CN111926055A - 一种hpv样品采集保存卡及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种HPV核酸（DNA/RNA）样本采集保存卡，具体涉及一种HPV样品采集保存卡及其制备方法。相较于传统的核酸保存卡，本发明的保存卡制备过程中使用的浸泡液中完全不需要使用EDTA、SDS和尿酸等PCR抑制剂成分，这不仅大大降低了HPV保存卡的生产成本，而且其添加成分也不会对PCR结果产生任何影响，在后续病毒核酸检测中无需进行繁琐的核酸提取纯化操作步骤；同时，在HPV样品保存中却能取得与传统保存卡相当（甚至更优）的保存效果。

Description

一种HPV样品采集保存卡及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种核酸（DNA/RNA）样本采集保存卡，特别涉及一种HPV样品采集保存卡及其制备方法，属于医疗设备技术领域。

背景技术

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤。原位癌高发年龄为30～35岁，浸润癌为45～55岁，近年来其发病有年轻化的趋势。宫颈癌在全球妇女的癌症死因中高居第二位，仅次于乳腺癌。国内外学者就HPV感染与子宫颈癌的关系进行了大量的研究，并获取了许多实验室与临床证据。1977年Laverty在电镜中观察到子宫颈癌活检组织中存在HPV颗粒，1981年第一次在生殖道分离出了HPV，1983-1986年依次从宫颈癌样本中分离出HPV16、18、31、35等类型。1995年IARC专题讨论会确定：HPV感染是子宫颈癌的主要病因。目前研究发现99.7％的宫颈鳞状细胞癌有人乳头瘤病毒的感染，而高危型人乳头状瘤病毒的持续感染是宫颈癌发病的重要因素。

人乳头瘤病毒（Human Papillomaviruses，HPV）属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属，是球形DNA病毒，外形呈20多面体对称型，无包膜，直径约45nm～55nm，基因组为共价闭合环状双链DNA分子，含近8000个碱基对（bp）。HPV能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖，表现为寻常疣、生殖器疣（尖锐湿疣）等症状。女性一生中有80%的几率会感染HPV，并可能会反复感染，通常感染在8-10个月内被自然清除，只有少数（5%）妇女呈持续感染状态。按照HPV亚型与癌症相关性的高低将HPV分为高危型和低危型。高危型HPV包括HPV-16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和82；可能的高危型包括HPV26、53和66；低危型包括HPV6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81和CP6108。HPV感染的检测和分型对了解女性生殖道肿瘤相关病情、判断预后、指导治疗、分析HPV流行状况以及基因疫苗的研制均具有重要价值。定期的HPV检测被权威指南推荐为可用于早期发现宫颈癌风险的初筛手段之一，越来越多的HPV分析检测方法被开发出来，包括细胞学检测、血清学检测、基因检测，其中，基因检测由于其检测结果准确以及检测的高敏感性和特异性，广泛应用于临床的大面积筛查。

传统的HPV基因检测大多是基于医生取样，覆盖率受医疗资源的限制，尤其是偏远落后地区。随着检测技术的进步，新兴技术层出不穷，自取样技术在2017年被美国克利夫兰医学中心评为全球十大医学创新技术之一。自取样HPV检测，受检者自己在家就能够进行取样，然后寄送样本到实验室检查，不用经过长途跋涉到医院进行长时间的排队检查。在第五届全国阴道镜与宫颈病理学（CSCCP）大会自取样专题会上，自取样HPV检测因具有不受时间地域限制、易于操作的优势受到了许多专家学者的肯定。基于HPV自检测技术的高敏感性、高阴性预测值及客观性，HPV自检测已经成为宫颈癌筛查的主要方法之一。

HPV自检测应用首先涉及HPV样品检材的采集，之后将生物HPV样品运输至检测实验室进行核酸提取及检测。在这一系列的操作中面临的最主要的问题是如何有效保存待检样品中的核酸不被降解，同时灭活样品中的HPV等病原微生物，以确保操作者及大众的安全。目前国内外使用最广泛的生物样品的保存方法是将采集样品保存至各类保存卡上，而商品化保存卡主要是英国Whatman公司的FTA系列保存卡。FTA保存卡包含一种包埋在过滤基质中的特殊干燥化学试剂混合物，该混合物包括蛋白质变性剂、一种螯合剂和一种自由基捕捉剂，它对人无毒，用FTA技术收集的核酸可以在室温下和高湿度环境下保存多年而不降解。细胞样品在接触FTA时会裂解掉，而其中的核酸则被固定下来，FTA是目前唯一的在实验室外收集样品的遗传分析工具。近期国内一些企业也纷纷致力于国产核酸采集卡的研制，其基本核心技术都同FTA技术类似。但FTA及其国内类似产品价格昂贵，且其设计的初衷主要是解决样本保存和运输中的问题，后续检测是以核酸分离提取为前提，样本在实施PCR等核酸检测之前需要分离步骤以除去样本卡中的去垢剂等裂解试剂，这增加了实验操作步骤和样本受到污染的几率；且为了保证产品的普适性，FTA及其类似仿制品均需要同时兼顾对组织、细胞、病毒等多种样品的裂解和保存，但是对某一单类样品的应用存在一定缺陷；尤其对HPV样品来说，其取样于女性宫颈部位，很多样品存在支原体等特殊微生物。此外，不管FTA保存卡还是其他仿制品，其保存液中大多含有SDS、EDTA等试剂，如果保存的样本不经过核酸提取步骤，保存液中的SDS、EDTA等试剂将严重影响PCR结果的准确度和灵敏度。

因此，为了在HPV自取样检测中实现更高的检测精度和检测敏感度，有必要针对HPV病毒定制一套专门适用于病毒样本的HPV自采样试剂体系，以增加对HPV病毒样本的高效特异裂解和保存，并能有效抑制其他微生物生长，同时不会对后续免核酸提取的直扩PCR检测灵敏度产生影响的保存卡及其制备方法。

发明内容

为解决当前保存卡存在的问题，本发明提供一种专门用于HPV样品保存的核酸保存卡，本发明的保存卡不仅可以有效抑制宫颈样品其他微生物，而且不需要使用能够影响PCR检测准确度和灵敏度的试剂，保存的样本可直接用于下游核酸分子检测，无需进行核酸分离提取步骤。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

本发明提供一种专有的HPV保存卡浸泡液，其配方为：细胞裂解剂、核酸稳定剂、颜色指示剂和水，pH值为9.5-11.5。本发明的保存卡可有效灭活有潜在传染性的细菌、真菌、病毒和其它微生物，并有效裂解细胞、释放样品中DNA，保护样品DNA免受核酸酶降解，并用颜色指示保存卡中样本的存在。

优选地，本发明的细胞裂解液选用蛋白质变性剂异硫氰酸胍或盐酸胍中的一种或两种，能够迅速破碎细胞或病毒释放核酸，并且能够抑制细胞释放出来的核酸酶的活性，保证核酸一级结构的完整性。胍盐是破坏蛋白质三维结构的离液剂，能迅速溶解蛋白质，导致核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离。在通常使用的蛋白质变性剂中作用最强的是异硫氰酸胍，含有强力的阴离子和阳离子基团，形成较强的氢键，可以使多数蛋白质转换成一随机的卷曲状态。在还原剂存在的情况下，异硫氰酸胍可以断裂氢键，而在去垢剂如SDS存在的情况下，可以破坏疏水作用。在具体实施例中，本发明所述HPV卡中的细胞裂解剂优选采用浓度范围1 M-4 M的异硫氰酸胍，能够裂解细胞同时抑制核酸酶和病原菌活性。

本发明的核酸稳定剂为有机缓冲溶液和/或无机缓冲溶液，其中有机溶液可以为Tris、乙醇胺、三乙醇胺、甘氨酸或柠檬酸三钠等，无机溶液可以为碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐或硼酸盐。在具体实施例中，优选地，本发明所述HPV保存卡中优选采用的核酸稳定剂为50 mM-100 mM的Tris 缓冲液，可以提供足够的缓冲环境，维持核酸磷酸基团与纤维膜的带电状态，利于氢键的保持，有利于DNA维持构象，对DNA碱基起保护作用，不易破坏其完整性或产生断裂，可使核酸保持稳定，避免脱氨基的发生。

本发明的颜色指示剂可为有色染料（偶氮染料、酞菁染料、蒽醌染料、菁类染料、靛族染料、芳甲烷染料、硝基染料和亚硝基染料），也可为常用指示剂（酸碱指示剂、氧化还原指示剂、金属指示剂、钙指示剂）或其他示剂（生物指示剂等）。在具体实施例中，本发明所述HPV保存卡中含有的颜色指示剂优选为酸碱指示剂（如对-硝基酚等硝基酚类，酚酞、百里酚酞和α-萘酚酞等酚酞类，有酚红、甲酚红、溴酚蓝、百里酚蓝等磺代酚酞类；甲基橙、中性红等偶氮化合物类），在具体实施例中，本发明优选0.01~0.05％的溴酚蓝，一种pH 依赖型指示剂，pH变色范围3.0（黄色）～4.6（紫色）。阴道在健康状态下PH为3.8到4.2之间，处于酸性，样本卡中添加溴酚蓝可以指示卡片中HPV样品的存在。

优选地，本发明的水为无核酸酶水。

在具体实施例中，优选地，本发明的HPV保存卡浸泡液，其配方为：50 mM-100 mM的Tris （优选80 mM），1 M-4 M的异硫氰酸胍（优选2 M），0.01~0.05%的溴酚蓝（优选0.02％）和无核酸酶水；溶液pH为9.5-11.5，优选pH为11.0。

另一方面，本发明提供一种HPV保存卡，所述保存卡是按照如下方法制备：配制上述HPV保存卡浸泡液，然后用浸泡液处理样本保存介质，最后取出保存介质，干燥，封装而得。所述保存介质是具有吸附能力的卡片，可以为滤纸、硝酸纤维素膜、尼龙膜、玻璃纤维素膜或硅胶膜中的一种。在具体实施例中，本发明HPV保存卡保存介质优选采用903滤纸（580mm X 580 mm）。

另一方面，本发明提供一种HPV保存卡使用方法，具体为：用采样刷采集宫颈或阴道分泌物，然后将吸附有HPV样品的采集刷头反复涂抹至保存卡上3-4次，室温放置样品保存卡至完全干燥（注意干燥过程不可加热），最后将带有HPV样品的保存卡置于样品采集袋中，密封保存。

传统的核酸保存试剂配方包括细胞裂解剂、核酸酶抑制剂、核酸稳定剂、抗菌剂、抗氧化抑制剂和颜色指示剂。其中，核酸酶抑制剂、抗菌剂、抗氧化抑制剂都是必须成分。

所述核酸酶抑制剂一般为金属离子螯合剂Na₂EDTA或EDTA，EDTA可以螯合生物样品中常见的二价金属离子Mg²⁺、Ca²⁺和Fe²⁺等，防止外界引入的金属离子催化核酸酶导致核酸降解的可能。Mg²⁺、Ca²⁺离子均是核酸酶(DNA酶和RNA酶)发挥活性所必不可缺少的催化剂，会协同核酸酶催化作用使核酸降解，而Fe²⁺离子非常容易发生氧化还原反应，它产生出的自由基会破坏核酸，另外Fe²⁺离子更容易直接氧化破坏核酸。

所述抗菌剂包括所有可以使样品中除核酸以外的物质（如蛋白质）变性的成分，使细菌、真菌、病毒等病原微生物外壳蛋白、内部蛋白以及膜蛋白的二级结构发生非特异性的破坏，使其失活，从而使操作者免受感染，一般选用蛋白质变性剂胍盐或阴离子表面活性剂十二烷基磺酸钠(SDS)或十二烷基硫酸钠(SLS)，也可以选用长链的脂肪酸钠。其中常用的SDS是一种能够与蛋白质结合从而使其变性的阴离子表面活性剂，它可以破坏细胞并裂解核酸-蛋白复合物，使DNA释放出来。

所述抗氧化剂的作用机理包括鳌合金属离子（如EDTA）、清除自由基（如酚类抗氧化剂、维生素E，类胡萝卜素）、淬灭单线态氧、清除氧（类胡萝卜素及其衍生物、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、异抗坏血酸和异抗坏血酸钠、硫脲、尿酸或尿酸盐等）、抑制氧化酶活性以及一些还原性功能的化学试剂（如亚硫酸及其钠盐）等。核酸保存溶液中常用的抗氧化剂为金属离子螯合剂EDTA、氧清除剂抗坏血酸、硫脲、尿酸或尿酸盐或还原性试剂亚硫酸及其钠盐等。

从理论上，上述的细胞裂解剂、核酸酶抑制剂、核酸稳定剂、抗菌剂和抗氧化抑制剂协同作用可以有效灭活样本中的病原微生物并高效释放和保存核酸。但是这些化学试剂组分如EDTA、SDS和尿酸的存在或者残留会对后续的PCR扩增过程产生明显的抑制，0.005%的SDS或0.5 mM EDTA残留即可显著降低PCR产量，0.01%的SDS、1 mM EDTA或0.1-1 ng/μL的酸类物质即可完全抑制PCR反应。因此，为了达到既能有效灭活病毒、保存核酸，又降低对后续PCR核酸检测的不利影响，我们对常规的核酸保存卡试剂配方进行改进优化。

本申请发明人，在研究中意外发现，对于收集的HPV样品来说，配方中仅保留胍盐类蛋白质变性剂（如异硫氰酸胍或盐酸胍等）和核酸稳定剂（如Tris等）即可有效灭活病毒并释放和保存核酸DNA；其在抑菌活性、样品核酸保存力、检测准确度等方面均能取得与上述传统保存卡（浸泡液中包含细胞裂解剂、核酸酶抑制剂、核酸稳定剂、抗菌剂和抗氧化抑制剂等成分的保存卡）相当的效果；且本申请带有样本的保存卡只需经过无核酸酶水漂洗1-2次，洗去胍盐和样品中的蛋白等杂质后，所得卡片上即带有纯净的DNA，无需核酸洗脱，即可直接用于后续PCR扩增检测。即本申请的保存卡制备完全不需要使用EDTA、SDS和尿酸等成分，这不仅大大降低了HPV保存卡的生产成本，而且其添加成分也不会对PCR扩增结果产生任何影响。也就是说，本申请发明人意外发现，对于采集的HPV样品，即使不含有常规使用的核酸酶抑制剂、抗菌剂和氧化剂的保存卡，同样能取得传统保存卡（如FTA卡）相同的保存效果，在大大降低成本的基础上，还能免核酸提取步骤，并最大程度保证了后续病毒核酸PCR检测的准确度和灵敏度。因此，本发明的上述保存液取得了预料不到的技术效果。

除此之外，本申请人发现，对部分采集样品（大约10%比例），本申请的保存卡和FTA卡均不能很好的检测其样品中的HPV，样本受到明显的污染。针对这一现象，本申请发明人发现，这部分采集样品中均存在一定浓度的支原体。很有可能是由于现有的FTA卡和本申请的保存卡中的成分均无法有效抑制支原体，导致其在样品保存过程中，仍有一定增加，对样品造成污染，影响到最终检测结果。

经过大量的研究和实验筛选，本申请发明人发现，在本申请的保存卡中添加一定量的牛磺酸盐可以有效抑制上述微生物，保证样品的检测结果。

优选地，本发明的保存卡可进一步含有牛磺酸盐，优选为牛磺酸钠，所述牛磺酸盐的加入能够进一步的抑制支原体等可能在宫颈样品中存在的微生物；优选地，所述牛磺酸盐的浓度为0.5-1 M。也就是说，本发明进一步提供一种改进的HPV保存卡浸泡液，其配方为：50 mM-100 mM的Tris （优选80 mM）, 1 M-4 M的异硫氰酸胍（优选2 M），0.01~0.05%的溴酚蓝（优选0.02％）、0.5-1 M的牛磺酸盐；溶液pH为9.5-11.5，优选pH为11.0。

与现有核酸保存卡（溶液）技术相比，本发明所述保存HPV的保存卡和保存方法存在以下优点：（1）采集的HPV样品直接涂抹到HPV保存卡上即可达到快速安全有效的保存HPV样品中遗传物质的目的；（2）较FTA卡，制造工艺简单，成本低，并具有操作简便、有效杀灭细菌、病毒并防止样品污染的特点；（3）本发明HPV保存卡浸泡液配方简单有效，不含EDTA、SDS、尿酸等一些常见的PCR抑制剂成分，保证PCR扩增结果准确性；（4）本发明保存卡保存的样本经过简单无核酸酶水洗涤洗除去盐离子和杂质即可，核酸无需洗脱，清洗后的样品卡即可直接加入PCR扩增试剂进行直接扩增。另外，本发明提供一种进一步改进的HPV保存卡，尤其涉及使用添加牛磺酸盐的浸泡液制备的HPV保存卡，能够有效抑制宫颈和阴道采样中特有微生物的繁殖，保证检测结果的准确性。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是HPV保存卡抑菌能力测试，A为大肠杆菌涂板结果，B为屎肠球菌涂板结果，C为白色念珠菌涂板结果；

图2是荧光定量PCR检测核酸扩增曲线图；

图3是HPV病毒核酸PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：HPV保存卡的制备

1) 配制HPV浸泡液：用900 ml无核酸酶水溶解19.38 g Tris，212.688 g异硫氰酸胍，0.2 g溴酚蓝，用NaOH调节pH至11.0，加无核酸酶水定容到1L；

2) 处理保存介质：将903滤纸（580 mm X 580 mm）浸没于一定体积的HPV浸泡液中 (按照50μl溶液/cm²介质的比例)，置于密闭容器中防止外界DNA污染，100 rpm/分钟震荡5-10分钟，直到溶液被吸收完全；

3）干燥：小心取出吸收了HPV浸泡液的滤纸，80℃烘烤1小时，充分干燥取出。注意：烘干时滤纸重叠放置，一张压一张，确保两张重叠；

4）剪裁装袋：用压痕装置在干燥后的保存介质中间压出多个45 mm X 30 mm的卡片，压痕个数视需要而定，用镊子将干燥的保存介质粘至HPV保存卡片左/右端，装入塑封袋，HPV保存卡即制作完成。

实施例2：HPV保存卡抑菌性能测试

菌种：大肠杆菌（革兰氏阴性细菌），屎肠球菌（革兰氏阳性菌），白色念珠菌（真菌）

对照品：FTA卡（GE Healthcare）

阴性对照品：903滤纸（3M公司）

取200μl过夜培养的大肠杆菌和屎肠球菌，分别涂布到LB固体培养基上，200μl过夜培养的白色念珠菌涂布到SDA培养基上，将HPV保存卡以及对照品FTA卡裁剪为1cm²的尺寸，放到涂满菌种的LB培养基和SDA培养基上，置于培养箱37℃培养，培养12h后观察大肠杆菌和屎肠球菌的生长情况，培养2-3天后观察白色念珠菌的生长情况。

结果如图1所示，没有经过处理的阴性对照品903滤纸没有抑菌能力，滤纸周围菌体正常生长。培养12小时后的LB平板，HPV保存卡和对照品FTA卡周围一圈无细菌生长，抑菌圈大小基本一致(图1A，1B)，说明本发明的 HPV保存卡和对照品FTA卡对革兰氏阴性细菌大肠杆菌和革兰氏阳性细菌屎肠球菌的抑菌能力基本一致，能有效杀灭样品中的细菌类病原微生物。培养2天后的SDA平板, HPV保存卡和对照品FTA卡周围一圈无菌体生长，抑菌圈大小也基本相当(图1C)，说明本发明的 HPV保存卡和对照品FTA卡对真菌类的白色念珠菌的抑菌能力也基本一致，都能有效杀灭样品中的真菌类病原微生物。

实施例3：样本采集、保存及从HPV样品卡上获取纯化的DNA

（1）HPV样本采集：用一次性宫颈采样刷采集宫颈或阴道分泌物，然后将吸附有HPV样品的采集刷头反复涂抹3-4次至HPV卡上的样品保存区，涂覆区域在数秒钟内由紫色变为白色或米黄色，室温放置样品卡至完全干燥，

（2）信息填写与卡片封装：填写样品信息后将带有HPV样品的卡片置于样品采集袋中，密封室温保存。

（3）HPV卡上DNA的使用：用打孔器、剪刀或一次性刀片取含有HPV样品区（黄色区域）的一小片卡片，置于0.2 ml离心管中，加入100μL无核酸酶水，在水平振荡器上振荡1分钟，吸弃水分，短暂离心，吸去残留水分，重新加入100μl无核酸酶水，在水平振荡器上振荡1分钟，吸弃所有水分，通过两次洗涤洗去了保存卡中所加入的胍盐以及样品中带有的蛋白等杂质，以免对后续的核酸检测反应产生抑制作用。所得卡片上带有纯净的DNA，可以用作PCR等分子生物学实验反应的模板。

实施例4：HPV保存卡对细胞裂解和DNA核酸保存能力的测试

（1）样品准备：取新鲜培养的人源293T细胞，梯度稀释10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4和10^-5，分别滴加在1cm²的HPV保存卡和FTA卡卡片（对照）上，自然风干，然后将滴加细胞的卡片放入样品袋密封，置于恒温箱37℃分别放置0天、7天、14天、26天后进行核酸检测。

（2）样品处理：将放置不同时间的带有293T细胞样品的HPV保存卡/FTA卡置于1.5ml干净离心管中，加入500μl无核酸酶水，在水平振荡器上振荡1分钟，5000rpm 离心30s，吸弃所有水分，再加入500μl无核酸酶水重复洗涤一次，吸弃所有水分，盖好离心管盖，放置于-20℃待用。

（3）核酸检测：采用荧光定量PCR法进行核酸检测，检测试剂为Ultra SYBRMixture（江苏康为世纪生物科技有限公司，货号CW0957），具体操作参考说明书。所用引物为人类内参基因β-actin引物βactin-F：GCGCCGTTCCGAAAGTT，βactin-R：CGGCGGATCGGCAAA。反应体系采用20μl PCR反应体系（包括：10 μl Ultra SYBR Mixture、0.4 μl Bactin-F（10μM）、0.4 μl Bactin-R（10μM）、9.2 μl无核酸酶水）+ 清洗后的样品卡。在ABI7500（美国Thermofisher公司）型荧光定量PCR仪上进行人类内参基因actin核酸检测，反应条件如下：95℃ 5 min→95 ℃ 10 s, 60℃30 s（40 个循环），SYBR通道。所有检测均进行 3 次重复，取平均循环阈值（cycling threshold，Ct）进行计算。结果如表1和图2所示，HPV保存卡/FTA卡样品卡在37℃条件下分别放置0天、7天、14天、26天后,核酸检测实验均得到了目的产物的扩增曲线，扩增效果好，并且HPV保存卡组的Ct值比FTA保存卡组的Ct值要小一些，但是两组Ct值差值在1以内，差异不显著（表1，p＞0.05），表明本发明所述保存卡对细胞样品的裂解和保存效果与FTA卡基本相当，本发明所述样品保存卡和保存方法在室温条件下可以稳定的保存核酸，而且不影响核酸的有效扩增。

实施例5：HPV保存卡对HPV样本保存能力的测试

使用本发明提供的HPV保存卡和对照品FTA卡，分别对6个HPV临床样本S1-S6进行保存、运输和后续HPV核酸检测，具体包括以下步骤：

（1）样品采集：将本发明提供的HPV保存卡和对照品FTA卡以及一次性医用宫颈样本取样刷发放给6位在医院检测为HPV阳性患者，6位患者都处于治疗初期。患者根据取样说明自行取样，分别涂抹到HPV保存卡和FTA卡上，装入样品袋密封后，室温条件下寄送至江苏康为世纪生物科技有限公司进行HPV核酸检测。6例样本运输时间分别约为3-4天，收到样品后室温再分别放置3-4天至达到7天后进行核酸检测，即从取样到检测，样品卡运输保存共计7天后进行核酸检测。

（2）样品处理：用打孔器取HPV保存卡/FTA卡上含有样品区的一小片卡片，置于0.2ml离心管中，加入100μl无核酸酶水，在水平振荡器上振荡1分钟，5000 rpm 离心30s，吸弃所有水分，再加入100μl无核酸酶水重复洗涤一次，吸弃所有水分，盖好离心管盖，待用。

（3）核酸检测：采用普通PCR凝胶电泳检测法进行HPV核酸检测，反应体系采用20μlPCR反应体系（包括：10 μl 2 × GoldStar Master Mix、0.4 μl引物-F（10 μM）、0.4 μl引物-R（10 μM）、9.2 μl无核酸酶水）+ 清洗后的样品卡。PCR反应条件如下： 95℃ 10 min→95 ℃ 15 s, 60℃ 30 s, 72℃ 30s（35 个循环）, 72℃ 5 min。琼脂糖凝胶电泳检测10μLPCR反应产物，电压180V，时间20 min。结果如图3所示，2组平行试验均可以检测出目的产物的扩增条带，并且扩增条带间差异不大，表明样品取样室温运输保存7天时间内，本发明提供的HPV保存卡能有效保存HPV核酸，保存效果与对照品FTA卡基本一致。

实施例6：改进型HPV保存卡对样品检测能力测试

在针对一些医院HPV临床检测应用过程中，申请人发现，部分样品（约占10%比例）放置数天以后检测结果出现较大的波动，甚至难以准确通过PCR检测出HPV的存在。申请人研究发现，此类原因是由于在部分存在支原体感染的样本中，上述保存卡和FTA卡并不能很好的抑制其繁殖，导致放置一段时间后，样品存在支原体污染而影响了检测结果。申请人经过深入研究发现，在保存卡浸泡液中加入牛磺酸盐可以很好的解决这一问题。

改进后的HPV保存卡浸泡液为：用900 ml无核酸酶水溶解19.38 g Tris，212.688g异硫氰酸胍，133.2 g牛磺酸钠，0.2 g溴酚蓝，用NaOH调节pH至11.0，加无核酸酶水定容到1L。使用所述改进的HPV保存卡浸泡液，按照实施例1的方法制备改进的HPV保存卡。

使用本发明提供的HPV保存卡、改进的HPV保存卡和对照品FTA卡，分别对56个HPV临床样本进行保存、运输（具体方法见实施例6）。于取样后14天进行核酸PCR检测，检测使用凯普HPV 21分型试剂盒。具体检测结果如下表2所示：

由此可见，本发明的HPV保存卡，制备过程中使用的浸泡液成分远比FTA卡简单，但其效果却相当（实施例2-5），甚至保存效果优于FTA卡（实施例6）；即在HPV样品检测分析中，本申请的HPV保存卡甚至检测更好（参见实施例6）。对上述结果进行分析，发现在HPV保存卡未检测出6例样品中，均有相当量的支原体存在，而在其检测HPV阳性的50例中，均为支原体阴性。推测是由于牛磺酸盐与异硫氰酸胍的组合，导致样本中的支原体受到抑制，而FTA卡和HPV保存卡因为不存在两者的协同，其样本中支原体污染导致相关检测试剂盒未能检测其中的HPV病毒。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种HPV保存卡浸泡液，其特征在于：所述浸泡液由细胞裂解剂、核酸稳定剂、颜色指示剂、牛磺酸盐和水组成，其pH值为9.5-11.5；其中，所述细胞裂解液为异硫氰酸胍，所述核酸稳定剂为Tris，所述颜色指示剂为溴酚蓝，所述水为无核酸酶水。

2.根据权利要求1所述的浸泡液，其特征在于：所述牛磺酸盐为牛磺酸钠。

3.权利要求1-2任一项所述的浸泡液，其特征在于：所述Tris的浓度为50mM-100mM，所述异硫氰酸胍的浓度为1M-4M，所述溴酚蓝的浓度为0.01~0.05%，所述牛磺酸盐的浓度为0.5-1M。

4.一种HPV保存卡，其特征在于，所述保存卡按照如下方法制备：

（1）配制权利要求1-3任一项所述的HPV保存卡浸泡液；

（2）用步骤（1）所述的浸泡液处理样本保存介质，

（3）最后，取出保存介质，干燥，封装而得；

所述保存介质是具有吸附能力的卡片，选自滤纸、硝酸纤维素膜、尼龙膜、玻璃纤维素膜或硅胶膜中的一种。

5.权利要求4所述的HPV保存卡，其特征在于：所述保存介质是903滤纸。

6.一种含HPV的样品采集保存方法，其特征在于，所述采集方法包括如下步骤：

（1）用采样刷采集宫颈或阴道分泌物；

（2）将吸附有HPV样品的采集刷反复涂抹至权利要求4-5任一项所述的保存卡上3-4次；

（3）室温放置样品保存卡至完全干燥，注意干燥过程不可加热,，最后将带有HPV样品的保存卡置于样品采集袋中，密封保存。

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