CN102182116B - 一种收集生物样本的滤纸制备及运用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种收集生物样本的滤纸制备及运用方法,通过在滤纸上添加特定的稳定剂,制备出一种准确度高、稳定性高、重复性好的吸附材料,从而使得样本便于运送、常温保存、干燥后易洗脱,也延长生物样本保存期。本发明选择高性能的醋酸纤维素膜和硝酸纤维素膜作为滤纸材料,将滤纸材料完全浸泡于3.8mM或7.7mM的乙二胺四乙酸水溶液中,取出完全浸润的滤纸材料,置于45℃下烘干,取出成品后,密封保存。本发明可以便捷检测程序,同时也能降低临床检验成本,减轻了患者的经济负担。
Description
技术领域
本发明属于临床疾病诊断检测领域,涉及一种广领域的可用于临床诊断检测的液态生物样本收集滤纸。
背景技术
临床检验是疾病诊断和预后的重要工具, 为了准确诊断疾病,为临床治疗提供科学依据。检验工作者必须在实践过程中不断探索出更准确、更经济实用的检验方法,从而更有效地协助临床诊断和鉴别诊断。
临床生物样品包括:体液和组织,具体包括血液、尿液、唾液、淋巴液、脑脊液、胃肠道分泌液和各类组织切片。因液态生物样品取才方便,临床上广泛将血液和尿液等液态生物样品运用于疾病的诊断检查,其中包括无机离子检测、糖类检测、肾功能检测、肝功能检测、心功能检测、脂类检测、血气酸碱、特定蛋白检测、临床免疫学检验、病原微生物检测。
衡量临床检验工作质量的重要标志之一,是结果的准确性和可靠性,而保证这一结果的重要前提是检验标本的正确采集和处理。标本采集和患者在标本留取前的准备对检验结果的准确性极为重要,在工作中常常碰到因标本采集或留取不当造成的检验结果失真和甚至错误的现象。如何正确采集或留取合格的检验标本,从而保证检验质量,需从患者准备、标本采集方法、标本的运输和保存等方面进行严格的质量控制。
传统样本收集流程包括:样本采集、样本送检、样本签收。样本采集按照检测项目的要求,对样本的采集内容、部位、容量、时间、方式等进行控制。样本应置于被认证批准的安全容器中运输。
然而,传统的液态生物样本的采集,如血液,在常规样本收集中存在以下不足:
即使在离体的液态样本中加入枸橼酸钠、EDTA等抗凝剂,其保存时间也很短。
样本采集后多使用试管装载,液态样本在运输送检中也很难避免振动、外溅。外部的机械力等物理作用会使检测产生误差,乃至错误。
生物样本自身含有丰富的蛋白质、糖类等营养物质,当处于液态的环境,容易滋生细菌而造成检测失败。
液态生物样本在送检过程中,更易发生泄漏或者不慎容器破裂,从而造成生物污染。
样本采集需要特定的安全容器、运送过程中一般需要低温、防震,增加了检测成本。
整个样品采集、运送过程,步骤繁琐复杂,缺少便捷性。
近年来,随着医疗器械行业公司普遍重视将大型医疗设备产品中高档产品的新技术、高性能、重要功能向中低挡产品转移,以降低成本,减轻医疗负担,适应更大范围就医人群的需要。现代医疗卫生事业已从单纯的医院内诊治为主的模式逐步发展为院前急救、临床诊治和康复保健结合的社区医疗、家庭护理的多元化的现代医疗保障体系,发展新型的、小型化、高精度和人性化的医疗仪器产品成为近几年医疗器械产业发展的新亮点。
同时最新调查显示,我国现有近9200万人的糖尿病患者。患病率居世界第二位,也稳步逐年上升。有超过一半的人并不知道自己是糖尿病人。在目前的糖尿病患者中,II型糖尿病患者约占糖尿病患者总数的90%,I型糖尿病约占5%至10%。广州及珠三角地区已成为全国糖尿病发病率最高的地区,约为6%至7%,是全国平均水平的1.5倍。2007至2008年广东省糖尿病流调结果显示,20至74岁居民糖尿病患病率为12.6%,超过全国平均水平。作为一种慢性终身性的代谢疾病,糖尿病到目前还没有根治的办法。糖尿病的治疗心理治疗、饮食治疗、运动治疗、药物治疗。这些治疗的的目的都是为了将患者血糖值控制下一定范围。然后,尽管如此,大致有三分之一的病人无法通过常规方法有效地控制血糖,从而导致后期严重的糖尿病并发症。
医院现有的糖尿病常规检查包括如下:
一、口服葡萄糖耐量实验(OGTT)。隔夜空腹10~12小时,抽取空腹静脉血,然后口服葡萄糖或进食馒头餐,再分别于进食第一口之后30分钟、一小时、两小时抽取静脉血,测出空腹、餐后30分钟、餐后一小时、餐后两小时血糖指标。
缺点:病人需要进行饮食控制,亲临医院,血糖易受饮食、运动、情绪、睡眠、服药的影响,血样的采集贮存不易,多次取血给患者造成额外的痛楚。
二、尿糖检测
当血浆葡萄糖浓度超过8.9~110mmol/L时,即可查出尿糖,用“+”表示,“+”越多表明血糖越高。
缺点:尿糖不作为糖尿病的诊断指标,一般仅用于糖尿病控制情况的监测和提示可能为糖尿病而需进一步检查的指标。
现在,国际糖尿病权威机构都以糖化血红蛋白水平作为控制血糖好坏的金标准。《中国糖尿病防治指南》将我国糖尿病患者的糖化血红蛋白达标值定为小于6.5%。糖化血红蛋白(HbA1c)是血红蛋白糖基化的产物。血红蛋白糖基化反映发生在许多氨基酸位点,将近一半的糖基化位点发生在糖化血红蛋白β链上的缬氨酸N末端。随着人们对糖尿病知识的逐步了解,多数人已意识到空腹和餐后2小时血糖监测的重要性,并常常把二者的测定值作为控制血糖的标准。其实不然,空腹和餐后2小时血糖是诊断糖尿病的标准,而衡量糖尿病控制水平的标准是糖化血红蛋白。空腹血糖和餐后血糖是反映某一具体时间的血糖水平,容易受到进食和糖代谢等相关因素的影响。糖化血红蛋白可以稳定可靠地反映出检测前120天内的平均血糖水平,且很少受抽血时间、是否空腹和是否使用胰岛素等因素干扰。常规的血糖检测只能反映了患者在某一时间点的血糖数值。糖化血红蛋白可反映糖尿病患者前120天这一时间段的病情控制情况,提供给医疗专家和患者中一个非常重要的工具,以确定患者的治疗效果以及病程进展。因此,国际糖尿病联盟明确规定糖化血红蛋白是国际公认的糖尿病监控“金标准”。糖化血红蛋白检测可通过特异性强的酶联免疫吸附法实现。
面对传统的液态样本收集方法的不足,另一种液态生物标本(例如血液、尿液、唾液以及其它液态标本)的采集方法——即使用滤纸收集样本, 已经被人们接受并运用但临床实践中。尤其是运用于新生儿疾病检测,例如,通过滤纸收集血样,检测其中的特定组分,来检测先天性代谢疾病(苯丙酮尿型)。此外,滤纸还运用于检测甲状腺功能不全和糖尿病患者疾病状况。滤纸干血样技术现已经广泛用于临床的新生儿先天性疾病诊断检测。
滤纸干血样技术是一种利用滤纸的吸附能力将采集血液,自然风干或人为风干后形成干血斑,从而留待诊断检测。干血斑作为检测样本,经洗脱后可用于临床项目检测。作为一种便捷的液态样本采集方法,减少了临床上的一次性采集试管、一次性采集带的使用,减少了污染的产生。
但是,目前中国临床上使用的样本收集滤纸,仅仅是将未经任何优化处理的滤纸直接用于疾病临床检测。其生产工艺简陋、技术含量低,未能很好地克服传统样本收集方法的不足,也未能很好地发挥滤纸收集样本方法的便捷性、实用性。
现有滤纸采集血液后,生物样本易变质而不易保存,样本洗脱时损耗太多甚至难于洗脱,造成检测结果准确度低、稳定性低、重复性差等缺点。这些不足限制了滤纸在临床诊断检测的推广运用。因此,迫切需要发明一种准确度高、稳定性高、重复性好的吸附材料,从而延长生物样本保存期,样本干燥后易洗脱。
利用滤纸样本收集技术,亟待研发一种家用的远程血液尿液收集产品,更好的便利大众,成为了时代的需求。
1980年,Schleicher和Schuell公司开始生产一种可贴附于测试申请表的滤纸。在S&S系统中,血液斑点可放置于滤纸上的一或多个指定区域,置干后,再连同测试申请表一同邮递到实验室。
Eross等介绍了滤纸的采样使用与利用亲和色谱法检测滤纸上的糖化血红蛋白。检测糖化血红蛋白对是糖尿病患者极其重要的代谢监控。在1987至 1992,此时所用的吸附材料为经葡萄糖氧化酶处理的滤纸。
这一方法和材料已经成为多种专利的主体,包括U.S. Pat. No. 5,516,487中描述的利用各种抗生素或防腐剂与棉纤维滤纸结合,以及使用滤纸是由被齿孔孤立的多重应用区构成。U.S. Pat. No. 5,508,200中介绍了利用S&S 903和S&S 470滤纸在复杂的综合分析体系测量的化学反应的滤纸矩阵。U.S. Pat. No. 5,432,097描述了添附消化纤维素酶的滤纸以便回收的完整细胞。U.S. Pat. No. 5,427,953涉及一种测量滤纸上吸附血样重金属含量的方法。U.S. Pat. No. 5,204,267描述的是采集于不同的过滤基质的血样保存,以进行葡萄糖分析。U.S. Pat. No. 4,816,224是一种多层复合器件,用于从收集到的血样中分离血浆或血清,再进行葡萄糖分析。U.S. Pat. No. 4,299,812,涉及到一种改良的甲状腺功能检测方法。U.S. Pat. No. 4,227,249主要涉及干性步骤,可有效地测量生长调节素。这些国外专利或产品的存在充分证明了吸附材料用于诊断检验领域的可行性。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺点,提供一种通过在滤纸上添加特定的稳定剂,制备出一种准确度高、稳定性高、重复性好的吸附材料,从而使得样本便于运送、常温保存、干燥后易洗脱,也延长生物样本保存期。同时本发明可以降低临床检验成本,减轻了患者的经济负担。
本发明的目的之二,是取吸附有血液的滤纸,洗脱后,通过酶联免疫吸附实验即可测得糖化血红蛋白浓度值。同样的,我们用滤纸收集其它液态生物样本,例如尿液、唾液,经洗脱后,选择适当的检测方法,便可达到检测目的。
为达上述目的,本发明的一种收集生物样本的滤纸制备方法,采用以下的技术方案:
步骤一、选择高性能的醋酸纤维素膜和硝酸纤维素膜作为滤纸材料;
步骤二、将滤纸材料完全浸泡于3.8mM或7.7mM的乙二胺四乙酸水溶液中;
步骤三、取出完全浸润的滤纸材料,置于40~55℃下烘干;
步骤四、取出成品后,密封保存。
本发明的一种收集生物样本的滤纸运用方法,采用以下的技术方案:
步骤一、制备实验滤纸:
①、称取0.25g乙二胺四乙酸二钠溶于200ml去离子水,制成3.8mM的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液;或称取0.51g乙二胺四乙酸二钠溶于200ml去离子水,制成7.7mM的乙二胺四乙酸溶液;
②、将常规滤纸完成放入3.8mM的EDTA溶液中,浸泡35~60分钟;
③、取出滤纸,置于40~55℃恒温烘箱中烘45~70分钟,防止盐结晶析出;
④、待滤纸完全烘干后,取出备用;
步骤二、采集血样。用一次性采血针,取无名指指尖血液,将一滴血液滴于滤纸上的指定位置,常温下风干25~40分钟;
步骤三、将干血斑用生理盐水溶解洗脱;
步骤四、用酶联免疫吸附法检测糖化血红蛋白(HbA1c)。
本发明提供一种准确度高、稳定性高、重复性好的吸附材料,从而使得样本干燥后易洗脱,也延长生物样本保存期。本发明属于临床疾病诊断检测领域,涉及一种广领域的可用于临床诊断检测的样本收集滤纸。即通过对原滤纸材料进行特殊处理,提高了滤纸收集的液态生物样本中待测组分的稳定性,也易于洗脱检测,具有准确度高、变异系数低的优点。本发明通过对原滤纸材料进行特殊处理,保存了滤纸所收集的液态生物样本中待测组分的稳定性,也易于洗脱检测,具有回收率高、稳定性好和样品可以在常温条件下远程输送的优点。
附图说明
图1所示为血样直接检测HbA1c平均值的示意图表。
图2所示为本发明实施例吸附血样滤纸放置3天后,回收检测HbA1c平均值的示意图表。
图3所示为本发明实施例吸附血样滤纸放置7天后,回收检测HbA1c平均值的示意图表。
图4所示为本发明实施例吸附血样滤纸放置11天后,回收检测HbA1c平均值的示意图表。
图5所示为本发明实施例各实验组的回收率计算及组间比较示意图表。
图6所示为本发明实施例滴取血样的示意图。
图7所示为本发明实施例滤纸上血样自然风干后的示意图。
具体实施方式
为能进一步了解本发明的特征、技术手段以及所达到的具体目的、功能,解析本发明的优点与精神,藉由以下结合附图与具体实施方式对本发明的详述得到进一步的了解。
对照组A:血样直接检测HbA1c平均值,参见附图1:
常规收集血样后,使用酶联免疫吸附法,直接检测血样的糖化血红蛋白HbA1c含量,每样本做三个复孔。图1的图表显示,复孔间变异系数小,检测方法准备可靠。检测范围跨越:4.7~13.6,可覆盖血糖浓度生理值与病理值,适用于临床各种临床样本和检测目的。
实验组B:吸附血样滤纸放置3天后回收检测HbA1c平均值,参见附图2:
使用本发明滤纸采集血样,自然风干,室温放置3天后,洗脱回收样本。再使用酶联免疫吸附法检测样本中的糖化血红蛋白HbA1c。每样本做三个复孔。图2的图表显示,复孔间变异系数小,数值与对照A高度相近。检测范围跨越:4.7~13.6,可覆盖生理值与病理值,适用于临床各种临床样本和检测目的。
实验组C:吸附血样滤纸放置7天后回收检测HbA1c平均值,参见附图3:
使用本发明滤纸采集血样,自然风干,室温放置7天后,洗脱回收样本。再使用酶联免疫吸附法检测样本中的糖化血红蛋白HbA1c。每样本做三个复孔。图3的图表显示,复孔间变异系数小,数值与对照A高度相近。检测范围跨越:4.7~13.6,可覆盖生理值与病理值,适用于临床各种临床样本和检测目的。
实验组D:吸附血样滤纸放置11天后回收检测HbA1c平均值,参见附图4:
使用本发明滤纸采集血样,自然风干,室温放置11天后,洗脱回收样本。再使用酶联免疫吸附法检测样本中的糖化血红蛋白HbA1c,每样本做三个复孔。图4的图表显示,复孔间变异系数小,数值与对照A高度相近。检测范围跨越:4.7~13.6,可覆盖生理值与病理值,适用于临床各种临床样本和检测目的。
各组之间的回收率计算,参见附图5:
各实验组的回收率计算及组间比较。图5的表a表明具有高回收率:各实验组样本回收率高,血样经本滤纸采集,洗脱回收后,仍可真实反映目的组分在样本中的量。图5的图b显示具有高稳定性:各样本以3天、7天、11天为时间轴进行对比,数值稳定。
本发明的收集生物样本的滤纸运用方法
1、制备实验滤纸:
①称取0.25g乙二胺四乙酸二钠溶于200ml去离子水,制成3.8mM的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液;或称取0.51g乙二胺四乙酸二钠溶于200ml去离子水,制成7.7mM的乙二胺四乙酸溶液;
②将4cm×4cm规格的常规滤纸完成放入3.8mM的EDTA溶液中,浸泡45分钟;
③取出滤纸,置于49℃恒温烘箱中烘60分钟,防止盐结晶析出;
④待滤纸完全烘干后,取出备用。
2、采集血样,用一次性采血针,取无名指指尖血液,将一滴血液滴于滤纸上的指定位置,常温(25℃)下风干30分钟。
3、将干血斑用生理盐水溶解洗脱。
4、用酶联免疫吸附法检测糖化血红蛋白(HbA1c)。
滴取一滴血样,滴于滤纸上的指定位置,参见附图6;
待血样干后,可邮寄运送,参见附图7。
实施例一、使用本发明滤纸采集血样,血样自然风干,室温放置3天后,洗脱回收样本。再使用酶联免疫吸附法检测样本中的糖化血红蛋白。每样本做三个复孔。图表显示,复孔间变异系数小,数值与对照A高度相近(结果见附图2)。
实施例二、用本发明滤纸采集血样,自然风干,室温放置7天后,洗脱回收样本。再使用酶联免疫吸附法检测样本中的糖化血红蛋白。每样本做三个复孔。图表显示,复孔间变异系数小,数值与对照A高度相近(结果见附图3)。
实施例三、使用本发明滤纸采集血样,自然风干,室温放置11天后,洗脱回收样本。再使用酶联免疫吸附法检测样本中的糖化血红蛋白,每样本做三个复孔。图表显示,复孔间变异系数小,数值与对照A高度相近(结果见附图4)。
乙二胺四乙酸通常称为EDTA,是一种有机化合物。它是一个六齿配体,能与Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+等金属离子结合。由于多数核酸酶类和有些蛋白酶类的作用需要Mg2+,故可作为核酸酶、蛋白酶的抑制剂。乙二胺四乙酸是一种重要的络合剂,其用途很广,可用作漂白定影液、染色助剂、纤维处理助剂、化妆品添加剂和血液抗凝剂等。基于乙二胺四乙酸的安全性和络合性质,本发明选择了它作为抗凝剂、络合剂,已达到增加样本稳定性的同时,易于洗脱。
乙二胺四乙酸通常只用于水溶液中,但本发明的实施例也证明了在固体中它也能发挥抗凝和络合作用。本发明中,浸泡用的乙二胺四乙酸水溶液浓度至少需要达到3.8mM,才能发挥效果,达到7.7mM具有最优的作用。
基于乙二胺四乙酸的安全性和络合性质,本发明选择了它作为抗凝剂、络合剂,增加了样本稳定性的同时,也易于干样本洗脱。实验证明,使用本发明收集样本,回收率高,变异系数小。
以上所述实施例仅表达了本发明的部分实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (1)
1.一种收集生物样本的滤纸运用方法,其特征在于,所述运用方法包括如下步骤:
步骤一、制备实验滤纸:
①、称取0.25g乙二胺四乙酸二钠溶于200ml去离子水,制成3.8mM的乙二胺四乙酸溶液;或称取0.51g乙二胺四乙酸二钠溶于200ml去离子水,制成7.7mM的乙二胺四乙酸溶液;
②、将常规滤纸完成放入3.8mM的EDTA溶液中,浸泡35~60分钟;
③、取出滤纸,置于40~55℃恒温烘箱中烘45~70分钟,防止盐结晶析出;
④、待滤纸完全烘干后,取出备用;
步骤二、采集血样:用一次性采血针,取无名指指尖血液,将一滴血液滴于滤纸上的指定位置,常温下风干25~40分钟;
步骤三、将干血斑用生理盐水溶解洗脱;
步骤四、用酶联免疫吸附法检测糖化血红蛋白。
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Granted publication date: 20121212 Termination date: 20160314 |
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