CN113186342A - 一种18联呼吸道病毒核酸联合检测装置 - Google Patents

一种18联呼吸道病毒核酸联合检测装置 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种18联呼吸道病毒核酸联合检测装置，属于荧光定量PCR的核酸检测技术领域。采用实时荧光定量PCR，扩增时加入18对引物和病毒特异性的荧光探针，探针为寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个淬灭荧光基团。检测分4组，其中3组为RNA标本，需要先进行反转录RT操作，得到DNA单链，每组为一个PCR反应管，提前预装了反应缓冲液以及引物和探针，其中包括了一个内参照品的引物及探针，检测到特异病毒时，对应的探针被降解，使报告基团释放出荧光信号，产生阳性结果。本发明采用多通道检测方案，任何重叠感染均可同时检出所有病原体，适用于人鼻咽拭子、口咽拭子、鼻腔擦拭液、鼻咽分泌物和支气管肺泡灌洗液样本，以及经过NaOH处理的痰液标本。

Description

一种18联呼吸道病毒核酸联合检测装置
技术领域
本发明涉及荧光定量PCR的核酸检测技术领域，具体是一种18联呼吸道病毒核酸联 合检测装置。
背景技术
呼吸道感染病原学复杂，包括细菌、病毒、支原体、衣原体、真菌等，其中80％ 以上是病毒性的。该病四季、任何年龄均可发病，通过含有病毒的飞沫、雾滴，或经污 染的用具进行传播。研究表明，有较多的呼吸道感染属于多重病毒感染(29％)。常于机 体抵抗力降低时，如受寒、劳累、淋雨等情况，原已存在或由外界侵入的病毒或/和细 菌，迅速生长繁殖，导致感染，一般5-7天痊愈。常继发支气管炎、肺炎、副鼻窦炎， 少数人可并发急性心肌炎、肾炎、风湿热等。呼吸道感染是世界范围内低龄儿童(<5 岁)死亡的首位原因，儿童上呼吸道感染的患病次数平均为3-8次/年，下呼吸道感染 率比URTI低，在1岁儿童中感染的比例约1～3％，学龄儿童至5％～10％。呼吸道病毒 习惯上是指侵害呼吸道的病毒，至少涉及到8个科，200多种型别的病毒。临床常见的 可导致呼吸道感染的病毒有腺病毒(AdV)、甲型流感病毒(FluA和FluB)、呼吸道合胞病 毒(RSV)，人偏肺病毒(MPV)、副流感病毒1-4型(PIVl-PIV4)、鼻病毒(hRV)、冠状病毒 (OC43、229E/NL63)、肠道病毒(hEV)和人博卡病毒(hBoV)，新冠状病毒(COVID-19)， 风疹，流行性腮腺炎。
呼吸道病毒是呼吸道感染最重要的病原体之一，随着抗病毒药物的广泛应用，越来 越多的病毒对抗感染的一线药物产生耐药性，且近年来不断有新发病毒威胁着全人类的 健康，而快速、灵敏、特异的检测方法有助于疫情暴发流行的控制和防止药物的滥用。传统呼吸道检测依赖于免疫学方法和组织分离培养，虽然组织分离培养为金标准，但是 检测时间需要几天甚至几周，因此其结果很难用于临床治疗的指导。免疫学方法虽然其 检测快速，在几个小时内得到结果，但是假阳性较高。目前，分子检测技术以其高灵敏、 高特异、快速的特点日渐成熟，荧光定量PCR的核酸检测高通量平台是目前最具有发 展前景的病毒检测方法。荧光定量PCR的方法通过其定量可以直接反应患者的感染情 况，并且能够进行定期检测达到指导预后的效果，对临床诊断具有标志性意义。
目前公布的相关类型的病毒检测均是介绍的单一的检测方法，对重叠感染则不能同 时检出所有病原体，检测效率低。
发明内容
本发明提供一种18联呼吸道病毒核酸联合检测装置，以解决呼吸道病毒单一检测存在对重叠感染则不能同时检出所有病原体，检测效率低的问题。
本发明采取的技术方案是：包括下列试剂：
管1：
DNA QPCR Supermix 2X 30μL；
(1)、流行性感冒病毒A型FluA特异性基因片段的序列如SEQ ID No.1所示，其 引物是：
正向引物1，5’-CACCCTTGGCCTCGACATTA-3’：0.5μL；
反向引物1，5’-ATTTCCTCGAGGGTCATGTC-3’：0.5μL；
探针1，FAM-5’-GAATCCAGCGAGACACTTAG-3’-BHQ-1：0.5μL；
(2)流行性感冒病毒B型FluB特异性基因片段的序列如SEQ ID No.2所示，其 引物是：
正向引物2，5’-ACAAAAGATGCTTAACTGAT-3’：0.5μL；
反向引物2，5’-GAATCAGGCCTTTCTTTTTT-3’：0.5μL；
探针2，HEX-5’-GACCAGGAAAGAAAAAGAAG-3’-BHQ-1：0.5μL；
(3)呼吸道合胞病毒A型RSVA特异性基因片段的序列如SEQ ID No.3所示，其 引物是：
正向引物3，5’-GGAAGTACTCACTACCAAGC-3’：0.5μL；
反向引物3，5’-GGAAGTACTCACTACCAAGC-3’：0.5μL；
探针3，Cy3-5’-CACTGCTCACCTCCAACACC-3’-BHQ-1：0.5μL；
(4)呼吸道合胞病毒B型RSVB特异性基因片段的序列如SEQ ID No.4所示，其 引物是：
正向引物4，5’-CCATTAACCCAACAAAAAAA-3’：0.5μL；
反向引物4，5’-TTGATGTGGTTGTGTCAAGC-3’：0.5μL；
探针4，Cy5-5’-CCACTGTGCTCGACATAACC-3’-BHQ-1：0.5μL；
(5)人偏肺病毒MPV特异性基因片段的序列如SEQ ID No.5所示，其引物是：
正向引物5，5’-TCTGTGTCAACATGCCACCG-3’：0.5μL；
反向引物5，5’-GTAGATGATTCTCTGAGGTT-3’：0.5μL；
探针5，ROX-5’-CCACAGCAGGCAACACAGTT-3’-BHQ-1：0.5μL；
内参照品GAPDH，其引物是：
正向引物19，5’-TAACTCTGGTAAAGTGGATA-3’，0.5μL；
反向引物19，5’-GATTTCCATTGATGACAAGC-3’，0.5μL；
探针19，TAMRA-5’-GTTTACATGTTCCAATATGA-3’-BHQ-1：0.5μL；
管2：
DNA QPCR Supermix 2X 30μL；
(6)冠状病毒OC43特异性基因片段的序列如SEQ ID No.6所示，其引物是：
正向引物6，5’-ACTTCTCAGCAACCATCAGG-3’：0.5μL；
反向引物6，5’-CCCCTTAGCTTCAGTAGCTG-3’：0.5μL；
探针6，FAM-5’-GGTTCTCTGGAATTACTCAG-3’-BHQ-1：0.5μL；
(7)冠状病毒229E特异性基因片段的序列如SEQ ID No.7所示，其引物是：
正向引物7，5’-TTTGACAAGCCTCAGGAAAA-3’：0.5μL；
反向引物7，5’-CATTTCATGCTTTTGTTCTT-3’：0.5μL；
探针7，HEX-5’-CGGGTACTCCTAAGCCTTCT-3’-BHQ-1：0.5μL；
(8)副流感病毒1型PIVl特异性基因片段的序列如SEQ ID No.8所示，其引物是：
正向引物8，5’-TTTGACCATCCTTTTTCTGC-3’：0.5μL；
反向引物8，5’-CTGATTAACATTGGGACATT-3’：0.5μL；
探针8，Cy3-5’-GATACACTCGTTTTCCTAGG-3’-BHQ-1：0.5μL；
(9)副流感病毒2型PIV2特异性基因片段的序列如SEQ ID No.9所示，其引物是：
正向引物9，5’-GGATCTATCACCTAGGCTTT-3’：0.5μL；
反向引物9，5’-CTGCTGCAGCCCGTTCACTG-3’：0.5μL；
探针9，Cy5-5’-CCTTCCTACAACGAGCAGTC-3’-BHQ-1：0.5μL；
(10)副流感病毒3型PIV3特异性基因片段的序列如SEQ ID No.10所示，其引物是：
正向引物10，5’-TCGGATAATACTAATGATCT-3’：0.5μL；
反向引物10，5’-ATCATTTCTAATTGCAATTT-3’：0.5μL；
探针10，ROX-5’-CAATTCAGAGTCATGTCCAG-3’-BHQ-1：0.5μL；
内参照品GAPDH，其引物是：
正向引物19，5’-TAACTCTGGTAAAGTGGATA-3’，0.5μL；
反向引物19，5’-GATTTCCATTGATGACAAGC-3’，0.5μL；
探针19，TAMRA-5’-GTTTACATGTTCCAATATGA-3’-BHQ-1：0.5μL；
管3：
DNA QPCR Supermix 2X 30μL；
(11)副流感病毒4型PIV4特异性基因片段的序列如SEQ ID No.11所示，其引物是：
正向引物11，5’-CATGACCAAAAATGAAACAG 3’：0.5μL；
反向引物11，5’-CCTACCCCTGGTGAGATGTG-3’：0.5μL；
探针11FAM-5’-GGTACCGTCAAAGAGCGTAT-3’-BHQ-1，：0.5μL；
(12)鼻病毒HRV特异性基因片段的序列如SEQ ID No.12所示，其引物是：
正向引物12，5’-GTGAACCTGGTGATTGTGGT-3’：0.5μL；
反向引物12，5’-GCATGTGTATATAATCAGTA-3’：0.5μL；
探针12，HEX-5’-CACAGCTGGTGGTGAGGGTC 3’-BHQ-1：0.5μL；
(13)肠道病毒HEV特异性基因片段的序列如SEQ ID No.13所示，其引物是：
正向引物13，5’-CCAAGTGATACCATGCAAAC-3’：0.5μL；
反向引物13，5’-CACTCCGCATAGCGCTTTAA-3’：0.5μL；
探针13，Cy3-5’-CCTGTGTAGGGCCGCATGTG-3’-BHQ-1：0.5μL；
(14)新冠状病毒COVID-19特异性基因片段的序列如SEQ ID No.14所示，其引 物是：
正向引物14，5’-CAATAATACTGCGTCTTGGT-3’：0.5μL；
反向引物14，5’-CCACGAATTCGTCTGGTAGC-3’：0.5μL；
探针14，Cy5-5’-CGAGGACAAGGCGTTCCAAT-3’-BHQ-1：0.5μL；
(15)流行性腮腺炎病毒HMV特异性基因片段的序列如SEQ ID No.15所示，其 引物是：
正向引物15，5’-GAGTAATTTGCTTCTTCCAA-3’：0.5μL；
反向引物15，5’-GAGACAGCGGCAGTTACTTG-3’：0.5μL；
探针15，ROX-5’-CGCCCTCACCTGGGTCAAGA-3’-BHQ-1：0.5μL；
内参照品GAPDH，其引物是：
正向引物19，5’-TAACTCTGGTAAAGTGGATA-3’，0.5μL；
反向引物19，5’-GATTTCCATTGATGACAAGC-3’，0.5μL；
探针19，TAMRA-5’-GTTTACATGTTCCAATATGA-3’-BHQ-1：0.5μL；
管4：
DNA QPCR Supermix 2X 30μL；
(16)腺病毒AdV特异性基因片段的序列如SEQ ID No.16所示，其引物是：
正向引物16，5’-AGATACTTTAGTATGTGGAA-3’：0.5μL；
反向引物16，5’-TGGTTCCACACCTTGGTATG-3’：0.5μL；
探针16，FAM-5’-CGGTGTGGAGGACGAACTTC-3’-BHQ-1：0.5μL；
(17)人博卡病毒HBoV特异性基因片段的序列如SEQ ID No.17所示，其引物是：
正向引物17,5’-GCAACCATCTGACTCAATGG-3’：0.5μL；
反向引物17,5’-GTGTTTTTTGTTATGACATA-3’：0.5μL；
探针17,HEX-5’-GGGAGGGGGGAAAGGTTCTG-3’-BHQ-1：0.5μL；
(18)人风疹病毒HRV特异性基因片段的序列如SEQ ID No.18所示，其引物是：
正向引物18，5’-GAATTACACCGGCAATCAGC-3’：0.5μL；
反向引物18，5’-ACCAGGCGCAGCCGGGGGCG-3’：0.5μL；
探针18，Cy3-5’-GCCACGGCCCCGATTGGGCC-3’-BHQ-1：0.5μL；
内参照品GAPDH，其引物是：
正向引物19，5’-TAACTCTGGTAAAGTGGATA-3’，0.5μL；
反向引物19，5’-GATTTCCATTGATGACAAGC-3’，0.5μL；
探针19，TAMRA-5’-GTTTACATGTTCCAATATGA-3’-BHQ-1：0.5μL。
本发明所述内参照品GAPDH的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示。
本发明还包括内参照品荧光染料TAMRA。
本发明的优点是：提供了一种流行性感冒病毒A型FluA，流行性感冒病毒B型FluB，呼吸道合胞病毒A型RSVA，呼吸道合胞病毒B型RSVB，腺病毒AdV，人偏 肺病毒MPV，冠状病毒OC43，冠状病毒229E，副流感病毒1型PIVl，副流感病毒2 型PIV2，副流感病毒3型PIV3，副流感病毒4型PIV4，鼻病毒HRV，肠道病毒HEV， 人博卡病毒HBoV，新冠状病毒COVID-19，人风疹病毒HRV，流行性腮腺炎病毒HMV18 联核酸定量检测试剂盒，辅助诊断18种多呼吸道病毒的感染。本发明配套普通PCR仪、 QuantStudio 3，ABI 7500，Step One Plus，ViiA7，Bio-Rad CFX96等多种常用型号的荧 光定量PCR仪上实现，其它型号只要包括FAM、TAMRA、ROX、TET通道的荧光定 量PCR仪也可使用进行检测。无需繁琐的设置运行程序，只需选择检测项目和标定样 品名称，反应完毕后，后台软件针对性分析数据，直接给出检测报告，方便快捷。
本发明对18种病毒进行定性同时进行定量检测，并采用单管多通道的检测方案，引物及探针设计较为复杂，难度系数大，所采用的18种病毒的特异性强的基因片段可 以有效的区别于其他病毒，能够更好的减少假阳性的检测结果。检测到特异病毒时， 对应的探针被降解，使报告基团释放出荧光信号，产生阳性结果，任何重叠感染均可同 时检出所有病原体。
本发明适用于人鼻咽拭子、口咽拭子、鼻腔擦拭液、鼻咽分泌物和支气管肺泡灌洗液样本，以及经过NaOH处理的痰液标本。
附图说明
图1是管1的阳性标准品结果图；
图2是管2的阳性标准品结果图；
图3是管3的阳性标准品结果图；
图4是管4的阳性标准品结果图；
图5是阳性标准品梯度实验结果图。
具体实施方式
包括下列试剂：
管1：
DNA QPCR Supermix 2X 30μL；
(1)、流行性感冒病毒A型FluA特异性基因片段的序列如SEQ ID No.1所示，其 引物是：
正向引物1，5’-CACCCTTGGCCTCGACATTA-3’：0.5μL；
反向引物1，5’-ATTTCCTCGAGGGTCATGTC-3’：0.5μL；
探针1，FAM-5’-GAATCCAGCGAGACACTTAG-3’-BHQ-1：0.5μL；
(2)流行性感冒病毒B型FluB特异性基因片段的序列如SEQ ID No.2所示，其 引物是：
正向引物2，5’-ACAAAAGATGCTTAACTGAT-3’：0.5μL；
反向引物2，5’-GAATCAGGCCTTTCTTTTTT-3’：0.5μL；
探针2，HEX-5’-GACCAGGAAAGAAAAAGAAG-3’-BHQ-1：0.5μL；
(3)呼吸道合胞病毒A型RSVA特异性基因片段的序列如SEQ ID No.3所示，其 引物是：
正向引物3，5’-GGAAGTACTCACTACCAAGC-3’：0.5μL；
反向引物3，5’-GGAAGTACTCACTACCAAGC-3’：0.5μL；
探针3，Cy3-5’-CACTGCTCACCTCCAACACC-3’-BHQ-1：0.5μL；
(4)呼吸道合胞病毒B型RSVB特异性基因片段的序列如SEQ ID No.4所示，其 引物是：
正向引物4，5’-CCATTAACCCAACAAAAAAA-3’：0.5μL；
反向引物4，5’-TTGATGTGGTTGTGTCAAGC-3’：0.5μL；
探针4，Cy5-5’-CCACTGTGCTCGACATAACC-3’-BHQ-1：0.5μL；
(5)人偏肺病毒MPV特异性基因片段的序列如SEQ ID No.5所示，其引物是：
正向引物5，5’-TCTGTGTCAACATGCCACCG-3’：0.5μL；
反向引物5，5’-GTAGATGATTCTCTGAGGTT-3’：0.5μL；
探针5，ROX-5’-CCACAGCAGGCAACACAGTT-3’-BHQ-1：0.5μL；
内参照品GAPDH，其引物是：
正向引物19，5’-TAACTCTGGTAAAGTGGATA-3’，0.5μL；
反向引物19，5’-GATTTCCATTGATGACAAGC-3’，0.5μL；
探针19，TAMRA-5’-GTTTACATGTTCCAATATGA-3’-BHQ-1：0.5μL；
管2：
DNA QPCR Supermix 2X 30μL；
(6)冠状病毒OC43特异性基因片段的序列如SEQ ID No.6所示，其引物是：
正向引物6，5’-ACTTCTCAGCAACCATCAGG-3’：0.5μL；
反向引物6，5’-CCCCTTAGCTTCAGTAGCTG-3’：0.5μL；
探针6，FAM-5’-GGTTCTCTGGAATTACTCAG-3’-BHQ-1：0.5μL；
(7)冠状病毒229E特异性基因片段的序列如SEQ ID No.7所示，其引物是：
正向引物7，5’-TTTGACAAGCCTCAGGAAAA-3’：0.5μL；
反向引物7，5’-CATTTCATGCTTTTGTTCTT-3’：0.5μL；
探针7，HEX-5’-CGGGTACTCCTAAGCCTTCT-3’-BHQ-1：0.5μL；
(8)副流感病毒1型PIVl特异性基因片段的序列如SEQ ID No.8所示，其引物是：
正向引物8，5’-TTTGACCATCCTTTTTCTGC-3’：0.5μL；
反向引物8，5’-CTGATTAACATTGGGACATT-3’：0.5μL；
探针8，Cy3-5’-GATACACTCGTTTTCCTAGG-3’-BHQ-1：0.5μL；
(9)副流感病毒2型PIV2特异性基因片段的序列如SEQ ID No.9所示，其引物是：
正向引物9，5’-GGATCTATCACCTAGGCTTT-3’：0.5μL；
反向引物9，5’-CTGCTGCAGCCCGTTCACTG-3’：0.5μL；
探针9，Cy5-5’-CCTTCCTACAACGAGCAGTC-3’-BHQ-1：0.5μL；
(10)副流感病毒3型PIV3特异性基因片段的序列如SEQ ID No.10所示，其引物是：
正向引物10，5’-TCGGATAATACTAATGATCT-3’：0.5μL；
反向引物10，5’-ATCATTTCTAATTGCAATTT-3’：0.5μL；
探针10，ROX-5’-CAATTCAGAGTCATGTCCAG-3’-BHQ-1：0.5μL；
内参照品GAPDH，其引物是：
正向引物19，5’-TAACTCTGGTAAAGTGGATA-3’，0.5μL；
反向引物19，5’-GATTTCCATTGATGACAAGC-3’，0.5μL；
探针19，TAMRA-5’-GTTTACATGTTCCAATATGA-3’-BHQ-1：0.5μL；
管3：
DNA QPCR Supermix 2X 30μL；
(11)副流感病毒4型PIV4特异性基因片段的序列如SEQ ID No.11所示，其引物是：
正向引物11，5’-CATGACCAAAAATGAAACAG 3’：0.5μL；
反向引物11，5’-CCTACCCCTGGTGAGATGTG-3’：0.5μL；
探针11FAM-5’-GGTACCGTCAAAGAGCGTAT-3’-BHQ-1，：0.5μL；
(12)鼻病毒HRV特异性基因片段的序列如SEQ ID No.12所示，其引物是：
正向引物12，5’-GTGAACCTGGTGATTGTGGT-3’：0.5μL；
反向引物12，5’-GCATGTGTATATAATCAGTA-3’：0.5μL；
探针12，HEX-5’-CACAGCTGGTGGTGAGGGTC 3’-BHQ-1：0.5μL；
(13)肠道病毒HEV特异性基因片段的序列如SEQ ID No.13所示，其引物是：
正向引物13，5’-CCAAGTGATACCATGCAAAC-3’：0.5μL；
反向引物13，5’-CACTCCGCATAGCGCTTTAA-3’：0.5μL；
探针13，Cy3-5’-CCTGTGTAGGGCCGCATGTG-3’-BHQ-1：0.5μL；
(14)新冠状病毒COVID-19特异性基因片段的序列如SEQ ID No.14所示，其引 物是：
正向引物14，5’-CAATAATACTGCGTCTTGGT-3’：0.5μL；
反向引物14，5’-CCACGAATTCGTCTGGTAGC-3’：0.5μL；
探针14，Cy5-5’-CGAGGACAAGGCGTTCCAAT-3’-BHQ-1：0.5μL；
(15)流行性腮腺炎病毒HMV特异性基因片段的序列如SEQ ID No.15所示，其 引物是：
正向引物15，5’-GAGTAATTTGCTTCTTCCAA-3’：0.5μL；
反向引物15，5’-GAGACAGCGGCAGTTACTTG-3’：0.5μL；
探针15，ROX-5’-CGCCCTCACCTGGGTCAAGA-3’-BHQ-1：0.5μL；
内参照品GAPDH，其引物是：
正向引物19，5’-TAACTCTGGTAAAGTGGATA-3’，0.5μL；
反向引物19，5’-GATTTCCATTGATGACAAGC-3’，0.5μL；
探针19，TAMRA-5’-GTTTACATGTTCCAATATGA-3’-BHQ-1：0.5μL；
管4：
DNA QPCR Supermix 2X 30μL；
(16)腺病毒AdV特异性基因片段的序列如SEQ ID No.16所示，其引物是：
正向引物16，5’-AGATACTTTAGTATGTGGAA-3’：0.5μL；
反向引物16，5’-TGGTTCCACACCTTGGTATG-3’：0.5μL；
探针16，FAM-5’-CGGTGTGGAGGACGAACTTC-3’-BHQ-1：0.5μL；
(17)人博卡病毒HBoV特异性基因片段的序列如SEQ ID No.17所示，其引物是：
正向引物17,5’-GCAACCATCTGACTCAATGG-3’：0.5μL；
反向引物17,5’-GTGTTTTTTGTTATGACATA-3’：0.5μL；
探针17,HEX-5’-GGGAGGGGGGAAAGGTTCTG-3’-BHQ-1：0.5μL；
(18)人风疹病毒HRV特异性基因片段的序列如SEQ ID No.18所示，其引物是：
正向引物18，5’-GAATTACACCGGCAATCAGC-3’：0.5μL；
反向引物18，5’-ACCAGGCGCAGCCGGGGGCG-3’：0.5μL；
探针18，Cy3-5’-GCCACGGCCCCGATTGGGCC-3’-BHQ-1：0.5μL；
内参照品GAPDH，其引物是：
正向引物19，5’-TAACTCTGGTAAAGTGGATA-3’，0.5μL；
反向引物19，5’-GATTTCCATTGATGACAAGC-3’，0.5μL；
探针19，TAMRA-5’-GTTTACATGTTCCAATATGA-3’-BHQ-1：0.5μL。
本发明所述内参照品GAPDH的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示。
本发明还包括内参照品荧光染料TAMRA。
本发明采用多通道实时荧光定量PCR(TaqMan探针法)，扩增时同时加入18对引物和 与之对应的18个病毒特异性的荧光探针。探针为寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个淬灭荧光基团。检测分4组，其中3组为RNA标本，需要先进行反转录RT操 作，得到DNA单链，其中组1，组2和组3需要加入反转录后的样本，组4直接加入样本 无需转录，按照检测组成加入相应的引物及探针。
病毒反转录RT反应目录如下：
病毒名称 种类 反转录RT
1、流行性感冒病毒A型FluA RNA Virus 是
2、流行性感冒病毒B型FluB RNA Virus 是
3、呼吸道合胞病毒A型 RNA Virus 是
4、呼吸道合胞病毒B型 RNA Virus 是
5、人偏肺病毒MPV RNA Virus 是
6、冠状病毒OC43 RNA Virus 是
7、冠状病毒229E RNA Virus 是
8、副流感病毒1型PIVl RNA Virus 是
9、副流感病毒2型PIV2 RNA Virus 是
10、副流感病毒3型PIV3 RNA Virus 是
11、副流感病毒4型PIV4 RNA Virus 是
12、鼻病毒HRV RNA Virus 是
13、肠道病毒HEV RNA virus 是
14、新冠状病毒COVID-19 RNA virus 是
15、流行性腮腺炎病毒HMV RNA virus 是
16、腺病毒AdV dsDNA Virus 否
17、人博卡病毒HBoV ssDNA virus 否
18、人风疹病毒HRV ssDNA virus 否
每组为一个PCR反应管，提前预装了反应缓冲液以及引物和探针，其中包括了一个内参照品的引物及探针，用来检测Q-PCR的反应是否正常，-20度下保存。
检测到特异病毒时，对应的探针被降解，使报告基团释放出荧光信号，产生阳性结果。本发明采用多通道检测方案，任何重叠感染均可同时检出所有病原体。
其中，检测反应液中6种特异性探针的标记报告基团分别选用的是FAM、HEX、 Cy3、Cy5、ROX、TAMRA，淬灭基团为BHQ-1；
FAM基团的激发波长为494nm，发射波长为517nm；
HEX基团的激发波长为535nm，发射波长为553nm；
Cy3基团的激发波长为550nm，发射波长为570nm；
CY-5基团的发射波长为646nm，发射波长为664nm；
ROX基团的发射波长为587nm，发射波长为607nm；
TAMRA基团的发射波长为560nm，发射波长为583nm；
FAM、HEX、Cy3、Cy5、ROX和TAMRA基团激发波长和发射波长之间没有交叉 重叠区段，故均不存在相互干扰的现象，进而实现了5种病毒同时进行特异性检测。
该检测试剂盒配套普通PCR仪、QuantStudio 3，ABI 7500，Step One Plus，ViiA7， Bio-Rad CFX96等多种常用型号的荧光定量PCR仪上实现，其它型号只要包括FAM、TAMRA、ROX、TET通道的荧光定量PCR仪也可使用进行检测。无需繁琐的设置运 行程序，只需选择检测项目和标定样品名称，反应完毕后，后台软件针对性分析数据， 直接给出检测报告，方便快捷。
下边通过实验例来进一步说明本发明。
阳性标准品通过基因合成公司，将所描述的需检测的片段合成，并以此为模板，利用相关引物、dNTPs、dUTP、10*taq buffer、Taq酶为反应体系扩增获阳性参考品，然 后通过PCR纯化试剂盒纯化PCR产物，用分光光度计测得各个阳性参考品的OD值， 利用拷贝数换算公式获得浓度。并依次稀释至5×107copies～5×10copies七个梯度，并 分别加入阳性反应液中配制成阳性定量标准品，阴性对照用临床阴性样本经过裂解液处 理后加入阴性反应液中制成阴性对照品。
每个梯度的阳性标准品为1mL，共7mL，阴性标准品为1mL(备用)。将七个梯度 的标准品同时进行检测，可得到一个目标基因片段的含量梯度结果，并可根据结果计算 出标准质量曲线可用于测算样本检测结果。在检测过程中可根据实际情况需要进行设置 标准质控品梯度实验，然后计算并导出标准曲线用于测算样本中目标基因的浓度， CT＝35设定为最低检测点，样本CT值大于35既可以认定为阴性结果，不含有目标基 因片段。
实验例1阳性标准品测试方法：
1、任意选择一个浓度的阳性标准品，将20μL的含有阳性标准品试剂加入到含有30μL预装有DNA QPCR Supermix 2X，混合引物，混合探针的PCR反应管中进行混合；
2、充分混合后放入到Q-PCR反应仪器中；
3、上机设定PCR程序：
Figure BDA0003008983770000121
1、将所有反应试管置入到仪器中，启动PCR反应；
2、反应结束后，利用分析软件进行含量鉴定；
采用ABI公司的Q-PCR仪：QuantStudio 3，检测软件为：StepOne Software V2.3。
管1的结果显示见图1，其中：
A:流行性感冒病毒A型FluA，CT＝26；
B:流行性感冒病毒B型FluB，CT＝26；
C:呼吸道合胞病毒A型，CT＝26；
D:呼吸道合胞病毒B型，CT＝26；
E:内参照品GAPDH，CT＝26；
F:人偏肺病毒，CT＝27；
以阳性标准品作为检测测试品，CT值均大于35，证明试剂盒中组1检测试剂能够检测 出含有阳性基因片段的样本。
管2的结果显示见图2，其中：
A：冠状病毒OC43，CT＝18；
B：冠状病毒229E，CT＝18；
C:副流感病毒1型，CT＝18；
D:副流感病毒2型，CT＝18；
E:副流感病毒3型，CT＝18；
F:内参照品GAPDH，CT＝18；
以阳性标准品作为检测测试品，CT值均大于35，证明试剂盒中组2检测试剂能够检测 出含有阳性基因片段的样本。
管3的结果显示见图3，其中：
A：副流感病毒4型，CT＝17；
B：鼻病毒，CT＝17；
C：肠道病毒，CT＝17；
D：新冠状病毒COVID-19，CT＝17；
E：人腺炎病毒，CT＝17；
F：内参照品GAPDH，CT＝17；
以阳性标准品作为检测测试品，CT值均大于35，证明试剂盒中组3检测试剂能够检测 出含有阳性基因片段的样本。
管4的结果显示见图4，其中：
A：腺病毒AdV，CT＝19；
B：人博卡病毒，CT＝19；
C：人风疹病毒，CT＝19；
D：内参照品APDH，CT＝19；
以阳性标准品作为检测测试品，CT值均大于35，证明试剂盒中组4检测试剂能够检测 出含有阳性基因片段的样本。
实验例2阳性标准品梯度实验
1、任选一组标准品，将7个不同梯度的20μL的含有阳性标准品试剂分别加入到7个不同的含有30μL预装有DNA QPCR Supermix 2X，混合引物，混合探针的PCR反应管 中进行混合；
2、充分混合后放入到Q-PCR反应仪器中；
(1)、上机设定PCR程序：
Figure BDA0003008983770000131
(2)将所有反应试管置入到仪器中，启动PCR反应；
(3)反应结束后，利用分析软件进行含量鉴定。
阳性标准品梯度实验结果图5，其中：
5×107copies～5×10copies七个梯度结果分别为(双组份平行检测，其结果一致)；
5×107copies：CT＝18；
5×106copies：CT＝20；
5×105copies：CT＝22；
5×104copies：CT＝24；
5×103copies：CT＝27；
5×102copies：CT＝29；
5×101copies：CT＝32；
根据其结果可绘制出目标基因含量(copies)与CT值相吻合的标准含量曲线，可利用该标准曲线，通过检测到的CT值推算出样本中的目标基因片段的最终含量。
实验例3对人体样本采集及检测方法：
1、利用咽拭子，从被采集的目标人体中提取样本；
2、提取后迅速将其放置到1.5ml含有核酸缓冲液的试管中，如不能及时检测，需要保存-20度；
3、混匀后，提取出30μL的含有样本的缓冲液(RNA反应组加入逆转录后的样本) 加入到含有30μL预装有DNA QPCR Supermix 2X，混合引物，混合探针的PCR反应 管中进行混合；
4、充分混合后放入到Q-PCR反应仪器中：
(1)上机设定PCR程序：
Figure BDA0003008983770000141
(2)将所有反应试管置入到仪器中，启动PCR反应；
(3)反应结束后，利用分析软件进行含量鉴定。
序列表
<110> 吉林双正医疗科技有限公司
<120> 一种18联呼吸道病毒核酸联合检测装置
<130> jlsz2021
<141> 2021-04-04
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工合成( 人工合成)
<400> 1
cacccttggc ctcgacatta aaacagccac tcttgttggg aaacaaattg tggaatggat 60
tttgaaagag gaatccagcg agacacttag aatggcaatt gcatctgtac ctacttcgcg 120
ttacatttct gacatgaccc tcgaggaaat 150
<210> 2
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工合成(人工合成)
<400> 2
acaaaagatg cttaactgat atacaaaaag cactaattgg tgcctctata tgctttttaa 60
aacccaaaga ccaggaaaga aaaagaagat tcatcacaga gcccttatca ggaatgggaa 120
caaccgcaac aaaaaagaaa ggcctgattc 150
<210> 3
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工合成(人工合成)
<400> 3
ggaagtactc actaccaagc ctacaggaaa gccaaccatc aacaccacta aaacaaacat 60
cagaactaca ctgctcacct ccaacaccaa aggaaatcca gaacacacaa gtcaagagga 120
aaccctccac tcaaccacct ccgaaggcta 150
<210> 4
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工合成(人工合成)
<400> 4
ccattaaccc aacaaaaaaa ccaaccccca agactacaga aagagacacc agcaccccac 60
aatccactgt gctcgacata accacatcaa aacacacaga aagagacacc agcacctcac 120
aattcattgc gcttgacaca accacatcaa 150
<210> 5
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工合成(人工合成)
<400> 5
tctgtgtcaa catgccaccg gtagaaccaa gcaagaagac cccaatgacc tctgcagtag 60
acttaaacac taaactcaat ccacagcagg caacacagtt gaccacagag gattcaacat 120
ctctagcagc aacctcagag aatcatctac 150
<210> 6
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工合成(人工合成)
<400> 6
acttctcagc aaccatcagg agggaatgtt gtaccctact attcttggtt ctctggaatt 60
actcagtttc aaaagggaaa ggagtttgag tttgcagaag gacaaggtgt gcctattgca 120
ccaggagtcc cagctactga agctaagggg 150
<210> 7
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工合成(人工合成)
<400> 7
tttgacaagc ctcaggaaaa agataaaaag tcagcgaaaa cgggtactcc taagccttct 60
cgtaatcaga gtcctgcttc ttctcaaact tctgccaaga gtcttgctcg ttctcagagt 120
tctgaaacaa aagaacaaaa gcatgaaatg 150
<210> 8
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工合成(人工合成)
<400> 8
tttgaccatc ctttttctgc aatgtatcca agtgtaggaa gtgggataaa gattgaagat 60
acactcgttt tcctaggata tggtggctta acaactccgc tccaaggcaa caccaagtgt 120
gtgataagca aatgtcccaa tgttaatcag 150
<210> 9
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工合成(人工合成)
<400> 9
ggatctatca cctaggcttt attttatttc ctgtatatgg tggtctcata aatgggactc 60
cttcctacaa cgagcagtcc tcacgctatt ttatcccaac acatcccaac ataacctgtg 120
ccggaaactc cagtgaacgg gctgcagcag 150
<210> 10
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工合成(人工合成)
<400> 10
tcggataata ctaatgatct aatacagtca ggagtgaata caaggcttct tacaattcag 60
agtcatgtcc agaattacat accaatatca ttgacacaac aaatatcgga tcttaggaaa 120
ttcattagtg aaattgcaat tagaaatgat 150
<210> 11
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工合成(人工合成)
<400> 11
catgaccaaa aatgaaacag agaattttaa ggatcctcaa ttggcaacac aattacttac 60
atatatatca tataatggta ccgtcaaaga gcgtataata aatccacccg gatcatctag 120
agattgggtt cacatctcac caggggtagg 150
<210> 12
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工合成(人工合成)
<400> 12
gtgaacctgg tgattgtggt ggaaaactat tgtgcaaaca tggagtgata ggtataatca 60
cagctggtgg tgagggtcat gttgcattta tagatttaag acactttcac tgtgctgaag 120
aacaaggcat tactgattat atacacatgc 150
<210> 13
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工合成(人工合成)
<400> 13
ccaagtgata ccatgcaaac caggcacgta cacaactatc actcaagatc cgaatcatca 60
atagagaatt tcctgtgtag ggccgcatgt gtgatttaca tcaaatactc aagtgccgaa 120
tccaataatt taaagcgcta tgcggagtgg 150
<210> 14
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工合成(人工合成)
<400> 14
caataatact gcgtcttggt tcaccgctct cactcaacat ggcaaggaag accttaaatt 60
ccctcgagga caaggcgttc caattaacac caatagcagt ccagatgacc aaattggcta 120
ctaccgaaga gctaccagac gaattcgtgg 150
<210> 15
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工合成(人工合成)
<400> 15
gagtaatttg cttcttccaa ttgcagagaa tataaacaat attgcatcgc cctcacctgg 60
gtcaagacgt cataaaaggt ttgctggcat tgccattggc attgctgcgc tcggtgttgc 120
aacagcagca caagtaactg ccgctgtctc 150
<210> 16
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工合成(人工合成)
<400> 16
agatacttta gtatgtggaa ctctgcggtg gacagctatg atccagatgt caggatcatt 60
gagaatcacg gtgtggagga cgaacttcca aattattgct tcccattgga tggtaccggt 120
accaatgcca cataccaagg tgtggaacca 150
<210> 17
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工合成(人工合成)
<400> 17
gcaaccatct gactcaatgg aagagcgagg aggcggagga ggtgcgaccg gtagtgtggg 60
aggggggaaa ggttctggtg tgggtatatc cacaggtggc tgggtaggag gcagctactt 120
cactgactca tatgtcataa caaaaaacac 150
<210> 18
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工合成(人工合成)
<400> 18
gaattacacc ggcaatcagc agtcccggtg gggcctcggg agtccgaatt gccacggccc 60
cgattgggcc tccccggttt gtcagcgcca ttcccctgac tgctcgcggc ttgtgggggc 120
cacgccagag cgcccccggc tgcgcctggt 150
<210> 19
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工合成(人工合成)
<400> 19
taactctggt aaagtggata ttgttgccat caatgacccc ttcattgacc tcaactacat 60
ggtttacatg ttccaatatg attccaccca tggcaaattc catggcaccg tcaaggctga 120
gaacgggaag cttgtcatca atggaaatcc 150

Claims (3)

1.一种18联呼吸道病毒核酸联合检测装置，其特征在于，包括下列试剂：
管1：
DNA QPCR Supermix 2X 30μL；
(1)、流行性感冒病毒A型FluA特异性基因片段的序列如SEQ ID No.1所示，其引物是：
正向引物1，5’-CACCCTTGGCCTCGACATTA-3’：0.5μL；
反向引物1，5’-ATTTCCTCGAGGGTCATGTC-3’：0.5μL；
探针1，FAM-5’-GAATCCAGCGAGACACTTAG-3’-BHQ-1：0.5μL；
(2)流行性感冒病毒B型FluB特异性基因片段的序列如SEQ ID No.2所示，其引物是：
正向引物2，5’-ACAAAAGATGCTTAACTGAT-3’：0.5μL；
反向引物2，5’-GAATCAGGCCTTTCTTTTTT-3’：0.5μL；
探针2，HEX-5’-GACCAGGAAAGAAAAAGAAG-3’-BHQ-1：0.5μL；
(3)呼吸道合胞病毒A型特异性基因片段的序列如SEQ ID No.3所示，其引物是：
正向引物3，5’-GGAAGTACTCACTACCAAGC-3’：0.5μL；
反向引物3，5’-GGAAGTACTCACTACCAAGC-3’：0.5μL；
探针3，Cy3-5’-CACTGCTCACCTCCAACACC-3’-BHQ-1：0.5μL；
(4)呼吸道合胞病毒B型特异性基因片段的序列如SEQ ID No.4所示，其引物是：
正向引物4，5’-CCATTAACCCAACAAAAAAA-3’：0.5μL；
反向引物4，5’-TTGATGTGGTTGTGTCAAGC-3’：0.5μL；
探针4，Cy5-5’-CCACTGTGCTCGACATAACC-3’-BHQ-1：0.5μL；
(5)人偏肺病毒MPV特异性基因片段的序列如SEQ ID No.5所示，其引物是：
正向引物5，5’-TCTGTGTCAACATGCCACCG-3’：0.5μL；
反向引物5，5’-GTAGATGATTCTCTGAGGTT-3’：0.5μL；
探针5，ROX-5’-CCACAGCAGGCAACACAGTT-3’-BHQ-1：0.5μL；
内参照品GAPDH，其引物是：
正向引物19，5’-TAACTCTGGTAAAGTGGATA-3’，0.5μL；
反向引物19，5’-GATTTCCATTGATGACAAGC-3’，0.5μL；
探针19，TAMRA-5’-GTTTACATGTTCCAATATGA-3’-BHQ-1：0.5μL；
管2：
DNA QPCR Supermix 2X 30μL；
(6)冠状病毒OC43特异性基因片段的序列如SEQ ID No.6所示，其引物是：
正向引物6，5’-ACTTCTCAGCAACCATCAGG-3’：0.5μL；
反向引物6，5’-CCCCTTAGCTTCAGTAGCTG-3’：0.5μL；
探针6，FAM-5’-GGTTCTCTGGAATTACTCAG-3’-BHQ-1：0.5μL；
(7)冠状病毒229E特异性基因片段的序列如SEQ ID No.7所示，其引物是：
正向引物7，5’-TTTGACAAGCCTCAGGAAAA-3’：0.5μL；
反向引物7，5’-CATTTCATGCTTTTGTTCTT-3’：0.5μL；
探针7，HEX-5’-CGGGTACTCCTAAGCCTTCT-3’-BHQ-1：0.5μL；
(8)副流感病毒1型PIVl特异性基因片段的序列如SEQ ID No.8所示，其引物是：
正向引物8，5’-TTTGACCATCCTTTTTCTGC-3’：0.5μL；
反向引物8，5’-CTGATTAACATTGGGACATT-3’：0.5μL；
探针8，Cy3-5’-GATACACTCGTTTTCCTAGG-3’-BHQ-1：0.5μL；
(9)副流感病毒2型PIV2特异性基因片段的序列如SEQ ID No.9所示，其引物是：
正向引物9，5’-GGATCTATCACCTAGGCTTT-3’：0.5μL；
反向引物9，5’-CTGCTGCAGCCCGTTCACTG-3’：0.5μL；
探针9，Cy5-5’-CCTTCCTACAACGAGCAGTC-3’-BHQ-1：0.5μL；
(10)副流感病毒3型PIV3特异性基因片段的序列如SEQ ID No.10所示，其引物是：
正向引物10，5’-TCGGATAATACTAATGATCT-3’：0.5μL；
反向引物10，5’-ATCATTTCTAATTGCAATTT-3’：0.5μL；
探针10，ROX-5’-CAATTCAGAGTCATGTCCAG-3’-BHQ-1：0.5μL；
内参照品GAPDH，其引物是：
正向引物19，5’-TAACTCTGGTAAAGTGGATA-3’，0.5μL；
反向引物19，5’-GATTTCCATTGATGACAAGC-3’，0.5μL；
探针19，TAMRA-5’-GTTTACATGTTCCAATATGA-3’-BHQ-1：0.5μL；
管3：
DNA QPCR Supermix 2X 30μL；
(11)副流感病毒4型PIV4特异性基因片段的序列如SEQ ID No.11所示，其引物是：
正向引物11，5’-CATGACCAAAAATGAAACAG 3’：0.5μL；
反向引物11，5’-CCTACCCCTGGTGAGATGTG-3’：0.5μL；
探针11FAM-5’-GGTACCGTCAAAGAGCGTAT-3’-BHQ-1，：0.5μL；
(12)鼻病毒HRV特异性基因片段的序列如SEQ ID No.12所示，其引物是：
正向引物12，5’-GTGAACCTGGTGATTGTGGT-3’：0.5μL；
反向引物12，5’-GCATGTGTATATAATCAGTA-3’：0.5μL；
探针12，HEX-5’-CACAGCTGGTGGTGAGGGTC 3’-BHQ-1：0.5μL；
(13)肠道病毒HEV特异性基因片段的序列如SEQ ID No.13所示，其引物是：
正向引物13，5’-CCAAGTGATACCATGCAAAC-3’：0.5μL；
反向引物13，5’-CACTCCGCATAGCGCTTTAA-3’：0.5μL；
探针13，Cy3-5’-CCTGTGTAGGGCCGCATGTG-3’-BHQ-1：0.5μL；
(14)新冠状病毒COVID-19特异性基因片段的序列如SEQ ID No.14所示，其引物是：
正向引物14，5’-CAATAATACTGCGTCTTGGT-3’：0.5μL；
反向引物14，5’-CCACGAATTCGTCTGGTAGC-3’：0.5μL；
探针14，Cy5-5’-CGAGGACAAGGCGTTCCAAT-3’-BHQ-1：0.5μL；
(15)流行性腮腺炎病毒HMV特异性基因片段的序列如SEQ ID No.15所示，其引物是：
正向引物15，5’-GAGTAATTTGCTTCTTCCAA-3’：0.5μL；
反向引物15，5’-GAGACAGCGGCAGTTACTTG-3’：0.5μL；
探针15，ROX-5’-CGCCCTCACCTGGGTCAAGA-3’-BHQ-1：0.5μL；
内参照品GAPDH，其引物是：
正向引物19，5’-TAACTCTGGTAAAGTGGATA-3’，0.5μL；
反向引物19，5’-GATTTCCATTGATGACAAGC-3’，0.5μL；
探针19，TAMRA-5’-GTTTACATGTTCCAATATGA-3’-BHQ-1：0.5μL；
管4：
DNA QPCR Supermix 2X 30μL；
(16)腺病毒AdV特异性基因片段的序列如SEQ ID No.16所示，其引物是：
正向引物16，5’-AGATACTTTAGTATGTGGAA-3’：0.5μL；
反向引物16，5’-TGGTTCCACACCTTGGTATG-3’：0.5μL；
探针16，FAM-5’-CGGTGTGGAGGACGAACTTC-3’-BHQ-1：0.5μL；
(17)人博卡病毒HBoV特异性基因片段的序列如SEQ ID No.17所示，其引物是：
正向引物17,5’-GCAACCATCTGACTCAATGG-3’：0.5μL；
反向引物17,5’-GTGTTTTTTGTTATGACATA-3’：0.5μL；
探针17,HEX-5’-GGGAGGGGGGAAAGGTTCTG-3’-BHQ-1：0.5μL；
(18)人风疹病毒HRV特异性基因片段的序列如SEQ ID No.18所示，其引物是：
正向引物18，5’-GAATTACACCGGCAATCAGC-3’：0.5μL；
反向引物18，5’-ACCAGGCGCAGCCGGGGGCG-3’：0.5μL；
探针18，Cy3-5’-GCCACGGCCCCGATTGGGCC-3’-BHQ-1：0.5μL；
内参照品GAPDH，其引物是：
正向引物19，5’-TAACTCTGGTAAAGTGGATA-3’，0.5μL；
反向引物19，5’-GATTTCCATTGATGACAAGC-3’，0.5μL；
探针19，TAMRA-5’-GTTTACATGTTCCAATATGA-3’-BHQ-1：0.5μL。
2.根据权利要求1所述的一种18联呼吸道病毒核酸联合检测装置，其特征在于：所述内参照品GAPDH的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示。
3.根据权利要求1所述的一种18联呼吸道病毒核酸联合检测装置，其特征在于：还包括内参照品荧光染料TAMRA。
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