CN104651524B

CN104651524B - 一种保存生物样品的方法及试剂盒

Info

Publication number: CN104651524B
Application number: CN201510110055.2A
Authority: CN
Inventors: 毕万里; 吴宁; 马静
Original assignee: SUZHOU NUHIGH BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SUZHOU NUHIGH BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2015-03-13
Filing date: 2015-03-13
Publication date: 2017-10-20
Anticipated expiration: 2035-03-13
Also published as: CN104651524A; WO2016146085A1

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体公开了一种保存生物样品的方法及试剂盒。本发明所述保存生物样品的方法，将吸附有生物样品的采集工具与功能性溶液充分混合，将混合后生物样品转印至滤纸卡上保存；所述功能性溶液包括缓冲溶液、络合剂、抗菌剂、颜色指示剂和抗氧化剂。本发明所述保存生物样品的方法操作简便、样品转移效率高、能更有效杀灭细菌、病毒。采集的生物样品经过一步混合操作，再转印至普通滤纸卡上，即可达到快速安全有效的保存生物样品中遗传物质的目的，同时可保证长期保存不发生褪色现象。

Description

一种保存生物样品的方法及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种保存生物样品的方法及试剂盒，广泛应用于生物学、化学及医学检测反应中基因疾病的诊断、监测、生物库的建立、分子诊断、PCR扩增、法医、遗传鉴定等。

背景技术

生物遗传物质(GM)，其中包括人或动物的生理/病理体液(分泌物、渗出液等)；人或动物的细胞悬液(血液、淋巴液、滑膜液、精液、唾液等)；植物的生理/病理体液或者细胞悬液；细菌、真菌、质粒、病毒、寄生虫等的提取液或者悬液；人或动物机体组织(肝脏、肾脏)提取液或者组织匀浆；DNA或者RNA合成过程的中间体；化学或生化合成的DNA/RNA的混合物；其他任何可以提供液态GM的物质。

核酸是生物遗传物质，包括脱氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)。核酸检测具有现有分子检测中最高的灵敏度及特异性，被广泛用于以下几个方面：传染病病原微生物的检测、遗传性疾病的诊断、血液中病毒的筛查、寄生虫疾病的诊断及监测(疟疾)、人身份鉴定如法医DNA分析及亲子鉴定、肿瘤疾病引起的血液中其他非正常细胞增殖的监测、食品安全及GMO检测、健康咨询等。

然而上述所有的应用均首先涉及生物样品检材的采集，之后将生物样品运输至检测实验室进行核酸提取及检测。在这一系列的操作中面临的最主要的问题是如何有效保存待检生物样品中的核酸使之不被降解，同时灭活生物样品中可能带有的病原微生物以确保操作者及大众的安全。

目前国内外使用最广泛的生物样品的保存方法是通过采集血液或者唾液样品保存至各类保存卡上。商品化保存卡主要有英国Whatman公司生产的FTA系列保存卡。FTA卡是Whatman专利产品，为在室温下收集、运输和储存核酸提供了稳妥、安全、可靠的方法。FTA卡经过专利的化学配方浸渍，含有独特的化学物质，当样品吸附在卡上时，细胞膜和细胞器被裂解，蛋白质变性，释放出的核酸被捕获在FTA卡纤维上，使其免受核酸酶、氧化剂和紫外线损伤及降解，在室温条件下长期稳定地保存。FTA卡可以快速地使有机体(包括血液中的各种病原体)失活，并抑制细菌和其它微生物生长。样品中的传染性病原体在FTA卡上5秒钟内失活。

近期国内一些企业纷纷致力于国产采集卡的研制，较有影响力的主要有天津诺维莱博科技有限公司的DNA存储卡、长春市博坤生物科技有限公司的生物样本采集卡等，其基本核心技术都同FTA技术较类似。

英国Whatman公司的FTA系列保存卡可以在室温条件下长期稳定地保存DNA使其免受降解。但其有众多不足之处，包括：

1、样品转移效率低：指示型FTA卡的样品采集棒的设计不利于样品的采集和转移，实际操作过程中样品的转移效率低。

2、直接扩增技术受限：由于FTA卡设计的初衷是以核酸分离提取为前提，而随着核酸扩增技术的发展，直接扩增技术已经开始普遍应用于法医DNA分析中，使得FTA卡在直接扩增技术方面受到一定的限制。

3、FTA卡保存过程中易褪色：目前市场上的大部分保存卡都设计成粉红色，颜色单一，其利用pH值的改变来指示样品，当无色的样品如唾液，接触到粉红色的保存卡后，样品区由于pH值发生变化而产生颜色变化，由原来的粉红色变成白色，从而可以用来指示样品区域。然而该方法仍存在一个问题，即滤纸卡在空气中保存的过程中随着保存时间的延长及受保存条件、环境温度、环境湿度、以及空气中CO₂含量的影响，从而导致滤纸卡pH值发生改变，粉红色的样品保存卡极易发生褪色现象。

4、使用成本高：FTA卡是Whatman专利产品，价格昂贵，使用成本相当高。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种操作简便、样品转移效率高、能更有效杀灭细菌、病毒的生物样品保存方法及试剂盒，可以使用直接扩增技术广泛应用于法医市场DNA分析。同时由于本发明含有颜色指示剂的功能性溶液为密封保存，保存时间不受保存条件的限制，因此可保证长期保存不发生褪色现象。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种保存生物样品的方法及试剂盒，将吸附有生物样品的采集工具与功能性溶液充分混合，将混合后生物样品转印至滤纸卡上保存；所述功能性溶液包括缓冲溶液、络合剂、抗菌剂、颜色指示剂和抗氧化剂。

优选的，所述缓冲溶液为pH6～10的缓冲溶液。

优选的，所述络合剂为氨基羧酸盐、羟基羧酸盐、有机膦酸盐或聚丙烯酸类络合剂等。

优选的，所述抗菌剂为阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂、烷基胍表面活性剂、抗生素、防腐剂、EDTA等。

优选的，所述颜色指示剂为有色染料、氧化还原指示剂、金属指示剂、钙指示剂、天然pH指示剂、生物指示剂等。

优选的，所述抗氧化剂为丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)、没食子酸丙酯(PG)、混合生育酚浓缩物及愈创树脂、抗坏血酸及其钠盐、异抗坏血酸及其钠盐、硫辛酸、维生素E，类胡萝卜素、枸橼酸、EDTA、磷酸衍生物、甲基硅酮、亚硫酸及其钠盐。

优选的，所述样品为人或动物的生理/病理体液、细胞悬液；人或动物机体组织提取液或者组织匀浆；植物的生理/病理体液或者细胞悬液；细菌、真菌、质粒、病毒、寄生虫等的提取液或者悬液；DNA或者RNA合成过程的中间体；化学或生化合成的DNA或者RNA的混合物；其他任何可以提供液态遗传物质。

优选的，所述缓冲溶液浓度≤600mM；所述络合剂浓度为≤60mM；所述抗菌剂浓度≤120mg/mL；所述颜色指示剂浓度为≤1％；所述抗氧化剂浓度≤180mM。

优选的，所述缓冲溶液浓度为240mM-480mM；所述络合剂浓度为10mM-30mM；所述抗菌剂浓度为45mg/mL-90mg/mL；所述颜色指示剂浓度为0.02％；所述抗氧化剂浓度为30mM-60mM。

本发明还提供一种保存生物样品的试剂盒，包括功能性溶液，所述功能性溶液包括缓冲溶液、络合剂、抗菌剂、颜色指示剂和抗氧化剂。

优选的，所述的试剂盒还包括滤纸卡和/或采集工具。

优选的，所述的滤纸卡为普通滤纸卡。

优选的，所述采集工具为医用采集工具。

本发明提供了一种保存生物样品的方法，使用采集工具采集生物样品，之后将吸附有生物样品的采集工具置于功能性溶液中充分混合，最后将混合后生物样品转印至滤纸卡上保存，其中所述功能性溶液包括缓冲溶液、络合剂、抗菌剂、颜色指示剂、抗氧化剂。与现有技术相比，本发明所述保存生物样品的方法，采集的生物样品经过一步混合操作，再转印至普通滤纸卡上，即可达到快速安全有效的保存生物样品中遗传物质的目的，无需使用制作成本高、价格昂贵的FTA卡，并具有操作简便、样品转移效率高、能更有效杀灭细菌、病毒的特点。本发明所述功能性溶液能够与生物样品中的细胞发生作用，抗菌剂使细胞膜破裂、细胞核裂解，从而释放出细胞核中的核酸，还能够保证各类核酸长期保存，同时具有灭菌作用，能够及时杀灭生物样品中可能存在的病原微生物，从而保证操作人员的安全性。此外本发明含有颜色指示剂的功能性溶液为密封保存，保存时间不受保存条件的限制，因此可保证长期保存不发生褪色现象。

本发明所述试剂盒不含有毒试剂、适用范围广，保存各类生物样品的效果优于市场上的大部分保存卡，而且成本低，适用于广大的实验室和科研工作。

附图说明

图1示荧光定量PCR扩增图，其中各曲线为荧光定量PCR检测放置不同时间滤纸卡检测结果曲线；

图2示琼脂糖凝胶电泳图，其中各泳道为PCR检测放置不同时间滤纸卡检测结果，从左至右依次为0天、4天、8天、12天、16天、20天、24天、28天；

图3示抗菌检测结果图，其中Blank为空白对照的涂板培养结果，1为功能性溶液1涂板培养结果，2为功能性溶液2涂板培养结果；

图4示样品转移率随着样品加入量的变化趋势图，其中为本发明方法的样品转移率，为传统方法的样品转移率。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种保存生物样品的方法及试剂盒。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的方法和试剂盒已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和试剂盒进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

本发明所述保存方法通过采样、混合、转印3步简单操作即可完成。即使用一次性采集工具采集生物样品，之后将吸附有生物样品的一次性采集工具与功能性溶液充分混合处理，最后将混合后生物样品转印至滤纸卡上保存。其中所述功能性溶液包括缓冲溶液、络合剂、抗菌剂、颜色指示剂和抗氧化剂。

在一些实施方案中，本发明所述保存方法中所述功能性溶液中所述缓冲溶液为pH6～10的缓冲溶液，其主要作用包括：①保护核酸使其不发生降解；②提供一个缓冲液系统；③保证络合剂与二价金属离子结合；④防止一些非金属离子依赖性的核酸酶发生反应导致核酸破坏。

在一些优选实施方案中，所述缓冲溶液pH为8.0～9.5。

在一些实施方案中，本发明所述保存方法中所述缓冲溶液浓度≤600mM。

在一些优选实施方案中，本发明所述保存方法中所述缓冲溶液浓度为240mM-480mM。

本发明所述保存方法中所述缓冲溶液可以为有机缓冲溶液和/或无机缓冲溶液。其中所述有机溶液可以为Tris、乙醇胺、三乙醇胺、甘氨酸或有机酸的碱盐如柠檬酸三钠等；所述无机溶液可以为碱金属钠、锂、钾的碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐或硼酸盐，即可以为碳酸钠、碳酸钾、碳酸锂、碳酸氢钠、碳酸氢钾、磷酸钠、磷酸锂、磷酸钾、硼酸钠、硼酸钾等。

采集的生物样品中含有二价活性金属离子Mg²⁺、Ca²⁺离子以及转运金属离子如Fe²⁺离子，Mg²⁺、Ca²⁺离子会协同核酸酶催化作用使核酸降解，而Fe²⁺离子非常容易发生氧化还原反应，它产生出的自由基会破坏核酸，另外Fe²⁺离子更容易直接氧化破坏核酸。本发明所述保存方法中所述功能性溶液中含有络合剂可以与二价活性金属离子Mg²⁺、Ca²⁺离子结合，以及与转运金属离子尤其是Fe²⁺离子结合，避免样品核酸被降解破坏。在一些实施方案中，所述络合剂为强络合剂，可以和多价的金属离子结合。

在一些实施方案中，所述络合剂为氨基羧酸盐类络合剂、羟基羧酸盐类络合剂、有机膦酸盐类络合剂或聚丙烯酸类络合剂。

其中，氨基羧酸盐类络合剂包括氨三乙酸钠(NTA)、乙二胺四乙酸盐(EDTA二钠或四钠)、二乙烯三胺五羧酸盐(DTPA)等，其络合能力强，稳定常数高，耐碱性尚好。羟基羧酸盐类络合剂包括酒石酸、庚糖酸盐、葡萄糖酸钠、海藻酸钠等，其络合能力较强，分散力较差，但容易生物降解。有机膦酸盐类络合剂包括乙二胺四甲叉磷酸钠(EDTMPS)、二乙烯三胺五甲叉膦酸盐(DETPMPS)、胺三甲叉磷酸盐等，其络合能力比EDTA类、磷酸盐类等都要强，络合容量高，络合稳定常数大，金属离子等被络合后不容易解离，而且耐化学稳定性好，不易发生物理降解。聚丙烯酸类络合剂包括水解聚马来酸酐(HPMA)、聚丙烯酸(PAA)、聚羟基丙烯酸、马来酸丙烯酸共聚物以及聚丙烯酰胺等，其螯合能力比羟基羧酸盐、氨基羧酸盐和有机膦酸盐差但阻垢性能较好，而且有吸附杂质的功能，具有良好的胶体特性和分散作用。

在一些实施方案中，本发明所述保存方法中所述络合剂浓度≤60mM。

在一些优选实施方案中，本发明所述保存方法中所述络合剂浓度为10mM-30mM。

本发明所述功能性溶液中还包括抗菌剂以使样品中除核酸以外的一些杂质(如蛋白质)变性，使病原微生物(真菌、细菌、病毒)外壳蛋白、内部蛋白以及膜蛋白的二级结构发生非特异性的破坏使其失活，从而使操作者免受感染。本发明所述保存方法中所述抗菌剂可为阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂、烷基胍表面活性剂、抗生素、防腐剂、EDTA等。

在一些实施方案中，所述抗菌剂为阴离子表面活性剂，其能够与蛋白质结合从而使其变性。

在一些优选实施方案中，所述抗菌剂为结构中含有一个脂肪族或者芳香族的烃链部分以及一个或多个阴离子基团的强阴离子表面活性剂。在一些具体实施例中，所述抗菌剂为十二烷基磺酸钠(SDS)或十二烷基硫酸钠(SLS)。

在一些实施方案中，本发明所述保存方法中所述抗菌剂浓度≤120mg/mL。

在一些优选实施方案中，本发明所述保存方法中所述抗菌剂浓度为45mg/mL-90mg/mL。

颜色指示剂起颜色指示作用，是一类有颜色的物质，并能够使一定颜色附着在纤维上且不易脱落、变色。本发明所述功能性溶液中含有的颜色指示剂具有颜色指示作用，且该指示作用不依赖于pH值的变化，避免了在保存过程中环境条件导致的pH值发生改变造成保存卡褪色现象的发生。同时指示颜色的选择具有多样性而不局限于粉红色。其中，本发明所述保存方法中所述颜色指示剂可为有色染料(偶氮染料、酞菁染料、蒽醌染料、菁类染料、靛族染料、芳甲烷染料、硝基染料和亚硝基染料)；也可为常用指示剂(氧化还原指示剂、金属指示剂、钙指示剂)；也可为其他示剂(生物指示剂等)。

在一些实施方案中，本发明所述保存方法中所述颜色指示剂浓度≤1％。

在一些优选实施方案中，本发明所述保存方法中所述颜色指示剂浓度为0.02％。

本发明所述保存方法中所述功能性溶液还包括抗氧化剂。

所述抗氧化剂按溶解性可为油溶性抗氧化剂(丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)和没食子酸丙酯(PG)、混合生育酚浓缩物及愈创树脂等)，可为水溶性抗氧化剂(抗坏血酸及其钠盐、异抗坏血酸及其钠盐等)，也可为兼溶性抗氧化剂(硫辛酸等)。

所述抗氧化剂按作用机理可为自由基吸收剂(酚类抗氧化剂，维生素E，类胡萝卜素)、氧清除剂(类胡萝卜素及其衍生物、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、异抗坏血酸和异抗坏血酸钠等)、金属离子螯合剂(枸橼酸、EDTA和磷酸衍生物)、单线态氧催猝灭剂、酶的抗氧化剂(SOD酶，过氧化物作用除去自由基)、化学试剂(甲基硅酮，物理屏壁阻碍氧气进入，抗氧化)。

在一些实施方案中，所述抗氧化剂为丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)、没食子酸丙酯(PG)、混合生育酚浓缩物及愈创树脂、抗坏血酸及其钠盐、异抗坏血酸及其钠盐、硫辛酸、维生素E，类胡萝卜素、枸橼酸、EDTA、磷酸衍生物、甲基硅酮、亚硫酸及其钠盐。在一些优选实施方案中，所述抗氧化剂为还原性功能的化学试剂。在一些具体实施例中，所述抗氧化剂为亚硫酸及其钠盐。

在一些实施方案中，本发明所述保存方法中所述抗氧化剂浓度为≤180mM。

在一些优选实施方案中，本发明所述保存方法中所述抗氧化剂浓度为30mM-60mM。

本发明所述生物样品保存方法适用于可以提供液态遗传物质一切生物样品，包括：人或动物的生理/病理体液(分泌物、渗出液等)、细胞悬液(血液、淋巴液、滑膜液、精液、唾液等)；植物的生理/病理体液或者细胞悬液；细菌、真菌、质粒、病毒、寄生虫等的提取液或者悬液；人或动物机体组织(肝脏、肾脏)提取液或者组织匀浆；DNA或者RNA合成过程的中间体；化学或生化合成的DNA/RNA的混合物；其他任何可以提供液态遗传物质的物质。

本发明还提供了一种保存生物样品的试剂盒，包括功能性溶液，所述功能性溶液包括缓冲溶液、络合剂、抗菌剂、颜色指示剂、抗氧化剂。

本发明提供的一种保存生物样品的试剂盒，还包括滤纸卡和/或采集工具。

在一些实施方案中，所述的滤纸卡为普通滤纸卡，如沃华滤纸。

在一些实施方案中，所述采集工具为医用采集工具，如医用棉签。

在一些具体实施例中，本发明所述保存生物样品的试剂盒包括浓度为480mM pH值8.0～9.5的Tris、30mM EDTA、90mg/mL SDS、60mM Na₂SO₃和0.02％百里酚蓝。

在一些具体实施例中，本发明所述保存生物样品的试剂盒包括浓度为240mM pH值8.0～9.5的Tris、15mM EDTA、45mg/mL SDS、30mM Na₂SO₃和0.02％百里酚蓝。

与现有技术相比，本发明所述保存生物样品的方法，采集的生物样品经过一步混合操作，再转印至普通滤纸卡上，即可达到快速安全有效的保存生物样品中遗传物质的目的，无需使用制作成本高、价格昂贵的FTA卡，并具有操作简便、样品转移效率高、能更有效杀灭细菌、病毒的特点。本发明所述功能性溶液能够与生物样品中的细胞发生作用，抗菌剂使细胞膜破裂、细胞核裂解，从而释放出细胞核中的核酸，还能够保证各类核酸长期保存，同时具有灭菌作用，能够及时杀灭生物样品中可能存在的病原微生物，从而保证操作人员的安全性。此外由于本发明的生物样品保存方法及试剂盒为密闭处理，保存时间不受保存条件的限制，因此可保证长期保存不发生褪色现象。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1：本发明所述保存生物样品的方法室温保存核酸

一次性采样工具：医用棉签(稳健医疗)

样品来源：9947标准DNA溶液(30ng/μL)

功能性溶液：浓度为480mM pH值8.0～9.5的Tris、30mM EDTA、90mg/mL SDS、60mMNa₂SO₃和0.02％百里酚蓝

滤纸卡：沃华滤纸(34mm×35mm)

样品采集：把一次性采样工具置于含100μL 9947标准DNA溶液的EP管中，使溶液完全吸附；再把吸附有DNA溶液的一次性采样工具置于含100μL功能性溶液的EP管中，使溶液完全吸附；取出一次性采样工具，然后转印至滤纸卡上。滤纸卡在室温条件下分别放置0天、4天、8天、12天、16天、20天、24天、28天后进行核酸检测。

核酸检测：将放置不同时间滤纸卡放到1.5mlEP管中，向其加入200μL的LB培养基，充分震荡约2分钟后分别吸取100μL上清液，分别采用荧光定量PCR法与普通PCR法进行核酸检测。

方法一：荧光定量PCR法，反应体系见表1，所用的引物及探针为ABI TaqmanUniversal PCR Mix试剂盒(购自公司)的引物及探针。循环条件：95℃10min

(95℃10s→60℃35s)×50循环

结果见表2和图1。

表1荧光定量PCR反应体系

反应物起始浓度	反应物加入的量/μL	反应物终浓度
			10U/μLmTaq	2.50	4.00U/反应
25mMeach dNTP	0.08	0.20nM
			4uM Primer SGF3	0.25	400nM
4uM Primer SGR3	0.25	400nM
			2uM Probe SG3	0.25	200nM
5×PCR Buffer	0.50	1×PCR Buffer
			H₂O	6.17

表2荧光定量PCR结果

由表2和图1结果可见，8组平行实验均得到了目的产物的扩增曲线，并且Ct都比较接近，表明本发明所述保存生物样品的方法在室温保存核酸在试验的8个时间点上，即28天时间内，目的产物得到了有效扩增，并且扩增效果好，本发明所述保存生物样品的方法在室温条件下可以稳定的保存核酸，而且不影响核酸的有效扩增。

方法二：普通PCR法，反应体系见表3，所用的引物及探针为ABI Taqman UniversalPCR Mix试剂盒(购自公司)的引物及探针。

循环条件：95℃10min

(94℃20s→60℃120s→68℃90s)×35循环

68℃10min。

表3普通PCR反应体系

反应物起始浓度	反应物加入的量/μL	反应物终浓度
			10U/μL mTaq	1.00	1.00U/反应
25mMeach dNTP	0.08	0.20nM
			4uM Primer SGF3	0.25	100nM
4uM Primer SGR3	0.25	100nM
			10×PCR Buffer	1.00	1×PCR Buffer
5×FTA拮抗剂	2.00	0.50×FTA拮抗剂
			H₂O	4.68

琼脂糖凝胶电泳检测10μL PCR反应产物，电压180V，时间20min，检测结果见图2。

由图2结果可见，8组平行试验均可以检测出目的产物的扩增条带，并且扩增条带间差异不大，表明在试验的8个时间点上，即28天时间内，本发明所述保存生物样品的方法比较稳定，可靠性较高，

实施例2：本发明所述保存生物样品的方法室温保存核酸

一次性采样工具：医用棉签(稳健医疗)

样品来源：9947标准DNA溶液(30ng/μL)

功能性溶液：浓度为240mM pH值8.0～9.5的Tris、15mM EDTA、45mg/mL SDS、30mMNa₂SO₃和0.02％百里酚蓝

滤纸卡：沃华滤纸(34mm×35mm)

样品采集：把一次性采样工具置于含100μL 9947标准DNA溶液的EP管中，使溶液完全吸附；再把吸附有DNA溶液的一次性采样工具置于含100μL功能性溶液的EP管中，使溶液完全吸附；取出一次性采样工具，然后转印至滤纸卡上。滤纸卡在室温分别放置0天、4天、8天、12天、16天、20天、24天、28天后进行核酸检测。

按照上述方法检测实施例1和实施例2中不同的功能性溶液对保存生物样品中核酸的效果。结果显示与图1和图2相似，表明本实施例所述保存方法的功能性溶液同样可以有效扩增目的产物的条带，而且不同扩增条带间差异较小。

实施例3：本发明所述保存生物样品的方法抗菌性检测

一次性采样工具：医用棉签(稳健医疗)

菌种来源：XL10-gold大肠杆菌(工程菌)，

功能性溶液组成：

溶液1：浓度为240mM pH值8.0～9.5的Tris、15mM EDTA、45mg/mL SDS、30mM Na₂SO₃和0.02％百里酚蓝。

溶液2：浓度为480mM pH值8.0～9.5的Tris、30mM EDTA、90mg/mL SDS、60mM Na₂SO₃和0.02％百里酚蓝。

滤纸卡：沃华滤纸(34mm×35mm)

样品采集：把一次性采样工具置于含100μL细菌悬液的EP管中，使溶液完全吸附；再把吸附有细菌悬液的一次性采样工具置于含100μL不同功能性溶液的EP管中，使溶液完全吸附；取出一次性采样工具，然后转印至滤纸卡上。

空白对照：把一次性采样工具置于含100μL细菌悬液的EP管中，使溶液完全吸附；再把吸附有细菌悬液的一次性采样工具置于含100μL纯水的EP管中，使溶液完全吸附；取出一次性采样工具，然后转印至滤纸卡上。

检测方法：涂板培养法，将空白对照、功能性溶液1和功能性溶液2滤纸卡放到1.5mlEP管中，向其加入200μL的LB培养基，充分震荡约2分钟后吸取100μL上清液，涂在准备好的平板，37℃培养，1小时后进行翻板倒置培养，24小时后拍照结果见图3。

由图3结果可见，空白对照组平板长满了菌落，而功能性溶液1和功能性溶液2组平板菌落很少，基本见不到。表明本发明所述保存方法的功能性溶液可以有效抑制大肠杆菌的生长。

按照上述方法检测所述功能性溶液1和功能性溶液2对葡萄球菌、链球菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、霍乱弧菌、破伤风梭菌、结核分枝杆菌等致病菌的抑制效果，结果显示与图3相似，空白对照组平板长满了菌落，而功能性溶液1和功能性溶液2组平板菌落很少。表明本发明所述保存方法的功能性溶液同样可以有效抑制其它致病菌的生长。

实施例4：本发明所述保存生物样品的方法的转移率检测

一次性采样工具：医用棉签(稳健医疗)

样品来源：高纯水(18Ω)

滤纸卡：沃华滤纸(34mm×35mm)

样品转移：把一次性采样工具分别置于含20μL、30μL、50μL、100μL和150μL高纯水的EP管中，使溶液完全吸附；再把吸附有高纯水的一次性采样工具置于含100μL功能性溶液的EP管中，使溶液完全吸附；取出一次性采样工具，然后转印至滤纸卡上。

空白对照：把一次性采样工具分别置于含20μL、30μL、50μL、100μL和150μL高纯水的EP管中，使溶液完全吸附；取出一次性采样工具，然后转印至滤纸卡上。

检测方法：分别对空白滤纸卡和转印样品的滤纸卡进行称重，计算转移率，结果见表4。分别利用两种方法的转移率对样品量作图，结果见图4。

表4转移率结果

样品量/μL	本发明方法转移率％	传统方法转移率％
			20	87.40	62.00
30	87.60	78.00
			50	93.50	80.60
100	95.70	61.47
			150	83.93	58.95

由表4和图4结果可见，两种方法的转移率均随着样品量的增加呈先上升后下降的趋势，本发明所述保存方法的转移率在样品量为100μL时，达到了最大，传统方法的转移率在样品量为50μL时，达到了最大。但本发明所述保存方法的样品转移率明显高于传统方法的样品转移率。

实施例5：本发明所述保存生物样品的试剂盒

一种保存生物样品的试剂盒，包括功能性溶液，所述功能性溶液包括浓度为480mMpH值8.0～9.5的Tris、30mM EDTA、90mg/mL SDS、60mM Na₂SO₃和0.02％百里酚蓝。

实施例6：本发明所述保存生物样品的试剂盒

一种保存生物样品的试剂盒，包括功能性溶液，所述功能性溶液包括浓度为240mMpH值8.0～9.5的Tris、15mM EDTA、45mg/mL SDS、30mM Na₂SO₃和0.02％百里酚蓝。

实施例7：本发明所述保存生物样品的试剂盒

一种保存生物样品的试剂盒，包括滤纸卡和功能性溶液，所述的滤纸卡为沃华滤纸(34mm×35mm)，所述功能性溶液包括浓度为480mM pH值8.0～9.5的Tris、30mM EDTA、90mg/mL SDS、60mM Na₂SO₃和0.02％百里酚蓝。

实施例8：本发明所述保存生物样品的试剂盒

一种保存生物样品的试剂盒，包括滤纸卡和功能性溶液，所述的滤纸卡为沃华滤纸(34mm×35mm)，所述功能性溶液包括浓度为240mM pH值8.0～9.5的Tris、15mM EDTA、45mg/mL SDS、30mM Na₂SO₃和0.02％百里酚蓝。

实施例9：本发明所述保存生物样品的试剂盒

一种保存生物样品的试剂盒，包括一次性采集工具，滤纸卡和功能性溶液。所述功能性溶液包括浓度为480mM pH值8.0～9.5的Tris、30mM EDTA、90mg/mL SDS、60mM Na₂SO₃和0.02％百里酚蓝。所述的滤纸卡为沃华滤纸(34mm×35mm)，所述的一次性采集工具为医用棉签。

实施例10：本发明所述保存生物样品的试剂盒

一种保存生物样品的试剂盒，包括一次性采集工具，滤纸卡和功能性溶液。所述功能性溶液包括浓度为240mM pH值8.0～9.5的Tris、15mM EDTA、45mg/mL SDS、30mM Na₂SO₃和0.02％百里酚蓝。所述的滤纸卡为沃华滤纸(34mm×35mm)，所述的一次性采集工具为医用棉签。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种保存生物样品的方法，其特征在于，将吸附有生物样品的采集工具与功能性溶液充分混合，将混合后生物样品转印至滤纸卡上保存；所述功能性溶液由480mM pH值8.0～9.5的Tris、30mM EDTA、90mg/mL SDS、60mM Na₂SO₃和0.02％百里酚蓝，或240mM pH值8.0～9.5的Tris、15mM EDTA、45mg/mL SDS、30mM Na₂SO₃和0.02％百里酚蓝组成。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物样品为可以提供液态遗传物质的生物样品。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物样品为人或动物的生理/病理体液、细胞悬液；人或动物机体组织提取液或者组织匀浆；植物的生理/病理体液或者细胞悬液；细菌、真菌、质粒、病毒、寄生虫的提取液或者悬液；DNA或者RNA合成过程的中间体；化学或生化合成的DNA或者RNA的混合物。

4.一种保存生物样品的试剂盒，其特征在于，由480mM pH值8.0～9.5的Tris、30mMEDTA、90mg/mL SDS、60mM Na₂SO₃和0.02％百里酚蓝，或240mM pH值8.0～9.5的Tris、15mMEDTA、45mg/mL SDS、30mM Na₂SO₃和0.02％百里酚蓝组成。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括滤纸卡和/或采集工具。