CN116179656A - 一种qPCR扩增反应液及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种qPCR扩增反应液及其用途，属于生物技术领域。本发明通过向qPCR扩增反应液中加入牛血清蛋白、棉子糖和二硫苏糖醇中的一种或多种作为添加剂，有利于提高血液样本的扩增效率和灵敏度，且对于不同的扩增反应体系具有较好的兼容性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种qPCR扩增反应液及其在扩增血液样本中的用途。
背景技术
实时荧光定量PCR技术(qPCR)是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程产物总量的方法。将标记有荧光素的TaqMan探针与模板DNA混合后，完成变性-退火-延伸的循环，在循环过程中与模板DNA互补配对的TaqMan探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值。
由于qPCR可以对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析，且灵敏度极高，目前已广泛应用于临床疾病分子诊断、亲子鉴定和刑事案件等众多领域。血液是这些领域中常见的生物样本，但由于血液样本中存在大量抑制因子，如血红蛋白、高铁血红素、乳铁蛋白等，对常规DNA聚合酶具有明显的抑制作用，这可能导致检测结果出现假阴性的情况，因此探究出能提高qPCR扩增反应灵敏度和效率的添加剂具有重要的意义。
当前，国内外学者的大量研究表明，Tween-20、NP-40、TritonX-100、BSA(牛血清蛋白)和DTT(二硫苏糖醇)等添加剂可以克服样本中一些抑制因子的抑制作用，增强扩增灵敏度及效率。其中，DTT是一种还原剂，DTT上的巯基可以保护酶的二硫键，增加扩增稳定性。另外一定浓度的BSA有利于清除和中和血液中抑制Taq酶的多种污染物的能力，从而提高扩增效率，但当BSA浓度超过一定限度时，过量的BSA就会与血液样本中的DNA结合，导致DNA的扩增量减少，因此也需要控制好BSA的浓度配比。不同浓度添加剂的不同组合对qPCR的促进作用是否会更优于单一添加剂我们也尚未可知。
虽然现有的一些扩增反应添加剂虽然也能在某些体系中具有一定的增强效果，但效果欠佳，且并不具有普遍性，如添加在不同扩增缓冲buffer时，增强效果相差较大。因此，研究出兼容性高且可大大提高qPCR扩增效率和灵敏度，对难以扩增的血液样本具有更好扩增效率的qPCR添加剂具有重要的意义。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的不足，提供一种qPCR扩增反应液，该反应液中由于添加牛血清蛋白、棉子糖和二硫苏糖醇中的一种或多种作为添加剂，有利于血液样本的扩增效率和灵敏度，且对于不同的扩增体系均有良好的兼容性。
本申请的第一方面提供一种qPCR扩增反应液，所述反应液包含样本、缓冲物质、金属盐、dNTPs、DNA聚合酶、引物、添加剂、探针和/或荧光染料，所述添加剂是牛血清蛋白(BSA)、棉子糖和二硫苏糖醇(DTT)中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述添加剂是BSA、棉子糖和DTT中的一种或两种或三种。
在一些实施方案中，所述BSA在所述反应液中的浓度是100-1000ng/μl，优选100-900ng/μl，更优选100-800ng/μl，包括所述范围内的100ng/μl，150ng/μl，200ng/μl，250ng/μl，300ng/μl，350ng/μl，400ng/μl，450ng/μl，500ng/μl，510ng/μl，520ng/μl，530ng/μl，540ng/μl，550ng/μl，560ng/μl，570ng/μl，580ng/μl，590ng/μl，600ng/μl，610ng/μl，620ng/μl，630ng/μl，640ng/μl，650ng/μl，660ng/μl，670ng/μl，680ng/μl，690ng/μl，700ng/μl，720ng/μl，750ng/μl和800ng/μl。
在一些实施方案中，所述棉子糖在所述反应液中的浓度是1-10ng/μl，优选1-9ng/μl，更优选1-8ng/μl，包括所述范围内的1ng/μl，1.5ng/μl，2ng/μl，2.5ng/μl，3ng/μl，3.5ng/μl，4ng/μl，4.5ng/μl，5ng/μl，5.5ng/μl，6ng/μl，6.1ng/μl，6.2ng/μl，6.3ng/μl，6.4ng/μl，6.5ng/μl，6.6ng/μl，6.7ng/μl，6.8ng/μl，6.9ng/μl，7ng/μl，7.2ng/μl，7.5ng/μl，7.8ng/μl和8ng/μl。
在一些实施方案中，所述DTT在所述反应液中的浓度是1-20mM，优选1-18mM，更优选1-15mM，包括所述范围内的1mM，1.5mM，2mM，2.5mM，3mM，3.5mM，4mM，4.5mM，5mM，5.5mM，6mM，6.5mM，7mM，7.5mM，8mM，8.5mM，9mM，9.5mM，10mM，10.1mM，10.2mM，10.3mM，10.4mM，10.5mM，10.6mM，10.7mM，10.8mM，10.9mM，11mM，11.1mM，11.2mM，11.3mM，11.4mM，11.5mM，11.6mM，11.7mM，11.8mM，11.9mM，12mM，12.2mM，12.5mM，12.8mM，13mM，13.2mM，13.5mM，13.8mM，14mM，14.5mM和15mM。
在一些实施方案中，所述样本是核酸，例如DNA或RNA。
在一些实施方案中，所述样本是血液，例如全血、血清、血浆中的任意一种或多种，优选全血。
在一些实施方案中，所述DNA聚合酶是耐热DNA聚合酶，优选TaqDNA聚合酶，所述TaqDNA聚合酶在所述反应液中的浓度是0.1-0.5U/μl，包括所述范围内的0.1U/μl、0.15U/μl、0.2U/μl、0.25U/μl、0.3U/μl、0.35U/μl、0.4U/μl、0.45U/μl、0.5U/μl。
在一些实施方案中，所述引物包含至少一对上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物在所述反应液中的浓度是0.1-0.5μmol/L，包括所述范围内的0.1μmol/L、0.15μmol/L、0.2μmol/L、0.25μmol/L、0.3μmol/L、0.35μmol/L、0.4μmol/L、0.45μmol/L和0.5μmol/L。
在一些实施方案中，所述dNTP在所述反应液中的浓度是100-500μmol/L，包括所述范围内的100μmol/L、125μmol/L、150μmol/L、175μmol/L、200μmol/L、225μmol/L、250μmol/L、275μmol/L、300μmol/L、325μmol/L、350μmol/L、375μmol/L、400μmol/L、425μmol/L、450μmol/L、475μmol/L和500μmol/L。
在一些实施方案中，所述金属盐包括Mg2+盐，优选地，所述金属盐包括MgCl2，更优选地，所述MgCl2在所述反应液中的浓度是1-10mmol/L，包括所述范围内的1mmol/L、1.2mmol/L、1.5mmol/L、1.8mmol/L、2mmol/L、2.5mmol/L、3mmol/L、3.2mmol/L、3.5mmol/L、3.8mmol/L、4mmol/L、4.5mmol/L、5mmol/L、5.5mmol/L、6mmol/L、6.5mmol/L、7mmol/L、7.5mmol/L、8mmol/L、8.5mmol/L、9mmol/L、9.5mmol/L和10mmol/L。
在一些实施方案中，所述缓冲物质包括Tris、Tris-HCl、Tris碱或HEPES中的一种或多种，优选Tris，更优选地，所述Tris在所述反应液中的浓度是10-80mmol/L，包括所述范围内的10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L、30mmol/L、35mmol/L、40mmol/L、45mmol/L、50mmol/L、55mmol/L、60mmol/L、65mmol/L、70mmol/L、75mmol/L和80mmol/L。
在一些实施方案中，所述金属盐还包括K+盐、Mn2+盐、Cs+盐、Na+盐和Ca2+盐中的一种或多种；优选地，所述金属盐还包括K+盐和Cs+盐中的一种或两种；优选地，所述金属盐还包括30-100mmol/LK+盐和10-50mmol/LCs+盐中的一种或两种。
在一些实施方案中，所述金属盐还包括KCl、KAc和CsCl中的一种或多种；优选地，所述KCl在所述反应液中的浓度是10-50mmol/L，包括所述范围内的10mmol/L、12mmol/L、15mmol/L、18mmol/L、20mmol/L、25mmol/L、30mmol/L、35mmol/L、40mmol/L、42mmol/L、45mmol/L、48mmol/L和50mmol/L；优选地，所述KAc在所述反应液中的浓度是10-80mmol/L，包括所述范围内的10mmol/L、12mmol/L、15mmol/L、18mmol/L、20mmol/L、25mmol/L、30mmol/L、35mmol/L、40mmol/L、45mmol/L、50mmol/L、55mmol/L、60mmol/L、65mmol/L、70mmol/L、75mmol/L和80mmol/L；优选地，所述CsCl在所述反应液中的浓度是10-50mmol/L，包括所述范围内的10mmol/L、12mmol/L、15mmol/L、18mmol/L、20mmol/L、25mmol/L、30mmol/L、35mmol/L、40mmol/L、42mmol/L、45mmol/L、48mmol/L和50mmol/L。
在一些实施方案中，所述探针是TaqMan探针，所述TaqMan探针在反应液中的浓度是0.1-0.5μmol/L，包括所述范围内的0.1μmol/L、0.12μmol/L、0.15μmol/L、0.18μmol/L、0.2μmol/L、0.25μmol/L、0.3μmol/L、0.35μmol/L、0.4μmol/L和0.5μmol/L。所述TaqMan探针包括5’端标记的报告荧光基团(Reporter)和3’端标记的淬灭荧光基团(Quencher)；所述报告荧光基团是例如FAM、VIC、HEX或TET，所述淬灭荧光基团是例如BHQ1、TAMRA、MGB。
在一些实施方案中，所述反应液还包括荧光定量PCR参比染料。
在一些实施方案中，所述荧光染料是SYBRGreen或EvaGreenTM，优选SYBRGreen。
在一些实施方案中，所述反应液包含样本、缓冲物质、金属盐、dNTPs、DNA聚合酶、引物、200ng/μLBSA、探针和/或荧光染料。
在一些实施方案中，所述反应液包含样本、缓冲物质、金属盐、dNTPs、DNA聚合酶、引物、3ng/μL棉子糖、探针和/或荧光染料。
在一些实施方案中，所述反应液包含样本、缓冲物质、金属盐、dNTPs、DNA聚合酶、引物、4mMDTT、探针和/或荧光染料。
在一些实施方案中，所述反应液包含样本、缓冲物质、金属盐、dNTPs、DNA聚合酶、引物、添加剂、探针和/或荧光染料，所述添加剂是200ng/μLBSA、3ng/μL棉子糖和4mMDTT中的两种或三种。
在一些实施方案中，所述反应液包含样本、缓冲物质、金属盐、dNTPs、DNA聚合酶、引物、添加剂、探针和/或荧光染料，所述添加剂是100ng/μLBSA、1ng/μL棉子糖和1mMDTT。
在一些实施方案中，所述反应液包含样本、缓冲物质、金属盐、dNTPs、DNA聚合酶、引物、添加剂、探针和/或荧光染料，所述添加剂是200ng/μLBSA、1-10ng/μL棉子糖和1-10mMDTT，优选地，所述添加剂是200ng/μLBSA，1-5ng/μL棉子糖和1-5mMDTT。
在一些实施方案中，所述反应液包含样本、缓冲物质、金属盐、dNTPs、DNA聚合酶、引物、添加剂、探针和/或荧光染料，所述添加剂是500ng/μLBSA，1-10ng/μL棉子糖和1-15mMDTT；优选地，所述添加剂是500ng/μLBSA，2-8ng/μL棉子糖和2-12mMDTT。
在一些实施方案中，所述反应液包含样本、缓冲物质、金属盐、dNTPs、DNA聚合酶、引物、添加剂、探针和/或荧光染料，所述添加剂是100-800ng/μLBSA，1-10ng/μL棉子糖和1-15mMDTT中的一种或两种或三种；更优选地，所述添加剂是100-600ng/μLBSA，2-8ng/μL棉子糖和2-12mMDTT中的一种或两种或三种；最优选地，所述添加剂是200-500ng/μLBSA，2-6ng/μL棉子糖和2-10mMDTT中的一种或两种或三种。
本申请的第二方面提供一种扩增血液样本的方法，所述方法包括：
(1)提供血液样本，任选地，提取或不提取DNA；
(2)以所述血液样本为样本，或以从所述血液样本中提取的DNA为样本，配制第一方面所述的qPCR扩增反应液；
(3)在合适的条件下进行qPCR扩增反应。
在一些实施方案中，所述血液样本包括全血、血清、血浆中的任意一种或多种，优选地，所述血液样本是全血样本。
在一些实施方案中，所述血液样本来自感兴趣的物种，包括但不限于哺乳动物，例如灵长动物或啮齿动物，又例如人、小鼠、大鼠、食蟹猴、兔、犬、猫、牛、马、羊、猪。
在一些实施方案中，所述qPCR扩增反应包括预变性和循环反应；所述预变性的温度是90-98℃，例如92-96℃，例如95℃温育20s-60s，例如25s-40s，例如30s；所述循环反应包括95℃变性8-12s，在55-65℃退火并延伸10-30s，共40-50个循环。
本申请的第三方面提供一种试剂盒，所述试剂盒包含缓冲物质、金属盐、dNTPs、DNA聚合酶、添加剂、探针和/或荧光染料，所述添加剂是牛血清蛋白(BSA)、棉子糖和二硫苏糖醇(DTT)中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述缓冲物质、金属盐、dNTPs、DNA聚合酶、添加剂、探针和荧光染料在试剂盒中的保存浓度是工作浓度的1-10倍。
在一些实施方案中，所述缓冲物质是Tris，所述Tris的工作浓度是10-80mmol/L。
在一些实施方案中，所述金属盐包括Mg2+盐，优选MgCl2，所述MgCl2的工作浓度是1-10mmol/L。
在一些实施方案中，所述金属盐还包括K+盐和Cs+盐中的一种或两种；优选30-100mmol/LK+盐和10-50mmol/LCs+盐中的一种或两种，更优选10-50mmol/LKCl、10-80mmol/LKAc和10-50mmol/LCsCl中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述dNTPs的工作浓度是100-500μmol/L。
在一些实施方案中，所述DNA聚合酶是TaqDNA聚合酶，所述TaqDNA聚合酶的工作浓度是0.1-0.5U/μl。
在一些实施方案中，所述探针是TaqMan探针，所述TaqMan探针的工作浓度是0.1-0.5μmol/L。
在一些实施方案中，所述BSA的工作浓度是100-1000ng/μl，优选100-800ng/μl，包括所述范围内的100ng/μl，150ng/μl，200ng/μl，250ng/μl，300ng/μl，350ng/μl，400ng/μl，450ng/μl，500ng/μl，510ng/μl，520ng/μl，530ng/μl，540ng/μl，550ng/μl，560ng/μl，570ng/μl，580ng/μl，590ng/μl，600ng/μl，610ng/μl，620ng/μl，630ng/μl，640ng/μl，650ng/μl，660ng/μl，670ng/μl，680ng/μl，690ng/μl，700ng/μl，720ng/μl，750ng/μl和800ng/μl。
在一些实施方案中，所述棉子糖的工作浓度是1-10ng/μl，优选1-8ng/μl，包括所述范围内的1ng/μl，1.5ng/μl，2ng/μl，2.5ng/μl，3ng/μl，3.5ng/μl，4ng/μl，4.5ng/μl，5ng/μl，5.5ng/μl，6ng/μl，6.1ng/μl，6.2ng/μl，6.3ng/μl，6.4ng/μl，6.5ng/μl，6.6ng/μl，6.7ng/μl，6.8ng/μl，6.9ng/μl，7ng/μl，7.2ng/μl，7.5ng/μl，7.8ng/μl和8ng/μl。
在一些实施方案中，所述DTT的工作浓度是1-20mM，优选1-15mM，包括所述范围内的1mM，1.5mM，2mM，2.5mM，3mM，3.5mM，4mM，4.5mM，5mM，5.5mM，6mM，6.5mM，7mM，7.5mM，8mM，8.5mM，9mM，9.5mM，10mM，10.1mM，10.2mM，10.3mM，10.4mM，10.5mM，10.6mM，10.7mM，10.8mM，10.9mM，11mM，11.1mM，11.2mM，11.3mM，11.4mM，11.5mM，11.6mM，11.7mM，11.8mM，11.9mM，12mM，12.2mM，12.5mM，12.8mM，13mM，13.2mM，13.5mM，13.8mM，14mM，14.5mM和15mM。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括其他辅助检测试剂如纯水。
本申请的第四方面提供一种添加剂在增强血液样本的PCR扩增效率中的用途，所述添加剂是牛血清蛋白(BSA)、二硫苏糖醇(DTT)和棉子糖中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述血液样本包括全血、血清、血浆中的任意一种或多种，优选地，所述血液样本是全血样本。
在一些实施方案中，所述血液样本来自感兴趣的物种，包括但不限于哺乳动物，例如灵长动物或啮齿动物，又例如人、小鼠、大鼠、食蟹猴、兔、犬、猫、牛、马、羊、猪。
在一些实施方案中，所述添加剂是BSA、棉子糖和DTT中的一种或两种或三种。
在一些实施方案中，所述BSA的工作浓度是100-1000ng/μl，优选100-900ng/μl，更优选100-800ng/μl，包括所述范围内的100ng/μl，150ng/μl，200ng/μl，250ng/μl，300ng/μl，350ng/μl，400ng/μl，450ng/μl，500ng/μl，510ng/μl，520ng/μl，530ng/μl，540ng/μl，550ng/μl，560ng/μl，570ng/μl，580ng/μl，590ng/μl，600ng/μl，610ng/μl，620ng/μl，630ng/μl，640ng/μl，650ng/μl，660ng/μl，670ng/μl，680ng/μl，690ng/μl，700ng/μl，720ng/μl，750ng/μl和800ng/μl。
在一些实施方案中，所述棉子糖的工作浓度是1-10ng/μl，优选1-9ng/μl，更优选1-8ng/μl，包括所述范围内的1ng/μl，1.5ng/μl，2ng/μl，2.5ng/μl，3ng/μl，3.5ng/μl，4ng/μl，4.5ng/μl，5ng/μl，5.5ng/μl，6ng/μl，6.1ng/μl，6.2ng/μl，6.3ng/μl，6.4ng/μl，6.5ng/μl，6.6ng/μl，6.7ng/μl，6.8ng/μl，6.9ng/μl，7ng/μl，7.2ng/μl，7.5ng/μl，7.8ng/μl和8ng/μl。
在一些实施方案中，所述DTT的工作浓度是1-20mM，优选1-18mM，更优选1-15mM，包括所述范围内的1mM，1.5mM，2mM，2.5mM，3mM，3.5mM，4mM，4.5mM，5mM，5.5mM，6mM，6.5mM，7mM，7.5mM，8mM，8.5mM，9mM，9.5mM，10mM，10.1mM，10.2mM，10.3mM，10.4mM，10.5mM，10.6mM，10.7mM，10.8mM，10.9mM，11mM，11.1mM，11.2mM，11.3mM，11.4mM，11.5mM，11.6mM，11.7mM，11.8mM，11.9mM，12mM，12.2mM，12.5mM，12.8mM，13mM，13.2mM，13.5mM，13.8mM，14mM，14.5mM和15mM。
在一些实施方案中，所述添加剂是200ng/μLBSA、3ng/μL棉子糖和4mM DTT中的一种或两种或三种。
在一些实施方案中，所述添加剂是100ng/μLBSA、1ng/μL棉子糖和1mM DTT。
在一些实施方案中，所述添加剂是200ng/μLBSA、1-10ng/μL棉子糖和1-10mMDTT，优选地，所述添加剂是200ng/μLBSA，1-5ng/μL棉子糖和1-5mM DTT。
在一些实施方案中，所述添加剂是500ng/μLBSA，1-10ng/μL棉子糖和1-15mMDTT；优选地，所述添加剂是500ng/μLBSA，2-8ng/μL棉子糖和2-12mMDTT。
在一些实施方案中，所述添加剂是100-800ng/μLBSA，1-10ng/μL棉子糖和1-15mMDTT中的一种或两种或三种；更优选地，所述添加剂是100-600ng/μLBSA，2-8ng/μL棉子糖和2-12mMDTT中的一种或两种或三种；最优选地，所述添加剂是200-500ng/μLBSA，2-6ng/μL棉子糖和2-10mMDTT中的一种或两种或三种。
在一些实施方案中，所述PCR包括但不限于本领域已知的PCR、qPCR和RT-qPCR。
本发明中所述添加剂的工作浓度是指添加剂在PCR反应体系中的终浓度。
附图说明
图1：实施例1中分别添加8组添加剂的扩增曲线，其中图1A为添加组合1-4添加剂的扩增曲线，图1B为添加1、组合5-8添加剂的扩增曲线。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。但是，下述实施例仅仅是本发明的示例，并不代表或限制本发明的保护范围。本发明的保护范围以权利要求书为准。在以下实施例中，若无特别说明，所用试剂和耗材均购自本领域普通供应商，所用实验方法和技术手段均为本领域常规方法和手段。
实施例1
以人全血血液作为样本，扩增RNaseP内参基因序列的部分片段，分别在各个扩增反应体系中加入不同的添加剂组合，根据Ct值和扩增曲线筛选增强效果最优的添加剂组合。其中组合1为空白对照组，组合2-8为实验组，各组添加剂(BSA、棉子糖和DTT均购于Sigma)的成分和用量如表1所示。
表1添加剂成分和用量
按照表2进行qPCR扩增体系的配制，配制完成后混合均匀，其中：
2×qPCR缓冲buffer：100mM Tris，20mM KCl，6mM MgCl2，80mM KAc，600μM dNTP。用1M HCL和1MNaOH将缓冲液pH调整为8.5。
正向引物(SEQ ID NO.1)：Primer-F：AGATTTGGACCTGCGAGCG
反向引物(SEQ ID NO.2)：Primer-R：GAGCGGCTGTCTCCACAAGT
探针序列(SEQ ID NO.3)：Probe：FAM-5’TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG’3-MGB
表2：qPCR扩增反应体系
| 2×qPCR缓冲buffer | 10μl |
| Taq DNA Polymerase(5U/μl)a | 1μl |
| Primer-F(10μM) | 0.6μl |
| Primer-R(10μM) | 0.6μl |
| Probe(10μM) | 0.3μl |
| 50×ROX Reference Dye 1/2b | 0.4μl |
| 样本 | 1μl |
| 添加剂 | 按表1添加 |
| 水 | To20μl |
a：Vazyme#P122；b：Vazyme#QN213
添加剂组合物1-8在qPCR反应体系中的工作浓度(即添加剂在最终PCR扩增反应体系中的浓度)如表3所示。
表3添加剂组合1-8的工作浓度
| 组别 | BSA | 棉子糖 | DTT |
| 1 | / | / | / |
| 2 | 200ng/μL | / | / |
| 3 | / | 3ng/μL | / |
| 4 | / | / | 4mM |
| 5 | 200ng/μL | 3ng/μL | / |
| 6 | 200ng/μL | / | 4mM |
| 7 | / | 3ng/μL | 4mM |
| 8 | 200ng/μL | 3ng/μL | 4mM |
按表4所述程序进行qPCR扩增。
表4 qPCR反应程序
扩增完成后，根据检测Ct值来评估各添加剂组合的性能。
数据处理：每个样本进行3次重复，Ct值取3次重复的平均值，所得结果如表5所示，扩增曲线如附图1A-B所示。
表5不同组合添加剂获得的检测Ct值
结果分析：根据表5及附图1A-B的结果可以看出，与组合1相比，添加其他不同组合的添加剂后均能提高扩增灵敏度，其中组合3/4/7的增强效果较弱，组合2/5/6的增强效果较好，组合8的增强效果最好。
实施例2
结合实施例1结果，对添加剂组合的浓度进行进一步调整优化，设置6种添加剂组合，分别用于6个qPCR扩增反应体系，各组添加剂的成分和用量如表6所示。
表6添加剂成分和用量
qPCR扩增反应体系同实施例1的表2，其中添加剂按照表6添加，添加剂组合物9-14在qPCR反应体系中的工作浓度如表7所示。
表7添加剂成分工作浓度
| 组别 | BSA | 棉子糖 | DTT |
| 9 | 100ng/μL | 1ng/μL | 1mM |
| 10 | 200ng/μL | 1ng/μL | 1mM |
| 11 | 200ng/μL | 1ng/μL | 4mM |
| 12 | 200ng/μL | 3ng/μL | 4mM |
| 13 | 500ng/μL | 3ng/μL | 4mM |
| 14 | 500ng/μL | 6ng/μL | 10mM |
qPCR扩增反应程序同实施例1的表4，数据处理方法同实施例1，得到检测Ct值如表8所示。
表8不同组合添加剂获得的检测Ct值
| 组合 | Ct值 |
| 9 | 34.03 |
| 10 | 32.01 |
| 11 | 31.75 |
| 12 | 30.70 |
| 13 | 26.51 |
| 14 | 24.42 |
结果分析：如表8所示，对qPCR体系中的添加剂组分浓度进行调整，检测到扩增曲线的Ct值随着三种添加剂浓度的上升而降低，说明提高添加剂的浓度同样有利于增强扩增的灵敏度，其中又以组合14的增强效果最好。
实施例3
结合实施例1的结果，对添加剂组合14在不同qPCR缓冲buffer中的兼容性进行探究。配制了4种组合qPCR缓冲buffer，分别用于4个不同的qPCR扩增反应体系，各种qPCR缓冲buffer的成分和浓度如下所示：
2×qPCR缓冲buffer试剂1：Tris(80mM)、KCl(40mM)、MgCl2(4mM)，600μM dNTP，pH＝8.5。
2×qPCR缓冲buffer试剂2：Tris(80mM)、KAc(40mM)、MgCl2(6mM)，600μM dNTP，pH＝8.5。
2×qPCR缓冲buffer试剂3：Tris(100mM)、CsCl(40mM)、MgCl2(6mM)，600μM dNTP，pH＝8.5。
2×qPCR缓冲buffer试剂4：Tris(100mM)、KAc(80mM)、KCl(20mM)、MgCl2(6mM)，600μM dNTP，pH＝8.5。
qPCR缓冲buffer的成分：Tris、KCl、MgCl2、KAc、CsCl、dNTP均购于Sigma。
qPCR扩增反应体系同实施例1的表2，其中添加剂为组合14，2×qPCR缓冲buffer分别为上述试剂1-4，qPCR扩增反应程序同实施例1的表4，数据处理方法同实施例1，得到检测Ct值如表9所示。
表9不同qPCR缓冲buffer获得的检测Ct值
| 试剂 | Ct值 |
| 1 | 24.52 |
| 2 | 24.89 |
| 3 | 24.45 |
| 4 | 24.31 |
结果分析：如表9所示，添加剂14在不同组份的qPCR缓冲buffer中得到的扩增结果较均一，说明本发明的添加剂组合对不同的扩增体系兼容性也较好。
实施例4
结合实施例2的结果，对添加剂组合14在不同类型的血液样本中的兼容性进行探究。
2×qPCR缓冲buffer：Tris(100mM)、KAc(80mM)、KCl(20mM)、MgCl2(6mM)，600μMdNTP，pH＝8.5。
qPCR扩增反应体系同实施例1的表2，其中样本类型分别为全血、血浆和血清，设置不含添加剂的对照组以及含有添加剂组合14的实验组，qPCR扩增反应程序同实施例1的表4，数据处理方法同实施例1，得到检测Ct值如表10所示。
表10不同类型样本获得的检测Ct值
| 样本类型 | 实验组(Ct值) | 对照组(Ct值) |
| 全血 | 24.51 | 未检出 |
| 血浆 | 24.85 | 未检出 |
| 血清 | 25.05 | 未检出 |
结果分析：如表10所示，与对照组相比，添加剂组合14在不同类型的血液样本中均能提高扩增灵敏度，说明本发明的添加剂兼容性高，适用于各种不同类型的血液样本。
实施例5
结合实施例2的结果，对添加剂组合14在染料法qPCR扩增反应体系中的兼容性进行探究。
按表11进行染料法qPCR扩增反应体系的配制，样本使用人全血样本，设置不含添加剂的对照组和含有添加剂组合14的实验组。
表11染料法qPCR扩增反应体系
| 2×AceQ Universal SYBR qPCR Master Mixa | 10μL |
| Primer-F(10μM) | 0.4μL |
| Primer-R(10μM) | 0.4μL |
| 样本 | 1μL |
| ddH2O | To20μL |
| 添加剂 | 组合14/不添加 |
a:Vazyme#Q511
反应体系配制完成后按表12所述程序进行qPCR扩增。
表12 qPCR反应程序
数据处理方法同实施例1，得到扩增曲线的检测Ct值如表13所示。
表13染料法qPCR检测Ct值
| 实验组 | 对照组 |
| 26.64 | 未检出 |
结果分析：如表13所示，与不含添加剂的对照组相比，添加剂组合14显著提高了实验组的扩增灵敏度，说明本发明的添加剂兼容性较好，不仅适用于探针法荧光定量qPCR，同时也适用于染料法荧光定量qPCR。
Claims (21)
1.一种qPCR扩增反应液，所述反应液包含样本、缓冲物质、金属盐、dNTPs、DNA聚合酶、引物、添加剂、探针和/或荧光染料，所述添加剂是牛血清蛋白(BSA)、棉子糖和二硫苏糖醇(DTT)中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的反应液，所述BSA在所述反应液中的浓度是100-1000ng/μl，优选100-900ng/μl，更优选100-800ng/μl。
3.根据权利要求1所述的反应液，所述棉子糖在所述反应液中的浓度是1-10ng/μl，优选1-9ng/μl，更优选1-8ng/μl。
4.根据权利要求1所述的反应液，所述DTT在所述反应液中的浓度是1-20mM，优选1-18mM，更优选1-15mM。
5.根据权利要求1所述的反应液，所述样本是核酸，或所述样本是血液，优选全血。
6.根据权利要求1所述的反应液，所述DNA聚合酶是耐热DNA聚合酶，优选Taq DNA聚合酶，更优选0.1-0.5U/μl的Taq DNA聚合酶。
7.根据权利要求1所述的反应液，所述引物包含至少一对上游引物和下游引物，优选地，所述上游引物和下游引物在所述反应液中的浓度是0.1-0.5μmol/L。
8.根据权利要求1所述的反应液，所述dNTP在所述反应液中的浓度是100-500μmol/L。
9.根据权利要求1所述的反应液，所述金属盐包括Mg2+盐，优选MgCl2，更优选1-10mmol/L的MgCl2。
10.根据权利要求9所述的反应液，所述金属盐还包括K+盐和Cs+盐中的一种或两种；优选地，所述金属盐还包括KCl、KAc和CsCl中的一种或多种；更优选地，所述金属盐还包括10-50mmol/L的KCl、10-80mmol/L的KAc和10-50mmol/L的CsCl中的一种或多种。
11.根据权利要求1所述的反应液，所述缓冲物质包括Tris、Tris-HCl、Tris碱或HEPES中的一种或多种，优选Tris，更优选10-80mmol/L的Tris。
12.根据权利要求1所述的反应液，所述探针是TaqMan探针，所述TaqMan探针在所述反应液中的浓度是0.1-0.5μmol/L，优选地，所述反应液还包括荧光定量PCR参比染料。
13.根据权利要求1所述的反应液，所述荧光染料是SYBRGreen或EvaGreenTM，优选SYBRGreen。
14.根据权利要求1所述的反应液，所述添加剂是200ng/μLBSA、3ng/μL棉子糖和4mMDTT中的一种或两种或三种；
或，所述添加剂是100ng/μLBSA、1ng/μL棉子糖和1mM DTT。
或，所述添加剂是200ng/μL BSA、1-10ng/μL棉子糖和1-10mM DTT，优选地，所述添加剂是200ng/μL BSA，1-5ng/μL棉子糖和1-5mM DTT。
或，所述添加剂是500ng/μL BSA，1-10ng/μL棉子糖和1-15mM DTT；优选地，所述添加剂是500ng/μL BSA，2-8ng/μL棉子糖和2-12mM DTT。
或，所述添加剂是100-800ng/μL BSA，1-10ng/μL棉子糖和1-15mM DTT中的一种或两种或三种；更优选地，所述添加剂是100-600ng/μLBSA，2-8ng/μL棉子糖和2-12mM DTT中的一种或两种或三种；最优选地，所述添加剂是200-500ng/μLBSA，2-6ng/μL棉子糖和2-10mMDTT中的一种或两种或三种。
15.一种扩增血液样本的方法，所述方法包括：
(1)提供血液样本，任选地，提取或不提取DNA；
(2)以所述血液样本为样本，或以从所述血液样本中提取的DNA为样本，
配制权利要求1-14任一项所述的qPCR扩增反应液；
(3)在合适的条件下进行qPCR扩增反应。
16.根据权利要求15所述的方法，所述血液样本包括全血、血清、血浆中的任意一种或多种，优选地，所述血液样本是全血样本。
17.根据权利要求15所述的方法，所述qPCR扩增反应包括预变性和循环反应；所述预变性的温度是90-98℃，例如92-96℃，例如95℃温育20s-60s，例如25s-40s，例如30s；所述循环反应包括95℃变性8-12s，在55-65℃退火并延伸10-30s，共40-50个循环。
18.一种扩增试剂盒，所述试剂盒包含缓冲物质、金属盐、dNTPs、DNA聚合酶、添加剂、探针和/或荧光染料，所述添加剂是牛血清蛋白(BSA)、棉子糖和二硫苏糖醇(DTT)中的一种或多种；
优选地，所述缓冲物质、金属盐、dNTPs、DNA聚合酶、添加剂、探针和荧光染料在试剂盒中的保存浓度是工作浓度的1-10倍，其中，
所述缓冲物质是Tris，所述Tris的工作浓度是10-80mmol/L；
所述金属盐包括Mg2+盐，优选MgCl2，所述MgCl2的工作浓度是1-10mmol/L；
所述金属盐还包括K+盐和Cs+盐中的一种或两种；优选30-100mmol/L K+盐和10-50mmol/L Cs+盐中的一种或两种，更优选10-50mmol/L KCl、10-80mmol/L KAc和10-50mmol/L CsCl中的一种或多种；
所述dNTPs的工作浓度是100-500μmol/L；
所述DNA聚合酶是Taq DNA聚合酶，所述Taq DNA聚合酶的工作浓度是0.1-0.5U/μl；
所述探针是TaqMan探针，所述TaqMan探针的工作浓度是0.1-0.5μmol/L；
所述BSA的工作浓度是100-1000ng/μl，优选100-800ng/μl；
所述棉子糖的工作浓度是1-10ng/μl，优选1-8ng/μl；
所述DTT的工作浓度是1-20mM，优选1-15mM。
19.一种添加剂在增强血液样本的PCR扩增效率中的用途，所述添加剂是100-1000ng/μl的牛血清蛋白(BSA)，1-20mM的二硫苏糖醇(DTT)和1-10ng/μl的棉子糖中的一种或多种。
20.根据权利要求19所述的用途，所述添加剂是200ng/μLBSA、3ng/μL棉子糖和4mM DTT中的一种或两种或三种；
或，所述添加剂是100ng/μLBSA、1ng/μL棉子糖和1mM DTT。
或，所述添加剂是200ng/μL BSA、1-10ng/μL棉子糖和1-10mM DTT，优选地，所述添加剂是200ng/μL BSA，1-5ng/μL棉子糖和1-5mM DTT。
或，所述添加剂是500ng/μL BSA，1-10ng/μL棉子糖和1-15mM DTT；优选地，所述添加剂是500ng/μL BSA，2-8ng/μL棉子糖和2-12mM DTT。
或，所述添加剂是100-800ng/μL BSA，1-10ng/μL棉子糖和1-15mM DTT中的一种或两种或三种；更优选地，所述添加剂是100-600ng/μLBSA，2-8ng/μL棉子糖和2-12mM DTT中的一种或两种或三种；最优选地，所述添加剂是200-500ng/μLBSA，2-6ng/μL棉子糖和2-10mMDTT中的一种或两种或三种。
21.根据权利要求19所述的用途，所述血液样本包括全血、血清、血浆中的任意一种或多种，优选地，所述血液样本是全血样本。
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