CN118159652A - Dna提取用沉淀剂组合物及使用其的dna提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种有效去除阻碍微生物DNA分离纯化的物质的沉淀剂组合物及使用该沉淀剂的高浓度、高纯度DNA提取方法，具体涉及一种杂质沉淀剂组合物、使用所述沉淀剂组合物的DNA提取方法及由此提取的DNA的扩增方法，其中所述杂质沉淀剂组合物用于在将试样中的细胞裂解并从中提取DNA的过程中沉淀和去除阻碍DNA分离纯化的杂质，其包含，由1.3～2.1％(w/v)磷钨酸水合物(Phosphotungstic acid hydrate)、1.2～1.8％(w/v)乙酸锌二水合物(Zinc acetate dihydrate)、13.0～19.0％(v/v)乙酸(Acetic acid)，余量为水。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于从乳化食品等试样提取微生物DNA的沉淀剂组合物及使用其的DNA提取方法，具体涉及一种有效去除阻碍微生物DNA分离纯化的物质的沉淀剂组合物及使用该沉淀剂的高浓度、高纯度DNA提取方法。
背景技术
随着食品安全事故的增多，食品安全是人类的共同课题，日益成为全球关注的重要问题。食品安全危害因素可分为微生物因素、化学因素和物理因素，其中微生物占因素占大多数。由于微生物产生的风险对人类健康具有直接严重的影响，而微生物引起的疾病正在引起全世界的关注，并且正在进行大量的研究以进行有效的管理。
乳制品如牛奶、发酵乳、奶酪、奶粉等，及由水溶性成分和脂溶性成分充分分散、混合而成的乳化食品如豆奶、巧克力、冰淇淋等是含有蛋白质、脂肪、维生素和矿物质的高营养食品，是微生物容易生长的环境。因此，在生产、运输、销售等整个过程中，很容易受到有害微生物的污染。然而，微生物在食品中微量存在，且与多种物质混合，使得微生物DNA的分离和检测变得困难。因此，检测食品中微生物的方法必须能够准确检测少量的细菌。
培养基培养法是检测微生物的传统方法，是通过在适当的条件下培养食品中的微生物来直接鉴定富集微生物的方法。然而，该培养法不仅需要大量的劳动力和较长的时间，而且由于假阳性结果频繁且敏感性低而具有局限性。为了弥补这些局限性，正在开发快速且简单的检测方法。
基于分子生物学的聚合酶链式反应(PCR)技术广泛应用于食品分析，因为该技术可以比培养法更高的灵敏度检测极少量的微生物，并且由于可以扩增提取的DNA的特定部分而具有高特异性。还可以使用蛋白质的免疫学方法，例如酶联免疫吸附试验(ELISA，Enzyme-linked Immunosorbent Assay)，该方法可以进行现场测试，但其灵敏度和重现性较低。
不幸的是，食品通常含有抑制DNA扩增的PCR抑制剂，例如脂肪、蛋白质和钙。据报道，从乳制品中去除PCR抑制剂并提取适合分析的DNA是一个常见问题，因此提取足够浓度和纯度的DNA非常重要。因此，为了成功地对从食品中提取的微生物DNA进行PCR分析，在DNA提取过程中去除PCR抑制因素非常重要。当从乳制品等乳化食品中提取微生物DNA时，食品中含有的蛋白质和脂肪会在DNA分离纯化(pure isolation)和PCR反应中起到抑制剂的作用，因此在DNA提取过程中必须将其去除。
并且，微生物检测方法必须能够准确检测食品中微量存在的细菌，检测所需细菌的最低浓度称为检测限(limit of detection)。进行PCR时影响检测限的因素之一是DNA浓度和纯度。因此，如果DNA提取过程中存在污染或提取效率低，则可能难以进行PCR，因此选择合适的DNA提取方法进行分析非常重要。
现有的DNA提取方法使用苯酚。这是一种使用苯酚/氯仿或苯酚/氯仿/异戊醇(phenol/chloroform/isoamyl alcohol)提取和分离DNA的方法，该方法需要很长时间并且需要非常小心，因为它使用对人体有害的试剂，例如苯酚。由于这些缺点，人们正在开发比现有提取方法更简单、更有效的提取方法。目前，使用特异性结合DNA的硅胶膜(silicamembrane)或玻璃纤维(glass fiber)的柱式DNA提取方法因其快速、方便而被广泛使用。
例如，用于从牛奶或奶酪样品中提取微生物DNA的市售试剂盒包括牛奶细菌DNA提取试剂盒(Norgen Biotek Corporation，加拿大安大略)或PowerFoodTM微生物DNA提取试剂盒(MoBio Laboratories Inc.，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。尽管这些试剂盒由于能够通过简单方便的方案提取DNA而被广泛使用，但由于食品中蛋白质等抑制剂和杂质等，从牛奶中提取微生物DNA仍然存在提取效率低的问题。
发明的内容
发明要解决的技术问题
本发明的一目的在于提供一种沉淀剂，其能够有效去除在使用硅胶膜柱进行DNA提取时阻碍DNA分离纯化的杂质，以高效地从乳化食品中提取微生物DNA。
本发明的另一目的在于提供一种通过应用所述沉淀剂并使用硅胶膜柱提取微生物DNA的方法。
用于解决问题的技术方案
用于实现上述目的的本发明涉及一种杂质沉淀剂组合物、使用所述沉淀剂组合物的DNA提取方法及由此提取的DNA的扩增方法，其中所述杂质沉淀剂组合物用于在将试样中的细胞裂解并从中提取DNA的过程中沉淀和去除阻碍DNA分离纯化的杂质，其包含，由1.3～2.1％(w/v)磷钨酸水合物、1.2～2.8％(w/v)乙酸锌二水合物、13.0～19.0％(v/v)乙酸，余量为水。
发明的效果
如上所述，根据本发明，能够使用沉淀剂有效地去除阻碍DNA分离纯化的杂质，并且可以提取比常规方法更高浓度和纯度的DNA。
并且，根据本发明，能够从乳化食品中以高浓度和高纯度提取微生物DNA，与常规方法相比，即使食品中的微生物浓度较低，也能够有效且准确地检测微生物。
附图说明
图1为对实施例中提取的鼠伤寒沙门菌DNA进行PCR后进行的电泳照片。
泳道1和7：1Kb Plus DNA梯度(DNA Ladder)；泳道2：无模板对照(NTC，NonTemplate Control)；泳道3和4：对照(牛奶)；泳道5和6：对牛奶接种鼠伤寒沙门菌1/5的牛奶试样
图2为对实施例中提取的阪崎克罗诺杆菌DNA进行PCR后进行的电泳照片。
泳道1和7：1Kb Plus DNA梯度；泳道2：无模板对照(NTC，Non Template Control)；泳道3和4：对照(牛奶)；泳道5和6：对牛奶接种阪崎克罗诺杆菌1/5的牛奶试样。
图3为对实施例中提取的莫氏克罗诺杆菌DNA进行PCR后进行的电泳照片。
泳道1和7：1Kb Plus DNA梯度；泳道2：无模板对照(NTC，Non Template Control)；泳道3和4：对照(牛奶)；泳道5和6：对牛奶接种莫氏克罗诺杆菌1/5的牛奶试样。
图4为对实施例中提取的铜绿假单胞菌DNA进行PCR后进行的电泳照片。
泳道1和7：1Kb Plus DNA梯度；泳道2：无模板对照(NTC，Non Template Control)；泳道3和4：对照(牛奶)；泳道5和6：对牛奶接种铜绿假单胞菌1/5的牛奶试样。
图5为实施例5中对根据鼠伤寒沙门菌细菌数量提取的DNA进行PCR后进行的电泳照片，以确认检测限。
泳道1：1Kb Plus DNA梯度；泳道2：无模板对照(NTC，Non Template Control)；泳道3：对照(牛奶)；泳道4：对牛奶接种鼠伤寒沙门菌1/5的牛奶试样；泳道5～11：接种鼠伤寒沙门菌2X106～2X100 CFU/mL的牛奶试样。
图6为实施例5中对根据莫氏克罗诺杆菌细菌数量提取的DNA进行PCR后进行的电泳照片，以确认检测限。
泳道1：1Kb Plus DNA梯度；泳道2：无模板对照(NTC，Non Template Control)；泳道3：对照(牛奶)；泳道4：对牛奶接种莫氏克罗诺杆菌1/5的牛奶试样；泳道5～11：接种莫氏克罗诺杆菌2X106～2X100 CFU/mL的牛奶试样。
具体实施方式
下面将参考附图和实施例对本发明进行更详细地说明。然而，这些附图和实施例仅仅是为了容易地解释本发明的技术思想的内容和范围的示例，并且本发明的技术范围不由此受到限制或改变。对于本领域技术人员来说显而易见的是，基于这些示例在本发明的技术思想的范围内可以进行各种修改和改变。
本发明人发现，在从食品中提取微生物DNA时，由于食品中残留或与各种物质混合含有蛋白质、脂肪等PCR抑制剂，导致微生物DNA的回收率较低，致使传统方法或试剂盒效率较低，可以通过去除阻碍DNA分离纯化的杂质来提高微生物DNA的提取率，由此完成了本发明。即，本发明人开发了一种去除阻碍DNA提取的杂质的沉淀剂，利用其导出一种从乳制品中有效提取微生物DNA的方法，并对提取的DNA进行PCR以确认微生物是否被准确检测，从而完成了本发明。
在完成本发明的过程中，首先进行复杂的多步骤流程，制备实际上具有各种成分和成分比的沉淀剂组合物，并将其应用于从先前已知的乳制品中分离DNA的方法(例如，使用牛奶细菌DNA提取试剂盒(Norgen Biotek Corporation，加拿大安大略)的方法)，从而确定最佳沉淀剂组合物。然而，由于确定沉淀剂组合物的过程涉及发明人的独特技术，因此将基于通过上述过程确定的沉淀剂组合物进行以下说明。即，按照如下顺序进行说明：本发明的沉淀剂组合物的制备，/>确认使用和不使用所述沉淀剂组合物从先前已知的乳制品中分离DNA的方法之间的差异，/>包含所述沉淀剂组合物的改良的DNA分离方法及其中使用的其他缓冲液的成分。
(1)与沉淀剂组合物相关的发明
如上所述，本发明涉及一种杂质沉淀剂组合物，用于在将试样中的细胞裂解并从中提取DNA的过程中沉淀和去除阻碍DNA分离纯化的杂质，其包含，由1.3～2.1％(w/v)磷钨酸水合物、1.2～1.8％(w/v)乙酸锌二水合物、13.0～19.0％(v/v)乙酸，余量为水。换言之，在磷钨酸水合物和乙酸锌二水合物溶解的状态下添加乙酸，加水至最终组合物体积为100％。如果试剂的纯度较低，自然可以调整试剂的含量来反映纯度。例如，当如实施例中使用纯度为65～70％的磷钨酸水合物时，可以通过将其换算为2.0～3.0％(w/v)来调整磷钨酸水合物的实际使用量。
所述沉淀剂组合物的成分是通过使用广泛使用的响应面分析法(ResponseSurface Methodology；RSM)设定最佳沉淀条件范围的，该方法从实验设计到结果分析进行统计优化从而找到最佳条件。利用统计技术分析根据每种沉淀剂的成分比的沉淀效果结果，以有效地获得具有良好沉淀率的最佳混合比例。
(2)使用所述沉淀组合物的DNA提取方法
并且，本发明还提供了一种利用所述沉淀剂组合物从乳化食品中高效提取微生物DNA的DNA提取方法，具体地包括如下步骤：(A)向试样溶液添加细胞裂解缓冲液(lysisbuffer)，以使细胞裂解；(B)向裂解后的所述试样溶液添加在所述(1)中制备的沉淀剂，以使杂质沉淀；(C)接下来，将所述试样溶液中除沉淀物之外的上清液转移至硅胶膜柱，以固定DNA；(D)然后，使用清洗缓冲液(washing buffer)清洗所述柱；及(E)最后，将DNA洗脱缓冲液(elution buffer)加入所述柱，以洗脱DNA。
本发明的DNA提取方法由上述三种DNA提取用缓冲液，即细胞裂解缓冲液、清洗缓冲液和DNA洗脱缓冲液组成，并且它们的成分优选如下：
细胞裂解缓冲液：0.4～0.6％(w/v)N-月桂基肌氨酸(N-laurylsarcosine)、25～35mM Tris-HCl(pH 8.0±0.2)、13～17mM EDTA(乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid)，pH 8.0±0.2)、2.5～3.5M硫氰酸胍；
清洗缓冲液：9～11mM Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Trishydrochloride)，pH 8.0±0.2)和75～85％乙醇(Ethanol)；
洗脱缓冲液：9～11mM Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，pH 8.0±0.2)和0.9～1.1mM EDTA(乙二胺四乙酸，pH 8.0±0.2)。
本发明的DNA提取方法进一步包括用于在使用DNA提取用缓冲液的基于基本柱的DNA提取过程中使用沉淀剂去除杂质的步骤。在使用DNA提取用缓冲液和沉淀剂的提取过程中，沉淀剂可以有效去除DNA以外的杂质来提取高纯度的DNA。从以下实施例中可以看出，使用所述沉淀剂的DNA提取效率优于常规方法，并且提取的DNA的纯度(A260/280)也显着提高。
并且，通过比较使用本发明的提取方法和现有的可从牛奶中提取微生物DNA的市售试剂盒的DNA提取效率，确认到当使用本发明的提取方法时，可以从相同的试样和量中以更高的效率提取DNA。
使用本发明的提取方法确认根据细菌数量的DNA检测限，结果能够检测出低达2X101 CFU/mL，这意味着即使微生物在1mL试样(牛奶)中以2X101 CFU(Colony FormingUnit；菌落形成单位)的低浓度存在，也能够检测到。
因此，本发明的沉淀剂和DNA提取方法能够检测乳化食品中低浓度存在的微生物DNA，并且能够有效地用于食品中微生物的检测和分析。
实施例
1.微生物培养和细菌数量测定
如下表1所示，将四种微生物在每种培养基中于36℃培养约17小时，并测定细菌数量。
表1
使用灭菌牛奶将所述培养物稀释至10-1～10-6范围后，将100μL稀释至10-4～10-6的培养液涂于平板计数琼脂(PCA，BD Difco)培养基上，并在36℃培养24小时后，测定细菌数量。
2.本发明的沉淀剂组合物
制备沉淀剂组合物，其包含，2.0～3.0％(w/v)磷钨酸水合物(纯度65.0～70.0％)、1.2～1.8％(w/v)乙酸锌二水合物、乙酸13.0～19.0％(v/v)，余量为水。
3.本发明效果的确认：应用例1和比较例1
首先，使用作为其他公司产品的现有的市售试剂盒牛奶细菌DNA提取试剂盒(Norgen Biotek Corp.)，按照制造商的说明提取DNA(比较例1)，并基于上述试剂盒和说明书，增加使用本发明的沉淀剂组合物的使用步骤来提取DNA(应用例1)，比较提取的DNA的量和纯度。
将在上述1中培养的微生物的细菌数量调整为8log CFU/mL，将该培养液手动接种到灭菌牛奶中，稀释后作为试样(下同)。
(1)比较例1
现有市售试剂盒“牛奶细菌DNA提取试剂盒”的DNA提取流程如下。
①取1mL试样，14,000rpm离心3分钟，除去上层溶液后，加入400μL缓冲液SK，混匀。
②细胞裂解后，加入200μL 96～100％乙醇混匀，然后将溶液转移至柱，14,000rpm离心2分钟。
③除去过柱溶液，加入500μL缓冲液SK后，14,000rpm离心2分钟。
④除去过柱溶液，加入500μL洗涤溶液A后，14,000rpm离心1分钟。该过程重复两次，并将柱以14,000rpm空转2分钟以将其干燥。
⑤将柱转移至新管中，加入100μL洗脱缓冲液B，2,000rpm离心2分钟，洗脱最终DNA。
(2)应用例1
其过程与上述(1)中的比较例1相同，只是增加了处理上述2中制备的沉淀剂的过程。具体而言，(1)在比较例1中，将20μL所述沉淀剂添加至①中的溶液中，混匀后，13,000rpm离心5分钟。将上层溶液转移至新管中，加入200μL比较例1中②的乙醇混合，并以相同方式进行后续过程。
(3)结果评述
测定以此方式提取的DNA的浓度和纯度并示于下表2中。
使用分光光度计(NP80 NanoPhotometer UV/Vis Spectrophotometers(Implen))测定DNA浓度和纯度，使用DNA洗脱缓冲液设置空白(blank)，取2μL提取的DNA进行测定。
测定260nm和280nm处的吸光度并通过A260/280比值确认DNA纯度(下同)。如果A260/280比值为1.8～2.1，则判断为纯核酸。
表2
从表中可以看出，本发明的应用例1中所提取的DNA的浓度(量)与使用现有市售试剂盒(比较例1)提取的DNA的浓度(量)相比均有所增加。对于DNA纯度(A260/280)而言，这与比较例1的结果不同地，应用例1中的所有值均在1.8以上，相当于表示最佳纯度(A260/280)的范围1.8～2.1。
换言之，本发明的提取方法(应用例1)中提取的浓度(量)与使用现有市售试剂盒的提取方法(比较例1)相比几乎相同或略高，但对于DNA纯度而言，以高纯度提取到，由此可以确认，本发明的提取方法能够提取高浓度、高纯度的DNA，因此具有更优异的提取效率。
4.确认对其他方案的适应性
在上文中，为了与现有技术(市售试剂盒)进行比较，而除了使用沉淀剂的步骤之外的其他步骤借用现有技术中的方案来进行分析和评述，因此存在一些局限性。因此，建立了一种不同于现有技术方案的方法来确认本发明是否能够有效地提取大量高纯度的DNA。
为此，制备DNA提取用缓冲液来替代常规市售试剂盒的缓冲液(成分未公开)，并且使用改良了具体提取过程后的方案来进行实验。
(1)制备DNA提取用缓冲液
制备三种DNA提取用缓冲液：细胞裂解缓冲液(lysis buffer)、清洗缓冲液(washing buffer)、DNA洗脱缓冲液(elution buffer)。
制备由以下成分组成的细胞裂解缓冲液：0.4～0.6％(w/v)N-月桂基肌氨酸、25～35mM Tris-HCl(pH 8.0±0.2)、13～17mM EDTA(乙二胺四乙酸，pH 8.0±0.2)、2.5～3.5M硫氰酸胍。
使用以下成分制备清洗缓冲液：9～11mM Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，pH8.0±0.2)和75～85％乙醇。
使用以下成分制备DNA洗脱缓冲液：9～11mM Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，pH 8.0±0.2)和0.9～1.1mM EDTA(乙二胺四乙酸，pH 8.0±0.2)。
(2)改良后方案
尽管省略了说明，但是在使用所述(1)的缓冲液和本发明的沉淀剂进行重复提取实验，建立了部分优化的改良后方案如下。
比较例2
①取1mL试样，13,000rpm离心5分钟，除去上层溶液后，加入500μL细胞裂解缓冲液，于65℃裂解10分钟。
②将步骤①的溶液转移至硅胶膜柱，13,000rpm离心1分钟。
③除去过柱溶液，加入500μL清洗缓冲液后，13,000rpm离心1分钟。该过程重复两次，并将柱以13,000rpm空转3分钟以将其干燥。
④将柱转移至新管中，加入100μL DNA洗脱缓冲液，常温放置5分钟，然后13,000rpm离心1分钟，洗脱最终DNA。
应用例2
其过程与上述(2)中的比较例2相同，只是增加了对(2)比较例2中的①的溶液添加20μL所述沉淀剂后13,000rpm离心5分钟。将上层溶液转移至比较例2中的②的硅胶膜柱，并以相同方式进行后续过程。
(3)结果评述
测定以此方式提取的DNA的浓度和纯度并示于下表3中。
表3
从表中可以看出，即使采用替代方案，使用沉淀剂的本发明的应用例2时，与不使用沉淀剂的提取(比较例2)相比，在所有微生物中提取的DNA的浓度(量)增加约150～300％，即大量提取到，且DNA的纯度(A260/280)也均在2.1以下，相当于表示最佳纯度(A260/280)的范围1.8～2.1。
5.本发明的特征分析
通过前述实验，确认到本发明的在DNA提取过程中处理沉淀剂的方法(应用例1)与使用广泛使用的市售试剂盒的提取方法(比较例1)相比，具有显着优越的DNA提取效率。并且，使用新的DNA提取缓冲液的改良提取方法(比较例2)显示出与使用沉淀剂的提取方法(应用例2)相同或更高的提取效率。
对以此方式提取的DNA进行分析，以确定其是否可以用作后续过程(即扩增)的模板，及本发明的提取方法的检测限。
(1)使用提取的DNA进行PCR分析的确认
为了确认使用通过上述实验结果建立的提取方法提取的DNA在PCR分析是否有异常，使用应用例2中获得的DNA进行PCR。
PCR使用T100热循环仪(T100 Thermal Cycler，Biorad)进行。引物序列参考了论文Fratamico,2003(Salmonella typhimurium).Jang et al.,2020(Cronobacter),Xu etal.,2004(Pseudomonas aeruginosa)。
PCR成分由10μL DreamTaq PCR Master mix(Thermo Fisher Scientific)、10μM正向和反向引物各1μL、1μL DNA和7μL无菌蒸馏水组成。PCR反应条件为95℃3分钟1个循环；95℃30秒、55℃30秒、72℃1分钟1个循环，共35个循环；72℃5分钟1个循环。
使用E-gel power snap电泳系统(Thermo Fisher Scientific)进行电泳，并使用1Kb Plus DNA梯度(Thermo fisher scientific)和2％E-Gel EX琼脂糖凝胶(ThermoFisher Scientific的Invitrogen)进行分析。
PCR后的电泳结果如图1至图4所示。如图所示，鼠伤寒沙门菌在796bp(invA基因)处扩增(图1)，阪崎克罗诺杆菌在302bp处(γ1a菌毛基因)扩增，铜绿假单胞菌在210bp处(γ1a菌毛基因)扩增(图2和3)，铜绿假单胞菌在504bp处(oprL(外膜脂蛋白)基因)扩增(图4)。如上所述，由于应用例2提取的四种微生物的DNA均从各靶基因中扩增出来，因此证实了在PCR分析中本发明的提取方法提取的DNA没有异常。
(2)确认根据细菌数量提取的DNA的检测限
因为本发明的微生物DNA提取方法不经历富集过程，因此DNA提取效率和检测限(limit of detection)很重要。因此，使用本发明的应用例2的提取方法进行根据细菌数量的DNA提取和PCR，以确认最终的检测限。
为了确认本发明的微生物DNA提取方法的检测限，将鼠伤寒沙门菌和莫氏克罗诺杆菌培养物用灭菌牛奶进行十进制稀释(2X106～2X100 CFU/mL)，从各稀释倍数中取1mL，按照与上述应用例2同样的方法提取DNA，按照上述(1)所述的方法进行PCR分析。
DNA提取和PCR分析的结果示于图5和图6及下表4中。从图和表中可以看出，本发明的微生物DNA提取方法的检测限对于鼠伤寒沙门菌和莫氏克罗诺杆菌都是2X101 CFU/mL，这意味着即使微生物在1mL牛奶中以2X101 CFU(Colony Forming Unit；菌落形成单位)的低浓度存在，也能够检测到。
表4
+:检出,-:未检出
因此，本发明的提取方法(应用例1和2)，能够得到与使用现有市售试剂盒的提取方法(比较例1)或改良提取方法(比较例2)相同或更好的高纯度DNA，并且DNA以更高的浓度(量)被提取。这表明，与现有技术相比，本发明的沉淀剂组合物和本发明的DNA提取方法表现出优异的效果，并且如果进行额外的优化过程，能够表现出更好的效果。
Claims (5)
1.一种杂质沉淀剂组合物，用于在将试样中的细胞裂解并从中提取DNA的过程中沉淀和去除阻碍DNA分离纯化的杂质，其包含，1.3～2.1％(w/v)磷钨酸水合物、1.2～1.8％(w/v)乙酸锌二水合物、13.0～19.0％(v/v)乙酸，余量为水。
2.一种DNA提取方法，其特征在于，
包括如下步骤：
(A)向试样溶液添加细胞裂解缓冲液，以使细胞裂解；
(B)向裂解后的所述试样溶液添加权利要求1所述的沉淀剂，以使杂质沉淀；
(C)接下来，将所述试样溶液中除沉淀物之外的上清液转移至硅胶膜柱，以固定DNA；
(D)然后，使用清洗缓冲液清洗所述柱；及
(E)最后，将DNA洗脱缓冲液加入所述柱，以洗脱DNA。
3.根据权利要求2所述的DNA提取方法，其特征在于，
所述裂解缓冲液由0.4～0.6％(w/v)N-月桂基肌氨酸、25～35mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tris-HCL、13～17mM乙二胺四乙酸EDTA、2.5～3.5M硫氰酸胍组成，其中Tris-HCL的PH为8.0±0.2，EDTA的PH为8.0±0.2，
所述清洗缓冲液由9～11mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tris-HCL和75～85％乙醇组成，其中Tris-HCL的PH为8.0±0.2，
所述DNA洗脱缓冲液由9～11mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和0.9～1.1mM乙二胺四乙酸组成，其中Tris-HCL的PH为8.0±0.2，EDTA的PH为8.0±0.2。
4.根据权利要求2或3所述的DNA提取方法，其特征在于，
所述试样是乳化食品或者是从乳化食品分离的。
5.一种DNA扩增方法，使用根据权利要求2或3所述的DNA提取方法提取的DNA作为模板。
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