계적인 관심과 중요한 문제로 강조되고 있다. 식품 안전에 대한 위해 요인은 미생물학적, 화학적 및 물리적 인자로 분류할 수 있으며, 이들 중 미생물이 대부분을 차지하고 있다(Kim et al., 2010). 미생물로부터 발생하는 위해는 인체 건강에 즉각적이고 심각한 영향을 미치기 때문에 미생물에 의한 질병은 전 세계의 관심을 차지하고 있으며, 효과적인 관리를 위한 많은 연구가 진행되고 있다(Kim et al., 2011).
우유, 발효유, 치즈, 분유류 등의 유제품 및 두유, 초콜릿, 아이스크림 등 수용성 원료와 지용성 원료들이 잘 분산되어 혼재해 있는 유화 식품은 단백질, 지방, 비타민, 미네랄이 함유된 고영양 식품으로, 미생물이 쉽게 자랄 수 있는 환경이다. 따라서 생산, 운반, 판매 등 전 과정에서 유해 미생물로부터 쉽게 오염될 수 있다. 그러나 식품 중에 미생물은 미량으로 존재하며, 여러 가지 물질들과 섞여 있어 미생물 DNA를 분리하여 검출하는 것은 어려움이 있다. 따라서 식품 중 미생물 검출방법은 소량의 균도 정확하게 검출할 수 있어야 한다(Kwak et al., 2013).
전통적인 미생물 검출방법인 배지 배양법은 식품 속 미생물을 적합한 조건에서 배양하여 증균된 미생물을 직접 확인하는 방법이다. 그러나 배양법은 많은 노동력과 긴 시간이 소요될 뿐만 아니라 위양성 결과가 빈번하고 낮은 민감도로 한계점이 있다(Law et al., 2015; Lee et al., 2014). 이러한 한계점을 보완하기 위해 신속하고 간편한 검출법이 개발되고 있다.
분자생물학 기반의 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 기법은 배양법보다 높은 민감도로 극소량의 미생물도 검출할 수 있고, 추출한 DNA의 특정 부분을 증폭하기 때문에 높은 특이성을 가지고 있어 식품 분석에서 널리 활용되고 있다(Cremonesi et al., 2006; Phuektes et al., 2003; Zhao et al., 2014). 효소형광법(ELISA, Enzyme-linked Immunosorbent Assay) 같은 단백질을 이용한 면역학적 방법도 현장 검사가 가능하여 사용되고는 있지만, 민감도와 재현성이 떨어지는 편이다(Kwak et al., 2013).
불행히도, 식품에는 DNA 증폭을 방해하는 지방, 단백질 및 칼슘과 같은 PCR 억제제가 포함된 경우가 많다(Wilson 1997). 유제품으로부터 PCR 억제제가 제거되고, 분석에 적합한 DNA를 추출하는 것은 흔한 문제인 것으로 보고되고 있어 DNA를 충분한 농도와 순도로 추출하는 것은 매우 중요하다(Pirondini et al. 2010). 따라서 식품으로부터 추출한 미생물 DNA의 PCR 분석을 성공적으로 수행하기 위해서는 DNA 추출과정 중 PCR 저해 요소를 제거하는 것이 중요하다. 유제품과 같은 유화 식품 중 미생물 DNA 추출 시, 식품에 함유된 단백질과 지방은 DNA 순수분리와 PCR 반응에서 저해제로 작용하기 때문에 DNA 추출과정 중 이들을 제거하는 과정이 필수적이다(Quigley et al., 2012).
또한, 미생물 검출방법은 식품 내 미량으로 존재하는 균을 정확하게 검출할 수 있어야 하는데 검출에 필요한 최소한의 균 농도를 검출한계(limit of detection)라고 한다. PCR 수행 시 검출한계에 영향을 주는 요인 중 하나가 DNA 농도와 순도이다. 따라서 DNA 추출과정 중 오염 혹은 추출 효율이 낮은 경우 PCR 수행이 어려울 수 있으므로 적합한 DNA 추출 방법을 선택해서 분석하는 것이 중요하다(Koo et al., 2016).
기존의 DNA 추출 방법은 페놀을 사용하는 방법이다. 이것은 페놀/클로로포름 혹은 페놀/클로로포름/아이소아밀 알콜(phenol/chloroform/isoamyl alcohol)을 사용하여 DNA 추출 및 분리하는 방법으로 긴 시간이 소요되며, 페놀 등 인체에 해로운 시약을 사용하기 때문에 많은 주의가 필요하다. 이러한 단점 때문에 기존의 추출 방법보다 더 간단하고 효과적인 추출 방법들이 개발되고 있다. 현재에는 DNA와 특이적으로 결합하는 실리카 막(silica membrane) 혹은 유리섬유(glass fiber)를 사용하는 컬럼 기반의 DNA 추출 방법이 신속하고 편리하여 널리 사용되고 있다.
예컨대, 우유 또는 치즈 샘플에서 미생물 DNA를 추출하는 상업화된 키트로서 Milk Bacterial DNA Isolation Kit(Norgen Biotek Corporation, Ontario, Canada) 또는 PowerFood™ Microbial DNA Isolation Kit(MoBio Laboratories Inc., Carlsbad, CA, USA) 등이 알려져 있다. 그러나 이들 키트류는 단순하고 간편한 프로토콜로 DNA 추출이 가능하여 널리 사용되고 있지만 우유로부터 미생물 DNA 추출은 식품에 함유된 단백질 등의 억제제와 불순물 등으로 인해 여전히 추출 효율이 낮은 문제가 있다.
CN104164416A (Method for high efficiently extracting nucleic acid from fresh milk) CN103882012B (A kind of quickly method of high efficiency extraction DNA from the milk product such as cattle and sheep liquid milk and milk powder)
본 발명의 목적은 유화 식품으로부터 미생물 DNA를 고효율로 추출하기 위해 실리카 막 컬럼을 사용한 DNA 추출에서 DNA 순수분리를 저해하는 불순물을 효과적으로 제거하는 침전제를 제공하는 것이다.
또 다른 본 발명의 목적은 상기 침전제를 적용하여 실리카 막 컬럼을 사용한 미생물 DNA 추출방법을 제공하는 것이다.
전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 시료 중의 세포를 용해하여 이로부터 DNA를 추출하는 과정에서 DNA 순수분리를 저해하는 불순물들을 침전시켜 제거하기 위한 용도로 사용되는 것으로서, 2.0~3.0 %(w/v) Phosphotungstic acid hydrate (순도 65.0~70.0%), 1.2~1.8 %(w/v) Zinc acetate dihydrate, 13.0~19.0 %(v/v) Acetic acid 및 나머지가 물인 것을 특징으로 하는 불순물 침전제 조성물, 상기 침전제 조성물이 적용된 DNA 추출방법 및 이렇게 추출된 DNA의 증폭방법에 관한 것이다.
이상과 같이 본 발명에 의하면, 침전제에 의해 DNA 순수분리를 저해하는 불순물을 효과적으로 제거할 수 있고 종래의 방법보다 고농도, 고순도의 DNA를 추출할 수 있게 된다.
또한 본 발명에 의하면 유화 식품으로부터 미생물 DNA를 고농도, 고순도로 추출할 수 있게 되어 종래 방법에 비해 식품 내 미생물의 농도가 낮더라도 이를 효율적으로 정확하게 검출할 수 있게 된다.
도 1은 실시예에서 추출한 살모넬라 타이피뮤리움 DNA를 PCR 후 수행한 전기영동 사진이다.
레인 1, 7: 1Kb Plus DNA ladder; 레인 2: NTC(Non Template Control); 레인 3, 4: Control(우유); 레인 5, 6: 우유에 살모넬라 타이피뮤리움 1/5 접종한 우유 시료
도 2는 실시예에서 추출한 크로노박터 사카자키 DNA를 PCR 후 수행한 전기영동 사진이다.
레인 1, 7: 1Kb Plus DNA ladder; 레인 2: NTC(Non Template Control); 레인 3, 4: Control(우유) ; 레인 5, 6: 우유에 크로노박터 사카자키 1/5 접종한 우유 시료
도 3은 실시예에서 추출한 크로노박터 뮤이젠시 DNA를 PCR 후 수행한 전기영동 사진이다.
레인 1, 7: 1Kb Plus DNA ladder; 레인 2: NTC(Non Template Control); 레인 3, 4: Control(우유) 레인 5, 6: 우유에 크로노박터 뮤이젠시 1/5 접종한 우유 시료
도 4은 실시예에서 추출한 슈도모나스 에루지노사 DNA를 PCR 후 수행한 전기영동 사진이다.
레인 1, 7: 1Kb Plus DNA ladder; 레인 2: NTC(Non Template Control); 레인 3, 4: Control(우유); 레인 5, 6: 우유에 슈도모나스 에루지노사 1/5 접종한 우유 시료
도 5는 실시예 5에서 검출한계를 확인하기 위해 살모넬라 타이피뮤리움 세균 수에 따라 추출한 DNA를 PCR 후 수행한 전기영동 사진이다.
레인 1: 1Kb Plus DNA ladder; 레인 2: NTC(Non Template Control); 레인 3: Control(우유); 레인 4: 우유에 살모넬라 타이피뮤리움 1/5 접종한 우유 시료; 레인 5-11: 살모넬라 타이피뮤리움 2X106-2X100 CFU/mL을 접종한 우유 시료
도 6는 실시예 5에서 검출한계를 확인하기 위해 크로노박터 뮤이젠시 세균 수에 따라 추출한 DNA를 PCR 후 수행한 전기영동 사진이다.
레인 1: 1Kb Plus DNA ladder; 레인 2: NTC(Non Template Control); 레인 3: Control(우유); 레인 4: 우유에 크로노박터 뮤이젠시 1/5 접종한 우유 시료; 레인 5-11: 크로노박터 뮤이젠시 2X106-2X100 CFU/mL을 접종한 우유 시료
이하 첨부된 도면과 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이러한 도면과 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에게는 당연할 것이다.
본 발명자들은 식품 중 미생물 DNA 추출에서 식품에 함유된 단백질, 지방과 같은 PCR 억제제가 잔류해 있거나, 여러 가지 물질들과 섞여 있어 미생물 DNA의 회수율이 낮아 종래의 방법이나 키트에서 저효율을 보이며, 추출 단계에서 DNA 순수분리를 방해하는 불순물을 제거하는 것으로 미생물 DNA 추출률을 증대시킬 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다. 즉, 본 발명자들은 DNA 추출을 방해하는 불순물을 제거하는 침전제를 개발하였고, 이를 사용하여 유제품으로부터 미생물 DNA를 효율적으로 추출하는 방법을 도출하였고, 추출한 DNA로 PCR을 수행하여 정확하게 미생물 검출 여부를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 완성 과정에서, 실제 다양한 성분과 성분비로 침전제 조성물을 제조하고, 이를 종래 알려진 유제품에서 DNA 분리하는 방법(예를 들면 Milk Bacterial DNA Isolation Kit(Norgen Biotek Corporation, Ontario, Canada)를 활용한 방법)에 적용하여 최적의 침전제 조성물을 결정하는 복잡다단한 과정이 먼저 수행되었다. 그러나 침전제 조성물을 결정하는 과정에 본 발명자들 고유의 노하우가 담겨져 있기에 이하에서는 위 과정을 거쳐 확정된 침전제 조성물을 기본으로 하여 설명하기로 한다. 즉, ⓐ 본 발명에 의한 침전제 조성물의 제조, ⓑ 종래 알려진 유제품에서 DNA를 분리하는 방법에 상기 침전제 조성물을 적용한 것과 하지 않은 것의 차이 확인, ⓒ 상기 침전제 조성물을 포함하는 개선된 DNA 분리방법 및 이에 사용되는 다른 버퍼들의 조성, 이러한 순서로 설명한다(실시예의 순서도 이에 준함).
(1) 침전제 조성물 관련 발명
전술하였듯이 본 발명은, 시료 중의 세포를 용해하여 이로부터 DNA를 추출하는 과정에서 DNA 순수분리를 저해하는 불순물들을 침전시켜 제거하기 위한 용도로 사용되는 것으로서, 2.0~3.0 %(w/v) Phosphotungstic acid hydrate (순도 65.0~70.0%), 1.2~1.8 %(w/v) Zinc acetate dihydrate, 13.0~19.0 %(v/v) Acetic acid 및 나머지가 물인 것을 특징으로 하는 불순물 침전제 조성물에 관한 것이다. 즉, Phosphotungstic acid hydrate와 Zinc acetate dihydrate가 용해된 상태에서 Acetic acid를 첨가하고 나머지는 물을 가하여 최종 조성물 부피가 100%가 되도록 하였다.
상기 침전제 조성물의 조성은 최적 조건을 찾아내기 위하여 실험설계부터 결과 분석까지 통계적으로 최적화하여 실험할 수 있도록 널리 사용되는 반응표면분석법(Response Surface Methodology; RSM) 통계기법을 이용해서 최적의 침전 조건 범위를 설정하였다. 각 침전제의 조성비에 따른 침전 효과의 결과를 통계기법으로 분석하여 침전율이 좋은 최적의 배합비를 효율적으로 구하였다.
(2) 상기 침전제 조성물이 적용된 DNA 추출방법
또한 본 발명은, 예를 들면 유화 식품으로부터 미생물 DNA를 고효율로 추출하기 위해 상기 침전제 조성물을 활용한 DNA 추출방법을 제공한다: 구체적으로는 (A) 시료액에 세포 용해 버퍼(lysis buffer)를 첨가하여 세포를 용해하는 단계; (B) 상기 용해된 시료액에 상기 (1)에서 제조한 침전제 조성물을 첨가하여 불순물을 침전시키는 단계; (C) 이어서, 상기 시료액 중 침전물을 제외한 상등액을 실리카 막 컬럼에 옮겨 DNA를 고정하는 단계; (D) 이어서 세척 버퍼(washing buffer)를 사용하여 상기 컬럼을 세척하는 단계; (E) 이어서 DNA 용출 버퍼(elution buffer)를 상기 컬럼에 가하여 DNA를 용출하는 단계;를 포함한다.
본 발명에 의한 DNA 추출방법에서 위 3종의 DNA 추출용 버퍼 즉, 세포 용해 버퍼, 세척 버퍼 및 DNA 용출 버퍼로 구성되는데, 이들의 조성은 다음과 같은 것이 바람직하다.
ⓐ 세포 용해 버퍼 ; 0.4~0.6 %(w/v) N-laurylsarcosine, 25~35mM Tris-HCl(pH 8.0±0.2), 13~17mM EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0±0.2), 2.5~3.5M Guanidine thiocyanate
ⓑ 세척 버퍼 ; 9~11mM Tris-HCl(Tris hydrochloride, pH 8.0±0.2)과 75~85% Ethanol
ⓒ 용출 버퍼 ; 9~11mM Tris-HCl(Tris hydrochloride, pH 8.0±0.2)과 0.9~1.1mM EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0±0.2)
이와 같은 본 발명의 DNA 추출방법은 상기 DNA 추출용 버퍼를 사용한 기본적인 컬럼 기반의 DNA 추출과정에서 침전제를 통한 불순물 제거 단계를 추가로 포함한다. DNA 추출용 버퍼와 침전제를 사용한 추출과정에서 침전제는 DNA 이외의 불순물을 효과적으로 제거함으로써 고순도의 DNA를 추출할 수 있다. 하기 실시예에서 알 수 있듯이, 상기 침전제 사용 여부에 따른 DNA 추출 효율이 종래방법에 비해 우수하였으며, 추출된 DNA 순도(A260/280)도 현저하게 향상됨을 확인하였다.
또한, 본 발명의 추출 방법과 우유로부터 미생물 DNA를 추출할 수 있는 기존 상용화 키트를 사용하여 DNA 추출 효율을 비교한 결과, 본 발명의 추출방법을 사용했을 경우 같은 시료와 양으로부터 더 높은 효율로 DNA를 추출할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 추출 방법을 사용하여 세균 수에 따른 DNA 검출한계를 확인한 결과, 2X101 CFU/mL까지 검출되었고 이것은 시료(우유) 1 mL에 미생물이 2X101 CFU(Colony Forming Unit; 집락형성단위)의 낮은 농도로 존재해도 검출 가능함을 의미한다.
따라서 본 발명에 의한 침전제 및 DNA 추출방법은 유화 식품에 낮은 농도로 존재하는 미생물 DNA도 검출할 수 있으므로 식품 내 미생물 검출 분석에 유용하게 활용할 수 있다.
[실시예]
1. 미생물 배양 및 균수 측정
하기 표 1에서와 같이 미생물 4종을 각각의 배지에서 36℃, 약 17시간 배양하고 균수를 측정하였다.
멸균우유를 사용하여 상기 배양액을 10-1-10-6 범위로 희석한 후 10-4-10-6으로 희석한 배양액 100 μL를 plate count agar (PCA, BD Difco) 배지에 도말하여 36℃에서 24시간 배양한 후 균수를 측정하였다.
2. 본 발명에 의한 침전제 조성물
2.0~3.0 %(w/v) Phosphotungstic acid hydrate (순도 65.0~70.0%), 1.2~1.8 %(w/v) Zinc acetate dihydrate, 13.0~19.0 %(v/v) Acetic acid 및 나머지는 순수로 이루어진 침전제 조성물을 제조하였다.
3. 본 발명의 효과 확인 : 적용예1 및 비교예1
먼저, 타사 제품인 기존 상용화 키트 Milk Bacterial DNA Isolation Kit (Norgen Biotek Corp.)를 사용하여 제작사의 지침에 따라 DNA를 추출한 것(비교예1)과, 상기 키트 및 지침을 기본으로 하여 본 발명에 의한 침전제 조성물 사용단계를 추가하여 DNA를 추출한 것(적용예1)의 추출된 DNA 양과 순도를 비교하였다.
위 1에서 배양한 미생물의 균수를 8 log CFU/mL로 조정하고 이 배양액을 멸균우유에 인위적으로 접종하여 희석한 것을 시료로 하였다(이하 동일).
(1) 비교예1
기존 상용화 키트인 Milk Bacterial DNA Isolation Kit의 DNA 추출과정은 다음과 같다.
① 시료 1 mL을 14,000rpm에서 3분간 원심분리하고, 상층 용액을 제거한 후 Buffer SK 400 μL를 가하고 잘 섞어준다.
② 세포 용해 후 96-100% 에탄올 200 μL를 가하고 섞은 후, 용액을 컬럼으로 옮겨 14,000rpm에서 2분간 원심분리하였다.
③ 컬럼을 통과한 용액은 제거하고 Buffer SK 500 μL를 가한 후 14,000rpm에서 2분간 원심분리하였다.
④ 컬럼을 통과한 용액은 제거하고 Wash Solution A를 500 μL 가한 후, 14,000rpm에서 1분간 원심분리하였다. 이 과정을 2회 반복하였고, 컬럼 건조를 위해 14,000rpm에서 2분간 공회전하였다.
⑤ 컬럼을 새 튜브에 옮겨 Elution buffer B를 100 μL 가한 후 2,000rpm에서 2분간 원심분리하여 최종 DNA를 용출하였다.
(2) 적용예1
위 2에서 제조한 침전제를 처리하는 과정을 추가하는 것을 제외하고는 위 (1) 비교예1과 동일하게 진행하였다. 구체적으로는 (1) 비교예1에서 ①의 용액에 상기 침전제 20 μL를 가하고 섞은 후, 13,000rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상층 용액을 새 튜브에 옮긴 후 비교예1 ②의 에탄올 200 μL를 가하고 섞는 과정 이후부터 동일하게 진행하였다.
(3) 결과 검토
이렇게 추출된 DNA의 농도와 순도를 측정하여 다음 표 2에 나타내었다.
DNA 농도와 순도는 분광광도계(NP80 NanoPhotometer UV/Vis Spectrophotometers (Implen))로 DNA 용출 버퍼를 사용하여 blank를 맞추고, 추출한 DNA 2 μL를 사용하여 측정하였다.
DNA 순도는 260nm와 280nm에서 흡광도를 측정하여 A260/280 비율로 확인하였다(이하 동일). A260/280 값이 1.8~2.1인 경우 순수한 핵산이라 판정한다.
표에서 확인되듯이, 본 발명의 적용예1에 의하면 기존 상용화 키트로 추출한 것(비교예1)에 비해 추출된 DNA의 농도(양)가 모두 증가되어 추출되었다. DNA 순도(A260/280) 경우에는 적용예1에서 모두 1.8 이상의 값으로, 비교예1의 결과와는 달리 가장 좋은 순도(A260/280)를 나타내는 1.8-2.1 범위에 해당하였다.
즉, 본 발명에 의한 추출방법(적용예1)에 의하면 기존 상용화 키트를 이용한 추출방법(비교예1)과 거의 동일하거나 좀 더 높은 농도(양)로 추출되지만, DNA 순도의 경우에는 고순도로 추출됨에 따라 본 발명의 추출방법은 고농도, 고순도 DNA를 추출할 수 있어 추출 효율이 더 우수한 방법임을 확인할 수 있다.
4. 다른 프로토콜에 대한 적응성 확인
이상에서는 종래기술(상용화된 키트)과의 비교를 위해 침전제를 적용하는 과정을 제외한 다른 과정을 종래기술의 그것을 차용하여 본 발명의 추출방법을 분석·검토하였다는 점에서 다소 제약이 있었다. 이에 종래기술의 프로토콜 이외의 다른 방법을 확립하여 본 발명이 효과적으로 다량의 DNA를 고순도로 추출할 수 있는지 확인하였다.
이를 위해 종래 상용화된 키트의 버퍼(그 조성은 공개되어 있지 않음)를 대체하는 DNA 추출용 버퍼를 제조하였고, 구체적인 추출과정도 변경한 프로토콜을 적용하여 실험하였다.
(1) DNA 추출용 버퍼 제조
DNA 추출용 버퍼는 3가지 즉, 세포 용해 버퍼(lysis buffer), 세척 버퍼(washing buffer), DNA 용출 버퍼(elution buffer)를 제조하였다.
세포 용해 버퍼는 0.4~0.6 %(w/v) N-laurylsarcosine, 25~35mM Tris-HCl(pH 8.0±0.2), 13~17mM EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0±0.2), 2.5~3.5M Guanidine thiocyanate의 조성으로 제조하였다.
세척 버퍼는 9~11mM Tris-HCl(Tris hydrochloride, pH 8.0±0.2)과 75~85% Ethanol을 사용하여 제조하였다.
DNA 용출 버퍼는 9~11mM Tris-HCl(Tris hydrochloride, pH 8.0±0.2)과 0.9~1.1mM EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0±0.2)를 사용하여 제조하였다.
(2) 변형된 프로토콜
기재를 생략하였지만, 상기 (1)의 버퍼와 본 발명의 침전제를 사용하여 반복적인 추출실험을 하면서 다음과 같이 부분적으로 최적화된 변형 프로토콜을 확립하였다.
<비교예2>
① 시료 1 mL을 13,000rpm에서 5분간 원심분리하고, 상층 용액을 제거한 후 세포 용해 버퍼 500 μL를 가하고 65℃에서 10분간 용해시켰다.
② 과정 ①의 용액을 실리카 막 컬럼으로 옮기고 13,000rpm에서 1분간 원심분리하였다.
③ 컬럼을 통과한 용액은 제거하고 세척용 버퍼 500 μL를 가한 후, 13,000rpm에서 1분간 원심분리하였다. 이 과정을 2회 반복하였고, 컬럼 건조를 위해 13,000rpm에서 3분간 공회전하였다.
④ 컬럼을 새 튜브에 옮겨 DNA 용출 버퍼 100 μL를 가하고 상온에서 5분간 둔 후 13,000rpm에서 1분간 원심분리하여 최종 DNA를 용출하였다.
<적용예2>
위 (2) 비교예2에서 상기 침전제를 처리하는 과정을 추가하여 진행하였다. 구체적으로는 (2) 비교예2에서 ①의 용액에 상기 침전제 20 μL를 가하고 섞은 후, 13,000rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상층 용액을 비교예2 ②의 실리카 막 컬럼으로 옮기는 과정 이후부터 동일하게 진행하였다.
(3) 결과 검토
이렇게 추출된 DNA의 농도와 순도를 측정하여 다음 표 3에 나타내었다.
표에서 확인되듯이, 대체 프로토콜에 의하더라도, 침전제를 사용한 본 발명에 의한 적용예2에 의하면 침전제를 사용하지 않고 추출한 것(비교예2)에 비해 추출된 DNA의 농도(양)가 모든 미생물에서 대략 150~300% 가량 증가되어 다량 추출되었으며, DNA의 순도(A260/280)도 모두 2.1 이하의 값으로, 가장 좋은 순도(A260/280)를 나타내는 1.8-2.1 범위에 해당하였다.
5. 본 발명의 특성 분석
앞선 실험으로 본 발명에 의한 DNA 추출과정 중 침전제를 처리하는 방법(적용예1)은 기존에 널리 활용되는 상용화된 키트를 이용한 추출방법(비교예1)에 비해 DNA 추출효율이 월등히 우수함을 확인하였다. 또한, 새로운 DNA 추출버퍼를 사용한 변형된 추출방법(비교예2)에서도 침전제를 사용한 추출방법(적용예2)이 동일하거나 더 높은 추출효율을 보였다.
이렇게 추출된 DNA를 후속과정 즉, 증폭을 위한 주형으로 사용 가능한 지와, 본 발명에 의한 추출방법의 검출한계에 대해 분석하였다.
(1) 추출된 DNA를 활용한 PCR 분석 확인
상기 실험 결과를 통해 확립한 추출방법을 사용하여 추출한 DNA가 PCR 분석 시 이상이 없는지 확인하기 위해 적용예2에 의해 획득된 DNA를 이용하여 PCR을 수행하였다.
PCR은 T100 Thermal Cycler (Biorad) 기기로 수행하였다. 프라이머 염기서열은 Fratamico, 2003 (Salmonella typhimurium). Jang et al., 2020 (Cronobacter), Xu et al., 2004 (Pseudomonas aeruginosa) 논문을 참고하였다.
PCR 조성은 DreamTaq PCR Master mix (Thermo Fisher Scientific) 10 μL, 10 μM 정방향 및 역방향 프라이머 1 μL 씩, DNA 1 μL, 멸균증류수 7 μL로 구성하였다. PCR 반응조건은 95℃에서 3분을 1 사이클; 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분을 1 사이클로 하여 총 35 사이클; 72℃에서 5분을 1 사이클로 반응시켰다.
전기영동은 E-gel power snap electrophoresis system (Thermo fisher scientific)을 사용하였고, 1Kb Plus DNA ladder (Thermo fisher scientific)와 2% E-Gel EX agarose gel (Invitrogen by Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 분석하였다.
PCR 후 전기영동 결과를 도 1~4에 도시하였다. 도면에서 확인되듯이, S. typhimurium은 796 bp (invA gene)에서 증폭되었고(도 1), C. sakazakii는 302 bp (γ1a fimbriae gene), C. muytjensii는 210 bp (γ1a fimbriae gene)에서 확인되었으며(도 2, 3), P. aeruginosa는 504 bp (oprL(outer membrane lipoprotein) gene)에서 증폭(도 4)되었다. 이상과 같이 4종의 미생물에 대한 적용예2의 추출 DNA 모두가 각각 타겟 유전자에서 증폭되었으므로, 본 발명의 추출법에 따라 추출한 DNA는 PCR 분석 시 이상 없음을 확인하였다.
(2) 세균 수에 따른 DNA 추출 검출한계 확인
본 발명에 의한 미생물 DNA 추출방법은 증균 과정을 거치지 않기 때문에 DNA 추출 효율과 검출한계(limit of detection)는 중요하다. 따라서 본 발명에 의한 적용예2의 추출방법으로 세균 수에 따른 DNA 추출 및 PCR을 수행하여 최종 검출한계를 확인하였다.
본 발명에 따른 미생물 DNA 추출방법의 검출한계를 확인하기 위해 각각 S. typhimurium과 C. muytjensii 배양액을 멸균우유로 십진 희석(2X106 ~ 2X100 CFU/mL)하고 각 희석배수에서 1 mL을 채취하여 전술한 적용예2와 같은 방법으로 DNA를 추출하였고, 위 (1)에 기재된 방법에 따라 PCR 분석을 수행하였다.
이러한 DNA 추출 및 PCR 분석 결과를 도 5, 6 및 아래 표 4에 나타내었다. 도면과 표에서 알 수 있듯이, 본 발명에 따른 미생물 DNA 추출방법의 검출한계는 S. typhimurium과 C. muytjensii 모두에서 2X101 CFU/mL로 나타났는데, 이것은 우유 1 mL에 미생물이 2X101 CFU(Colony Forming Unit; 집락형성단위)의 낮은 농도로 존재해도 검출 가능함을 의미한다.
따라서 본 발명에 의한 추출방법(적용예1, 2)에 의하면 기존 상용화 키트를 이용한 추출방법(비교예1) 또는 이를 변형시킨 추출방법(비교예2)과 동일하거나 더 우수한 고순도 DNA가 추출되며, 또한 월등히 높은 DNA 농도(양)로 추출됨을 알 수 있다. 이는 본 발명에 의한 침전제 조성물, 본 발명에 의한 DNA 추출방법이 종래기술에 비해 우수한 효과를 나타내며, 추가적인 최적화 과정을 거친다면 더욱 우수한 효과를 나타낼 수 있음을 보여주는 것이다.

Claims (5)

  1. 시료 중의 세포를 용해하여 이로부터 DNA를 추출하는 과정에서 DNA 순수분리를 저해하는 불순물들을 침전시켜 제거하기 위한 용도로 사용되는 것으로서,
    2.0~3.0 %(w/v) Phosphotungstic acid hydrate (순도 65.0~70.0%), 1.2~1.8 %(w/v) Zinc acetate dihydrate, 13.0~19.0 %(v/v) Acetic acid 및 나머지가 물인 것을 특징으로 하는 불순물 침전제 조성물.
  2. (A) 시료액에 세포 용해 버퍼(lysis buffer)를 첨가하여 세포를 용해하는 단계;
    (B) 상기 용해된 시료액에 청구항 1에 의한 침전체를 첨가하여 불순물을 침전시키는 단계;
    (C) 이어서, 상기 시료액 중 침전물을 제외한 상등액을 실리카 막 컬럼에 옮겨 DNA를 고정하는 단계;
    (D) 이어서 세척 버퍼(washing buffer)를 사용하여 상기 컬럼을 세척하는 단계;
    (E) 이어서 DNA 용출 버퍼(elution buffer)를 상기 컬럼에 가하여 DNA를 용출하는 단계;를 포함하는 DNA 추출방법.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 용해 버퍼는, 0.4~0.6 %(w/v) N-laurylsarcosine, 25~35mM Tris-HCl(pH 8.0±0.2), 13~17mM EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0±0.2), 2.5~3.5M Guanidine thiocyanate로 이루어지며,
    상기 세척 버퍼는, 9~11mM Tris-HCl(Tris hydrochloride, pH 8.0±0.2)과 75~85% Ethanol로 이루어지며,
    상기 용출 버퍼는, 9~11mM Tris-HCl(Tris hydrochloride, pH 8.0±0.2)과 0.9~1.1mM EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0±0.2)로 이루어지는 것을 특징으로 하는 DNA 추출방법.
  4. 청구항 2 또는 3에 있어서,
    상기 시료는 유화식품 또는 유화식품에서 분리된 것을 특징으로 하는 DNA 추출방법.
  5. 청구항 2 또는 3에 의한 추출방법에 따라 추출된 DNA를 주형으로 하는 것을 특징으로 하는 DNA 증폭방법.
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