KR102247419B1

KR102247419B1 - 버퍼 조성물 및 이를 이용한 분석방법

Info

Publication number: KR102247419B1
Application number: KR1020200035825A
Authority: KR
Inventors: 정지원; 박세광; 김미영; 김정환; 유진주; 최경하; 노미혜
Original assignee: 정지원; (주)비지엔케어
Priority date: 2020-03-24
Filing date: 2020-03-24
Publication date: 2021-05-03

Abstract

본 발명은 DNA 추출용 세포 용해 버퍼 조성물 및 이를 이용한 분석방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시예에 따른 DNA 추출용 세포 용해 버퍼 조성물은 프로테아제 K(Proteinase K); 킬레이트제; 이온성 계면활성제; Tris-HCl; 리보핵산가수분해효소 A(Ribonuclease A); 오소바나데이트 나트륨(Sodium orthovanadate) 및 피로인산나트륨(Sodium pyrophosphate)을 포함하는 것일 수 있다.

Description

버퍼 조성물 및 이를 이용한 분석방법{BUFFER COMPOSITION AND ANALYSIS METHOD USING THE SAME}

본 발명은 DNA 추출용 세포 용해 버퍼 조성물 및 이를 이용한 분석방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 PCR 분석을 진행할 수 있도록 하기 위한 DNA 추출용 세포 용해 버퍼 조성물을 제공하는 것으로, 오염에 대한 저항성을 높이고, DNA 중합효소 및 이의 활성을 높여, DNA 분석의 정밀도 및 속도를 높일 수 있도록 하기 위한 것이다. 또한 본 발명은 상기 DNA 추출용 세포 용해 버퍼 조성물을 이용하여 시료의 DNA 및 PCR 분석방법에 적용할 수 있도록 하는 방법을 제공한다.

첫 번째 인간 유전체 서열이 밝혀진 이래로, 연구자들은 단일염기 돌연변이(단일염기다형성, SNPs)와 같은 개체 간의 유전적 차이를 발견하는데 집중해왔다. 유전체에서 단일염기 변이는 매우 다양한 질환에 대한 서로 다른 약물 내성 또는 질병소질과 연관되어 있다는 것이 점점 더 분명해지고 있기 때문에 관심의 대상이 된다. 추후 의학적으로 관련이 있는 뉴클레오타이드 변이에 대한 지식은 개인의 유전적 공급에 대한 치료법을 적용할 수 있고, 비효과적이거나 부작용을 일으킬 수 있는 약물 치료를 방지할 수 있다(Shi, Expert Rev. Mol. Diagn. 1, 363-365(2001)). 뉴클레오타이드 변이의 시간 및 비용 효율적인 식별을 가능하게 하는 기술의 개발은 약리유전학에서의 추가적인 진보를 가져올 것이다.

SNPs는 인간 유전체에서 주요 유전적 변이를 차지하며 개체 간의 차이의 90% 이상을 유발한다(Kwok, Annu. Rev. Genomics Hum, Genet. 2, 235-258(2001); Kwok and Chen, Curr. Issues Mol. Biol. 5, 43-60(2003); Twyman and Primrose, Pharmacogenomics 4, 67-79(2003)). 이러한 유전적 변이와 돌연변이와 같은 다른 핵산 변이를 검출하기 위해, 다양한 방법들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 표적 핵산의 변이체를 동정하는 것은 분석하고자 하는 핵산 샘플을 적합한 혼성화 조건에서 서열 변이체에 대해 특이적인 혼성화 프라이머와 혼성화함으로써 이루어질 수 있다(Guo et al., Nat. Biotechnol. 15, 331-335(1997)).

그러나, 이러한 혼성화 방법은, 특히, 어세이의 필수적인 민감도 측면에서 임상학적 요구를 만족시키지 못한다는 것을 발견하였다. 따라서, PCR은 분자생물학 및 SNP 및 다른 대립 유전자 서열 변이체와 같은 돌연변이 검출을 위한 진단 검사 방법에서 폭넓게 사용되어 왔으며(Saiki et al., Science 239, 487-490(1988)), 여기서 변이체의 존재를 고려하여 검사하고자 하는 표적 핵산은 혼성화 전에 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 증폭하였다. 그러한 어세이를 위한 혼성화 프라이머로서, 일반적으로 단일가닥 올리고뉴클레오타이드가 사용된다. 상기 어세이의 변형된 구현예는 형광 혼성화 프로브를 사용하는 것을 포함한다(Livak, Genet. Anal. 14, 143-149(1999)). 일반적으로, SNP 및 다른 서열 변이의 측정 방법을 자동화하고자 노력하였다(Gut, Hum. Mutat. 17, 475-492(2001)).

해당 기술분야에 공지된 서열 변이 특이적 혼성화의 대안은 소위 유전자 변이 특이적 증폭에 의해 제공된다. 이러한 검출 방법에서, 이미 증폭하는 동안, 변이 특이적 증폭 프라이머가 사용되고, 이는 통상적으로 프라이머의 3'-말단에 소위 차별적 말단 뉴클레오타이드 잔기를 가지며, 잔기는 단지 검출하고자 하는 표적 핵산의 하나의 특이적 변이에만 상보적이다. 이 방법에서, 뉴클레오타이드 변이체는 PCR 증폭 후에 DNA 산물의 존재 또는 부재에 의해 측정된다. 유전자 변이 특이적 증폭의 원리는 유전자 변이 특이적 증폭 프라이머 말단에서 표준(canonical) 또는 비표준 프라이머-주형 복합체의 형성을 기반으로 한다. 정확하게 쌍을 이루는 3' 프라이머 말단에서, DNA 중합효소에 의한 증폭이 일어나는 반면, 미스매치된 프라이머 말단에서는 연장이 억제된다.

예를 들어, U.S. Pat. No. 5,595,890는 유전자 변이 특이적 증폭을 위한 방법 및 이의 적용, 예를 들어 k-ras 종양 유전자에서 임상적으로 연관된 점돌연변이(point mutation)의 검출을 위한 적용을 개시하고 있다. 또한, U.S. Pat. No. 5,521,301은 ABO 혈액형 시스템의 유전형 분석을 위한 대립 유전자-특이적 증폭 방법을 개시하고 있다. 대조적으로, U.S. Pat. No. 5,639,611은 겸상 적혈구 빈혈의 원인이 되는 점돌연변이의 검출과 관련된 대립 유전자-특이적 증폭의 사용을 개시하고 있다. 그러나, 유전자 변이 특이적 증폭 또는 대립 유전자-특이적 증폭은 선택성이 낮다는 문제가 있으며, 이는 더욱 복잡하고 시간 및 비용 집약적인 최적화 단계를 필요로 한다.

중합효소연쇄반응(PCR)은 DNA의 원하는 부분의 복사본(copy)의 수를 기하급수적으로 증폭시킬 수 있는 분자생물학적(molecular biological) 방법이다. DNA의 어느 부분이든지 그 서열만 알면 PCR을 통해서 증폭할 수 있다.

PCR은 1980년대 중반 K. Mullis에 의해서 고안되었으며 유전자를 연구, 분석하는 분자유전학을 포함한 많은 생물학 관련 연구에서 현재까지도 널리 이용되고 있는 방법이다. PCR은 DNA 중합효소(polymerase)에 의한 DNA 복제(replication)의 특징을 이용한 방법이다. DNA 중합효소는 외가닥(single stranded) DNA를 주형(template)으로 해서 상보적인(complementary) DNA를 합성할 수 있는데, 이러한 외가닥 DNA는 두 가닥(double stranded) DNA를 끓임(boiling)으로써 간단하게 얻을 수 있다. 이 과정을 DNA 변성(denaturation)이라 한다. DNA 중합효소가 DNA 복제를 시작하기 위해서는 시작 부위가 두 가닥 DNA 형태로 되어 있어야 한다. 따라서 PCR에서는 증폭시킬 DNA 서열의 양 말단에 주형 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 작은 DNA 조각을 함께 넣어 주어야 하며 이것이 특정 DNA 서열의 양 끝에 결합(annealing)하여 두 가닥 형태의 DNA가 되어야 한다. 이럴 경우에만 DNA 중합효소에 의한 DNA 복제가 개시될 수 있다. 주형 DNA 말단과 상보적으로 결합할 수 있는 작은 DNA 조각을 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프라이머(primer) 또는 줄여서 프라이머라 한다. 일단 프라이머가 주형 DNA 말단에 결합한 후에는 DNA 중합효소의 작용으로 DNA 합성이 반대편 끝까지 진행(extension)된다. 이런 일련의 기작에 PCR 반응이 기반하기 때문에 PCR 주기(cycle)는 두 가닥 주형 DNA를 외가닥 DNA로 바꾸어 주는 변성 단계, 프라이머가 주형 DNA 말단에 결합하는 결합 단계 및 DNA 중합효소의 작용으로 DNA 합성이 반대편 끝까지 되는 신장 단계의 3단계로 구성된다. 최초 1회의 PCR 주기가 끝난 후에 그 다음으로 이어지는 PCR 주기에서는 최초(original) 주형 DNA와 PCR에 의해 새로 합성된 DNA 모두가 DNA 주형이 된다. 이렇게 PCR은 주기가 계속적으로 반복될수록 DNA 주형의 수는 계속 늘어나게 된다.

최근까지 개발된 PCR 방법으로는, 증폭에 소요되는 시간을 줄인 래피드 PCR(rapid PCR), 시료의 정제 과정을 생략하고자 하는 직접 PCR(direct PCR), 역전사 반응과 PCR을 결합시켜 RNA를 주형으로 사용하게 한 역전사 효소 PCR(reverse transcriptase PCR; RT-PCR), 상온에서 일어나는 비특이 증폭을 획기적으로 감소시켜 PCR 반응의 특이성(specificity)을 개선시킨 핫-스타트 PCR(hot-start PCR), PCR 반응의 실시간 모니터링(monitering)이 가능한 실시간 PCR(real-time PCR) 등이 있다. 이외에도 매우 많은 방법들과 관련 기술들이 개발되었다.

아울러, PCR 반응 자체의 효율을 개선하려는 시도들이 있어 왔다. PCR 반응의 효율을 높이려는 시도는 다양한 방법이 있었는데, 그 예로 PCR 장치(machine)의 개량, 기존 DNA 중합효소의 단백질 공학(protein engineering)적 개량, PCR 반응 성분(component)들의 고순도화, PCR 반응을 증진시킬 수 있는 PCR 반응 증진제(enhancer)의 적용, 및 DNA 중합효소 등 PCR 반응의 필수 성분들의 안정성(stability)을 높여줄 수 있는 안정화제(stabilizer)의 적용 등의 방법이 있었다.

한편, PCR에 사용되는 중합효소(polymerase)들은 제 기능을 발휘하기 위해서는 반드시 다양한 물질이 혼합된 최적의 반응 buffer를 사용해야 한다. 반응 buffer 안에는 pH 안정화를 위한 요소, 보조인자(cofactor)로써의 금속이온(metal ion), 중합효소의 변성을 막기 위한 안정화 요소가 포함되기도 한다. 또한 상기 버퍼 용액은 DNA 중합효소 및 이의 활성을 높여 DNA 분석 등에 소요되는 시간을 크게 절감시킬 수 있다.

따라서 분석용액으로서 사용되는 다양한 반응에 적용할 수 있는 버퍼 용액의 개발이 필요하다.

KR 10-2019-0007216 A KR 10- 2003-0006505 A

본 발명의 목적은 중합효소 연쇄 반응(PCR)에서 DNA 추출을 보다 빠르고 효과적으로 진행할 수 있도록 하는 세포 용해용 버퍼 조성물을 제공하기 위한 것이다. 특히 단백질 분해 효소의 활성을 높여 PCR을 통한 DNA 분석 시간을 대폭 절감할 수 있게 한다.

또한 본 발명의 목적은 DNA 분석 단계에서 이온 오염에 의한 저항성을 높인 세포 용해용 버퍼 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 목적은 적은 양의 시료로부터 비교적 짧은 시간 내에 시험 가능한 DNA를 추출할 수 있으며, 분석의 정밀도를 높일 수 있도록 하는 버퍼 조성물을 제공하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 DNA 추출용 세포 용해 버퍼 조성물은 프로테아제 K(Proteinase K); 킬레이트제; 이온성 계면활성제; Tris-HCl; 리보핵산가수분해효소 A(Ribonuclease A); 오소바나데이트 나트륨(Sodium orthovanadate) 및 피로인산나트륨(Sodium pyrophosphate)을 포함하는 것일 수 있다.

상기 DNA 추출용 세포 용해 버퍼 조성물은 자일나아제, 소르비톨, 만니톨, 칼락토오스 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 포함하는 것일 수 있다.

상기 DNA 추출용 세포 용해 버퍼 조성물은 글리세롤 2-포스페이트(Glycerol 2-phosphate)를 더 포함하는 것일 수 있다.

상기 DNA 추출용 세포 용해 버퍼 조성물은 AEBSF(4-(2-Aminoethyl)benzenesulfonyl fluoride hydrochloride), 아프로티닌(Aprotinin), 우베니멕스(Ubenimex), 류펩틴(Leupeptin), 펩스타틴(Pepstatin) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 더 포함하는 것일 수 있다.

상기 DNA 추출용 세포 용해 버퍼 조성물은 브로멜라인(Bromelain); 뉴트라제(Neutrase); 프로타맥스(Protamex); 징지바인(Zingibain); 발리다제(Validase); 우마미자임(Umamizyme); 델보라아제(Delvorase); 써모아제(Thermoase); 서브틸리신(Subtilisin); 칼루풀린(Callupulin); 에스퍼라아제(Esperase); 테르몰리신(Thermolysin) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 및 제2인산나트륨을 더 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 DNA 추출용 세포 용해 버퍼 조성물을 이용한 DNA의 추출방법은 상기 DNA 추출용 세포 용해 버퍼 조성물로 세포를 용해하고 DNA 시료의 DNA를 분리 및 회수하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 DNA 추출용 세포 용해 버퍼 조성물을 이용한 DNA의 추출방법에 있어서 상기 세포 용해는 30 내지 90℃에서 진행되는 것일 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 DNA 추출용 세포 용해 버퍼 조성물은 프로테아제 K(Proteinase K); 킬레이트제; 이온성 계면활성제; Tris-HCl; 리보핵산가수분해효소 A(Ribonuclease A); 오소바나데이트 나트륨(Sodium orthovanadate) 및 피로인산나트륨(Sodium pyrophosphate)을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 말하는 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)은 DNA의 원하는 부분을 복제, 증폭시키는 분자생물학적인 기술을 말한다. 이 기술은 사람의 게놈과 같은 매우 복잡하며 양이 지극히 미량인 DNA 용액에서 연구자가 원하는 특정 DNA 단편만을 선택적으로 증폭시킬 수 있다. 또한 증폭에 필요한 시간이 2시간 정도로 짧으며, 실험 과정이 단순하고, 전자동 기계로 증폭할 수 있기 때문에, PCR과 여기서 파생한 여러가지 기술은 분자생물학, 의료, 범죄 수사, 생물의 분류 등 DNA를 취급하는 작업 전반에서 지극히 중요한 역할을 담당하고 있다.

본 발명에 말하는 세포 용해는 PCR을 진행하기 위하여 시료로부터 DNA를 추출 및 회수하는 단계를 말한다. DNA를 수득하는 일반적인 과정으로는 cell lysis(세포 용해), RNase treatment, Protein precipitation(단백질 침전), DNA precipitation 과정을 진행하는 것일 수 있다.

상기 DNA 추출용 세포 용해 버퍼 조성물에 있어서, 프로테아제 K(Proteinase K)는 단백질 가수분해 효소이고, 세포 시료로부터 DNA를 추출하는데 가장 많이 사용되는 효소이다.

상기 킬레이트제는 Mg²⁺ 또는 Ca²⁺와 같은 양이온을 격리시키기 위해 사용될 수 있으며, 이에 따라 DNA를 분해하는 효소로부터 DNA를 보호할 수 있다. 예시적으로는 DTPA(Diethylenetriaminepentaacetic acid), EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid), EGTA(Ethylene glycol tetraacetic acid), NTA (N,N-bis(carboxymethyl)glycine), 이미노디아세트산기 함유 스티렌-디비닐벤젠 공중합체인 이온교환수지 등을 들 수 있으며, 상기 이온교환수지로는 Chelex 100(Bio-Rad Laboratories, Inc. 제조)이 대표적이다. 다만 이에 한정하는 것은 아니다.

상기 이온성 계면활성제는 한 분자 내에 친수성과 소수성 부분을 함께 가지고 있는 물질로서, 해리시 이온성인 특성을 나타내는 물질이다. 상기 이온성 계면활성제를 예시하면, SDS(Sodium dodecyl sulfate), 암모늄 라우릴 설페이트(Ammonium lauryl sulfate), SLES(Sodium lauryl ether sulfate), 소듐 미레스 설페이트(Sodium myreth sulfate), 사코실 설페이트(Sarcosyl sulfate), Triton X-100 등을 들 수 있다. 다만 이에 한정하는 것은 아니다.

상기 Tris-HCl은 상기 Tris가 버퍼 조성물에 양이온을 공급하여(-)charge를 띠고 있는 DNA를 끌어주는 역할을 한다.

상기 리보핵산가수분해효소 A(Ribonuclease A)는 RNA를 제거하는 역할을 한다.

상기 글리세롤 2-포스페이트에 의하는 경우 단백질이 일정하게 분해되면서 DNA가 손상되지 않고 안정적으로 추출되는데 도움이 될 수 있다.

바람직하게는 류펩틴(Leupeptin)이 포함되는 것일 수 있다. 류펩틴에 의하는 경우 가수분해에 의하여 과분해가 발생하는 문제를 방지할 수 있다.

더 바람직하게는 류펩틴(Leupeptin) 100 중량부에 대하여 아프로티닌(Aprotinin) 10 내지 30 중량부; 우베니멕스(Ubenimex) 10 내지 30 중량부 및 펩스타틴(Pepstatin) 10 내지 30 중량부가 포함되는 것일 수 있다. 상기 범위에 의하는 경우 동일한 함량 대비 가수분해효소의 과분해를 방지하는 효과가 높아지는데, 특히 가수분해효소를 카테일 조성물로 처리하는 경우 세포 용해가 아주 빠르게 일어나기 때문에, 설계된 용해정도 이후에 과분해가 일어나지 않도록 하는데 유리할 수 있다.

상기 DNA 추출용 세포 용해 버퍼 조성물은 브로멜라인(Bromelain); 뉴트라제(Neutrase); 프로타맥스(Protamex); 징지바인(Zingibain); 발리다제(Validase); 우마미자임(Umamizyme); 델보라아제(Delvorase); 써모아제(Thermoase); 서브틸리신(Subtilisin); 칼루풀린(Callupulin); 에스퍼라아제(Esperase); 테르몰리신(Thermolysin) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 및 제2 인산나트륨을 더 포함하는 것일 수 있다.

바람직하게는 프로테아제 K(Proteinase K) 100 중량부에 대하여 브로멜라인(Bromelain) 10 내지 30 중량부; 뉴트라제(Neutrase) 10 내지 30 중량부를 포함하는 것일 수 있다. 상기 범위에 의하는 경우 상호 작용에 의한 상승효과로 단순 조합 이상으로 세포 용해 활성이 증진된다.

더 바람직하게는 프로테아제 K(Proteinase K) 100 중량부에 대하여 브로멜라인(Bromelain) 10 내지 30 중량부; 뉴트라제(Neutrase) 10 내지 30 중량부; 징지바인(Zingibain) 1 내지 5 중량부; 발리다제(Validase) 1 내지 5 중량부 및 우마미자임(Umamizyme) 1 내지 5 중량부가 포함된 것일 수 있다. 상기 범위에 따른 가수분해효소 카테일 조성물은 상호 작용에 의한 상승효과에 의하여 가수분해 활성이 급격히 향상되는 점을 알 수 있다. 따라서 상기 조합에 의하는 경우 세포 용해 속도를 높여 분석을 위한 DNA 추출 및 분리하는데 필요한 시간을 대폭 감소시킬 수 있다.

한편, 상기 DNA 추출용 세포 용해 버퍼 조성물은 염화칼슘; 염화마크네슘; 염화칼륨; 염화구리; 수산화암모늄 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나가 포함된 것일 수 있다. 이 경우 외부 이온오염에 대한 저항성이 높아질 뿐만 아니라, 세포 용해 활성을 증진하는 효과를 낼 수 있다.

바람직하게 상기 DNA 추출용 세포 용해 버퍼 조성물은 염화칼슘 100 중량부에 대하여 염화마그네슘 1 내지 10 중량부; 염화칼륨 0.1 내지 5 중량부; 염화구리 0.1 내지 5 중량부; 수산화암모늄 0.01 내지 0.5 중량부가 포함된 것일 수 있다. 상기 범위에 의하는 경우 상호 작용에 의한 상승효과로, 이온오염에 대한 저항성과 세포 용해 활성 증진효과가 높아지게 된다. 따라서 각 단독 화합물 또는 각 화합물을 단순 조합하는 경우에 비하여 보다 적은 량을 사용하면서도, 동일하거나 보다 우수한 효과를 나타낼 수 있는 장점을 가진다.

한편, 상기 DNA 추출용 세포 용해 버퍼 조성물은 제2 인산나트륨을 더 포함하는 것일 수 있다.

바람직하게는 상기 제2 인산나트륨이 조성물 총량에 대하여 0.01 내지 0.06 중량%로 포함되는 것일 수 있다. 제2 인산나트륨이 상기 범위로 포함되는 경우 가수분해효소 및 각 시료의 반응활성을 높여 세포의 용해작용을 촉진시킬 수 있다. 따라서 상기 범위에 의하는 경우 DNA 분리 및 추출이 보다 빠르게 진행될 수 있다. 한편, 상기 제2 인산나트륨이 0.01 중량% 미만으로 포함되는 경우 용해반응을 촉진하는 효과가 나타나지 않고, 상기 제2 인산나트륨이 0.06%를 초과하여 포함되는 경우 오히려 반응이 느려지게 되는 문제가 발생하며, 더 초과하여 일정량 이상으로 제2 인산나트륨이 포함되면, 그 자체로 반응에 관여하여 부산물이 생길 수 있다는 등의 문제가 발생한다.

상기 DNA 추출용 세포 용해 버퍼 조성물을 이용한 DNA의 추출방법을 구체적으로 예시하면, DNA 추출용 시료를 제공하는 단계; DNA 추출용 세포 용해 버퍼를 제공하는 단계; 상기 시료를 상기 DNA 추출용 세포 용해 버퍼 조성물에 첨가하여 80 내지 90℃에서 30 내지 40분 동안 세포를 용해시키는 단계; 및 분리된 DNA를 회수하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 다만 이는 일 예시 사항이며, 본 발명의 내용을 위 예시에 한정하는 것은 아니다.

상기 DNA 추출용 세포 용해 버퍼 조성물을 이용한 DNA의 추출방법에 있어서 상기 세포 용해는 30 내지 90 ℃에서 진행되는 것일 수 있다. 상기 범위에 의하는 경우 상기 DNA 추출용 세포 용해 버퍼 조성물에 포함된 이온 및 효소의 활성이 증진되어 DAN 추출을 위한 세포 용해가 빠르고 보다 효과적으로 진행될 수 있다.

본 발명은 중합효소 연쇄 반응(PCR)에서 DNA 추출을 보다 빠르고 효과적으로 진행할 수 있도록 하는 세포 용해용 버퍼 조성물을 제공한다. 특히 본 발명에 따른 버퍼 조성물에 의하는 경우 단백질 분해 효소의 활성을 높여 PCR을 통한 DNA 분석 시간을 대폭 절감할 수 있다.

또한 본 발명은 DNA 분석 단계에서 이온 오염에 의한 저항성을 높인 세포 용해용 버퍼 조성물을 제공한다.

본 발명은 적은 양의 시료로부터 비교적 짧은 시간 내에 시험 가능한 DNA를 추출할 수 있으며, 분석의 정밀도를 높일 수 있도록 하는 버퍼 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

[제조예 1: DNA 추출용 세포 용해 버퍼 조성물의 제조]

혼합 가수분해 효소의 사용에 따른 상승효과를 확인하기 위하여 킬레이트제; 이온성 계면활성제; Tris-HCl; Ribonuclease A; Na₃VO₄; Sodium pyrophosphate; Leupeptin을 포함하고, 하기의 [표 1]과 같이 가수분해효소의 조성을 달리면서 본 발명에 따른 DNA 추출용 세포 용해 버퍼 조성물을 제조하였다.

	Con	T1	T2	T3	T4	T5	T6	T7	T8	T9	T10	T11	T12
Proteinase K	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100
Neutrase	-	100	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Delvorase	-	-	100	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Callupulin	-	-	-	100	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Bromelain	-	-	-	-	5	10	20	30	40	20	20	20	20
Neutrase	-	-	-	-	5	10	20	30	40	20	20	20	20
Zingibain	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0.1	1	5	7
Validase	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0.1	1	5	7
Umamizyme	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0.1	1	5	7

(단위: 중량부)

[실험예 1: DNA 추출 및 분석]

모근을 일정한 크기로 절단한 시료 및 입안의 구강상피세로를 시료로 하고, 상기 시표를 준비된 각 버퍼 조성물에 혼합하고, 65 내지 75℃를 유지하면서 반응시켰다. 이후 원심분리 후 상승액을 회수하였다. 이후 전기영동을 통하여 추출된 DNA 양을 분석하였다.

각 혼합효소에 따른 효과를 확인하기 위하여 각 실시예별로 버퍼 용액과 시료의 반응시간을 줄이면서 실험을 반복하였고, DNA 추출에 소요되는 최소시간을 측정하였다. 이후 객관적인 비교를 위하여 Control의 최소시간 값을 50으로 하고, T1 내지 T12의 결과를 1 내지 100의 지수로 나타내었다. 상기 지수는 그 숫자가 낮을수록 반응시간이 빠르고, 신속한 분석에 유리한 것을 의미한다.

그 결과는 하기의 [표 2]에 나타내었다.

	Con	T1	T2	T3	T4	T5	T6	T7	T8	T9	T10	T11	T12
모근	50	56	51	54	51	43	41	44	49	42	33	32	43
구강상피세포	50	58	52	56	49	40	38	39	47	38	29	28	39

(단위: 지수)

상기 [표 2]를 참조하면, T1 내지 T3의 경우 반응속도가 오히려 지연된다는 점을 확인할 수 있다. 반면, T5 내지 T7의 경우 칵테일 효소가 일정한 함량비로 혼합되는 경우 가수분해활성이 증진된다는 점을 확인할 수 있다.

특히 T6가 우수한 효과를 나타내었는데, T10 및 T11의 경우 이에 더하여 추가적인 상승효과가 나타난다는 점을 확인할 수 있다.

[제조예 2: 염화칼슘 및 제2 인산나트륨 첨가]

상기 실험예 1에서 T6 및 T11에 대하여 염화칼슘 및 제2 인산나트륨의 함량이 조절된 첨가제를 사용하면서, 반응속도에 미치는 영향을 확인하였다. 염화칼슘 및 제2 인산나트륨을 10: 1 내지 1: 10로 혼합하고, 제 2인산나트륨이 버퍼 조성물 총량에 대하여 하기의 [표 3]과 같은 범위의 중량%가 되도록 혼합하였다. 또한, 하기의 [표 4]와 같이 포함된 염화칼슘을 기준으로 염화마그네슘, 염화칼륨, 염화구리, 수산화암모늄을 일정한 범위로 혼합하였다.

	TA1	TA2	TA3	TA4	TA5	TB1	TB2	TB3	TB4	TB5
버퍼	T6	T6	T6	T6	T6	T11	T11	T11	T11	T11
제2인산나트륨(w%)	0.001	0.01	0.03	0.06	0.09	0.001	0.01	0.03	0.06	0.09

	TA1	TA2	TA3	TA4	TA5	TB1	TB2	TB3	TB4	TB5
염화칼슘	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100
염화마크네슘	0.1	1	5	10	15	0.1	1	5	10	15
염화칼륨	0.01	0.1	3	5	5	0.01	0.1	3	5	5
염화구리	0.01	0.1	3	5	5	0.01	0.1	3	5	5
수산화암모늄	0.001	0.01	0.1	0.5	1	0.001	0.01	0.1	0.5	1

(단위: 중량부)

[실험예 2: DNA 추출 및 분석]

일정한 크기로 절단된 모근을 시료로 하여 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 TA1 내지 TA5, TB1 내지 TB5를 control의 값과 비교하여 평가하였다. 그 결과를 하기의 [표 5]에 나타내었다.

	Con	TA1	TA2	TA3	TA4	TA5	TB1	TB2	TB3	TB4	TB5
모근	50	45	38	37	34	X	31	27	23	27	X

(단위: 지수)

상기 [표 5]를 참조하면, TA1 및 TB1의 경우 용해 효율 증가에 미치는 효과를 확인할 수가 없었다. 또한 TA5 및 TB5의 경우 control에 비하여 현저히 느려지는 반응속도를 확인하고 폐기하였다.

한편, TA2 내지 TA4, TB2 내지 TB4의 경우 제2 인산나트륨과 염화칼슘, 염화마그네슘, 염화칼륨, 염화구리, 수산화암모늄이 일정한 범위로 가수분해효율을 촉진함으로서 용해 반응의 활성이 향상된다는 점을 확인할 수 있다.

또한 상기 염화칼슘, 염화마그네슘, 염화칼륨, 염화구리, 수산화암모늄 및 인산 이온에 의하여 이온오염에 대한 저항성을 높일 수 있다. 따라서 상기 범위에 의하는 경우 반응 효율을 증진시키면서도 분석 중 이온오염에 대한 저항성이 높은 DNA 추출용 세포 용해 버퍼 조성물을 제조할 수 있다는 점을 알 수 있다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims

프로테아제 K(Proteinase K);
킬레이트제;
이온성 계면활성제;
Tris-HCl;
리보핵산가수분해효소 A(Ribonuclease A);
오소바나데이트 나트륨(Sodium orthovanadate);
피로인산나트륨(Sodium pyrophosphate);
제2 인산나트륨;
염화캄슘; 및
상기 프로테아제 K(Proteinase K) 100 중량부에 대하여 브로멜라인(Bromelain) 10 내지 30 중량부; 뉴트라제(Neutrase) 10 내지 30 중량부를 포함하고,
상기 염화칼슘 및 상기 제2 인산나트륨을 10: 1 내지 1: 10의 중량비로 포함되고, 상기 제2 인산나트륨은 조성물 총량에 대하여 0.01 내지 0.06 중량%로 포함되며, 상기 염화칼슘 100 중량부에 대하여 염화마그네슘 1 내지 10 중량부; 염화칼륨 0.1 내지 5 중량부; 염화구리 0.1 내지 5 중량부; 수산화암모늄 0.01 내지 0.5 중량부가 포함되는 것인
DNA 추출용 세포 용해 버퍼 조성물.
제 1항에 있어서,
자일나아제, 소르비톨, 만니톨, 갈락토오스 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 포함하는
DNA 추출용 세포 용해 버퍼 조성물.
제 1항에 있어서,
글리세롤 2-포스페이트(Glycerol 2-phosphate)를 더 포함하는 것인
DNA 추출용 세포 용해 버퍼 조성물.
제1항에 있어서,
AEBSF(4-(2-Aminoethyl)benzenesulfonyl fluoride hydrochloride), 아프로티닌(Aprotinin), 우베니멕스(Ubenimex), 류펩틴(Leupeptin), 펩스타틴(Pepstatin) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 더 포함하는 것인
DNA 추출용 세포 용해 버퍼 조성물.
삭제
제 1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 DNA 추출용 세포 용해 버퍼 조성물로 세포를 용해하고 DNA 시료의 DNA를 분리 및 회수하는 단계를 포함하는 것인
DNA 추출용 세포 용해 버퍼 조성물을 이용한 DNA의 추출방법.
제 6항에 있어서,
상기 세포 용해는 30 내지 90 ℃에서 진행되는 것인
DNA 추출용 세포 용해 버퍼 조성물을 이용한 DNA의 추출방법.