CN109486904A - 一种全血rna保存液及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于核糖核酸技术领域，尤其涉及一种全血RNA保存液及其应用。本发明提供了一种全血RNA保存液，包括：核酸稳定剂、螯合剂、还原剂和pH缓冲剂。实验结果表明，在模拟保存的情况下，本发明RNA保存液可有效地保护全血RNA不被降解，保证离体血细胞基因转录水平的稳定性，解决了全血样本中RNA易降解、血细胞离体后基因转录水平不稳定的技术问题，确保了将全血RNA用于科研实验和临床检测时，其实验和检测结果的准确性和可靠性，对全血RNA在科研或临床检测时的样本保存有重要应用价值。

Description

一种全血RNA保存液及其应用
技术领域
本发明属于核糖核酸技术领域，尤其涉及一种全血RNA保存液及其应用。
背景技术
核糖核酸(Ribonucleid acid,RNA)作为生命遗传信息的载体之一，存在于细胞生物、部分病毒、类病毒中，并参与多种生命活动，因此在科研及临床检测的分子生物学领域被广泛研究及应用，高质量、完整的RNA可用于各种分子生物学实验和检测，如核酸酶保护实验、原癌基因表达检测、用药监测等。RNA本身的单链结构既不稳定，且极易被广泛存在并极其稳定的核糖核酸酶(RNase)降解，另外，离体血液细胞的基因转录水平可能会迅速发生改变，而RNA的完整性和基因转录水平的稳定性会对检测结果的可靠性和准确性产生重要影响。
目前市场上有PAXgene品牌的血液RNA采血管对全血RNA有一定的保存效果，但其RNA提取产量较低，且需要配合专用试剂盒才可提取，因而应用有限。一般采用EDTA抗凝血作为提取全血RNA的样品，无法有效抑制血液中丰富的RNase活性，采集样品后需立即提取RNA或者对样品的储存温度和时间都有较严格的要求，因而限制了全血RNA检测的应用，且EDTA抗凝血无法保证离体血液细胞基因转录水平的稳定性，严重影响检测结果的准确性。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种全血RNA保存液及其应用，用于解决全血样本中RNA易降解、血细胞离体后基因转录水平不稳定的技术问题。
本发明的具体技术方案如下：
一种全血RNA保存液，包括：核酸稳定剂、螯合剂、还原剂和pH缓冲剂。
优选的，在所述RNA保存液中，所述核酸稳定剂的浓度为0.001M～4M、所述螯合剂的浓度为10mM～100mM、所述还原剂的浓度为10mM～150mM、所述pH缓冲剂的浓度为20mM～100mM。
优选的，在所述RNA保存液中，所述核酸稳定剂的浓度为0.1M～3M、所述螯合剂的浓度为20mM～80mM、所述还原剂的浓度为20mM～100mM、所述pH缓冲剂的浓度为30mM～50mM。
更优选的，在所述RNA保存液中，所述核酸稳定剂的浓度为0.2M、所述螯合剂的浓度为35mM、所述还原剂的浓度为20mM、所述pH缓冲剂的浓度为50mM。
优选的，所述RNA保存液的pH为3.0～9.0。
更优选的，RNA保存液的pH为3.5～7.0。
优选的，所述核酸稳定剂包括离液盐和/或表面活性剂。
优选的，所述螯合剂为乙二胺四乙酸二钾和/或乙二胺四乙酸三钾。
优选的，所述还原剂包括β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、硫代硫酸钠和三(2-羧乙基)膦中的一种或多种。
优选的，所述pH缓冲剂选自柠檬酸-柠檬酸钠、Tris-HCl或磷酸氢二钠-磷酸二氢钠。
优选的，所述离液盐包括异硫氰酸胍、盐酸胍、尿素和氯化锂中的一种或多种。
优选的，所述表面活性剂包括十二烷基二甲基苄基氯化铵、十二烷基硫酸钠和Triton X-100中的一种或多种。
本发明还提供了上述技术方案所述全血RNA保存液在保存全血RNA中的应用。
本发明全血RNA保存液可直接应用于保存全血RNA中，无需对血液样本进行预处理。本发明全血RNA保存液应用于保存全血RNA中，可有效保护全血RNA不降解、降低对样品储存条件要求、保证离体血液细胞基因转录水平稳定性。
综上所述，本发明提供了一种全血RNA保存液，包括：核酸稳定剂、螯合剂、还原剂和pH缓冲剂。实验结果表明，在模拟保存的情况下，本发明全血RNA保存液可有效地保护全血RNA不被降解，保证离体血细胞基因转录水平的稳定性，解决了全血样本中RNA易降解、血细胞离体后基因转录水平不稳定的技术问题，确保了将全血RNA用于科研实验和临床检测时，其实验和检测结果的准确性和可靠性，对全血RNA在科研或临床检测时的样本保存有重要应用价值。
具体实施方式
本发明提供了一种全血RNA保存液及其应用，用于解决全血样本中RNA易降解、血细胞离体后基因转录水平不稳定的技术问题。
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例全血RNA保存液(pH＝6.0)包括：核酸稳定剂、螯合剂、还原剂和pH缓冲剂，在全血RNA保存液中，核酸稳定剂的浓度为4M、螯合剂的浓度为100mM、还原剂的浓度为35mM、pH缓冲剂的浓度为50mM。其中，核酸稳定剂为盐酸胍，螯合剂为乙二胺四乙酸三钾(EDTA·K3)，还原剂为二硫苏糖醇，pH缓冲剂为柠檬酸-柠檬酸钠。
实施例2
本实施例全血RNA保存液(pH＝9.0)包括：核酸稳定剂、螯合剂、还原剂和pH缓冲剂，在全血RNA保存液中，核酸稳定剂的浓度为3M、螯合剂的浓度为50mM、还原剂的浓度为150mM、pH缓冲剂的浓度为100mM。其中，核酸稳定剂为尿素，螯合剂为乙二胺四乙酸二钾(EDTA·K2)，还原剂为硫代硫酸钠，pH缓冲剂为Tris-HCl。
实施例3
本实施例全血RNA保存液(pH＝4.0)包括：核酸稳定剂、螯合剂、还原剂和pH缓冲剂，在全血RNA保存液中，核酸稳定剂的浓度为0.2M、螯合剂的浓度为35mM、还原剂的浓度为20mM、pH缓冲剂的浓度为50mM。其中，核酸稳定剂为十二烷基二甲基苄基氯化铵，螯合剂为EDTA·K2，还原剂为二硫苏糖醇，pH缓冲剂为柠檬酸-柠檬酸钠。
实施例4
本实施例全血RNA保存液(pH＝3.5)包括：核酸稳定剂、螯合剂、还原剂和pH缓冲剂，在全血RNA保存液中，核酸稳定剂的浓度为0.1M、螯合剂的浓度为10mM、还原剂的浓度为50mM、pH缓冲剂的浓度为30mM。其中，核酸稳定剂为十二烷基硫酸钠，螯合剂为EDTA·K2，还原剂为三(2-羧乙基)膦，pH缓冲剂为柠檬酸-柠檬酸钠。
实施例5
本实施例全血RNA保存液(pH＝3.0)包括：核酸稳定剂、螯合剂、还原剂和pH缓冲剂，在全血RNA保存液中，核酸稳定剂包括浓度为0.15M的十二烷基二甲基苄基氯化铵和浓度为0.001M的Triton X-100、螯合剂的浓度为20mM、还原剂的浓度为10mM、pH缓冲剂的浓度为20mM。其中，螯合剂为EDTA·K2，还原剂为三(2-羧乙基)膦，pH缓冲剂为柠檬酸-柠檬酸钠。
实施例6
本实施例全血RNA保存液(pH＝7.0)包括：核酸稳定剂、螯合剂、还原剂和pH缓冲剂，在全血RNA保存液中，核酸稳定剂包括浓度为1M的异硫氰酸胍和浓度为0.05M的十二烷基硫酸钠、螯合剂的浓度为80mM、还原剂的浓度为100mM、pH缓冲剂的浓度为80mM。其中，螯合剂为EDTA·K3，还原剂为二硫苏糖醇，pH缓冲剂为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠。
实施例7
本实施例采用实施例1～6全血RNA保存液在模拟储存的情况下，检测其应用于全血RNA保存的效果。
将实施例1～6的全血RNA保存液作为添加剂分别加入真空采血管中，采集同一血液样本作为实验组1～6，同时用市售常规EDTA·K2抗凝剂真空采血管采集同一血液样本作为对照组1，PAXgene Blood RNA Tube采集同一血液样本作为对照组2。实验组1～6中，血液样本与RNA保存液的体积比为1：3，实验组1～6和对照组1、2得到实验样本。
将实验组1～6和对照组1、2得到的实验样本分别放于不同温度的环境中保存，分别在采血后18-25℃2小时、18-25℃3天、2-8℃5天、-20℃30天时提取全血RNA，利用Qubit3.0测定全血RNA总量，并且利用实时荧光定量PCR的方法检测内参基因18s rRNA的转录量，结果参阅表1和表2。
表1表明，实验组1～6在采血后18-25℃2小时、18-25℃3天、2-8℃5天、-20℃30天，实验样本的全血RNA总量不发生明显变化。而对照组1(EDTA抗凝血)中，实验样本在采血后18-25℃3天和2-8℃5天时，血液内的RNase对样本中的RNA持续降解使得其提取量降低；在采血后-20℃30天时，样本冻融导致血液中的有核细胞破裂损失而使RNA提取量明显降低。对照组2(PAXgene Blood RNA Tube)中，虽然RNA提取量没有随时间明显降低，但其平均提取量均低于实验组1～6。结果表明实验组1～6RNA保存液对全血RNA的保存效果远优于对照组1(EDTA抗凝血)，提取量优于对照组2(PAXgene Blood RNA Tube)。
表2表明，实验组1～6在采血后18-25℃2小时、18-25℃3天、2-8℃5天、-20℃30天，实验样本的18s rRNA转录量不发生明显变化。而对照组1(EDTA抗凝血)中，实验样本在采血后18-25℃3天和2-8℃5天时，血液内的RNase对样本中的18s rRNA持续降解使得其转录量明显降低(CT值升高)；在采血后-20℃30天时，样本冻融使RNA提取量降低而导致18s rRNA转录量显著降低(CT值显著升高)。对照组2(PAXgene Blood RNA Tube)中，虽然18s rRNA的转录量没有明显变化，但由于RNA提取量较低而导致CT值均高于实验组1～6。结果表明实验组1～6RNA保存液对全血RNA的保存效果远优于对照组1(EDTA抗凝血)，提取量优于对照组2(PAXgene Blood RNA Tube)。
结合表1和表2所得出的实验结果，在模拟保存的情况下，本发明全血RNA保存液可有效地保护全血RNA不被降解且有较好的提取效果，进一步确保了将全血RNA用于科研实验和临床检测时，其实验和检测结果的准确性和可靠性。
表1实验样本中RNA提取量(用μg/500μl全血表示)
表2实验样本中18s rRNA转录量(用CT值表示)
实施例8
本实施例采用实施例1～6全血RNA保存液在模拟储存的情况下，检测其应用于全血RNA保存对于维持全血RNA基因转录水平稳定性的效果。
将实施例1～6的全血RNA保存液作为添加剂分别加入真空采血管中，采集同一血液样本作为实验组1～6，同时用市售常规EDTA·K2抗凝剂真空采血管采集同一血液样本作为对照组1，PAXgene Blood RNA Tube采集同一血液样本作为对照组2。实验组1～6中，血液样本与RNA保存液的体积比为1：3，实验组1～6和对照组1、2得到实验样本。
将实验组1～6和对照组1、2得到的实验样本分别放于不同温度的环境中保存，分别在采血后18-25℃2小时、18-25℃3天、18-25℃5天、2-8℃5天、2-8℃7天、-20℃30天时提取全血RNA，采用18s rRNA作为内参基因，采用实时荧光定量PCR的方法检测C-FOS基因的相对转录水平(用ΔCT值表示，ΔCT＝C-FOS CT值-18s rRNA CT值)，结果参阅表3。
表3表明，实验组1～6和对照组2(PAXgene Blood RNA Tube)的实验样本在采血后18-25℃2小时、18-25℃3天、2-8℃5天、-20℃30天，C-FOS相对转录水平不发生明显变化(ΔCT值变化均小于1)；在采血后18-25℃5天、2-8℃7天时，实验组1～6的C-FOS相对转录水平变化(ΔCT值变化均小于1.5)要小于对照组2(PAXgene Blood RNA Tube)(ΔCT值变化均大于1.5)。而对照组1(EDTA抗凝血)中，血液中的RNase对RNA持续降解以及血细胞离体后受外界刺激而可能使C-FOS转录水平迅速增加，最终导致样本在采血后18-25℃3天和2-8℃5天时的相对转录水平就已发生明显变化(ΔCT值变化均大于1)，在采血后18-25℃5天和2-8℃7天时的相对转录水平变化更大(ΔCT值变化均大于2)。结果表明实验组1～6RNA保存液对血细胞基因转录水平的稳定效果远优于对照组1(EDTA抗凝血)，亦优于对照组2(PAXgeneBlood RNA Tube)。
上述实验结果表明，在模拟保存的情况下，本发明全血RNA保存液可有效地保证离体血细胞基因转录水平的稳定性，进一步确保了将全血RNA用于科研实验和临床检测时，其实验和检测结果的准确性和可靠性。
表3实验样本中C-FOS相对转录水平(用ΔCT值表示)
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (11)

1.一种全血RNA保存液，其特征在于，包括：核酸稳定剂、螯合剂、还原剂和pH缓冲剂。
2.根据权利要求1所述的全血RNA保存液，其特征在于，在所述全血RNA保存液中，所述核酸稳定剂的浓度为0.001M～4M、所述螯合剂的浓度为10mM～100mM、所述还原剂的浓度为10mM～150mM、所述pH缓冲剂的浓度为20mM～100mM。
3.根据权利要求1所述的全血RNA保存液，其特征在于，在所述全血RNA保存液中，所述核酸稳定剂的浓度为0.1M～3M、所述螯合剂的浓度为20mM～80mM、所述还原剂的浓度为20mM～100mM、所述pH缓冲剂的浓度为30mM～50mM。
4.根据权利要求1所述的全血RNA保存液，其特征在于，所述全血RNA保存液的pH为3.0～9.0。
5.根据权利要求1所述的全血RNA保存液，其特征在于，所述核酸稳定剂包括离液盐和/或表面活性剂。
6.根据权利要求1所述的全血RNA保存液，其特征在于，所述螯合剂为乙二胺四乙酸二钾和/或乙二胺四乙酸三钾。
7.根据权利要求1所述的全血RNA保存液，其特征在于，所述还原剂包括β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、硫代硫酸钠和三(2-羧乙基)膦中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的全血RNA保存液，其特征在于，所述pH缓冲剂包括柠檬酸-柠檬酸钠、Tris-HCl和磷酸氢二钠-磷酸二氢钠的一种或多种。
9.根据权利要求5所述的全血RNA保存液，其特征在于，所述离液盐包括异硫氰酸胍、盐酸胍、尿素和氯化锂中的一种或多种。
10.根据权利要求5所述的全血RNA保存液，其特征在于，所述表面活性剂包括十二烷基二甲基苄基氯化铵、十二烷基硫酸钠和Triton X-100中的一种或多种。
11.权利要求1至权利要求10任意一项所述全血RNA保存液在保存全血RNA中的应用。
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