CN105925692A

CN105925692A - 一种常温稳定的pcr预混液

Info

Publication number: CN105925692A
Application number: CN201610321072.5A
Authority: CN
Inventors: 疏义林; 张守德
Original assignee: Anlu Municipal Center For Disease Control And Prevention
Current assignee: Anlu Municipal Center For Disease Control And Prevention
Priority date: 2016-05-16
Filing date: 2016-05-16
Publication date: 2016-09-07
Anticipated expiration: 2036-05-16
Also published as: CN105925692B

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及PCR实验，具体地，本发明提供了一种PCR预混液，包括Taq酶、缓冲液、dNTP以及甘油、叠氮化钠和1，2，4‑三氮唑等。本发明的PCR预混液能够在常温下稳定存在144小时以上，提高工作效率，节省成本。

Description

一种常温稳定的PCR预混液

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及PCR实验。

背景技术

随着PCR技术的发展，市场上出现了各种PCR试剂盒，用以体外诊断、动物疾病监控。一些公司尝试将Taq酶加入PCR试剂中，组成PCR预混液，方便客户操作。因此，PCR预混液通常包括dNTP、Taq酶和缓冲液等必要成分。

然而，现有的PCR预混液在常温下仅能在4～5小时内进行有效扩增，超过5h的常温放置之后，性能会有较大的损失。

一些PCR试剂往往会添加0.02％～0.09％叠氮化钠作为试剂防腐剂。叠氮化钠防腐机理与其毒性相关。与氰化物相似，叠氮化钠对细胞色素氧化酶和其它酶有抑制作用。虽然叠氮化钠对一般的PCR试剂有较强的防腐效果，但是对于预混了Taq酶的PCR预混液，只添加0.02％～0.09％叠氮化钠，防腐效果有限，仅能常温放置不到48小时。

一些PCR试剂也会加入5％～15％的甘油等成分来增强试剂中的聚合酶稳定性，但是实际测试发现，加入5％～15％甘油的PCR预混液，防腐效果虽有提升，仍然不能在常温下放置超过96小时。

还有一些PCR试剂会加入0.1～0.2M海藻糖、1％～10％右旋糖苷用以稳定Taq酶，但是经实际测试发现，这些预混液仍然不能在常温下放置超过96小时。

因此，本领域希望有一种PCR预混液，可以常温下放置更长的时间，既能够减少试剂的存储，使使用更加方便，又能减少因试剂在-20℃和常温下频繁转换，反复冻融带来的Taq酶性能损失。

发明内容

本发明的一个目的是为解决现有PCR预混液常温下保存时间较短的问题，提供一种加入几种混合化合物的可在常温下稳定存放144小时以上的PCR预混液。

本发明的PCR预混液包括Taq酶、缓冲液、dNTP，还进一步包括甘油、叠氮化钠和1，2，4-三氮唑。优选地，所述甘油的含量为1％～10％(W/W)，所述叠氮化钠的含量为0.002％～0.09％(W/W)，所述1，2，4-三氮唑的含量为0.1％～1％(W/W)。

进一步地，所述PCR预混液还包括Tris-马来酸(50～100mM，pH8.7)、Tris-苹果酸(50～100mM，pH 8.7)、Tris-琥珀酸(50～100mM，pH8.7)或Tris-富马酸(50～100mM，pH 8.7)中的一种。

或者，所述PCR预混液包括Taq酶、缓冲液、dNTP，其中，还进一步包括甘油、DMSO、1，2，4-三氮唑，以及Tris-马来酸、Tris-苹果酸、Tris-琥珀酸或Tris-富马酸中的一种；优选地，所述DMSO的含量为2％～10％(V/V)，其它成分含量如上所述。

优选地，所述PCR预混液中还包括扩增引物和/或探针。

优选地，所述PCR预混液中还包括氯化钾、氯化镁和/或硫酸铵。

优选地，所述Taq酶为热启动Taq酶。

再一方面，本发明提供本发明的PCR预混液在制备PCR试剂盒中应用。

经过实验发现，本发明的PCR预混液可以在常温下储存144小时而依然能够工作，甚至可以储存192h，使得本领域技术人员可以方便地进行PCR实验，提高工作效率，节省成本。

附图说明

图1显示了放置24h后，试剂组合A、B、C、D、E均可以有效扩增出单增李斯特菌；

图2显示了放置72h后，试剂组合B、C、D、E可以有效扩增出单增李斯特菌，试剂组合A无法有效扩增；

图3显示了放置96h后，试剂C、D、E可以有效扩增出单增李斯特菌，试剂组合A、B无法有效扩增；

图4显示了放置168h后，试剂D、E可以有效扩增出单增李斯特菌，试剂组合A、B、C无法有效扩增；

图5显示了放置192h后，试剂E可以有效扩增出单增李斯特菌，试剂组合A、B、C、D无法有效扩增，其中翘起的曲线为试剂组合D。

图6显示了放置24h后，试剂组合F、G、H、I、J均可以有效扩增出沙门氏菌；

图7显示了放置72h后，试剂组合G、H、I、J可以有效扩增出沙门氏菌，试剂组合F无法有效扩增；

图8显示了放置96h后，试剂I、J可以有效扩增出沙门氏菌，试剂组合F、G、H无法有效扩增；

图9显示了放置192h后，试剂J可以有效扩增出沙门氏菌，试剂组合F、G、H、I无法有效扩增。

具体实施方式

以下将通过具体实施例来说明本发明内容，但本发明内容不限于此。如无特殊说明，以下实施例中所使用的试剂、仪器都是本领域常用试剂、仪器，可以从化学或生物制品/制剂公司购买；以下实施例中使用的方法都是本领域常规方法，本领域技术人员根据现有技术或生产商提供的操作手册可以毫无疑义地知道这些实验的操作过程并获得相应结果。

实施例1：

本实施例比较不同的叠氮化钠、1，2，4-三氮唑、甘油和Tris缓冲液的组合，研究不同的PCR预混液在常温下的保存时间。

配制了几种PCR缓冲液，用单增李斯特菌的引物探针(引自出入境标准SN/T 1870-2007)做测试；扩增程序为：95℃15min；93℃15s，58℃35s，40个循环。

上述单增李斯特菌的引物探针分别为：

上游引物为：CTGAATCTCAAGCAAAACCTGGT，

下游引物为：CGCGACCGAAGCCAACTA，

探针为：5‘6-Fam-ATACGATAACATCCACGGCTCTGGCTGG-3’BHQ1。

按下表配制几种不同的试剂组合(预混液)：

表1：预混液配方

配制好以上的试剂组合A、B、C、D、E，放置在常温环境下。使用购自北京北纳创联生物技术研究院的单增李斯特菌株(货号：BNCC185986)，经Roche High Pure PCR Template Preparation Kit提取后，作为PCR模板。每隔一天，对试剂进行荧光PCR测试。如图1-5所示，经过实验发现：不加入甘油、叠氮化钠、1，2，4-三氮唑、仅使用Tris-Cl的PCR预混液，可以在常温下储存24h；加入2％(W/W)甘油和0.05％(W/W)叠氮化钠的PCR预混液，可以在常温下储存72h；加入2％(W/W)甘油和0.5％(W/W)1，2，4-三氮唑的PCR预混液，可以在常温下储存96h；加入2％(W/W)甘油、0.05％(W/W)叠氮化钠和0.5％(W/W)1，2，4-三氮唑的PCR预混液，可以在常温下储存168h；加入2％(W/W)甘油、0.05％(W/W)叠氮化钠和0.5％(W/W)1，2，4-三氮唑，并且用马来酸调节pH至8.7的PCR预混液，可以在常温下储存192h。

根据上述结果可见，本发明的PCR预混液在常温下的保存时间长，可以稳定存放168小时以上，甚至达到192小时。

实施例2

本实施例比较了不同的叠氮化钠、1，2，4-三氮唑、甘油、DMSO和Tris缓冲液的组合，研究不同的PCR预混液在常温下的保存时间。

配制了几种PCR缓冲液，用沙门氏菌通用的引物探针(引自出入境标准SN/T 1059.7-2010)做测试；扩增程序为：95℃15min；93℃15s，58℃35s，40个循环。

上述沙门氏菌通用引物探针为：

上游引物为：CTCACCAGGAGATTACAACATGG，

下游引物为：AGCTCAGACCAAAAGTGACCATC，

探针为：5‘6-Fam-CACCGACGGCGAGACCGACTTT-3’BHQ1。按下表配制几种不同的试剂组合(预混液)。

表2：预混液配方

配制好以上的试剂组合F、G、H、I、J，放置在常温环境下。使用购自北京北纳创联生物技术研究院的乙型副伤寒沙门氏菌(货号BNCC103169)，经Roche High Pure PCR Template Preparation Kit提取后，作为PCR模板。每隔一天，使用上述模板，对所述试剂组合F、G、H、I、J进行荧光PCR测试。如图6-9所示，经过实验发现：不加入DMSO、叠氮化钠、1，2，4-三氮唑，只加入2％(W/W)甘油的PCR预混液，可以在常温下储存24h；加入5％(V/V)DMSO、2％(W/W)甘油的PCR预混液，可以在常温下储存24h；加入5％(V/V)DMSO、2％(W/W)甘油和0.5％(W/W)叠氮化钠的PCR预混液，可以在常温下储存72h；加入5％(V/V)DMSO、2％(W/W)甘油和0.5％(W/W)1，2，4-三氮唑的PCR预混液，可以在常温下储存96h；加入5％(V/V)DMSO、2％(W/W)甘油和0.5％(W/W)1，2，4-三氮唑，并且用琥珀酸调节pH至8.7的PCR预混液，可以在常温下储存192h。

由实验结果可见，本发明的PCR预混液在常温下的保存时间延长，可以在常温下稳定存放144h以上，比如168小时，甚至192h。

Claims

1.一种PCR预混液，包括Taq酶、缓冲液、dNTP，其中，还进一步包括甘油、叠氮化钠以及1，2，4-三氮唑。

2.根据权利要求1所述的PCR预混液，其中，所述甘油的含量为1％～10％(W/W)，所述叠氮化钠的含量为0.002％～0.09％(W/W)，所述1，2，4-三氮唑的含量为0.1％～1％(W/W)。

3.根据权利要求1或2所述的PCR预混液，其中，所述PCR预混液还包括Tris-马来酸(50～100mM，pH 8.7)、Tris-苹果酸(50～100mM，pH8.7)、Tris-琥珀酸(50～100mM，pH 8.7)或Tris-富马酸(50～100mM，pH8.7)中的一种。

4.根据权利要求1-3任一项所述PCR预混液，还包括扩增引物和/或探针。

5.根据权利要求4所述的PCR预混液，还包括氯化钾、氯化镁和/或硫酸铵。

6.根据权利要求5所述的PCR预混液，其中，所述Taq酶为热启动酶。

7.一种PCR预混液，包括Taq酶、缓冲液、dNTP，其中，还进一步包括甘油、DMSO、1，2，4-三氮唑，以及Tris-马来酸、Tris-苹果酸、Tris-琥珀酸或Tris-富马酸中的一种。

8.根据权利要求7所述的PCR预混液，其中，所述甘油的含量为1％～10％(W/W)，所述DMSO的含量为2％～10％(V/V)，所述1，2，4-三氮唑的含量为0.1％～1％(W/W)，所述Tris-马来酸、Tris-苹果酸、Tris-琥珀酸或Tris-富马酸的含量为50～100mM，pH 8.7。

9.根据权利要求7或8所述的PCR预混液，还包括扩增引物、探针、氯化钾、氯化镁和/或硫酸铵，且其中，所述Taq酶为热启动酶。

10.根据权利要求1-9任一项所述的PCR预混液在制备PCR试剂盒中的应用。