CN115852056A - 呼吸道病毒检测的荧光pcr试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学检测领域,具体涉及呼吸道病毒检测的荧光PCR试剂盒及检测方法。本发明构建了检测呼吸道并病毒甲型流感病毒、乙型流感病毒、人副流感病毒I型、人副流感病毒II型、人副流感病毒III型、呼吸道合胞病毒和偏肺病毒的特异性的引物组及探针,通过配套的PCR体系,以熔解曲线和融链温度特征峰为指标实现了单色检测通道完成多种呼吸道病原菌的同时检测,将现有的荧光PCR检测通量增加至少一倍,其成本低,耗时少,极大的提升了检测效率,可广泛用于多病原体混合检测分析,其检测结果可进一步用于辅助临床诊断和治疗。
Description
技术领域
本发明涉及生化检测领域,具体涉及呼吸道病毒检测的荧光PCR试剂盒及检测方法。
背景技术
呼吸道感染(Respiratory tract infection,RTI)是人类最常见的一类疾病,可以在任何性别、年龄和地域中发生,是全球范围内引起人群发病和死亡的最主要原因之一。呼吸道感染引起的临床症状和体征都较为相似,其临床表现主要为鼻炎、咽炎、喉炎、扁桃体炎等症状,严重的可引起气管炎、支气管炎及肺炎等,但不同病原体引起的感染,其治疗方法、疗效和病程也不尽相同。目前已证明,大部分呼吸道疾病是由细菌外的病原体引起,其中以呼吸道病毒最常见。常见的呼吸道病毒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、人偏肺病毒、腺病毒、呼吸道感染肠道病毒、冠状病毒、博卡病毒等。
在传统检测中,往往需要患者先抽血化验,但临床常规的生化指标分析无法对患者所感染的病原体种属做出准确鉴定,大多数临床治疗仍处于经验应用阶段,存在较大的盲目性。呼吸道病毒“金标准”是病毒的分离培养,一般病毒培养需要时间长,对实验室环境要求高,同时由于一些传染性和致病性强的呼吸道病毒,如寨卡病毒和人偏肺病毒等,在一般医院是无法进行培养,需要专业的机构才能进行。这种方法周期长、环境要求高,不仅耗费人力物力,对重症呼吸道感染患者来说还会延误宝贵救治时间,所以急需一种检测速度快、灵敏度高、结果准确呼吸道病毒检测方法,为快速检测、精准治疗提供一种有效的工具。目前市场上虽有一些检测呼吸道病原体的试剂盒,但是以单一靶标检测或分管检测为主,不能一次性检出多个病原菌,要检测多个靶标就需进行多次检测,耗时长,且检测流程不统一,操作复杂。
目前分子体外检测领域采用的技术主流是实时荧光PCR技术,但随着检测行业发展的需求,多基因、多病原体的检测变得越来越迫切,面对越来越复杂的复合性病原体感染的多靶点检测需求,多重PCR扩增以其高通量、高效率、低成本和少耗时的特性成为最理想和最快速的分子检测方法之一,但是在进行多重PCR扩增时,实验也不得不去面对新的问题,如现有的常用荧光定量仪器检测通道为4~5个,单管检测的靶基因数量一般也为4~5个,同时伴随体系中引物探针数目的增加,对引物探针的设计提出更高要求,这些因素都很大程度的影响多重实时定量PCR检测技术在检测领域的应用和推广。
发明内容
有鉴于此,本发明要解决的技术问题在于提供呼吸道病毒检测的荧光PCR试剂盒及检测方法。
本发明提供了引物探针组合,其包括:
用于检测检测甲型流感病毒的探针A和引物组,所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示;和/或
用于检测乙型流感病毒的探针B和引物组,所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示,下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示;和/或
用于检测呼吸道合胞病毒的探针C和引物组,所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示,下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示;和/或
用于检测副流感病毒1型的探针D和引物组,所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示,下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示;和/或
用于检测副流感病毒2型的探针E和引物组,所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示,下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示;和/或
用于检测副流感病毒3型的探针F和引物组,所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示,下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示;和/或
用于检测人偏肺病毒的探针G和引物组,所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示,下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
进一步的,本发明所述的引物探针组合还包括用于检测内标的探针H和引物组,所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示,下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:23所示。
本发明所述的引物探针组合中,
所述探针的5’端连接荧光报告基团,3’端连接荧光淬灭基团;
所述荧光报告基团选自FAM、HEX、ROX或CY5中的任意一种,所述荧光淬灭基团选自BHQ1或BHQ2中的任意一种;
所述探针A~H中,任意两者为一组,同一组中两个探针的5’端荧光报告基团相同。在本发明的一些具体的实施例中,所述用于检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的探针的5’端荧光报告基团和3’端荧光淬灭基团分别为FAM和BHQ1;所述用于检测呼吸道合胞病毒和副流感病毒1型的探针的5’端荧光报告基团和3’端荧光淬灭基团分别为ROX和BHQ2;所述用于检测副流感病毒2型和副流感病毒3型的探针的5’端荧光报告基团和3’端荧光淬灭基团分别为和HEX和BHQ2;所述用于检测人偏肺病毒和内标的探针的连接的荧光报告基团和荧光淬灭基团分别为CY5和BHQ2;
进一步的,所述探针A~H中同一组的两个探针,任意一种的TM为60~75℃,另外1种探针的Tm值比检测同一呼吸道病原菌的引物组的Tm值低0~30℃。
本发明中,对于单色光通道同时进行两种病原菌检测,要求检测两种病原菌的探针的的Tm值不同,其中一条探针Tm值较高,优选TM值为60~75℃,另外1条探针Tm值检测同一呼吸道病原菌的引物组的Tm值低0~30℃。本发明针对单色光检测通道检测不同病原菌的引物组和探针进行了多次尝试,在本发明的对比例中,针对同一检测通道的病原菌的引物组和探针也按此要求设置,结果表明,并非简单将单靶点引物探针组合即可得到成功的多重检测体系。
本发明所述探针中,
探针A的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示;
探针B的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示;
探针C的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示;
探针D的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示;
探针E的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示;
探针F的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示;
探针G的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示;
探针H的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示。
本发明提供了所述的引物探针组合在制备呼吸道病原菌检测的试剂盒中的应用。
本发明提供了呼吸道病原菌检测的试剂盒,其包括本发明所述的引物探针组合。
进一步的,所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液、Mn2+溶液、dNTPs溶液和rTth聚合酶中的至少一项。
本发明所述的试剂盒中,
所述PCR反应缓冲液的成分包括100mM的Tricine、200mM的KOAC和体积分数为0.1‰~1‰的NaN3;
所述Mn2+溶液的溶剂为水,其中Mn2+的使用浓度为3mM;
dNTPs溶液的溶剂为水,其中各dNTP的使用浓度为0.2mM;
rTth聚合酶的使用浓度为15U/80μL。
本发明提供了呼吸道病原菌的检测方法,其为本发明所述的引物探针组合或本发明所述的试剂盒对样本进行呼吸道病原菌检测。
进一步的,所述检测方法的步骤包括:获得模板后进行实时荧光PCR扩增,在扩增过程中检测荧光信号,得到检测结果。
所述检测方法的步骤中的模板可以为纯化RNA,也可混合的RNA,也可为分离提取的RNA,本发明对此不做限定;在本发明的一些具体实施例中,所述模板为分离提取的RNA,其通过磁珠法提取获得。
本发明通过检测实时荧光PCR扩增过程中的荧光信号,得到检测结果。
本发明的一些具体实施例中,单色光通道可同时对两种病原菌进行检测,检测时针对单色荧光通道中一个靶点的检测采用荧光探针,以荧光信号达到设定的阈值时所需的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准,Ct值小于等于40时为阳性,Ct值大于40时为阴性;另一个靶点的检测采用熔解曲线的方式,以熔解曲线法在Tm时有无特征峰作为阴阳性判定标准,在特定的Tm温度下,有特征峰,则为阳性,若无,则为阴性。
本发明所述的检测方法解决了荧光PCR检测受限于检测通道的瓶颈问题,上述用于联合检测多种呼吸道病毒的实时荧光定量RT-PCR检测体系、试剂盒及检测方法基于rTth酶水解荧光探针产生荧光信号及低Tm值探针在扩增阶段不与靶序列结合,从而避免rTth酶的水解,而在溶解阶段低Tm值荧光探针与扩增后产物杂交产生荧光信号的两种技术原理,针对单色荧光通道中一个靶点的检测采用荧光探针,另一个靶点的检测采用低Tm值荧光探针与扩增产物熔解曲线的方式,实现了在单色的荧光通道中同时进行两个靶点检测和分析,因而能够进行呼吸道多种病毒的联合检测,并将现有的荧光PCR检测通量增加一倍,可一次性检测多种病原体,有利于解决目前市场上病原体试剂盒检测靶标单一,无法同时获得多个靶标信息的问题。
进一步的,本发明所述的检测方法包括诊断目的和非诊断目的的检测方法,本发明对此不做限定。所述非诊断目的的检测方法,包括对环境样本的检测或以科研为目的的检测,其中所述环境样本包括但不限于:食物、饮用水、生活用水、生活废水或物体表面拭子。所述诊断目的的检测方法包括对人体或动物体或其离体样本进行检测。
本发明基于rTth酶水解荧光探针产生荧光信号及低Tm值探针在扩增阶段不与靶序列结合,从而避免rTth酶的水解,而在溶解阶段低Tm值荧光探针与扩增后产物杂交产生荧光信号的两种技术原理,有针对性的对单色光检测通道的病原菌的引物探针组合进行了差异化设计,检测结果不存在相互干扰,同时单色光探针TM值差值较大,低Tm探针熔解曲线法采取的是核酸杂交的方式,降低探针设计难度,尤其对于靶基因GC含量低的序列,拓宽PCR荧光探针法应用的范围。且所述特殊设计的引物组和探针配套PCR检测试剂和程序一起,完成单色光通道同时检测两种病原菌,进一步提高了检测通量,极大地提高了检测效率,节省了人力和物力。此外,采用多重荧光PCR扩增检测技术与传统的培养和免疫学检测比较,具有更高的灵敏度,同时避免了交叉反应,缩短了检测窗口期并有效提高样本周转效率。
本发明中,所述的样本包括但不限于为咽拭子、痰液、肺泡灌洗液或血液中的至少一项。
进一步的,所述述引物探针组合、试剂盒及检测方法在实时多重PCR检测平台开发时,与市面上已有的普通定量PCR仪的硬件设施兼容,从而达到解决现有荧光定量PCR仪器多重检测通道瓶颈问题,进而实现多重实时定量PCR检测的目的。
本发明构建了检测呼吸道并病毒甲型流感病毒、乙型流感病毒、人副流感病毒I型、人副流感病毒II型、人副流感病毒III型、呼吸道合胞病毒和偏肺病毒的特异性的引物组及探针,通过配套的PCR体系,以熔解曲线和融链温度特征峰为指标实现了单色检测通道完成多种呼吸道病原菌的同时检测,将现有的荧光PCR检测通量增加至少一倍,其成本低,耗时少,极大的提升了检测效率,可广泛用于多病原体混合检测分析,其检测结果可进一步用于辅助临床诊断和治疗。
附图说明
图1为FAM通道甲型流感病毒的阳性检测结果;
图2为ROX通道呼吸道合胞病毒的阳性检测结果;
图3为HEX通道副流感病毒2型的阳性检测结果;
图4为CY5通道内标检测结果;
图5为FAM通道乙型流感病毒的阳性检测结果;
图6为ROX通道副流感病毒1型检测结果;
图7为HEX通道副流感病毒3型的阳性检测结果;
图8为CY5通道人偏肺病毒检测结果;
图9为所有通道中阴性样本检测结果;
图10为灵敏度分析时FAM甲型流感病毒的检测结果;
图11为灵敏度分析时ROX通道呼吸道合胞病毒的检测结果;
图12为灵敏度分析时HEX通道副流感病毒2型的检测结果;
图13为灵敏度分析时FAM通道乙型流感病毒的检测结果;
图14为灵敏度分析时ROX通道副流感病毒1型的检测结果;
图15为灵敏度分析时HEX通道副流感病毒3型的检测结果;
图16为灵敏度分析时CY5通道人偏肺病毒的检测结果;
图17为甲型流感病毒用本发明的引物探针组合检测时,Ct值在25左右;
图18为甲型流感病毒用对比例引物探针组合检测时,Ct值在29左右;
图19为乙型流感病毒用对比例引物探针组合检测时,无特征峰;
图20为呼吸道合胞病毒用本发明的引物探针组合检测时,Ct值在25左右;
图21为呼吸道合胞病毒用对比例引物探针组合检测时,Ct值在32左右;
图22为副流感病毒1型用对比例引物探针组合检测时,无特征峰;
图23为副流感病毒2型用本发明的引物探针组合检测时,Ct值在24左右;
图24为副流感病毒2型用对比例引物探针组合检测时,Ct值在33左右;
图25为副流感病毒3型用对比例引物探针组合检测时,无特征峰;
图26为人偏肺病毒用对比例引物探针组合检测时,特征峰不明显;
图27为内标用本发明的引物探针组合检测时,Ct值在24左右;
图28为内标用对比例引物探针组合检测时,Ct值在32左右;
具体实施方式
本发明提供了呼吸道病毒检测的荧光PCR试剂盒及检测方法,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品,皆可于市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1试剂盒的制备
一、引物及探针设计
本实施例所提供的试剂盒包括序列如下的荧光PCR检测体系:SEQ ID NO.1~SEQIDNO.24,具体参见下表1。该试剂盒可特异性地检测多种呼吸道病毒,包括甲型流感病毒(IFV A)、乙型流感病毒(IFV B)、呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒1型(PIV1)、副流感病毒2型(PIV2)、副流感病毒3型(PIV3)及人偏肺病毒(hMPV)等,特异性高,检测便捷,临床应用范围广。
表1.引物
RNase P-F、RNase P-R和RNase P-P为内标引物探针。
可理解,在其他实施例中,该试剂盒中的荧光PCR检测体系可以包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、人偏肺病毒中的任两种的组合或任两种以上的组合,只要同一荧光通道中两种检测靶标对应即可。
二、实验步骤
1、样本RNA的提取
本实施例检测样本来源可以是咽拭子、鼻咽拭子等,用磁珠法提取RNA,在样本处理室进行如下操作:
1.1取适量1.5mL灭菌离心管,分别标记阴性对照(无核酸水)及待测样本,将30μL蛋白酶K、600μL阴性对照和样本、100μL磁珠混悬液(吸前混匀磁珠)、1.2mL裂解液加入1.5mL灭菌离心管中,混匀,于37℃培养箱中孵育2min;
1.2将孵育后的上述混合液磁吸1min 30s,弃废液;
1.3去磁,添加2mL洗液A,混匀,磁吸1min 30s,弃废液;
1.4去磁,添加2mL洗液B,混匀,磁吸1min 30s,弃废液(尽量减少残留);
1.5加100~300μL(按照后续实验要求添加)洗脱液,混匀,于80℃干式恒温器中解离5min;
1.6磁吸2min后,取提取或纯化产物用于后续实验。
2、实时荧光PCR扩增
取0.2mL PCR管,分别加入30μL PCR反应液和50μL上述洗脱液,盖上管盖,转移到扩增检测区。
本实施例所提供的实时荧光PCR扩增的反应体系如下表2所示,实时荧光定量RT-PCR扩增程序如下表3所示。
表2.实时荧光PCR扩增的反应体系
组份名称 | 每一个反应中的体积或浓度 |
Mn2+ | 4mM |
dNTPs(100mM) | 0.2mM |
Tth酶(5U/μl) | 15U |
SEQ ID NO:1~14 | 200nM |
SEQ ID NO:15~21 | 100nM |
SEQ ID NO:22~23 | 100nM |
SEQ ID NO:24 | 50nM |
模板量 | 50μl |
PCR buffer(1×) | Up to 80μL |
表3.实时荧光定量RT-PCR扩增程序
三、结果分析
本实施例所用TaqMan探针法荧光定量PCR其原理为:PCR扩增时同时加入一对引物的和一个特异性的荧光检测探针,该探针为一寡核苷酸,在5’标记一个荧光报告基团和在3’一个荧光淬灭基团,在探针完整状态时5’端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3’端荧光淬灭基团(发生荧光共振能量转移,FRET),检测不到该探针5’端荧光报告基团发出的荧光。但在PCR扩增中,在PCR反应退火时,TaqDNA聚合酶的5’~3’外切酶活性将探针5’端连接的荧光报告基团从探针上切割下来,游离于反应体系中,从而脱离3’端荧光淬灭基团的屏蔽,接受光刺激发出荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
荧光熔解曲线法的原理是:首先利用PCR扩增产生大量靶序列,由于熔解曲线用的探针Tm值比同一通道探针Tm值低5~30℃,在PCR反应阶段不能结合到模板上,所以不会产生荧光信号和Ct值,而在熔解曲线反应阶段,产生的靶序列与探针杂交,杂交产物具有特定的熔点,当温度低于扩增产物设计的Tm值时,扩增产物在体系中为相互杂交的DNA双链状态,此时探针处于游离状态,这时由于寡聚核苷酸的分子柔性,导致荧光报告基团与荧光猝灭基团的物理位置较近,进而荧光报告基团发出的荧光会被荧光猝灭基团所猝灭,体系检测的荧光信号会相应减弱;当温度高于扩增产物设计的Tm值时,扩增产物在体系中以DNA单链的形式存在,此时荧光探针与单链模板结合,探针的荧光基团与粹灭基团距离较远,故而荧光报告基团产生的荧光不能被荧光猝灭基团猝灭,体系可以检测到较强的荧光信号,因此,通过监测荧光信号的强弱变化就可以检测是否有目的序列扩增,进而就可以检测出是否有目的病原体。
本实施例的技术原理即是一个通道的其中一个靶点利用TaqMan探针法,通过Ct值来判读检测阴阳性,而同一通道中的另一个靶点利用的是熔解曲线分析法,通过是否有熔解曲线特征峰来判读检测阴阳性。
各通道分别确定基线及阈值:Baseline一般设置为3~15个循环,具体可根据实际情况进行调整。Threshold的设置:设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点。
首先分析内参在HEX(VIC)通道是否检测扩增曲线,且Ct≤35,若有,表示本次检测有效,可继续进行后续分析。
1)若FAM通道检测到扩增曲线,且Ct≤40,表示乙型流感病毒检测结果为阳性;若FAM通道检测到Tm(49~51℃)特征峰,表示甲型流感病毒检测结果为阳性;
2)若ROX通道检测到扩增曲线,且Ct≤40,表示呼吸道合胞病毒检测结果为阳性;若ROX通道检测到Tm(56~58℃)特征峰,表示副流感病毒1型检测结果为阳性;
3)若HEX(VIC)通道检测到扩增曲线,且Ct≤40,表示人副流感病毒2型检测结果为阳性;若HEX(VIC)通道检测到Tm(50~52℃)特征峰,表示人副流感病毒3型检测结果为阳性;
4)若CY5通道检测到Tm(50~52℃)特征峰,表示人偏肺病毒检测结果为阳性;
5)若CY5通道检测到扩增曲线,且Ct>35,表示内标检测结果为无效,表示本次检测样本浓度太低或者有干扰物质抑制反应及样本采集有问题,需重新检测。
2.结果
利用各靶标的阳性假病毒做模板,模拟实验样本,在宏石荧光定量PCR仪器(型号:SLAN-96P)上进行多重PCR检测,结果如图1至图8所示,图1为FAM通道甲型流感病毒的阳性检测结果;图2为ROX通道呼吸道合胞病毒的阳性检测结果;图3为HEX通道副流感病毒2型的阳性检测结果;图4为CY5通道内标检测结果;图5为FAM通道乙型流感病毒的阳性检测结果;图6为ROX通道副流感病毒1型检测结果;图7为HEX通道副流感病毒3型的阳性检测结果;图8为CY5通道人偏肺病毒检测结果。
实施例2试剂盒的检测灵敏度、准确度和特异性
(1)本发明试剂盒的检测灵敏度
针对7种病原体,分别设置不同浓度样本通过该检测试剂盒使用实时荧光定量RT-PCR的方法进行核酸扩增。
提取各病原体核酸,测定并计算核酸模板浓度,并按照比例稀释至5×104copies/mL,作为初始浓度,进行10倍的倍比稀释,最终获得5×103copies/mL、5×102copies/mL、50copies/mL、5copies/mL总计4个浓度梯度,以这些样本作为反应模板,按照该试剂盒加样方法进行实时荧光定量RT-PCR扩增,试剂盒检测结果如表4和图9至图16所示:
表4.各病原体灵敏度试验
结果显示本发明设计的引物探针组合,具有较强的灵敏度。甲型流感病毒引物探针的检测灵敏度达到50copies/mL,乙型流感病毒引物探针的检测灵敏度达到50copies/mL,呼吸道合胞病毒引物探针的检测灵敏度达到50copies/mL,副流感病毒1型引物探针的检测灵敏度达到50copies/mL,副流感病毒2型引物探针的检测灵敏度达到50copies/mL,副流感病毒3型引物探针的检测灵敏度达到50copies/mL,人偏肺病毒引物探针的检测灵敏度达到500copies/mL。
(2)本发明试剂盒的检测准确度及特异性
使用本发明试剂盒,检测15种病原体,其中7种病原体包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感1,2,3型(HPIV1,HPIV2,HPIV3)、人偏肺病毒(hMPV)以及8种其他病原体,包括麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、百日咳病毒、博卡病毒、人副流感病毒4型、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌。
提取各病原体核酸备用,使用该荧光PCR检测试剂盒反应体系,加入待检样本的核酸模板,使用该检测试剂盒建议反应程序进行实时荧光定量RT-PCR扩增,试剂盒准确度及特异性结果如表5所示:
表5.各病原体准确度及特异性试验
结果显示,7种病原体在各自对应的荧光通道出值,根据荧光检测结果显示为甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感1,2,3型(PIV1,PIV2,PIV3))、人偏肺病毒(hMPV)、军团菌。麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、百日咳病毒、博卡病毒、人副流感病毒4型、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌及阴性对照的通道均未出现扩增曲线和熔解曲线。
对比例1、本发明设计的其余的效果不好的引物和探针
在引物和探针设计过程中,发明人还设计了其余的引物和探针(所述表2中编号为2的构成一个组合物)同样用于检测所述病毒。具体序列如以下表6所示,在宏石荧光定量PCR仪器上使用阳性对照进行PCR检测,结果如图5~8和17~28所示。从图中可以看出:
甲型流感病毒用本发明的组合物检测时,Ct值在25左右,如图17;用对比例表2中的甲型流感病毒2检测时,Ct值在29左右,如图18。
乙型流感病毒用本发明的组合物检测时,有明显特征峰,如图5;用对比例表2中的乙型流感病毒2检测时,无特征峰,如图19。
呼吸道合胞病毒用本发明的组合物检测时,Ct值在25左右,如图20;用对比例表2中的呼吸道合胞病毒2检测时,Ct值在32左右,如图21。
副流感病毒1型用本发明的组合物检测时,有明显特征峰,如图6;用对比例表2中的副流感病毒1型2检测时,无特征峰,如图22。
副流感病毒2型用本发明的组合物检测时,Ct值在24左右,如图23;用对比例表2中的副流感病毒2型2检测时,Ct值在33左右,如图24。
副流感病毒3型用本发明的组合物检测时,有明显特征峰,如图7;用对比例表2中的副流感病毒3型2检测时,无特征峰,如图25。
人偏肺病毒用本发明的组合物检测时,有明显特征峰如图8;用对比例表2中的人偏肺病毒2检测时,特征峰不明显,如图26。
内标用本发明的组合物检测时,Ct值在24左右,如图27;用对比例表2中的内标2检测时,Ct值在32左右,如图28。
由此可见在多重荧光PCR体系的构建中,并非简单将单靶点引物探针组合即可得到成功的多重检测体系,稳定的多重体系设计和构建需要多次调整和优化。
表6.对比例引物
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.检测呼吸道病原菌的引物探针组合,其特征在于,包括:
用于检测检测甲型流感病毒的探针A和引物组,所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示;和/或
用于检测乙型流感病毒的探针B和引物组,所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQID NO:3所示,下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示;和/或
用于检测呼吸道合胞病毒的探针C和引物组,所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示,下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示;和/或
用于检测副流感病毒1型的探针D和引物组,所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示,下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示;和/或
用于检测副流感病毒2型的探针E和引物组,所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示,下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示;和/或
用于检测副流感病毒3型的探针F和引物组,所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示,下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示;和/或
用于检测人偏肺病毒的探针G和引物组,所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQID NO:13所示,下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合,其特征在于,还包括用于检测内标的探针H和引物组,所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示,下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示。
3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合,其特征在于,
所述探针的5’端连接荧光报告基团,3’端连接荧光淬灭基团;
所述荧光报告基团选自FAM、HEX、ROX或CY5中的任意一种,所述荧光淬灭基团选自BHQ1或BHQ2中的任意一种;
所述探针A~H中,任意两者为一组,同一组中两个探针的5’端荧光报告基团相同;
并且,同一组的两个探针中,任意一种的TM为60~75℃,另外1种探针的Tm值比检测同一呼吸道病原菌的引物组的Tm值低0~30℃。
4.根据权利要求1~3任一项所述的引物探针组合,其特征在于,
所述探针A的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示;
所述探针B的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示;
所述探针C的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示;
所述探针D的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示;
所述探针E的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示;
所述探针F的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示;
所述探针G的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示;
所述探针H的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示。
5.权利要求1~4任一项所述的引物探针组合在制备呼吸道病原菌检测的试剂盒中的应用。
6.呼吸道病原菌检测的试剂盒,其包括权利要求1~4任一项所述的引物探针组合。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液、Mn2+溶液、dNTPs溶液和rTth聚合酶中的至少一项。
8.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,
所述PCR反应缓冲液的成分包括100mM Tricine、200mM KOAC和体积分数为0.1‰~1‰的NaN3;
所述Mn2+溶液的溶剂为水,其中Mn2+的使用浓度为3mM;
dNTPs溶液的溶剂为水,其中各dNTP的使用浓度为0.2mM;
rTth聚合酶的使用浓度为15U/80μL。
9.呼吸道病原菌的检测方法,其特征在于,其为利用权利要求1~4所述的引物探针组合或权利要求6或7所述的试剂盒对样本进行呼吸道病原菌检测。
10.根据权利要求9所述的检测方法,其特征在于,所述样本包括为咽拭子、痰液、肺泡灌洗液或血液中的至少一项。
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---|---|---|---|---|
CN118272556A (zh) * | 2024-06-03 | 2024-07-02 | 上海美吉生物医药科技有限公司 | 用于呼吸道细菌靶标核酸多联检的荧光pcr多重检测体系、试剂盒及检测方法 |
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2022
- 2022-12-07 CN CN202211563528.0A patent/CN115852056A/zh active Pending
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