KR100454869B1

KR100454869B1 - Ｄｎａ 추출용 세포 용해 버퍼 및 이를 이용한 ｄｎａ 추출방법

Info

Publication number: KR100454869B1
Application number: KR10-2001-0042305A
Authority: KR
Inventors: 윤성준; 조민순
Original assignee: 주식회사 인트론바이오테크놀로지
Priority date: 2001-07-13
Filing date: 2001-07-13
Publication date: 2004-11-03
Also published as: KR20030006505A

Abstract

본 발명은 DNA 추출용 세포 용해 버퍼와 이를 이용한 DNA 추출 방법에 관한 것으로써, 보다 상세하게는 Tris-Cl, EDTA, 계면활성제(detergent), 아세트산염(salt of acetic acid), 단백질 분해효소 및 RNA 분해효소를 포함하는 DNA 추출용 세포 용해 버퍼 및 이를 이용한 DNA 추출 방법에 관한 것이다. 본 발명의 세포 용해 버퍼를 이용하면 DNA를 추출하는데 필요한 단계와 시간을 줄일 수 있고 재현성 있는 결과를 얻을 수 있다.

Description

ＤＮＡ 추출용 세포 용해 버퍼 및 이를 이용한 ＤＮＡ 추출방법{Cell lysis buffer for extracting DNA and extraction method by using thereof}

본 발명은 DNA 추출용 세포 용해 버퍼와 이를 이용한 DNA 추출 방법에 관한 것으로써, 보다 상세하게는 Tris-Cl, EDTA, 계면활성제(detergent), 아세트산염(salt of acetic acid), 단백질 분해효소 및 RNA 분해효소를 포함하는 DNA 추출용 세포 용해 버퍼 및 이를 이용한 DNA 추출 방법에 관한 것이다.

유전공학이 발전함에 따라 클로닝(Cloning), 제한효소 분석(Restriction enzyme analysis), PCR, 염기서열 분석(Sequencing) 및 기타 DNA를 이용한 실험이 급증하게 되었고, 이와 같은 실험에서는 DNA의 오염 여부가 실험에 중요한 변수로 작용하고 있다. DNA가 오염되면 서던 블럿(Southern blot) 같은 혼성화(hybridization) 반응, 효소 반응 등과 같은 화학반응을 억제하거나 방해시키며, 또한 DNA의 오염 물질은 실험하고자 하는 DNA를 분해하고 DNA의 양을 측정할 때 오류를 범하게 된다. 이런 오염 물질로는 지방과 같은 저분자 물질, 저분자 효소 저해제 뿐만 아니라 단백질과 같은 효소, 다당체(polysaccharides) 및 폴리뉴클레오타이드 등이 있다.

분자생물학 방법의 응용에 적합한 오염 없는 DNA를 얻기 위해서 상기 문제를 해결하기 위한 많은 방법이 개발되었다. DNA를 얻기 위한 전통적인 방법은 효소적 혹은 화학적 방법으로 세포를 용해하여 DNA를 녹여 오염물질인 단백질, RNA 및 기타 물질들을 제거하는 것이다(Sambrook et al., Molecular cloning; A laboratory Manual, 2nd, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring harbor, NY, 1989; F. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley-Interscience, NY, 1993). 하지만 상기 방법들은 많은 단계들을 포함하며, 그 성공 여부는 작업자의 노련성에 따라 크게 좌우된다. 따라서 이러한 방법을 반복적으로 응용하는 것은 경험이 없는 작업자의 수작업의 결과에 변화를 유발시킬 수 있다.

기존의 방법은 페놀/클로로포름 혹은 페놀/클로로포름/아이소아밀 알콜(phenol/chloroform/isoamyl alcohol)을 사용하여 DNA를 추출하는 과정과 DNA를 회수하기 위한 에탄올(혹은 아이소프로판올) 침전을 포함하여 오염원을 DNA와 분리하는 과정을 거친다. 에탄올(혹은 아이소프로판올) 침전은 페놀/클로로포름에 의해 추출된 DNA의 액상 용액으로부터 DNA를 추출하고 DNA로부터 잔여 페놀과 클로로포름을 제거한다. 또한, 에탄올 침전 과정을 통해 뉴클레오사이드 트리포스페이트(nucleoside triphosphate) 일부와 짧은(30 베이스 이하) 올리고 뉴클레오타이드들도 제거할 수 있다.

하지만 상기 페놀/클로로포름 추출 과정은 DNA를 추출하는데 많은 단계와 시간을 필요로 하고 인체에 유해한 페놀과 클로로포름을 사용하고 있어 매우 위험하다. 페놀은 피부에 닿으면 타버릴 정도로 매우 위험하고 클로로포름도 휘발성, 독성, 인화성이 매우 높다. 이런 위험한 페놀과 클로로포름을 사용하려면 후드(hood)안에서 실험을 해야하는 단점도 있다. 또한 페놀/클로로포름 추출과정을 거치면 페놀의 산화에 의해 DNA가 크게 훼손을 당하므로 새롭게 증류한(redistilled) 페놀만 사용해야 한다.

이에, 페놀/클로로포름 추출 과정과 에탄올 침전 과정을 통한 전통적인 DNA 분리 과정보다 더 효과적이고 간단하며 DNA 분리 시간을 최소화하는 방법들이 고안되어 왔다. 이러한 방법들의 예로는 기존의 페놀/클로로포름과 염석하는 방법 외에 카오트로픽 염 및 실리카 수지를 사용하는 방법, 친화성 수지를 사용하는 방법, 이온 교환 수지 크로마토그래피법 및 자기성 비드를 사용하는 방법 등이 있다(미국 특허 제5057426호, 미국특허 4923978호, EP 제0512767A1호, EP 제0515484B호, WO 제97/10331호, WO 제96/18731호).

최근에는 페놀/클로로포름 추출과 에탄올 침전 방법의 불편함을 극복하고 편리함을 도모하고자 컬럼을 이용한 키트가 게놈 DNA 추출의 기본이 되고 있는 추세이다. 이와 같은 컬럼을 통해 게놈 DNA를 추출하는 원리는 DNA와 특이하게 결합하는 유리 섬유(glass fiber)나 실리카 막(silica membrane)을 사용하는 것으로써 물 분자와 DNA와의 구조적 상호작용(structural interaction)의 원리를 이용하는 것이다. 이처럼 유리 섬유 혹은 실리카 막은 염, 단백질 및 기타 세포 내 물질과는 결합하지 않기 때문에 궁극적으로 DNA만을 순수하게 분리할 수 있다.

최근에는 유전공학이 발전함에 따라 대량의 시료를 처리해야 하는 실험이 많아지게 되었고 또한 반복적인 실험을 수행하였을 때 재현성 있는 결과를 얻을 수 있어야만 그 결과에 대하여 신뢰할 수 있으며 아울러 혈액 및 그 밖의 체액 등으로부터 게놈 DNA를 추출함에 있어서 더욱 간단하고 DNA를 추출하는데 필요한 시간을 줄일 수 있는 방법이 필요하게 되었다.

이에, 본 발명자들은 DNA를 추출하기 위한 신규한 세포 용해 버퍼를 제조하였고, 상기 버퍼를 이용하여 다양한 검체로부터 짧은 단계와 시간으로 재현성이 높게 DNA를 추출할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 DNA 추출용 세포 용해 버퍼 및 이를 이용한 DNA 추출 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 세포 용해 버퍼를 이용하여 세포 수에 따른 게놈 DNA 추출 결과에 대한 전기영동 사진이고,

레인 1 : 5 X 10⁵개 세포, 레인 2 : 3 X 10⁶개 세포,

레인 3 : 5 X 10⁶개 세포, 레인 4 : 1 X 10⁷개 세포,

도 2는 본 발명의 세포 용해 버퍼를 이용하여 추출한 게놈 DNA를 제한효소로 절단한 전기영동 사진이고,

레인 1 : 제한효소로 처리하지 않은 것, 레인 2 :BamHⅠ,

레인 3 :EcoRⅠ, 레인 4 :HincⅡ,

레인 5 :HindⅢ, 레인 6 :NcoⅠ,

도 3은 본 발명의 세포 용해 버퍼를 이용하여 추출한 게놈 DNA를 이용하여 PCR 반응을 수행한 전기영동 사진이고,

레인 1 : B16, 레인 2 : HeLa,

레인 3 : NB4, 레인 4 : SNU1,

레인 5 : SNU601,

도 4는 본 발명의 세포 용해 버퍼를 이용하여 그램 음성 세균인 살모넬라로부터 게놈 DNA를 추출한 전기영동 사진이고,

레인 1 : 3 ㎖, 레인 2 : 3 ㎖, 레인 3 : 3 ㎖,

레인 4 : 3 ㎖, 3/20, 4℃(35일 경과),

레인 5 : 3 ㎖, 3/20, 상온(35일 경과),

레인 6 : 3 ㎖, 4/13, 4℃(14일 경과),

레인 7 : 3 ㎖, 4/13, 상온(14일 경과),

도 5는 본 발명의 세포 용해 버퍼의 양에 따라 게놈 DNA 분리 효율을 비교 분석한 전기영동 사진이고,

레인 1 : 5 X 10⁵개 세포, 150 ㎕, 레인 2 : 5 X 10⁵개 세포, 300 ㎕,

레인 3 : 1 X 10⁶개 세포, 300 ㎕, 레인 4 : 3 X 10⁶개 세포, 300 ㎕,

레인 5 : 3 X 10⁶개 세포, 600 ㎕, 레인 6 : 1 X 10⁷개 세포, 600 ㎕,

도 6은 본 발명의 세포 용해 버퍼를 이용한 게놈 DNA 추출과 타사 제품(DNeasy^TMTisssue Kit, Qiagen사)을 이용한 게놈 DNA 추출을 비교 분석한 전기영동 사진이다.

레인 1, 2, 3 : 본 발명의 세포 용해 버퍼를 이용,

레인 1 : 3 X 10⁶개 세포, 레인 2 : 5 X 10⁶개 세포,

레인 3 : 1 X 10⁷개 세포,

레인 4,5,6 : 타사 제품(DNeasy^TMTisssue Kit, Qiagen사)을 이용,

레인 4 : 3 X 10⁶개 세포, 레인 5 : 5 X 10⁶개 세포,

레인 6 : 1 X 10⁷개 세포

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 DNA 추출용 세포 용해 버퍼를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 세포 용해 버퍼를 이용한 DNA 추출 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 DNA 추출용 세포 용해 버퍼를 제공한다.

본 발명의 DNA 추출용 세포 용해 버퍼는 Tris-Cl, EDTA, 계면활성제(detergent), 아세트산염(salt of acetic acid), 단백질 분해효소 및 RNA 분해효소가 용해되어 있는 수용액으로 제조된다.

상기 세포 용해 버퍼의 성분 중 계면 활성제는 Triton X-100, 사코실 설페이트(sarcosyl sulfate) 및 SDS로 구성되는 군으로부터 선택하여 사용할 수 있고, Triton X-100을 사용하는 것이 바람직하다. 또한 상기 용해 버퍼의 성분 중 아세트산염은 암모늄 아세테이트 및 소듐 아세테이트 등을 사용할 수 있고, 암모늄 아세테이트를 사용하는 것이 바람직하다.

상기 세포 용해 버퍼의 성분 중 Tris-Cl은 최종농도를 0.1 내지 0.5 M 인 것이 바람직하며, 0.25 M인 것이 더욱 바람직하다. EDTA는 최종농도 0.01 내지 0.05 M 인 것이 바람직하며, 0.05 M인 것이 더욱 바람직하다. Triton X-100은 최종농도 0.5 내지 3 중량%인 것이 바람직하며, 1 중량% 인 것이 더욱 바람직하다. 암모늄 아세테이트는 최종농도 1.5 내지 5.4 M 인 것이 바람직하며, 3.5 M인 것이 더욱 바람직하다. 단백질 분해효소는 최종농도 10 내지 50 ㎍/㎖인 단백질 분해효소 K를사용하는 것이 바람직하며, 50 ㎍/㎖ 농도인 것이 더욱 바람직하다. RNA 분해효소는 최종농도를 10 내지 50 ㎍/㎖인 RNA 분해효소 A를 사용하는 것이 바람직하며, 50 ㎍/㎖ 농도인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 DNA 추출용 세포 용해 버퍼는 DNA를 추출함에 있어서 기존의 방법보다 단계를 줄이고 또한 DNA를 추출하는데 소요되는 시간을 줄일 수 있는 장점이 있다. 또한, 세포 용해와 DNA 추출을 동시에 가능하게 하고 단백질 및 RNA를 세포 용해 단계에서 동시에 분해함으로써 각각의 분해효소를 처리하기 위한 단계와 시간을 줄일 수 있다.

본 발명의 세포 용해 버퍼를 이용한 DNA 추출 방법은,

1) 세포에 상기 세포 용해 버퍼를 첨가하여 세포를 용해하는 단계;

2) 단계 1의 용해된 세포를 컬럼에 옮겨 DNA를 고정하는 단계;

3) 단계 2의 컬럼을 세척하는 단계; 및

4) 컬럼으로부터 DNA를 회수하는 단계로 구성된다.

단계 2에 있어서 컬럼은 유리섬유 컬럼, 실리카막 컬럼 중에서 선택되어 사용될 수 있다.

기존의 DNA 추출 방법들은 여러 가지 용액을 사용하여 세포를 용해하는 단계, 용해 후 단백질을 분리하는 단계 및 DNA를 추출하는 단계 등으로 나뉘어져 있고, RNA를 제거하는 단계와 단백질 분리 단계에서는 각각의 반응 효소를 처리하여 일정 시간 효소 활성을 보이도록 반응시키는 단계들이 포함되어 있어서 시간이 많이 소요되며, 여러 단계를 거쳐야 하므로 불순물의 오염 가능성이 증가하고 반복적인 실험을 수행할 시에 재현성 있는 결과를 얻는데 어려움이 있었다. 하지만 본 발명의 세포 용해 버퍼를 이용한 DNA 추출 방법은 하나의 세포 용해 버퍼를 가지고 세포 용해와 단백질 분리, RNA 제거 및 DNA 추출을 동시에 가능하게 함으로써 DNA를 추출하는 단계를 줄이고 동시에 DNA를 추출하는데 소요되는 시간을 줄일 수 있다. 또한, 여러 단계로 나뉘었던 것을 하나의 단계에서 모두 가능케 함으로써 작업자가 범할 수 있는 실수와 오차를 줄여 재현성 있는 결과를 얻을 수 있다.

본 발명의 세포 용해 버퍼는 아주 적은 양의 세포를 가지고도 DNA 추출이 가능하고 세포 수가 많아져도 추출 효율이 일정하며(도 1참조), 또한 본 발명의 세포 용해 버퍼를 사용하여 추출한 DNA는 제한 효소에 의해 정확히 절단되고, 단백질, RNA 및 다른 효소 등에 의해 오염되어 있지 않으므로, 상기 DNA를 효소 반응이 포함된 다른 실험에 사용하여도 아무런 문제가 되지 않고(도 2참조), PCR 반응을 수행하여도 아무런 문제가 되지 않는다(도 3참조), 아울러 본 발명의 세포 용해 버퍼는 그램 음성 세균의 게놈 DNA 추출에도 적합하다(도 4참조).

본 발명의 상기 세포 용해 버퍼는 세포 수에 따라 세포 용해 버퍼의 양을 달리하면 더욱 효과적인 DNA 추출이 가능하며(도 5참조), 또한 본 발명의 세포 용해버퍼를 이용한 DNA 추출은 타사 제품을 이용한 DNA 추출보다 추출 효율이 높다(도 6참조).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 세포 용해 버퍼의 제조

<1-1> 세포 용해 버퍼의 제조 1

본 발명자들은 DNA를 추출하기 위한 세포 용해 버퍼의 바람직한 실시예로서 0.25 M Tris-Cl(pH 8.0), 0.05 M EDTA(pH 8.0), 1 중량% Triton X-100, 3.5 M 암모늄 아세테이트(pH 7.0), 50 ㎍/㎖ 농도의 단백질 분해효소 K, 50 ㎍/㎖ 농도의 RNA 분해효소 A를 포함하는 수용액을 제조하였다.

<1-2> 세포 용해 버퍼의 제조 2

DNA를 추출하기 위한 세포 용해 버퍼의 조성으로 0.5 M Tris-Cl(pH 8.8), 0.05 M EDTA(pH 8.0), 0.5 중량% 사코실 설페이트, 3.5 M 암모늄 아세테이트(pH 7.0), 50 ㎍/㎖ 농도의 단백질 분해효소 K, 50 ㎍/㎖ 농도의 RNA 분해효소 A를 포함하는 수용액을 제조하였다.

<1-3> 세포 용해 버퍼의 제조 3

DNA를 추출하기 위한 세포 용해 버퍼의 조성으로 0.25 M Tris-Cl(pH 8.0), 0.05 M EDTA(pH 8.0), 0.25 중량% SDS, 1.2 M 소듐 아세테이트(pH 5.2), 50 ㎍/㎖ 농도의 단백질 분해효소 K, 50 ㎍/㎖ 농도의 RNA 분해효소 A를 포함하는 수용액을 제조하였다.

<실시예 2> 세포 용해 버퍼를 이용한 DNA 추출

본 발명자들은 상기 실시예 1에서 제조한 본 발명의 세포 용해 버퍼를 이용한 DNA 추출을 하기와 같은 방법으로 수행하였다.

1) 동물세포를 배양한 후 1.5 ㎖ 튜브 당 각각 5 X 10⁵개, 3 X 10⁶개, 5 X 10⁶개 및 1 X 10⁷개 정도의 세포가 있는 혼탁액을 13,000 rpm으로 10-20초 동안 2-3회 원심분리하여 세포들을 회수하였다. 상기 세포들을 회수할 때 남아있는 배지는 완전히 제거해 주었다.

2) 상기 회수한 세포들을 본 발명의 세포 용해 버퍼를 300 ㎕ 첨가하였다. 이 때 세포 용해의 효율을 높이기 위해 튜브 밑 부분을 가볍게 두드려서 세포 침전물을 완전히 풀어준 뒤 세포 용해 버퍼를 첨가하였다.

3) 본 발명의 세포 용해 버퍼를 첨가한 후 70℃에서 5분간 방치하였다.

4) 상기 용해 단계에서 변성된 단백질 등이 엉켜있는 것을 풀어주어 컬럼에 잘 통과할 수 있도록 하기 위해 용해된 세포들을 2-3회 피펫팅(pipetting) 하였다.

5) 상기 용해된 세포들을 실리카(silica) 막으로 된 컬럼에 옮긴 후, 13,000 rpm에서 1분간 원심분리 하여 용액은 버리고 다시 한번 원심분리하였다.

6) 상기 컬럼에 세척 버퍼를 500 ㎕ 첨가하여 원심분리하였다. 효율을 높이기 위하여 용액을 버리고 다시 한 번 원심분리 하여 완전히 세척버퍼를 제거하여 주었다.

7) 상기 컬럼에 용출 버퍼를 200 ㎕ 첨가하여 원심분리 하였고 더 많은 양의 게놈 DNA를 얻기 위하여 용출된 용액을 다시 한번 컬럼에서 원심분리 하였다.

8) 상기 추출한 DNA는 1.2% 아가로스 젤에서 전기영동하여 EtBr로 염색한 후 관찰하였다.

그 결과, 세포수가 5 X 10⁵개일 때 7.2 ㎍/㎕ 농도의 DNA가 추출되었고, 3 X 10⁶개일 때는 13.9 ㎍/㎕, 5 X 10⁶개일 때는 13.4 ㎍/㎕, 1 X 10⁷개일 때는 19.7 ㎍/㎕ 농도의 DNA가 추출되었다. 상기 결과로 본 발명의 세포용해 버퍼는 적은 양의 세포를 가지고도 DNA 추출이 가능하고, 세포수가 많아져도 DNA의 추출 효율이 일정한 것을 알 수 있었다(도 1).

<실험예 1> 게놈 DNA의 제한효소 절단

본 발명의 세포 용해 버퍼를 사용하여 추출한 DNA가 단백질, RNA 및 다른 효소등에 의해 오염되어 있는지 확인하기 위하여 추출한 DNA를 제한효소로 절단하여 보았다. 구체적으로, 실시예 2에서 추출한 DNA를 제한효소 BamHⅠ, EcoRⅠ, HincⅡ, HindⅢ, NcoⅠ으로 각각 절단하였고, 1.2% 아가로스 젤에서 전기영동하여 EtBr로 염색한 후 관찰하였다.

그 결과, 본 발명의 세포 용해 버퍼를 사용하여 추출한 게놈 DNA는 제한 효소에 의해 절단되었고, 단백질, RNA 및 다른 효소 등에 의해 오염되어 있지 않으므로, 상기 DNA를 효소 반응이 포함된 다른 실험에 사용하여도 아무런 문제가 되지 않는다는 것을 알 수 있었다(도 2).

<실험예 2> PCR 반응

본 발명의 세포 용해 버퍼를 사용하여 추출한 DNA가 PCR 반응에 이상이 있는지 확인하기 위하여 여러 가지 세포들을 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 추출하여 PCR 반응을 수행해 보았다.

서울대학교 암연구소에 위치한 세포주 은행에서 B16, HeLa, NB4, SNU1, SNU601 세포주를 구입하여 실험예 1과 동일한 방법으로 게놈 DNA를 추출하고 상기 DNA를 주형으로 이용하고 액틴 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. 상기 PCR 반응은 94℃에서 5 분 동안 DNA를 변성시키고, 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 1분의 조건으로 30회 반복 실시한 후, 72℃에서 5 분 동안 더 반응시켰다. PCR 산물은 1.2% 아가로스 젤에서 전기영동하여 EtBr로 염색한 후 관찰하였다.

그 결과, 본 발명의 세포 용해 버퍼를 사용하여 B16, HeLa, NB4, SNU1, SNU601 세포에서 추출한 DNA를 PCR 하였을 때 예상 밴드에서 정확히 PCR 반응이 일어난 것으로 보아 상기 DNA를 이용하여 PCR 반응을 했을 때 아무런 이상이 없음을알 수 있었다(도 3).

<실험예 3> 그램(Gram) 음성 세균에서의 게놈 DNA 분리

본 발명의 세포 용해 버퍼를 그램 음성 세균의 게놈 DNA를 추출에 이용 가능한 지를 확인하였다.

그램 음성 세균으로 살모넬라(Salmonella)를 사용하였고, 상기 살모넬라에서 DNA를 추출하는 과정은 하기와 같다. O.D 600 값이 1.8까지 균주를 배양하고, 이때의 세포 수는 1×10⁸/㎖였다. 상기 균주 3 ㎖를 취하여 원심분리하여 모으고, 세포를 잘 풀어준 뒤, 세포용해 버퍼를 300 ㎕를 넣었다. 그리고, 70℃에서 5분간 동일온도에서 배양하고, 컬럼에 걸어준 후 세척 단계와 추출 단계를 거쳐 DNA를 추출하였다. 상기 추출한 DNA는 1.2% 아가로스 젤에서 전기영동하여 EtBr로 염색한 후 관찰하였다.

상기에서 본 발명자들은 3가지 살모넬라 균주를 이용하였고,도 4의 레인 1은 살모넬라 엔데리티디스(Salmonella Enteritidis)를 3 ㎖ 사용하여 DNA를 추출했을 때 5.53 ㎍/㎕ 농도의 DNA가 추출되었고, 레인 2는 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum)을 3 ㎖ 사용하여 DNA를 추출했을 때 8.9 ㎍/㎕ 농도의 DNA가 추출되었고, 레인 3은 대장균 DH-5α를 3 ㎖ 사용하여 DNA를 추출했을 때 3.56 ㎍/㎕ 농도의 DNA가 추출되었다.도 4의 레인 4 내지 7은 버퍼의 보관에 적당한 온도 조건을 알아보기 위한 것이다.

그 결과, 본 발명의 세포 용해 버퍼는 그램 음성 세균의 게놈 DNA 추출에도 적합함을 알 수 있고 또한 4℃와 상온에서도 버퍼를 보관하여도 버퍼의 활성은 변함이 없었다(도 4).

<실험예 4> 세포 수에 따른 적정 세포용해 버퍼의 양과 분리 효율

세포 수에 따른 알맞은 본 발명의 세포 용해 버퍼의 양과 그 때의 분리 효율을 확인하였다.

세포 수가 5 X 10⁵개, 1 X 10⁶개, 3 X 10⁶개, 1 X 10⁷개인 샘플에서 본 발명의 세포 용해 버퍼의 양을 달리하여 실시예 2와 동일하게 게놈 DNA를 추출하였다. 상기 추출한 게놈 DNA는 1.2% 아가로스 젤에서 전기영동하여 EtBr로 염색한 후 관찰하였다.

그 결과,도 5의 레인 1과 같이 5 X 10⁵개 세포에 세포 용해 버퍼를 150 ㎕ 첨가했을 때 7.2 ㎍/㎕ 농도의 DNA가 추출되었고, 5 X 10⁵개 세포에 300 ㎕를 첨가하면 6.3 ㎍/㎕(레인 2), 1 X 10⁶개 세포에 300 ㎕를 첨가하면 7.2 ㎍/㎕(레인 3), 3 X 10⁶개 세포에 300 ㎕를 첨가하면 13.9 ㎍/㎕(레인 4), 3 X 10⁶개 세포에 600 ㎕를 첨가하면 13.4 ㎍/㎕(레인 5), 1 X 10⁷개 세포에 600 ㎕를 첨가하면 19.7 ㎍/㎕(레인 6) 농도의 DNA가 추출되었다.

상기 결과에서 세포수가 5 X 10⁵내지 1 X 10⁶개일 때는 세포 용해 버퍼를 150 ㎕ 내지 300 ㎕를 사용하는 것이 바람직하고, 세포수가 3 X 10⁶내지 5 X 10⁶개일 때는 세포 용해 버퍼를 300 ㎕ 내지 600 ㎕, 세포수가 5 X 10⁶내지 1 X 10⁷개일 때는 세포 용해 버퍼를 450 ㎕ 내지 600 ㎕를 사용하는 것이 바람직함을 알 수 있었다(도 5).

<비교예 1> 타사 제품과의 DNA 추출효율 비교

본 발명의 세포 용해 버퍼를 이용한 DNA 추출과 타사 제품을 이용한 DNA 추출 효율을 비교하여 보았다.

3 X 10⁶개, 5 X 10⁶개, 1 X 10⁷개의 세포에 대하여 본 발명의 세포 용해 버퍼를 사용한 경우와 비교군으로서 타사 제품(DNeasy^TMTisssue Kit, 키아젠(Qiagen)사)을 이용한 경우에 있어서의 DNA 추출 효율을 비교하여 보았다. 키아젠사의 제품을 이용한 게놈 DNA 추출방법은 제품 매뉴얼에 따라 수행하였다.

그 결과, 3 X 10⁶개, 5 X 10⁶개, 1 X 10⁷개의 세포에 대하여 본 발명의 세포 용해 버퍼를 사용한 결과 13.7 ㎍/㎕, 13.9 ㎍/㎕, 16.6 ㎍/㎕ 농도의 DNA가 추출되었고, 위와 동일한 세포에 대하여 키아젠사의 제품을 사용했을 때는 11.5 ㎍/㎕, 13.1 ㎍/㎕, 9.4 ㎍/㎕ 농도의 DNA가 추출되었다(도 6).

상기 결과에서, 키아젠 제품보다 본 발명의 세포 용해 버퍼를 사용하였을 때가 DNA 분리 효율이 더 높았고, 특히 세포 수가 많을 때는 본 발명의 세포 용해 버퍼를 사용하였을 때에 비해 키아젠 제품을 사용했을 때는 분리 효율이 급격히 낮아진 것을 알 수 있었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 세포 용해 버퍼는 세포 용해와 단백질 분리 및 RNA 제거를 동시에 수행함으로써 DNA를 추출하는 단계와 그에 따라 소요되는 시간을 줄이고 이에 따라 대량의 시료 처리도 가능해질 뿐만 아니라 재현성 있는 결과를 얻을 수 있다.

Claims

0.1 내지 0.5 M 농도의 Tris-HCl, 0.01 내지 0.05 M 농도의 EDTA, 0.5 내지 3 중량%의 계면활성제(detergent), 1.5 내지 5.4 M 농도의 아세트산염(salt of acetic acid), 10 내지 50 ㎍/㎖ 농도의 단백질 분해효소 K 및 10 내지 50 ㎍/㎖ 농도의 RNA 분해효소 A를 포함하는 DNA 추출용 세포 용해 버퍼.
제 1항에 있어서, 상기 계면활성제는 Triton X-100, 사코실 설페이트(sarcosyl sulfate), SDS로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 DNA 추출용 세포 용해 버퍼.
제 1항에 있어서, 상기 아세트산염은 암모늄 아세테이트(ammonium acetate) 또는 소듐 아세테이트(sodium acetate)인 것을 특징으로 하는 DNA 추출용 세포 용해 버퍼.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 Tris-HCl은 0.25 M 농도이고, EDTA는 0.05 M 농도이고, Triton X-100은 1중량%이고, 암모늄 아세테이트는 3.5 M 농도이고, 단백질 분해효소 K는 50 ㎍/㎖ 농도이고, RNA 분해효소 A는 50 ㎍/㎖ 농도인 것을 특징으로 하는 DNA 추출용 세포 용해 버퍼.
1) 세포에 제 1항 내지 제 3항 및 제 5항 중 어느 한 항의 DNA 추출용 세포 용해 버퍼를 첨가하여 세포를 용해하는 단계;

2) 단계 1의 용해된 세포를 컬럼에 옮겨 DNA를 고정하는 단계;

3) 단계 2의 컬럼을 세척하는 단계; 및

4) 컬럼으로부터 DNA를 회수단계를 포함하는 DNA 추출 방법.
제 6항에 있어서, 단계 2의 컬럼은 유리섬유 컬럼과 실리카 막(silica membrane) 컬럼 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 DNA 추출 방법.