BR112021013524A2 - Agente de liberação de ácido nucleico, método de amplificação em pcr de ácido nucleico, e kit de amplificação em pcr - Google Patents
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Abstract
agente de liberação de ácido nucleico, método de amplificação em pcr de ácido nucleico, e kit de amplificação em pcr. a presente invenção refere-se a um agente de liberação de ácido nucleico, um método de amplificação em pcr e um kit de amplificação em pcr. o agente de liberação de ácido nucleico compreende tris-hcl, cloreto de sódio, cloreto de potássio, tween 20, triton x-100, etil fenil polietileno glicol e uma base forte, a concentração molar de tris-hcl sendo de 0,5 mm a 500 mm, a concentração molar de cloreto de sódio sendo de 20 mm a 500 mm, a porcentagem em volume de tween 20 sendo de 0,1% a 2%, a porcentagem em volume de triton x-100 sendo de 0,1% a 3%, a porcentagem em volume de etil fenil polietileno glicol sendo de 0,1% a 3%, a concentração em massa de cloreto de potássio sendo de 5 mg / ml a 8 mg / ml e a concentração em massa da base forte sendo de 2 mg / ml a 50 mg / ml. o agente de liberação de ácido nucleico pode permitir que uma amostra contendo rna libere rna diretamente em temperatura ambiente, e seja diretamente misturada com uma solução de reação de pcr para amplificação em pcr.
Description
[001] A presente descrição refere-se ao campo da biologia molecular, em particular a um agente de liberação de ácido nucleico, um método para amplificação em PCR de um ácido nucleico e um kit de amplificação em PCR.
[002] A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica de biologia molecular para amplificar um fragmento de ácido nucleico específico, caracterizada de forma importante pelo enriquecimento maciço e aumento de uma quantidade residual de ácido nucleico, de modo a facilitar a detecção da quantidade traço de ácido nucleico. O método de PCR comumente usado no diagnóstico médico é principalmente um método de PCR quantitativa de fluorescência em tempo real (qPCR) baseado em sondas fluorescentes duplas. Os alvos para diagnóstico in vitro usando o método qPCR incluem principalmente DNA genômico humano, DNA viral, bactérias, fungos, RNA viral e similares. No entanto, uma vez que o RNA tem uma estrutura de fita simples, que é instável e facilmente degradada, um processo de tratamento de amostra é submetido a requisitos muito rigorosos, e um método mais complicado é necessário para o pré-tratamento, extração de ácido nucleico e purificação da amostra de RNA a ser amplificada para obter o ácido nucleico puro, então a detecção pode ser realizada para obter um resultado estável.
[003] Consequentemente, é necessário fornecer um agente de liberação de ácido nucleico que possa simplificar o método de amplificação em PCR de amostras de RNA.
[004] A presente descrição fornece um agente de liberação de ácido nucleico compreendendo Tris-HCl, cloreto de sódio, cloreto de potássio, Tween 20, Triton X- 100, etil fenil polietileno glicol e uma base forte; em que Tris-HCl tem uma concentração molar que varia de 0,5 mM a 500 mM, cloreto de sódio tem uma concentração molar de 20 mM a 500 mM, cloreto de potássio tem uma concentração em massa que varia de 5 mg / mL a 8 mg / mL, Tween 20 tem uma porcentagem em volume que varia de 0,1% a 2%, Triton X-100 tem uma porcentagem em volume que varia de 0,1% a 3%, etil fenil polietileno glicol tem uma porcentagem em volume que varia de 0,1% a 3%, e a base forte tem uma concentração em massa que varia de 2 mg / mL a 50 mg / mL.
[005] No agente de liberação de ácido nucleico da presente descrição, uma certa proporção de base forte lisa as células, que liberam ácidos nucleicos. O cloreto de sódio e o cloreto de potássio protegem os ácidos nucleicos coordenando o equilíbrio dos íons intracelulares e extracelulares. Tris-HCl é para manter um valor de pH estável durante a lise celular e melhor compatível com uma solução de reação de PCR na amplificação subsequente. O Triton X-100, por outro lado, pode proteger os ácidos nucleicos, especialmente o RNA de fita simples, permitindo que o RNA seja armazenado em um ambiente alcalino. Por outro lado, o Triton X-100 com cloreto de potássio em determinada relação pode reduzir o efeito inibitório do forte ambiente alcalino sobre a enzima na reação de PCR, garantindo assim a eficiência de amplificação do RNA. O Tween 20 e o etil fenil polietileno glicol podem proteger a transcriptase reversa, de modo que a transcriptase reversa funcione normalmente em ambiente alcalino. Através da sinergia dos componentes acima, o agente de liberação de ácido nucleico da presente descrição permite que uma amostra contendo RNA libere RNA diretamente em temperatura ambiente, evitando assim o problema de contaminação de amostra causada por aerossol gerado por aquecimento, e prevenindo eficazmente a degradação do RNA no ambiente alcalino. De forma mais importante, ele pode ser misturado diretamente com a solução de reação de PCR para amplificação em PCR para completar a amplificação sem a necessidade de processos complicados de extração e purificação de ácido nucleico. Isso realmente realiza uma amplificação e detecção de RNA de uma câmara, livre de poluição, simples e rápida, com alta sensibilidade de detecção e boa repetibilidade.
[006] Em uma das modalidades, o agente de liberação de ácido nucleico compreende ainda betaína e albumina de soro bovino, em que a betaína tem uma concentração em massa que varia de 0,1 mg / mL a 20 mg / mL e a albumina de soro bovino tem uma concentração em massa que varia de 5 mg / mL a 100 mg / mL.
[007] Em uma das modalidades, o agente de liberação de ácido nucleico compreende ainda proteinase K e dodecil sulfato de lítio, em que a proteinase K tem uma concentração em massa que varia de 0,02 mg / mL a 1,5 mg / mL, e o dodecil sulfato de lítio tem uma concentração em massa que varia de 0,4 mg / mL a 30 mg / mL.
[008] A presente descrição também fornece um método para amplificação em PCR de um ácido nucleico, compreendendo as etapas de: misturar o agente de liberação de ácido nucleico como descrito acima com uma amostra, colocar a mistura em 25° C a 60° C por 2 min a 10 min, e adicionar uma solução de reação de PCR para amplificação em PCR.
[009] Em uma das modalidades, o método compreende ainda uma etapa de pré-tratamento da amostra de misturar a amostra com polietileno glicol seguido por centrifugação para coletar um precipitado antes de misturar o agente de liberação de ácido nucleico com a amostra.
[010] Em uma das modalidades, a amplificação em PCR de vírus intestinais na amostra é realizada nas seguintes condições: transcrição reversa de 48° C a 52° C durante 28 min a 32 min; desnaturação térmica de 93° C a 97° C durante 0,9 min a 1,1 min; vários ciclos de amplificação de 93° C a 97° C por 13 s a 17 s seguido por 53°
C a 57° C durante 28 s a 32 s; resfriamento de 23° C a 27° C por 8 segundos a 12 segundos.
[011] Em uma das modalidades, a amplificação em PCR do vírus da hepatite C na amostra é realizada nas seguintes condições: pré-desnaturação e ativação enzimática de 93° c a 97° c por 0,9 min a 1,1 min; transcrição reversa de 58° c a 62° c durante 28 min a 32 min; desnaturação térmica de 93° c a 97° c durante 0,9 min a 1,1 min; vários ciclos de amplificação de 93° c a 97° c por 13 s a 17 s seguido por 58° c a 62° c durante 28 s a 32 s; resfriamento de 23° C a 27° C por 8 s a 12 s.
[012] Em uma das modalidades, a amplificação em PCR de vírus respiratórios na amostra é realizada nas seguintes condições: transcrição reversa de 48° C a 52° C durante 28 min a 32 min; desnaturação térmica de 93° C a 97° C durante 0,9 min a 1,1 min; vários ciclos de amplificação de 93° C a 97° C por 13 s a 17 s seguido por 58° C a 62° C durante 28 s a 32 s; resfriamento de 23° C a 27° C por 8 s a 12 s.
[013] Em uma das modalidades, a amplificação em PCR de bactérias respiratórias na amostra é realizada nas seguintes condições: reação com a enzima UDG de 48° C a 52° C durante 1,9 min a 2,1 min; desnaturação térmica de 92° C a 96° C durante 2,9 min a 3,1 min; vários ciclos de amplificação de 92° C a 96° C por 8 s a 12 s seguido por 58° C a 62° C durante 18 s a 22 s; extensão e coleta de fluorescência de 73° C a 77° C por 18 s a 22 s; curva de fusão: 62° C a 75° C.
[014] A presente descrição também fornece um kit de amplificação em PCR,
compreendendo o agente de liberação de ácido nucleico conforme descrito acima e uma solução de reação de PCR.
[015] A Figura 1 mostra curvas de amplificação em PCR quantitativa de fluorescência em tempo real nos Exemplos 1 a 25.
[016] A Figura 2 mostra curvas de amplificação em PCR quantitativa de fluorescência em tempo real nos Exemplos 26 a 50.
[017] A Figura 3 mostra curvas de amplificação em PCR quantitativa de fluorescência em tempo real nos Exemplos 51 a 70.
[018] A Figura 4 mostra curvas de amplificação em PCR quantitativa de fluorescência em tempo real nos Exemplos 71 a 90.
[019] Para tornar a presente descrição fácil de entender, uma descrição mais abrangente da presente descrição será dada abaixo, e melhores modalidades da presente descrição são fornecidas abaixo. No entanto, a presente descrição pode ser implementada em muitas formas diferentes e não deve ser limitada às modalidades aqui descritas. Pelo contrário, o objetivo de fornecer essas modalidades é fornecer uma compreensão mais completa e abrangente da presente descrição.
[020] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm os mesmos significados que aqueles geralmente compreendidos pelos versados na técnica da presente descrição. Os termos usados na especificação da presente descrição têm apenas o propósito de descrever modalidades específicas, em vez de limitar a presente descrição. O termo “e / ou”, conforme usado neste documento, inclui qualquer e todas as combinações de um ou mais itens listados relacionados.
[021] Em uma modalidade da presente descrição, um agente de liberação de ácido nucleico compreende Tris-HCl, cloreto de sódio, cloreto de potássio, Tween 20,
Triton X-100, etil fenil polietileno glicol e uma base forte; em que Tris-HCl tem uma concentração molar que varia de 0,5 mM a 500 mM, cloreto de sódio tem uma concentração molar que varia de 20 mM a 500 mM, cloreto de potássio tem uma concentração em massa que varia de 5 mg / mL a 8 mg / mL, Tween 20 tem uma porcentagem em volume que varia de 0,1% a 2%, Triton X-100 tem uma porcentagem em volume que varia de 0,1% a 3%, etil fenil polietileno glicol tem uma porcentagem em volume que varia de 0,1% a 3%, e a base forte tem uma massa concentração que varia de 2 mg / mL a 50 mg / mL.
[022] De modo a alcançar o efeito de lise, uma solução de lise precisa ser alcalina, mas o RNA é facilmente degradado em um ambiente alcalino. Além disso, uma transcriptase reversa, que é necessária para amplificação em PCR e detecção de RNA, é relativamente frágil em comparação com a TaqDNA polimerase termicamente estável e é facilmente inibida em um ambiente alcalino, resultando em uma incapacidade de atingir o efeito da transcrição reversa. Portanto, o RNA na solução de lise geralmente não pode ser diretamente amplificado e detectado por PCR. No momento, os métodos de pré-tratamento para amplificação em PCR e detecção de amostras de RNA incluem principalmente um método de lise por fervura e um método de esfera magnética. No método de lise por fervura, os ácidos nucleicos em uma amostra são liberados por fervura sob a ação de um tampão de lise e dissolvidos no tampão de lise. Enquanto as células são lisadas em um banho de água fervente, as proteínas e os cromossomos das células são desnaturados. Em seguida, as proteínas desnaturadas e outras impurezas são removidas por centrifugação, e os ácidos nucleicos no sobrenadante são recuperados para amplificação em PCR. No entanto, a coagulação das proteínas submetidas à fervura em alta temperatura faz com que parte dos ácidos nucleicos sejam envolvidos e escorram com a centrifugação, levando diretamente a uma diminuição na quantidade de ácidos nucleicos modelo no sobrenadante, o que reduz a sensibilidade de amplificação e detecção subsequentes. Além disso, os aerossóis são facilmente produzidos por fervura e aquecimento, levando à contaminação da amostra, o que resultará em resultados falso-positivos na detecção subsequente. No método de esfera magnética, as células são lisadas em uma solução de lise, e as moléculas de ácido nucleico livres são adsorvidas especificamente na superfície das partículas magnéticas, enquanto as impurezas, tal como as proteínas, não são adsorvidas, mas permanecem na solução. Após um determinado período de reação, as partículas magnéticas são separadas do líquido sob a ação de um campo magnético, seguindo-se a eluição com um eluente para obter ácidos nucleicos puros. No entanto, o método de esfera magnética tem operação complicada, requer um tamanho de amostra que geralmente é de 200 a 600 microlitros, e tem uma demanda muito alta de equipamentos, o que limita sua promoção e uso.
[023] Com base no mecanismo acima, no agente de liberação de ácido nucleico desta modalidade, uma certa proporção da base forte lisa as células, que liberam ácidos nucleicos. O cloreto de sódio e o cloreto de potássio protegem os ácidos nucleicos coordenando o equilíbrio de íons intracelulares e extracelulares. Tris- HCl é para manter um valor de pH estável durante a lise celular e é mais compatível com uma solução de reação de PCR na amplificação subsequente. O Triton X-100, por outro lado, pode proteger os ácidos nucleicos, especialmente o RNA de fita simples, permitindo que o RNA seja armazenado em um ambiente alcalino. Por outro lado, o Triton X-100 com cloreto de potássio em determinada relação pode reduzir o efeito inibitório do forte ambiente alcalino sobre a enzima na reação de PCR, garantindo assim a eficiência de amplificação do RNA. O Tween 20 e o etil fenil polietileno glicol podem proteger a transcriptase reversa, de modo que a transcriptase reversa funcione normalmente em ambiente alcalino. Através da sinergia dos componentes acima, o agente de liberação de ácido nucleico desta modalidade permite que uma amostra contendo RNA libere RNA diretamente em temperatura ambiente, evitando assim o problema de contaminação da amostra causada pelo aerossol gerado pelo aquecimento e prevenindo eficazmente a degradação do RNA no ambiente alcalino. De forma mais importante, ele pode ser misturado diretamente com a solução de reação de PCR para amplificação em PCR para completar a amplificação, sem a necessidade de processos complicados de extração e purificação de ácido nucleico. Isso realmente realiza uma amplificação e detecção de RNA de uma câmara, livre de poluição, simples e rápida, com alta sensibilidade de detecção e boa repetibilidade. Entende-se que o agente de liberação de ácido nucleico pode ser usado não apenas para amplificação em PCR e detecção de amostras de RNA, mas também para amplificação e detecção múltiplas e combinadas de amostras de DNA ou amostras mistas de RNA e DNA.
[024] Especificamente, a base forte é hidróxido de sódio ou hidróxido de potássio e similares, que podem ser selecionados conforme necessário.
[025] Em um exemplo específico, o agente de liberação de ácido nucleico compreende ainda betaína e albumina de soro bovino, em que a betaína tem uma concentração em massa que varia de 0,1 mg / mL a 20 mg / mL, e a albumina de soro bovino tem uma concentração em massa que varia de 5 mg / mL a 100 mg / mL. A certa proporção de betaína e albumina de soro bovino adicionada pode colaborar com o Triton X-100 para proteger melhor o RNA em condições alcalinas e prevenir a polimerase e a transcriptase reversa de sua desnaturação, garantindo assim a liberação e a amplificação rápidas de RNA para alcançar a detecção rápida de amostras de RNA.
[026] Em um exemplo específico, o agente de liberação de ácido nucleico compreende ainda proteinase K e dodecil sulfato de lítio, em que a proteinase K tem uma concentração em massa que varia de 0,02 mg / mL a 1,5 mg / mL, e o dodecil sulfato de lítio tem uma concentração em massa que varia de 0,4 mg / mL a 30 mg / mL. A certa proporção de proteinase K e dodecil sulfato de lítio adicionada pode desnaturar e degradar RNase, protegendo assim ainda mais o RNA de se degradar.
[027] Em uma modalidade da presente descrição, um método para amplificação em PCR de um ácido nucleico compreende as etapas de: misturar o agente de liberação de ácido nucleico como descrito acima com uma amostra, colocar a mistura de 25° C a 60° C por 2 min a 10 min, e adicionar uma solução de reação de PCR para amplificação em PCR.
[028] O método para amplificação em PCR do ácido nucleico nesta modalidade realiza a operação de amplificação direta sem extração e purificação para amostras de ácido nucleico, tal como RNA, ou seja, a amplificação e a detecção da amostra de ácido nucleico podem ser feitas adicionando o agente de liberação de ácido nucleico descrito acima à amostra para liberar os ácidos nucleicos a partir das células, adicionar a solução de reação de PCR e realizar a amplificação em PCR, tal como PCR quantitativa de fluorescência em tempo real diretamente, sem a necessidade de fervura e aquecimento ou processos de extração e purificação, e similares. Isso realmente realiza amplificação e detecção de RNA de uma câmara, livre de poluição, simples e rápida, com alta sensibilidade de detecção e boa repetibilidade.
[029] Em um exemplo específico, uma relação em volume do agente de liberação de ácido nucleico para a amostra é de 1:1 a 1:5. Opcionalmente, as amostras podem ser de uma variedade de tipos, incluindo soro, plasma, um esfregaço orofaríngeo, um esfregaço nasofaríngeo, fluido de lavagem alveolar, fezes e similares, e depois de serem misturadas com o agente de liberação de ácido nucleico, podem ser usadas diretamente em métodos de detecção à jusante, tal como amplificação em PCR ou chip genético.
[030] Em um exemplo específico, a solução de reação de PCR compreende desoxirribonucleosídeo trifosfato, um iniciador direto, um iniciador reverso, DNA polimerase, transcriptase reversa e tampão de amplificação, e similares. Entende-se que, de acordo com diferentes tipos e finalidades da reação de PCR, a composição da solução de reação de PCR pode ser selecionada conforme necessário e não está limitada a essa. Por exemplo, quando realizando PCR quantitativa de fluorescência em tempo real, a solução de reação de PCR também inclui sondas fluorescentes ou corantes fluorescentes, etc.
[031] Em um exemplo específico, o método compreende ainda uma etapa de pré-tratamento da amostra de misturar a amostra com polietileno glicol seguido por centrifugação para coletar um precipitado antes de misturar o agente de liberação de ácido nucleico com a amostra. Especificamente, o polietileno glicol é PEG-6000, com uma concentração de 0,5% a 5% em volume. O polietileno glicol como agente de sedimentação de ácido nucleico pode ser usado para o tratamento de amostras complexas. Ele pode capturar RNA viral de forma eficaz na forma livre e aumentar a sensibilidade da detecção tardia sem afetar o sistema de reação de PCR, e pode melhorar significativamente o desempenho da detecção rápida de RNA por PCR. Por exemplo, para fluidos de preservação de células contendo soluções com alto teor de sal, fluidos de preservação de vírus ou amostras de sangue hemolisadas, 50 a 5000 microlitros da amostra podem ser retirados e solução de PEG em um volume igual pode ser adicionada seguida por centrifugação de 3000 a 13000 rpm / min por 1 a 10 min, com o sobrenadante descartado e o pelete deixado, e então 50 a 100 microlitros de agente de liberação de ácido nucleico são adicionados.
[032] Em um exemplo específico, a amplificação em PCR de vírus intestinais na amostra é realizada nas seguintes condições: transcrição reversa de 48° C a 52° C durante 28 min a 32 min; desnaturação térmica de 93° C a 97° C durante 0,9 min a 1,1 min; vários ciclos de amplificação de 93° C a 97° C por 13 s a 17 s seguido por 53° C a 57° C durante 28 s a 32 s; resfriamento de 23° C a 27° C por 8 segundos a 12 segundos.
[033] Em um exemplo específico, a amplificação em PCR do vírus da hepatite C (HCV) na amostra é realizada nas seguintes condições: pré-desnaturação e ativação enzimática de 93° C a 97° C por 0,9 min a 1,1 min; transcrição reversa de 58° C a 62° C durante 28 min a 32 min; desnaturação térmica de 93° C a 97° C durante 0,9 min a 1,1 min; vários ciclos de amplificação de 93° C a 97° C por 13 s a 17 s seguido por 58° C a 62° C durante 28 s a 32 s; resfriamento de 23° C a 27° C por 8 s a 12 s.
[034] Em um exemplo específico, a amplificação em PCR de vírus respiratórios na amostra é realizada nas seguintes condições: transcrição reversa de 48° C a 52° C durante 28 min a 32 min; desnaturação térmica de 93° C a 97° C durante 0,9 min a 1,1 min; vários ciclos de amplificação de 93° C a 97° C por 13 s a 17 s seguido por 58° C a 62° C durante 28 s a 32 s; resfriamento de 23° C a 27° C por 8 s a 12 s.
[035] Em um exemplo específico, a amplificação em PCR de bactérias respiratórias na amostra é realizada nas seguintes condições: reação com a enzima UDG a 48° C a 52° C durante 1,9 min a 2,1 min; desnaturação térmica de 92° C a 96° C durante 2,9 min a 3,1 min; vários ciclos de amplificação de 92° C a 96° C por 8 s a 12 s seguido por 58° C a 62° C durante 18 s a 22 s; extensão e coleta de fluorescência de 73° C a 77° C por 18 s a 22 s; curva de fusão: 62° C a 75° C.
[036] Pode ser entendido que as condições para a amplificação em PCR não estão limitadas aos exemplos específicos acima, e podem ser ajustadas de acordo com diferentes tipos e finalidades de PCR.
[037] Em uma modalidade da presente descrição, um kit de amplificação em PCR compreende o agente de liberação de ácido nucleico como descrito acima e uma solução de reação de PCR. O kit de amplificação em PCR nesta modalidade realiza a operação de amplificação direta sem extração e purificação para amostras de ácido nucleico, tal como RNA, ou seja, a amplificação e a detecção da amostra de ácido nucleico podem ser feitas adicionando o agente de liberação de ácido nucleico descrito acima à amostra para liberar os ácidos nucleicos a partir das células, adicionando a solução de reação de PCR e realizando a amplificação em PCR, tal como PCR quantitativo fluorescente em tempo real diretamente, sem a necessidade de fervura e aquecimento ou processos de extração e purificação e similares. Isso realmente realiza uma amplificação e detecção de RNA de uma câmara, livre de poluição, simples e rápida, com alta sensibilidade de detecção e boa repetibilidade.
[038] A seguir estão exemplos específicos.
1. Detecção de vírus intestinais
[039] Exemplos 1 a 25: 25 amostras de esfregaço de garganta de vírus intestinal (veículo fluido de preservação de vírus) foram preparadas. 100 μL de cada amostra foram retirados e centrifugados a 12000 rpm / min por 10min, sendo o sobrenadante descartado. Depois de adicionar 50 μL de um agente de liberação de ácido nucleico e permanecer por 10 min, 10 μL da amostra tratada com o agente de liberação de ácido nucleico foram misturados com 40 μL de uma solução de reação de PCR para realizar amplificação em PCR quantitativa de fluorescência em tempo real. A curva de amplificação é mostrada na Figura 1. O agente de liberação de ácido nucleico utilizado nos Exemplos 1 a 25 compreende Tris-HCl, cloreto de sódio, cloreto de potássio, Tween 20, Triton X-100, etil fenil polietileno glicol, betaína, albumina de soro bovino, Proteinase K, dodecil sulfato de lítio e hidróxido de sódio; em que Tris- HCl tinha uma concentração molar de 0,5 mM, cloreto de sódio tinha uma concentração molar de 500 mM, Tween 20 tinha uma porcentagem em volume de
0,1%, Triton X-100 tinha uma porcentagem em volume de 3%, etil fenil polietileno glicol tinha uma porcentagem em volume de 0,1%, cloreto de potássio tinha uma concentração em massa de 8 mg / mL, hidróxido de sódio tinha uma concentração em massa de 2 mg / mL, a betaína tinha uma concentração em massa de 20 mg / mL, a albumina de soro bovino tinha uma concentração em massa de 5 mg / mL, a proteinase K tinha uma concentração em massa de 1,5 mg / mL e dodecil sulfato de lítio tinha uma concentração em massa de 0,4 mg / mL.
[040] Exemplos Comparativos 1-25: As 25 amostras acima foram tratadas pelo método de esferas magnéticas e foi realizada amplificação em PCR quantitativa de fluorescência em tempo real. Os Exemplos Comparativos 26-35 foram basicamente iguais aos Exemplos 1 a 10, exceto que Tween 20 e etil fenil polietileno glicol não estavam incluídos no agente de liberação de ácido nucleico.
[041] Os Exemplos Comparativos 36-45 foram basicamente iguais aos Exemplos 11 a 20, exceto que Triton X-100 não estava incluído no agente de liberação de ácido nucleico. Os Exemplos Comparativos 46-50 foram basicamente os mesmos que os Exemplos 21 a 25, exceto que Triton X-100 no agente de liberação de ácido nucleico tinha uma porcentagem em volume de 8% e o cloreto de potássio tinha uma concentração em massa de 15 mg / mL.
[042] Os valores de Ct nos Exemplos e Exemplos Comparativos são mostrados na Tabela 1. A amplificação em PCR foi realizada nas seguintes condições: transcrição reversa a 50° C durante 30 min; desnaturação térmica a 95° C durante 1 min; 45 ciclos de amplificação a 95° C durante 15 s, seguido de 55° C durante 30 s; resfriamento a 25° C por 10 s. Tabela 1
Exemplos Exemplos Exemplos Exemplos Comparativo 1 a 13 Comparativos 14 a 25 s 1 a 13 14 a 25 Amostra 1 24,49 24,07 Amostra 14 20,06 21,68 Amostra 2 25,88 25,32 Amostra 15 24,21 20,64 Amostra 3 25,55 23,61 Amostra 16 23,30 23,63 Amostra 4 23,89 23,55 Amostra 17 26,39 27,63 Amostra 5 27,36 26,06 Amostra 18 29,66 28,03 Amostra 6 26,61 28,12 Amostra 19 24,24 21,44 Amostra 7 28,56 29,06 Amostra 20 34,01 34,23 Amostra 8 44,09 37,96 Amostra 21 28,69 27,57 Amostra 9 32,44 31,82 Amostra 22 27,10 25,31 Amostra 30,04 29,27 Amostra 23 29,63 31,11 10 Amostra 22,54 24,24 Amostra 24 31,99 32,50 11 Amostra 24,18 25,83 Amostra 25 27,69 27,60 12 Amostra 31,13 29,93 13
[043] De acordo com os resultados do teste, as amostras que foram positivas para vírus intestinal podem ser detectadas em todos os Exemplos Comparativos 1 a 25 e Exemplos 1 a 25 com uma taxa consistente de resultados de 100% e boa precisão. No entanto, as amostras que foram positivas para vírus intestinal não podem ser detectadas de forma estável e com sucesso nos Exemplos Comparativos 26 a 50. Além disso, um valor de Ct menor indica maior sensibilidade de detecção. Comparando os valores de Ct, pode ser visto que nos exemplos usando o agente de liberação de ácido nucleico e o método para amplificação em PCR do ácido nucleico da presente descrição, a sensibilidade da amplificação e detecção de amostras de RNA é equivalente àquela usando o método de esfera magnética.
2. Detecção combinada de bactérias respiratórias
[044] Exemplos 26 a 50: 25 amostras de escarro do trato respiratório (veículo de solução salina normal) foram preparadas. 5 μL de cada amostra foram retirados e 5 μL de um agente de liberação de ácido nucleico foram adicionados, seguidos de repouso por 10 min. 40 μL de uma solução de reação de PCR foram adicionados com misturação para realizar a amplificação em PCR quantitativa de fluorescência em tempo real. A curva de amplificação é mostrada na Figura 2. Os agentes de liberação de ácido nucleico usados compreendem Tris-HCl, cloreto de sódio, cloreto de potássio, Tween 20, Triton X-100, etil fenil polietileno glicol, betaína, albumina sérica bovina, proteinase K, dodecil sulfato de lítio e hidróxido de sódio; em que Tris-HCl tinha uma concentração molar de 500 mM, cloreto de sódio tinha uma concentração molar de 20 mM, Tween 20 tinha uma porcentagem em volume de 2%, Triton X-100 tinha uma porcentagem em volume de 0,1%, etil fenil polietileno glicol tinha uma porcentagem em volume de 3%, cloreto de potássio tinha uma concentração em massa de 5 mg / mL, hidróxido de sódio tinha uma concentração em massa de 50 mg / mL, betaína tinha uma concentração em massa de 0,1 mg / mL, albumina de soro bovino tinha uma concentração em massa de 100 mg / mL, a proteinase K tinha uma concentração em massa de 0,02 mg / mL e o dodecil sulfato de lítio tinha uma concentração em massa de 30 mg / mL.
[045] Exemplos Comparativos 51-75: As 25 amostras acima foram tratadas pelo método de esferas magnéticas e foi realizada amplificação em PCR quantitativa de fluorescência em tempo real.
[046] Os valores de Ct nos Exemplos e Exemplos Comparativos são mostrados na Tabela 2. A amplificação em PCR foi realizada nas seguintes condições: reação com a enzima UDG a 50° C durante 2 min; desnaturação térmica a 94° C durante 3 min; 45 ciclos de amplificação a 94° C durante 10 s, seguido de 60° C durante 20 s; extensão e coleta de fluorescência a 75° C por 20 s; curva de fusão: 62° C a 75° C. Tabela 2
Exemplos Exemplos Exemplos Exemplos Comparativo 26 a 38 Comparativos 39 a 50 s 51 a 63 64 a 75 Amostra 1 35,36 31,34 Amostra 14 23,35 24,14 Amostra 2 29,47 24,54 Amostra 15 36,03 32,69 Amostra 3 30,18 31,1 Amostra 16 36,2 35,99 Amostra 4 37,23 36,56 Amostra 17 36,02 35,95 Amostra 5 33,21 28,44 Amostra 18 33,44 33,2 Amostra 6 27,94 25,69 Amostra 19 38,34 38,32 Amostra 7 26,58 24,945 Amostra 20 30,76 29,145 Amostra 8 31,19 30,495 Amostra 21 36,49 30,85 Amostra 9 33,64 29,675 Amostra 22 26,22 25,925 Amostra Amostra 23 10 37,95 34,455 23,01 22,96 Amostra Amostra 24 11 32,68 24,13 31,39 27,32 Amostra Amostra 25 12 27,58 23,355 29,26 24,015 Amostra 13 34,14 32,605
[047] De acordo com os resultados do teste, as amostras positivas para bactérias respiratórias podem ser detectadas em todos os exemplos comparativos e exemplos com uma taxa consistente de resultados de 100% e boa precisão. Além disso, um valor de Ct menor indica maior sensibilidade de detecção. Comparando os valores de Ct, pode ser visto que nos exemplos usando o agente de liberação de ácido nucleico e o método para amplificação em PCR do ácido nucleico da presente descrição, a sensibilidade da amplificação múltipla e detecção de bactérias foi equivalente àquela usando o método de esferas magnéticas. Ele também mostra que o agente de liberação de ácido nucleico e o método para amplificação em PCR do ácido nucleico da presente descrição não são apenas aplicáveis à amplificação e detecção de amostras de RNA, mas também podem ser aplicados à amplificação e à detecção de amostras de DNA.
3. Detecção de vírus HCV
[048] Exemplos 51 a 70: 20 amostras de soro de HCV foram preparadas. 15 μL de cada amostra foram retirados e 5 μL de um agente de liberação de ácido nucleico foram adicionados, seguido de repouso por 10 min. 30 μL de uma solução de reação de PCR foram adicionados com misturação para realizar a amplificação em PCR quantitativa de fluorescência em tempo real. A curva de amplificação é mostrada na Figura 3. O agente de liberação de ácido nucleico usado compreendia Tris-HCl, cloreto de sódio, cloreto de potássio, Tween 20, Triton X-100, etil fenil polietileno glicol, betaína, albumina de soro bovino e hidróxido de sódio; em que Tris-HCl tinha uma concentração molar de 200 mM, cloreto de sódio tinha uma concentração molar de 250 mM, Tween 20 tinha uma porcentagem em volume de 1%, Triton X-100 tinha uma porcentagem em volume de 2%, etil fenil polietileno glicol tinha uma porcentagem em volume de 2%, cloreto de potássio tinha uma concentração em massa de 7 mg / mL, hidróxido de sódio tinha uma concentração em massa de 25 mg / mL, a betaína tinha uma concentração em massa de 10 mg / mL e a albumina de soro bovino tinha uma concentração em massa de 60 mg / mL.
[049] Exemplos 91 a 110: foram utilizadas as mesmas amostras de soro de HCV que nos Exemplos 51 a 70. 15 μL de cada amostra foram retirados e 5 μL de um agente de liberação de ácido nucleico foram adicionados, seguido de repouso por 10 min. 30 μL de uma solução de reação de PCR foram adicionados com misturação para realizar a amplificação em PCR quantitativa por fluorescência em tempo real. O agente de liberação de ácido nucleico é o mesmo que o agente de liberação de ácido nucleico usado nos Exemplos 1 a 25.
[050] Os valores de Ct nos exemplos são mostrados na Tabela 3. A amplificação em PCR foi realizada nas seguintes condições: pré-desnaturação e ativação enzimática a 95° C por 1 min; transcrição reversa a 60° C por 30 min; desnaturação térmica a 95° C durante 1 min; 45 ciclos de amplificação a 95° C por 15 s seguidos de 60° C por 30 s; resfriamento a 25° C por 10 s. Tabela 3
Exemplos Exemplos Exemplos Exemplos 91 a 100 51 a 60 101 a 110 61 a 70 Amostra Amostra 1 30,25 31,32 11 24,56 25,13 Amostra Amostra 2 27,66 29,78 12 25,60 26,03 Amostra Amostra 3 28,31 30,28 13 27,06 27,92 Amostra Amostra 4 29,00 31,23 14 27,95 28,88 Amostra Amostra 5 28,63 31,81 15 31,05 31,64 Amostra Amostra 6 27,25 27,94 16 28,60 30,55 Amostra Amostra 7 27,21 26,85 17 29,67 30,76 Amostra Amostra 8 29,29 31,27 18 30,44 31,49 Amostra Amostra 9 28,63 31,64 19 19,78 20,25 Amostra Amostra 10 30,55 31,95 20 33,20 32,01
[051] De acordo com a Figura 3, pode ser visto que as amostras que foram positivas para HCV podem ser detectadas em todos os exemplos usando o agente de liberação de ácido nucleico e o método para amplificação em PCR do ácido nucleico da presente descrição com boa precisão. Além disso, pode ser visto na Tabela 3 que a sensibilidade de detecção nos Exemplos 51 a 70 é ligeiramente pior do que nos Exemplos 91 a 100, indicando que o efeito do agente de liberação de ácido nucleico usado nos Exemplos 51 a 70 é ligeiramente inferior ao do agente de liberação de ácido nucleico usado nos Exemplos 91 a 100.
4. Detecção de vírus respiratórios
[052] Exemplos 71 a 90: 20 amostras de esfregaço de garganta de vírus respiratório (veículo de solução salina normal) foram preparadas. Foram retirados 100 μL de cada amostra e centrifugados a 12.000 rpm / min por 10 min, sendo o sobrenadante descartado. Depois de adicionar 50 μL de um agente de liberação de ácido nucleico e permanecer por 10 min, 10 μL da amostra tratada com agente de liberação de ácido nucleico foram misturados com 40 μL de uma solução de reação de PCR para realizar amplificação em PCR quantitativa de fluorescência em tempo real. A curva de amplificação é mostrada na Figura 1. O agente de liberação de ácido nucleico usado compreende Tris-HCl, cloreto de sódio, cloreto de potássio, Tween 20, Triton X-100, etil fenil polietileno glicol e hidróxido de sódio; em que Tris-HCl tinha uma concentração molar de 400 mM, cloreto de sódio tinha uma concentração molar de 150 mM, Tween 20 tinha uma porcentagem em volume de 0,8%, Triton X-100 tinha uma porcentagem em volume de 1,2%, etil fenil polietileno glicol tinha uma porcentagem em volume de 1,5%, cloreto de potássio tinha uma concentração em massa de 6 mg / mL e hidróxido de sódio tinha uma concentração em massa de 15 mg / mL.
[053] Exemplos 111 a 130: foram utilizadas as mesmas amostras de esfregaço de garganta de vírus respiratório que nos Exemplos 71 a 90. Foram retirados 100 μL de cada amostra e centrifugados a 12.000 rpm / min por 10 min, sendo o sobrenadante descartado. Depois de adicionar 50 μL de um agente de liberação de ácido nucleico e permanecer por 10 min, 10 μL da amostra tratada com agente de liberação de ácido nucleico foram misturados com 40 μL de uma solução de reação de PCR para realizar amplificação em PCR quantitativa de fluorescência em tempo real. O agente de liberação de ácido nucleico foi o mesmo que o agente de liberação de ácido nucleico usado nos Exemplos 51 a 70.
[054] Os valores de Ct nos exemplos são mostrados na Tabela 4. A amplificação em PCR foi realizada nas seguintes condições: transcrição reversa a 50° C durante 30 min; desnaturação térmica a 95° C durante 1 min; 45 ciclos de amplificação a 95° C por 15 s seguidos de 60° C por 30 s; resfriamento a 25° C por 10 s. Tabela 4
Exemplos Exemplos Exemplos Exemplos 111 a 120 71 a 80 121 a 130 81 a 90 Amostra Amostra 1 23,64 26,05 11 27,56 28,69 Amostra Amostra 2 25,97 28,77 12 28,67 29,61 Amostra Amostra 3 29,55 31,28 13 26,22 28,32 Amostra Amostra 4 30,52 32,65 14 27,88 29,78 Amostra Amostra 5 28,10 28,55 15 31,36 31,54 Amostra Amostra 6 31,69 34,12 16 30,69 33,69 Amostra Amostra 7 25,19 26,12 17 29,89 29,47 Amostra Amostra 8 30,26 32,36 18 30,79 32,34 Amostra Amostra 9 28,96 31,59 19 29,20 32,69 Amostra Amostra 10 31,60 31,35 20 33,59 33,06
[055] De acordo com a Figura 4, pode ser visto que as amostras que foram positivas para o vírus respiratório podem ser detectadas em todos os exemplos usando o agente de liberação de ácido nucleico e o método para amplificação em PCR do ácido nucleico da presente descrição com boa precisão. Além disso, pode ser visto na Tabela 4 que a sensibilidade de detecção nos Exemplos 71 a 90 foi ligeiramente pior do que nos Exemplos 111 a 130, indicando que o efeito do agente de liberação de ácido nucleico usado nos Exemplos 71 a 90 foi ligeiramente inferior ao do agente de liberação de ácido nucleico usado nos Exemplos 111 a 130.
[056] As características técnicas das modalidades descritas acima podem ser combinadas arbitrariamente. Para simplificar a descrição, nem todas as combinações possíveis das características técnicas nas modalidades acima são descritas. No entanto, todas as combinações dessas características técnicas devem ser consideradas como dentro do escopo da presente descrição, desde que tais combinações não se contradigam.
[057] As modalidades descritas acima meramente representam várias modalidades da presente descrição, e a descrição das mesmas é mais específica e detalhada, mas não deve ser interpretada como limitando o escopo da presente descrição.
Deve-se notar que, para aqueles versados na técnica, várias variações e aprimoramentos podem ser feitos sem abandonar o conceito da presente descrição, e todos estão dentro do escopo de proteção da presente descrição.
Portanto, o escopo da presente descrição deve ser definido pelas reivindicações em anexo.
Claims (10)
1. Agente de liberação de ácido nucleico, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende Tris-HCl, cloreto de sódio, cloreto de potássio, Tween 20, Triton X-100, etil fenil polietileno glicol e uma base forte; em que Tris-HCl tem uma concentração molar que varia de 0,5 mM a 500 mM, cloreto de sódio tem uma concentração molar de 20 mM a 500 mM, cloreto de potássio tem uma concentração em massa que varia de 5 mg / mL a 8 mg / mL, Tween 20 tem uma porcentagem em volume que varia de 0,1% a 2%, Triton X-100 tem uma porcentagem em volume que varia de 0,1% a 3%, etil fenil polietileno glicol tem uma porcentagem em volume que varia de 0,1% a 3%, e a base forte tem uma concentração em massa que varia de 2 mg / mL a 50 mg / mL.
2. Agente de liberação de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente betaína e albumina de soro bovino, em que a betaína tem uma concentração em massa que varia de 0,1 mg / mL a 20 mg / mL, e a albumina de soro bovino tem uma concentração em massa que varia de 5 mg / mL a 100 mg / mL.
3. Agente de liberação de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente proteinase K e dodecil sulfato de lítio, em que a proteinase K tem uma concentração em massa que varia de 0,02 mg / mL a 1,5 mg / mL, e dodecil sulfato de lítio tem uma concentração em massa que varia de 0,4 mg / mL a 30 mg / mL.
4. Método para amplificação em PCR de um ácido nucleico, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: misturar o agente de liberação de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 com uma amostra, colocar a mistura de 25° C a 60° C por 2 min a 10 min, e adicionar uma solução de reação de PCR para amplificação em PCR.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente uma etapa de pré-tratamento de amostra de misturar a amostra com polietileno glicol seguido por centrifugação para coletar um precipitado antes de misturar o agente de liberação de ácido nucleico com a amostra.
6. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a amplificação em PCR de vírus intestinais na amostra é realizada nas seguintes condições: transcrição reversa de 48° C a 52° C durante 28 min a 32 min; desnaturação térmica de 93° C a 97° C durante 0,9 min a 1,1 min; vários ciclos de amplificação de 93° C a 97° C durante 13 s a 17 s seguido de 53° C a 57° C durante 28 s a 32 s; resfriamento de 23° C a 27° C por 8 s a 12 s.
7. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a amplificação em PCR do vírus da hepatite C na amostra é realizada nas seguintes condições: pré-desnaturação e ativação enzimática de 93° C a 97° C por 0,9 min a 1,1 min; transcrição reversa de 58° C a 62° C durante 28 min a 32 min; desnaturação térmica de 93° C a 97° C durante 0,9 min a 1,1 min; vários ciclos de amplificação de 93° C a 97° C durante 13 s a 17 s seguido de 58° C a 62° C durante 28 s a 32 s; resfriamento de 23° C a 27° C por 8 s a 12 s.
8. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a amplificação em PCR de vírus respiratórios na amostra é realizada nas seguintes condições: transcrição reversa de 48° C a 52° C durante 28 min a 32 min; desnaturação térmica de 93° C a 97° C durante 0,9 min a 1,1 min; vários ciclos de amplificação de 93° C a 97° C durante 13 s a 17 s seguido de 58° C a 62° C durante 28 s a 32 s;
resfriamento de 23° C a 27° C por 8 s a 12 s.
9. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a amplificação em PCR de bactérias respiratórias na amostra é realizada nas seguintes condições: reação com a enzima UDG de 48° C a 52° C durante 1,9 min a 2,1 min; desnaturação térmica de 92° C a 96° C durante 2,9 min a 3,1 min; vários ciclos de amplificação de 92° C a 96° C durante 8 s a 12 s seguido de 58° C a 62° C durante 18 s a 22 s; extensão e coleta de fluorescência de 73° C a 77° C por 18 s a 22 s; curva de fusão: de 62° C a 75° C.
10. Kit de amplificação em PCR, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o agente de liberação de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e uma solução de reação de PCR.
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