CN105506129B - 一种rna类样本保存稀释液及其制备 - Google Patents

一种rna类样本保存稀释液及其制备 Download PDF

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Abstract

本发明的目的是提供一种RNA类样本保存稀释液及其制备方法，属于聚合酶链式反应(PCR)技术领域核糖核酸(RNA)类样本的稀释和保存范畴。本发明的制备步骤包括：在去离子纯化水中加入一定量的RNA防腐剂和化学试剂；调pH值至4.8‑5.2后定容；密封后高压灭菌，室温备用。本发明为一种白色透明溶液，具有稳定、易保存、便捷等优点，适用于血清、血浆、组织、尿液、分泌物等RNA类样本的保存和/或稀释。浸入RNA类样本稀释保存液后，新鲜组织细胞中RNA可以完好的在37℃下保存一天，在25℃下保存一周，4℃下保存一个月，在‑20℃或‑80℃下长期保存。

Description

一种RNA类样本保存稀释液及其制备
所属领域
本发明属于生物制品技术领域，属于聚合酶链式反应(PCR)技术领域核糖核酸(RNA)类样本的稀释和保存范畴，涉及RNA类样本保存稀释液的制备方法及其应用。
发明背景
聚合酶链式反应(PCR)技术是重要的分子生物学技术，对现代分子生物学的发展起到非常重要的作用。PCR技术特点是高灵敏度、高特异性、省时快速，直接检测目的基因的样本分为DNA类样本或RNA类样本，但是对样本的稀释和保存要求甚高。核糖核酸(缩写为RNA，即RibonucleicAcid)，存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA由核糖核苷酸经磷酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种，即A腺嘌呤、G鸟嘌呤、C胞嘧啶、U尿嘧啶，其中，U(尿嘧啶)取代了DNA中的T。RNA的质量好坏和浓度高低直接影响着检测结果，RNA酶是RNA降解的主要原因，RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶，除细胞内RNA酶外，环境中的灰尘、各种实验器皿和试剂、人类皮肤的汗液、唾液中均存在RNA酶，且RNA酶耐热、耐酸碱，煮沸也不能使之完全失活，蛋白变性剂可使之暂时失活，但变性剂去除后，又可恢复活性。所以在RNA提取过程中必须避免外源性RNA酶的污染和抑制内源性RNA酶的活性。RNA易受外界物理因素：温度、湿度；化学因素：pH值、水解反应、氧化反应；生物因素：酶解及微生物侵染等作用等因素而降解
在现有的RNA类样本稀释保存方法中，主要方法有：1.稀释液用DEPC水、RNAsin等；2.保存主要用液氮或低温保存。其缺点是：1.不同类型的RNA类样本(血清、血浆、组织、尿液、分泌物、培养液等)无法用同一种缓冲液或稀释液；2.各种缓冲液或稀释液保存的效果质量差，RNA容易降解；3.保存后的样本要快速进入液氮或低温保存，室温保存时间过短。因此，开发一种高效防止RNA降解且能适用不同RNA类样本的保存稀释液，具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种RNA类样本保存稀释液的制备方法。可作为临床不同类型的RNA类样本(血清、血浆、组织、尿液、分泌物、培养液等)的样本稀释或保存。
本发明的RNA类样本保存稀释液制备方法如下：
1、量取若干毫升的DEPC·H2O；
2、分别加入β-巯基乙醇(10mmol/L～15mmol/L)、8-羟基喹啉(0.05mol/L～0.1mol/L)、醋酸钠(2mol/L～5mol/L)、十二烷基肌氨酸钠(5％～10％[w/v])、异硫氰酸胍(10％～15％[w/v])，Tris-HCl(0.01mol/L～0.05mol/L)，乙二胺四乙酸(0.01mol/L～0.05mol/L)，Triton-100(0.1％～0.5％[v/v])，丙三醇(3％～8％[v/v])，叠氮钠(0.08％～0.1％[w/v])，搅拌混匀；
3、pH值至4.8～5.2后定容；
4、密封后高压灭菌，室温备用。
本发明为一种可直接使用的样品保存稀释液，其原理是抑制RNase活性，可有效保护新鲜样本里的RNA免受降解，具有稳定、易保存、便捷等优点。适用于血清、血浆、组织、尿液、分泌物等RNA类样本的保存和稀释。浸入RNA类样本保存稀释液后，新鲜组织细胞中RNA可以完好的在37℃下保存一天，在25℃下保存一周，4℃下保存一个月，在-20℃或-80℃下长期保存。
附图说明
图1显示对照组PCR扩增检测图
图2显示实验组PCR扩增检测图
图3显示37℃环境中普通稀释液稀释的样本(P2)PCR扩增检测图
图4显示37℃环境中普通稀释液稀释的样本(P1)PCR扩增检测图
图5显示37℃环境中RNA类样本保存稀释液稀释的样本(P2)PCR扩增检测图
图6显示37℃环境中RNA类样本保存稀释液稀释的样本(P1)PCR扩增检测图
图7显示室温环境中普通稀释液稀释的样本(P2)PCR扩增检测图
图8显示室温环境中普通稀释液稀释的样本(P1)PCR扩增检测图
图9显示室温环境中RNA类样本保存稀释液稀释的样本(P2)PCR扩增检测图
图10显示室温环境中RNA类样本保存稀释液稀释的样本(P1)PCR扩增检测图
图11显示2-8℃环境中普通稀释液稀释的样本(P2)PCR扩增检测图
图12显示2-8℃环境中普通稀释液稀释的样本(P1)PCR扩增检测图
图13显示2-8℃环境中RNA类样本保存稀释液稀释的样本(P2)PCR扩增检测图
图14显示2-8℃环境中RNA类样本保存稀释液稀释的样本(P1)PCR扩增检测图
图15显示-20℃环境中普通稀释液稀释的样本(P2)PCR扩增检测图
图16显示-20℃环境中普通稀释液稀释的样本(P1)PCR扩增检测图
图17显示-20℃环境中RNA类样本保存稀释液稀释的样本(P2)PCR扩增检测图
图18显示-20℃环境中RNA类样本保存稀释液稀释的样本(P1)PCR扩增检测图
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明。实施例中所用的技术手段若为特殊指明，均为常规方法。实施例中涉及到的试剂与耗材若无特殊说明均可从商业途径获取。以下实施例中的RNA类样本保存稀释液测试实验。
实施例1：RNA保存稀释液的制备(100ml)
1)用量筒量取40mlDEPC·H2O加入灭菌烧杯中；
2)吸取0.1mlβ-巯基乙醇加入烧杯中，并搅拌均匀；
3)吸取2.5ml8-羟基喹啉(2mol/L)加入烧杯中，并搅拌均匀；
4)称取16.4g的醋酸钠加入烧杯中，并搅拌溶解；
5)称取10g的十二烷基肌氨酸钠加入烧杯中，并搅拌溶解；
6)称取15g的异硫氰酸胍加入烧杯中，并搅拌溶解；
7)称取0.12g的Tris-HCl加入烧杯中，并搅拌溶解；
8)吸取10mlENDA(0.5mol/L)加入烧杯中，并搅拌均匀；
9)吸取0.5mlTriton-100加入烧杯中，并搅拌均匀；
10)吸取5ml丙三醇加入烧杯中，并搅拌均匀；
11)称取0.1g的叠氮钠加入烧杯中，并搅拌溶解；
12)用浓盐酸调pH值至4.8～5.2；
13)把已经调好pH的溶液转移到100ml的容量瓶中，用DEPC·H2O定容到100ml；
14)把配制好的溶液置于试剂瓶中，密封后高压灭菌，室温备用。
实施例2：血浆样本稀释测试
1、仪器、试剂和样本
1)主要仪器：ABI 7500PCR检测仪、TGL-18R高速冷冻离心机、TDL-5-A台式离心机、K10CD干式恒温金属浴、BSC-1500IIA2-X生物安全柜、移液器等。
2)主要试剂：中山大学达安基因股份有限公司的丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)。
3)样本：新鲜的HCV RNA临床阳性血浆样本(1.0E+07IU/ml)。
2、实验方案
用普通稀释液和RNA类样本保存稀释液分别将HCV RNA阳性血浆样本进行10倍倍比稀释。设计对照组和实验组两组稀释液，用中山大学达安基因股份有限公司的丙型肝炎病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)对两组不同稀释液稀释的样本进行提取。
对照组：普通稀释液和HCV RNA阳性血浆。
实验组：RNA类样本保存稀释液和HCV RNA阳性血浆。
3、实验结果
PCR扩增检测图见图1、图2
表1HCV RNA阳性血浆样本的检测结果
4、实验结论
实验结果表明，用RNA类样本保存稀释液稀释的HCV RNA阳性样本，扩增曲线呈典型的S型曲线，稀释的浓度梯度间隔较好，适用于临床血浆样本的稀释。
实施例3：血浆样本保存测试
1、仪器、试剂和样本
1)主要仪器：ABI 7500PCR检测仪、TGL-18R高速冷冻离心机、TDL-5-A台式离心机、K10CD干式恒温金属浴、BSC-1500IIA2-X生物安全柜、移液器等。
2)主要试剂：中山大学达安基因股份有限公司的丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)。
3)样本：新鲜的HCV RNA临床阳性血浆样本(1.0E+07IU/ml)。
2、实验方案
用RNA类样本保存稀释液将HCV RNA阳性血浆样本稀释10倍、10000倍，作为高、低浓度测试样本分别标记为P1、P2。分别于-20±5℃环境中、2-8℃环境中、室温(20～25℃)环境中和37℃下放置，本实验的设计如下：把稀释后的样本，做好标记，分别放入指定环境中，按指定周期进行检验，具体如下：①-20±5℃环境中，半年检测一次；②2-8℃环境中，每7天检测一次，检测35天；③室温(20～25℃)环境中，每隔1天检测一次，检测8天；④37℃环境中，每隔6小时检测一次，检测30小时。用中山大学达安基因股份有限公司的丙型肝炎病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)对样本进行提取。
对照组：放置-80℃环境中普通稀释液稀释的样本，放置-80℃环境中RNA类样本保存稀释液稀释的样本。
实验组：普通稀释液稀释的样本和RNA类样本保存稀释液稀释的样本分别放置-20℃环境中、2-8℃环境中、室温(20～25℃)环境中和37℃环境中的样本。
3、实验结果
表2 37℃环境中普通稀释液稀释的样本的检测结果(见图3、图4)
表3 37℃环境中RNA类样本保存稀释液稀释的样本检测结果(见图5、图6)
表4室温环境中普通稀释液稀释的样本检测结果(见图7、图8)
表5室温环境中RNA类样本保存稀释液稀释的样本检测结果(见图9、图10)
表6 2-8℃环境中普通稀释液稀释的样本检测结果(见图11、图12)
表7 2-8℃环境中RNA类样本保存稀释液稀释的样本检测结果(见图13、图14)
表8 -20℃环境中普通稀释液稀释的样本检测结果(见图15、图16)
表9 -20℃环境中RNA类样本保存稀释液稀释的样本检测结果(见图17、图18)
4、实验结论
实验结果表明，用RNA类样本保存稀释液保存的HCV RNA阳性样本比普通稀释液的稳定性要好，适用于临床血浆样本的保存。

Claims (2)

1.一种RNA类样本保存稀释液，其成分由10mmol/L～15mmol/L的β-巯基乙醇、0.05mol/L～0.1mol/L的8-羟基喹啉、2mol/L～5mol/L的醋酸钠、5％～10％w/v的十二烷基肌氨酸钠、10％～15％w/v的异硫氰酸胍、0.01mol/L～0.05mol/L的Tris-HCl、0.01mol/L～0.05mol/L的乙二胺四乙酸、0.1％～0.5％v/v的Triton-100、3％～8％v/v的丙三醇、0.08％～0.1％w/v的叠氮钠和DEPC·H2O组成。
2.根据权利要求1所述的保存稀释液，其特征还在于其制备方法如下：
(1)量取若干毫升的DEPC·H2O；
(2)分别加入β-巯基乙醇、8-羟基喹啉、醋酸钠、十二烷基肌氨酸钠、异硫氰酸胍、Tris-HCl、乙二胺四乙酸、Triton-100、丙三醇、叠氮钠，搅拌混匀；
(3)调pH值至4.8～5.2后定容；
(4)密封后高压灭菌，室温备用。
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