CN112831547A - 一种用于高GC片段扩增的qPCR添加剂及扩增方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于高GC片段扩增的qPCR添加剂及扩增方法，所述的用于高GC模板扩增的添加剂为三氮唑或三氮唑衍生物。本发明中所述三氮唑或其衍生物在qPCR扩增体系中的应用，可扩增高GC含量的目的基因；提高高GC片段的扩增特异性；可以成功地扩增人、动物、等不同来源不同复杂程度的高GC模板基因。

Description

一种用于高GC片段扩增的qPCR添加剂及扩增方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于高GC片段扩增的qPCR添加剂及扩增方法。
背景技术
聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加；而实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chainreaction，Real-Time qPCR)是指在PCR反应中加入荧光基团，通过连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化，即时分析目的基因的初始量。
探针法Real-Time qPCR中最常用的荧光探针为TaqMan探针，其基本原理是依据目的基因设计合成一个能够与之特异性杂交的探针，该探针的5′端标记荧光基团，3′端标记淬灭基团。正常情况下两个基团的空间距离很近，荧光基因因淬灭而不能发出荧光。PCR扩增时，引物与该探针同时结合到模板上，探针的结合位置位于上下游引物之间。当扩增延伸到探针结合的位置时，Taq酶利用5′-3′外切酶活性，将探针5′端连接的荧光分子从探针上切割下来，从而使其发出荧光。检测到的荧光分子数与PCR产物的数量成正比，因此，根据PCR反应体系中的荧光强度即可计算出初始DNA模板的数量。
Real-Time qPCR扩增的效率受模板DNA的核苷酸组成和序列影响。例如哺乳动物基因的调控区域存在反向重复或富含GC片段(＞60％G+C)的模板。PCR技术发展到今天已经有三十多年的时间，随着技术的不断进步，Real-Time qPCR也应运而生，并且具有灵敏度高、特异性好等特点，但在扩增高GC含量序列方面仍有不足之处。碱基A、T之间形成2对氢键，G、C之间形成3对氢键，因此高GC含量基因解链所需能量高，导致高GC模板解链困难。
常见的对于高GC模板扩增的方法，一种是改变引物的设计，并结合使用热启动的DNA聚合酶，有时可以提高扩增效率。然而，更为常见的是在扩增反应中使用增强剂，常用的增强剂包括甜菜碱、DMSO、甲酰胺、甘油、7-deaza-dGTP等。甜菜碱是一种中性物质，在PCR反应中，它可以与DNA大沟中的A、T碱基对结合而影响延伸反应，或者通过与DNA小沟结合，使二级结构易于打开，保证扩增的顺利进行。甜菜碱的另外一个优点是对酶的保护作用，它可以提高酶在热变性时所需温度，保证聚合酶在高温变性过程中不易失活。DMSO作为一种PCR增强剂，它的作用原理是通过破坏模板DNA大沟与小沟里带有供体和受体的互补氢键，降低DNA二级结构的形成，增加引物与模板的特异性结合，降低非特异性扩增。但有报道称当DMSO浓度过高时会影响DNA聚合酶活性，因此在使用时，要平衡模板、引物、酶的用量。甲酰胺可以促进引物与模板的退火，降低带有二级结构的DNA的变性温度，从而显著提高PCR反应的特异性。甘油可以提高产量，增加酶的稳定性。7-deaza-dGTP是一种dGTP类似物，经它修饰后的模板，在反应过程中能够避免二级结构的产生，使引物易于与模板结合。
但是传统增强剂多用于普通PCR，但因qPCR对扩增要求更高，传统的增强剂增效效果，如灵敏度、终点荧光值、线型、特异性等效果有限且不稳定，容易出现在不同的高GC体系里出现增强效果不同的现象，甚至在不同的高GC体系中不都具有增强效果。
发明内容
本发明目的在于提供一种用于高GC模板扩增的新型添加剂及扩增方案，可以在复杂模板中扩增富含GC的DNA片段。该新型添加剂可直接作为组分添加到扩增试剂中，不必单独作为组分提供，减少操作步骤，改善操作体验。
本发明目的通过以下技术方案实现：
本发明提供一种用于高GC模板扩增的添加剂，所述添加剂为三氮唑或三氮唑衍生物。
在本发明的一些具体的实施例中，本发明所述的三氮唑衍生物是指三唑钠、3-氨基-1，2，4-三唑、3-甲基-1，2，4-三氮唑-5-羧酸、3-巯基-1，2，4-三氮唑、3-氯-1，2，4-三氮唑、3，5-二氨基-1，2，4-三氮唑、3-水杨酰胺基-1，2，4-三氮唑或4-氨基-3-肼-5-巯基-1，2，4-三唑。
在本发明的一些实施例中，当添加剂为三氮唑时，三氮唑的工作浓度为0.1-1mol/L；在一些具体的实施例中，为0.2-0.5mol/L；在一些更具体的实施例中，为0.3-0.4mol/L。
在本发明的一些实施例中，当添加剂为三氮唑衍生物时，三氮唑衍生物的工作浓度为0.01-0.1mol/L；在一些具体的实施例中，为0.03-0.1mol/L；在一些更具体的实施例中，为0.03-0.07mol/L。
本发明采用三氮唑或其衍生物作为高GC体系PCR扩增中的增强剂，对模板的兼容范围广，且对不同的缓冲体系、不同的模板体系均具有更好的增强效果。
本发明还提供包含所述添加剂的试剂盒。
本发明还提供所述添加剂或试剂盒在PCR中的应用，在一些实施例中，是在高GC含量基因的PCR中的应用，在一些更具体的实施例中，是在高GC含量基因的qPCR中的应用。
本发明还提供一种高GC含量基因的qPCR扩增方法，包括如下步骤：
1)准备qPCR反应体系：包括DNA聚合酶、缓冲Buffer、MgCl2、dNTP、上游引物、下游引物、TaqMan探针、DNA模板、荧光定量PCR参比染料(ROX Reference Dye)、双蒸水和本发明所述的添加剂；
2)进行qPCR扩增程序：
①预处理：95℃变性20～30s；
②qPCR反应：95℃变性8～12s，在55-65℃退火并延伸10～30s，共40-45个循环。
本发明所述添加剂可以将步骤①的热启动程序缩短至30s以内；并在步骤②中，退火与延伸温度范围降为55℃～65℃；时间范围10～30S。
本发明所述方法中的DNA聚合酶可以为本领域的常用Taq DNA聚合酶。
本发明所述的qPCR反应体系中的缓冲Buffer、MgCl2和dNTP配方量可以按照本领域的常规方法进行选择，可以选择单个试剂的适当配方量自行混合，也可以直接选择市售的反应体系成品，这些组分的差异性对增强效果没有明显影响。其中缓冲Buffer为本领域常规Buffer即可，例如为30-60mmol/L的Tris和10-50mmol/L的KCl，或者为30-600mmol/L的Tris和10-50mmol/L的KAc，或者为30-60mmol/L的Tris和10-50mmol/L的CsCl，或者为30-60mmol/L的Tris、10-50mmol/L的KAc和10-50mmol/L的KCl，这些差异对本发明所述的添加剂均没有显著的影响。
本专利所述的扩增体系适用性强，因此本发明所述的方法中，上游引物和下游引物可按照本领域的常规方法进行选择和设计，引物的结构及是否复杂，均不影响本发明所述添加剂作为增强剂的效果，例如引物可以为常规引物或简并引物中的任意一种，所述上游引物和下游引物的GC含量也可以较高且引物的解链温度Tm值可达到85℃并具有引物设计无法避免的发夹结构，这些引物均不会影响本专利所述添加剂的增强效果。
本发明所述方法中的添加剂的兼容范围广，因此所用的DNA模板可以为不同来源的高GC含量的基因片段，例如可以为含有丰度低、拷贝数低的目的序列的人或动物的基因组，特别是可以适用于选自人或动物基因组中的高GC含量基因片段，长度通常在75～200bp之间。
本发明所述方法中的荧光定量PCR参比染料(ROX Reference Dye)可以选用本领域常规。双蒸水用于补足体系体积。
本发明所述的qPCR扩增技术可以适用多种品牌不同型号的qPCR仪，包括但不限于ABI 7500、SLAN 96P、BioRad CFX96等等。
在本发明的一种具体的实施例中，本发明提供了一种具体的qPCR反应体系：包括：DNA聚合酶200U/ml～1000U/ml，缓冲Buffer，MgCl2 2-8mmol/L，dNTP 0.2～0.4mmol/L，上游引物0.2μmol/L～0.5μmol/L，下游引物0.2μmol/L～0.5μmol/L，TaqMan探针0.1～0.5μmol/L，荧光定量PCR参比染料1％～3％(v/v)，DNA模板0.005ng/μL～100ng/μL添加剂；其中添加剂的量可以如前所述。
所述缓冲Buffer为本领域常规，对结果不会产生影响，在一些具体的实施例中，所述缓冲Buffer为30-60mmol/L的Tris和10-50mmol/L的KCl，或者为30-60mmol/L的Tris和10-50mmol/L的KAc，或者为30-60mmol/L的Tris和10-50mmol/L的CsCl，或者为30-60mmol/L的Tris、10-50mmol/L的KAc和10-50mmol/L的KCl。
本发明与现有技术相比具有下列优点：
(1)根据本发明中所述三氮唑或其衍生物在qPCR扩增体系中的应用，可扩增高GC含量的目的基因；提高高GC片段的扩增特异性；可以成功地扩增人、动物、等不同来源不同复杂程度的高GC模板基因。
(2)一般qPCR扩增程序大都选用常规引物，特异性相对较高，结构简单，但是在扩增一些未知序列时，只能通过保守序列设计简并引物，这给特异性扩增带来了困难。而本发明所述的qPCR扩增程序不仅可以使用常规引物，还可以使用较为复杂、解链温度较高的简并引物，并且可以成功扩增出单一条带的目的基因片段。
(3)本发明所述的添加剂是常规试验中容易得到且价格较低的小分子化学物质，为大规模实验带来了经济和便利。
(4)扩增产物特异性高：本发明所述的添加剂对qPCR扩增技术的扩增产物特异性极高，针对不同的模板均可得到单一性的目的条带。
(5)仪器设备兼容性广：本发明所述的qPCR扩增技术能够适用于多种qPCR机型且性能一致。
若无特别说明，本发明的相关术语解释如下：
实时荧光定量PCR：又称Real-Time qPCR，可简写为qPCR。是指在PCR反应中加入荧光基团，通过连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化，即时分析目的基因的初始量。
本发明中各个成分的“工作浓度”是指其在最终PCR工作体系中的浓度。例如本发明所述的“工作浓度”是指添加剂在最终PCR扩增反应体系中的浓度。
本发明中的“三氮唑”、“三唑钠”为含有下列结构的化合物。
Figure BDA0002895314600000051
本发明所述的“高GC模板”是指基因模板中GC含量高达60％以上，特别是高达65％以上，更进一步的达75％以上。
附图说明
图1、qPCR扩增体系添加三氮唑后扩增H-H(GC)-09，其中：○为三氮唑400mM，△为对照；
图2、qPCR扩增体系添加三氮唑后扩增H-H(GC)-12，其中：○为三氮唑400mM，△为对照；
图3、qPCR扩增体系添加三氮唑后扩增M-H(GC)-02，其中：○为三氮唑400mM，△为对照；
图4、qPCR扩增体系添加三氮唑后扩增M-H(GC)-63，其中：○为三氮唑400mM，△为对照；
图5、qPCR扩增体系添加三氮唑后扩增高GC目的基因的产物检测；其中：M为Marker，1为三氮唑0mM，2为三氮唑10mM，3为三氮唑20mM，4为三氮唑50mM，5为三氮唑100mM，6为三氮唑200mM，7为三氮唑300mM，8为三氮唑400mM；
图6、qPCR扩增体系添加三氮唑后扩增高GC模板不同浓度梯度；其中：○为三氮唑400mM，△为对照；模板浓度从左至右分别为5ng/μl、0.5ng/μl、0.05ng/μl、0.005ng/μl。
图7、qPCR扩增体系添加三氮唑或DMSO后扩增H-H(GC)-12的比较，其中：○为三氮唑400mM，△为对照，◇为4％的DMSO；
图8、qPCR扩增体系添加三氮唑或DMSO后扩增M-H(GC)-02的比较，其中：○为三氮唑400mM，△为对照，◇为4％的DMSO；
图9、qPCR扩增体系添加三氮唑或DMSO后扩增H-H(GC)-63的比较，其中：○为三氮唑400mM，△为对照，◇为4％的DMSO；
图10、添加三氮唑或DMSO后扩增H-H(GC)-12的基因产物特异性检测，其中：○为三氮唑400mM，△为对照，◇为4％的DMSO；
图11、添加三氮唑或DMSO后扩增M-H(GC)-02的基因产物特异性检测，其中：○为三氮唑400mM，△为对照，◇为4％的DMSO；
图12、不同添加剂在3个qPCR扩增体系中扩增M-H(GC)-02基因组片段；
图13、不同添加剂在3个qPCR扩增体系中扩增M-H(GC)-62基因组片段；
图14、三氮唑在3个qPCR扩增体系中梯度扩增M-H(GC)-02基因组片段，其中：○为三氮唑400mM，△为对照；模板浓度从左至右分别为5ng/μl、0.5ng/μl、0.05ng/μl、0.005ng/μl；
图15、三氮唑在3个qPCR扩增体系中梯度扩增M-H(GC)-62基因组片段，其中：○为三氮唑400mM，△为对照；模板浓度从左至右分别为5ng/μl、0.5ng/μl、0.05ng/μl、0.005ng/μl；
图16、qPCR扩增体系添加三氮唑衍生物后扩增高GC目的基因。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中所用的高GC片段M-H(GC)-02、M-H(GC)-63、M-H(GC)-62、H-H(GC)-09和H-H(GC)-12，其中M-H(GC)-02来自于小鼠基因组(NC_000067.6)的基因片段，M-H(GC)-02基因片段序列如SEQ ID NO.1所示，其GC含量为68.5％；M-H(GC)-63、M-H(GC)-62来自于小鼠基因组(NC_000068.8)的基因片段，M-H(GC)-63基因片段序列如SEQ ID NO.2所示，其GC含量为75％；M-H(GC)-62基因片段序列如SEQ ID NO.3所示，其GC含量为68％；H-H(GC)-09和H-H(GC)-12为来自于人源基因组(NC_000005.10)的基因片段，H-H(GC)-09基因片段序列如SEQ ID NO.4所示，其GC含量为67％；H-H(GC)-12基因片段序列如SEQ ID NO.5所示，其GC含量为68.4％。
实施例1
本实施例用于人源和鼠源基因组高GC基因片段的qPCR扩增：
1、模板制备
本实施例中使用的DNA提取试剂盒为南京诺唯赞生物科技股份有限公司FastPureCell/Tissue DNA Isolation Mini Kit(Vazyme，#DC102)，提取DNA的浓度为200ng/μl，260/230值大于2.0，260/280值在1.8-2.0之间。
2、引物设计
根据人源基因组(NC_000005.10)和小鼠基因组(NC_000067.6、NC_000068.8)全基因组序列，引物、探针设计软件使用南京市诺唯赞生物科技股份有限公司CE Design设计引物探针，序列信息如下表1所示：
表1：引物探针序列(5’-3’)
Figure BDA0002895314600000071
3、qPCR反应
配制qPCR扩增反应体系(表2)，同时设置不含三氮唑的对照组(其他成分同)：
扩增体系的反应终浓度：Tris(50mmol/L)、KAc(40mmol/L)、KCl(10mmol/L)、dNTPs(0.4mmol/L)、MgCl2(5mmol/L)；
表2 qPCR扩增反应体系
组分 体积(μL)
ddH<sub>2</sub>0 To 20μL
2×扩增体系 10
上游引物(10μmol/L) 0.4
下游引物(10μmol/L) 0.4
探针(10μmol/L) 0.2
ROX Reference Dye 1/2 0.4
三氮唑(4 mol/L) 2
Taq DNA Polymerase(5U/μL) 1
模板(1ng/μL) 1
反应条件如表3：
表3反应条件
Figure BDA0002895314600000081
4、扩增结束后分析扩增曲线的灵敏度和平台荧光值
1、从图1～图4中可以看出，本实施例中的扩增体系能够扩增GC含量68％以上甚至高达75％的目的基因，并且在本发明的扩增体系的基础上加入400mmol/L的三氮唑，灵敏度和荧光平台值得到明显的提升，可见本发明所述的添加剂能够显著提高扩增体系的平台和灵敏度。
实施例2
本实施例中扩增体系中的三氮唑浓度分别为0mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、200mmol/L、300mmol/L和400mmol/L不同的梯度，且其中M-H(GC)-02片段更换为M-H(GC)-62片段，其他同实施例1，通过核酸电泳检测qPCR扩增产物：1.5％琼脂糖电泳，加入EB，紫外检测qPCR产物。
qPCR扩增产物的电泳图结果请参阅图5。从图5中可以看出，本实施例的扩增体系能够扩增GC含量68％以上甚至高达75％的目的基因，且随着三氮唑浓度升高到合适的浓度时，qPCR扩增产物条带变亮、特异性高、条带单一。
实施例3
本实施例中的各扩增体系分别加入1μL的浓度为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、0.1ng/μl 1的模板(基因片段)，其他同实施例1。
结果显示，三氮唑在四种基因片段浓度为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、0.1ng/μl的定量范围内均体现出对高GC片段的明显提升作用，可见本发明所述的添加剂对模板浓度的兼容范围广，图6为其中高GC模板H-H(GC)-12的不同浓度梯度扩增曲线。
由上述实施例1～实施例3实验结果可知，本专利中研究的三氮唑可应用于高GC含量基因扩增等困难PCR扩增中，实现高灵敏度、高特异性和高检出率。
实施例4
本实施例用于人源和鼠源基因组高GC基因片段的qPCR扩增：
1、模板制备
本实施例中使用的DNA提取试剂盒为南京诺唯赞生物科技股份有限公司FastPureCell/Tissue DNA Isolation Mini Kit(Vazyme，#DC102)，提取DNA的浓度为200ng/μl，260/230值大于2.0，260/280值在1.8-2.0之间。
2、引物设计
根据人源(NC_000005.10)和小鼠(NC_000067.6、NC_000068.8)全基因组序列，引物、探针设计软件使用南京市诺唯赞生物科技股份有限公司CE Design设计引物探针，序列信息如下表4：
表4：引物探针序列(5’-3’)
Figure BDA0002895314600000091
Figure BDA0002895314600000101
3、qPCR反应
配制qPCR扩增反应体系(表5)，同时设置不含三氮唑和DMSO的对照组(其他成分同)：
扩增体系的反应终浓度：Tris(50mmol/L)、KAc(40mmol/L)、KCl(10mmol/L)、dNTPs(0.4mmol/L)、MgCl2(5mmol/L)；
表5 qPCR扩增反应体系
组分 体积(μL)
ddH<sub>2</sub>0 To 20μL
2×扩增体系 10
上游引物(10μmol/L) 0.4
下游引物(10μmo1/L) 0.4
探针(10μmol/L) 0.2
ROX Reference Dye 1/2 0.4
三氮唑或DMSO 2
Taq DNA Polymerase(5U/μL) 1
模板(1ng/μL) 1
qPCR添加剂分别为三氮唑或DMSO，其中三氮唑的反应终浓度为400mmol/L，DMSO的反应终浓度为4％。
反应条件如表6所示：
表6反应条件
Figure BDA0002895314600000102
4、扩增结束后分析扩增曲线的灵敏度和平台荧光值
从图7～图9中可以看出，本实施例扩增体系能够扩增GC含量68％以上甚至高达75％的目的基因，并且在本发明的扩增Mix基础上加入终浓度400mmol/L的三氮唑，或者终浓度4％的DMSO，相较于添加三氮唑组灵敏度和荧光平台值得到明显的提升，添加DMSO组的灵敏度和平台无提升作用或提升作用不明显。
5、染料法检测qPCR扩增产物特异性
在扩增产物中加入终浓度为0.3×SYBR Green I，在qPCR仪(ABI QuantiStudio3)上检测产物的熔解曲线。qPCR扩增产物的熔解曲线检测结果请参阅图5。从图10～图11中可以看出，本实施例的扩增体系能够扩增GC含量68％以上甚至高达75％的目的基因，且qPCR扩增产物特异性高，熔解曲线峰型单一，无其他多余刺峰。
熔解曲线测试程序(表7)：
【表7】
步骤1 95℃ 15sec
步骤2 60℃ 1min
步骤3 95℃ 1sec
由上述实验结果可知，本发明的高GC含量基因的扩增Mix可应用于高GC含量基因扩增等困难PCR扩增中，实现高灵敏度、高特异性和高检出率。
实施例5
本实施例用于鼠源基因组高GC基因片段在不同扩增试剂中的qPCR扩增：
1、模板制备
本实施例中使用的DNA提取试剂盒为南京诺唯赞生物科技股份有限公司FastPureCell/Tissue DNA Isolation Mini Kit(Vazyme，#DC102)，提取DNA的浓度为200ng/μl，260/230值大于2.0，260/280值在1.8-2.0之间。
2、引物设计
根据小鼠基因组(NC_000067.6、NC_000068.8)全基因组序列，引物、探针设计软件使用南京市诺唯赞生物科技股份有限公司CE Design设计引物探针，序列信息如下表8所示：
表8：引物探针序列(5’-3’)
Figure BDA0002895314600000111
Figure BDA0002895314600000121
M-H(GC)-02、M-H(GC)-62为小鼠基因组片段；其GC含量分别为68.5％、68％。
3、qPCR反应
qPCR扩增体系1的反应终浓度：Tris(50mmol/L)、KCl(50mmol/L)、dNTPs(0.4mmol/L)、MgCl2(5mmol/L)：
qPCR扩增体系2的反应终浓度：Tris(50mmol/L)、KAc(50mmol/L)、dNTPs(0.4mmol/L)、MgCl2(5mmol/L)；
qPCR扩增体系3的反应终浓度：Tris(50mmol/L)、CsCl(50mmol/L)、dNTPs(0.4mmol/L)、MgCl2(5mmol/L)；
配制qPCR扩增反应体系(表9)，其中三氮唑的终浓度为400mmol/L，同时设置不含三氮唑、甘油和DMSO的对照组，以及分别含有终浓度为体积百分比4％或5％的甘油组和终浓度为体积百分比4％或5％的DMSO组(其他成分同)：
【表9】
组分 体积(μL)
ddH<sub>2</sub>0 To 20μL
2×qPCR扩增体系1或2或3 10
上游引物(10μmol/L) 0.4
下游引物(10μmol/L) 0.4
探针(10μmol/L) 0.2
ROX Reference Dye 1/2 0.4
三氮唑或甘油或DMSO -2
Taq DNA Polymerase(5U/μL) 1
模板(1ng/μL) 1
反应条件(表10)：
【表10】
Figure BDA0002895314600000122
Figure BDA0002895314600000131
4、扩增结束后分析扩增曲线的灵敏度和平台荧光值
1、从图12～图13中可以看出，三氮唑在本实施例的3个qPCR扩增体系中均能够有效扩增高GC含量目的基因，相较于对照及添加剂DMSO或甘油，添加了三氮唑检测灵敏度和荧光平台值得到明显的提升；
2、从图14～图15可以看出，在不同体系中，三氮唑在反应终浓度为5ng/μl、0.5ng/μl、0.05ng/μl、0.005ng/μl的不同模板浓度条件下均能提高检测灵敏度及扩增效率，可见本发明所述的添加剂对缓冲体系的适用度更高。
实施例6
本实施例用于人源基因组高GC基因片段的qPCR扩增：
1、模板制备
本实施例中使用的DNA提取试剂盒为南京诺唯赞生物科技股份有限公司FastPureCell/Tissue DNA Isolation Mini Kit(Vazyme，#DC102)，提取DNA的浓度为200ng/μl，260/230值大于2.0，260/280值在1.8-2.0之间。
2、引物设计
根据人源全基因组序列(NC_000005.10)，引物、探针设计软件使用南京市诺唯赞生物科技股份有限公司CE Design设计引物探针，序列信息如下表11：
表11：引物探针序列(5’-3’)
Figure BDA0002895314600000132
H-H(GC)-12为人源293细胞基因组片段；其GC含量为68.4％。
3、qPCR反应
配制qPCR扩增反应体系(表12)，同时设置不含三唑钠的对照组(其他成分同)：
扩增体系的反应终浓度：Tris(50mmol/L)、KAc(40mmol/L)、KCl(10mmol/L)、dNTPs(0.4mmol/L)、MgCl2(5mmol/L)；
【表12】
组分 体积(μL)
ddH<sub>2</sub>0 To 20μL
2×扩增体系 10
上游引物(10μmol/L) 0.4
下游引物(10μmol/L) 0.4
探针(10μmol/L) 0.2
ROX Reference Dye 1/2 0.4
三唑钠(1mol/L) 1
Taq DNA Polymerase(5U/μL) 1
模板(1ng/μL) 1
反应条件(表13)：
【表13】
Figure BDA0002895314600000141
4、扩增结束后分析扩增曲线的灵敏度和平台荧光值
从图16中可以看出，本实施例扩增体系能够扩增GC含量75％的目的基因，并且在本发明的扩增Mix基础上加入50mmol/L的三唑钠，灵敏度和荧光平台值得到明显的提升。
序列表
<110> 南京诺唯赞生物科技股份有限公司
<120> 一种用于高GC片段扩增的qPCR添加剂及扩增方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 92
<212> DNA
<213> 家鼠(Mus musculus)
<400> 1
cggacctgca cattcctctc ctcccctcgc gcgcgctccc tcctcccgca gcctctcctc 60
caccagctga ctccgaggga gaggatgacc tc 92
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> 家鼠(Mus musculus)
<400> 2
gggctgtggg gtgctgctgt cccgcaagcg ccggcggcag catggccagc tctgg 55
<210> 3
<211> 90
<212> DNA
<213> 家鼠(Mus musculus)
<400> 3
cacccaatca agcgctctac agtgggttgg gccacctctt cactgcttcc tggtaccagt 60
ggtgggcgcc agcgcaggga gctggacccc 90
<210> 4
<211> 106
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
ccgcggaagc cagagacagg gagagcaagg atgaaagacg gcgaccacct cccaaggacc 60
cgccggccgt caggacctgc caccgactca ccctctacgg ctacgc 106
<210> 5
<211> 80
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
cctctacggc gtcttcctca gtgggctcat gggtgagtct gcgccactgt tgccccggcc 60
gggatcaggg tggggtccgg 80

Claims (10)

1.一种用于高GC模板扩增的添加剂，其特征在于，所述添加剂为三氮唑或三氮唑衍生物。
2.根据权利要求1所述的添加剂，其特征在于，所述的三氮唑衍生物是指三唑钠、3-氨基-1，2，4-三唑、3-甲基-1，2，4-三氮唑-5-羧酸、3-巯基-1，2，4-三氮唑、3-氯-1，2，4-三氮唑、3，5-二氨基-1，2，4-三氮唑、3-水杨酰胺基-1，2，4-三氮唑或4-氨基-3-肼-5-巯基-1，2，4-三唑。
3.根据权利要求1所述的添加剂，其特征在于，当添加剂为三氮唑衍生物时，三氮唑衍生物的工作浓度为0.01-0.1mol/L，优选的，为0.03-0.1mol/L，进一步优选的，为0.03-0.07mol/L。
4.根据权利要求1所述的添加剂，其特征在于，当添加剂为三氮唑时，三氮唑的工作浓度为0.1-1mol/L；优选的，为0.2-0.5mol/L；更优选的，为0.3-0.4mol/L。
5.包含权利要求1～4任一项所述的添加剂的试剂盒。
6.权利要求1～4任一项所述的添加剂或权利要求5所述的试剂盒在PCR中的应用；优选的，是在高GC含量基因的PCR中的应用，更优选的，是在高GC含量基因的qPCR中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的高GC含量基因是指基因模板中GC含量达60％以上，优选的达65％以上，更优选的达75％以上。
8.一种高GC含量基因的qPCR扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)准备qPCR反应体系：包括DNA聚合酶、缓冲Buffer、MgCl2、dNTP、上游引物、下游引物、TaqMan探针、DNA模板、荧光定量PCR参比染料(ROX Reference Dye)、双蒸水和权利要求1～4任一项所述的添加剂；
2)进行qPCR扩增程序：
①预处理：95℃变性20～30s；
②qPCR反应：95℃变性8～12s，在55-65℃退火并延伸10～30s，共40-45个循环。
9.根据权利要求8所述的扩增方法，其特征在于，缓冲Buffer为30-60mmol/L的Tris和10-50mmol/L的KCl，或者为30-60mmol/L的Tris和10-50mmol/L的KAc，或者为30-60mmol/L的Tris和10-50mmol/L的CsCl，或者为30-60mmol/L的Tris、10-50mmol/L的KAc和10-50mmol/L的KCl。
10.根据权利要求8所述的扩增方法，其特征在于，所述的qPCR反应体系包括：DNA聚合酶200U/ml～1000U/ml，缓冲Buffer，MgCl2 2-8mmol/L，dNTP 0.2～0.4mmol/L，上游引物0.2μmol/L～0.5μmol/L，下游引物0.2μmol/L～0.5μmol/L，TaqMan探针0.1～0.5μmol/L，荧光定量PCR参比染料1％～3％(v/v)，DNA模板0.005ng/μL～100ng/μL，权利要求1～4任一项所述添加剂。
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