CN108107224A - 一种ProGRP含量测定用液态校准品 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种ProGRP含量测定用液态校准品,包括以下组分:缓冲液10~200mmol/L,防腐剂0.1~0.5%(w/v),蛋白质类稳定剂1~5%(w/v),糖类稳定剂5~10%(w/v),EDTA 1~5%(w/v),表面活性剂0.1~0.5%(w/v),ProGRP抗原0~5000pg/mL,抑肽酶1~10mg/L。本发明的优点在于不用冻干,使用时也无需复溶,减少了复溶过程中可能出现的不可控因素,使得临床检测结果更为准确。由于其中添加了糖类稳定剂、金属蛋白酶抑制剂(EDTA)、抑肽酶等成份,有效地提高了ProGRP蛋白的稳定性,使得制备的ProGRP液态校准品稳定性较好,可在2‑8℃冷藏稳定保存12个月。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验领域,尤其是涉及一种用于胃泌素释放肽前体(ProGRP)含量测定用液态校准品。
背景技术
胃泌素释放肽(GRP)是由McDonald等在1978年从猪的胃组织细胞中分离出来的一种具有促胃泌素分泌作用的胃肠道激素,由27个氨基酸组成,是有效的促分泌素或调节肽,广泛分布于哺乳动物的胃肠道神经系统和肺呼吸道。肺癌的癌细胞本身亦可产生并分泌GRP,以自分泌的方式调节自身的生长,并且也可以通过局部弥散的方式与周围的肿瘤细胞膜上相应的受体结合,刺激肿瘤的生长。低水平GRP即可刺激小细胞肺癌(SCLC)细胞DNA合成,因而GRP被认为是SCLC的自主生长因子。但由于GRP很容易被肽链端解酶快速降解,活性部分在血中不稳定,从血浆中直接提取可靠的GRP较困难,因而难以在临床上应用。
ProGRP是GRP的前体结构,普遍存在于非胃窦组织神经纤维脑和肺的神经内分泌细胞中,ProGRP根据其部分氨基酸的变异,可分为3种生物大分子,它们具有共同的羧基末端序列31-98,能够在血浆中稳定表达ProGRP,是GRP基因编码的产物。
研究证实ProGRP羧基末端序列31-98水平能够代表GRP水平和GRP基因表达,是一种新的肿瘤标志物。特别是针对于小细胞型肺癌,ProGRP和NSE(神经元特异性烯醇化酶)检测SCLC的敏感性分别为73%和60%,特异性分别为98%和92%,但是NSE诊断早期SCLC的敏感性仅36.84%,而ProGRP诊断早期SCLC的敏感性可达63.16%。此外,ProGRP较NSE有一个更大的优势,就是样本检验结果不受溶血的影响。由此可见ProGRP对SCLC诊断的特异性、敏感性尤其是SCLC的早期诊断比NSE更好;在对其他癌症方面诸如非小细胞肺癌、胃肠肿瘤、小细胞食管癌、卵巢癌等的诊断和监测也有重要意义。通过动态监测,可辅助判断疾病的进程、治疗效果和复发。
2017中国癌症登记年报显示,肺癌是近年发病率和死亡率最高的癌症。通过免疫检测定量测定人血浆和血清中的ProGRP含量,可辅助用于小细胞肺癌的早期诊断、疾病进程检测、治疗效果评价及复发监测等。目前,国内外知名的体外诊断试剂生产商(如罗氏、康乃格等)提供的ProGRP校准品主要是冻干品,不仅价格昂贵,而且冻干校准品存在以下缺点:a. 复溶给操作者带来了一定麻烦;b. 复溶过程中,水质差异及人为操作误差可能导致校准品复溶后的浓度与靶值有偏差,从而造成临床检测结果的不准确; c. 校准品复溶后不易保存、保存时间短。
发明内容
本发明的目的在于提供一种稳定的ProGRP含量测定用液态校准品,该液态校准品在2~8℃冷藏条件下能保存1年,对ProGRP的测定具有良好的检测性能。
为实现上述目的,本发明可采取下述技术方案:
本发明所述的ProGRP含量测定用液态校准品,包括以下组分:
缓冲液10~200mmol/L,防腐剂0.1~0.5%(w/v),蛋白质类稳定剂1~5%(w/v),糖类稳定剂5~10%(w/v),EDTA 1~5%(w/v),表面活性剂0.1~0.5%(w/v),ProGRP抗原0~5000pg/mL,抑肽酶1~10mg/L。
实际配制时,缓冲液可以采用Tris缓冲液、PBS缓冲液、MES缓冲液、Taps缓冲液或Mops缓冲液中的任一种,所用缓冲液的PH为6~8。
防腐剂可以使用Proclin 300、MIT、Bro、IPBC或NaN3中的一种或两种以上的混合物。
蛋白质类稳定剂可以采用酪蛋白、鱼明胶或牛血清白蛋白中的一种或两种以上混合物。
糖类稳定剂可以采用蔗糖、海藻糖或葡萄糖中的一种或两种以上混合物。
表面活性剂可以采用Trotion X-100、Tween20、Tween60或辛基酚聚氧乙烯醚中的一种或两种以上混合物。
EDTA可以单独使用乙二胺四乙酸二钠或乙二胺四乙酸二钾,也可以将两者混合使用。
所述ProGRP抗原分为0pg/mL、20pg/mL、80pg/mL、400pg/mL、1250pg/mL、5000 pg/mL六个浓度梯度。
本发明的优点在于不用冻干,使用时也无需复溶,减少了复溶过程中可能出现的不可控因素,使得临床检测结果更为准确。
ProGRP易被蛋白酶降解为GRP,从而失去稳定性,EDTA是一种优良的金属蛋白酶抑制剂,本发明液态校准品中加入1-5%(w/v)的EDTA,可以通过鳌和金属离子,夺取金属蛋白酶活性必需的金属离子,使其失活,从而提高ProGRP蛋白的稳定性;糖类分子通常具有五个以上的羟基,具有较高的玻璃化温度,在相对高温下,糖与蛋白质分子之间混合作用增大,有部分糖分子在蛋白质分子内部形成玻璃态,从而更有效的限制蛋白质分子空间结构发生变化,保护蛋白质分子免受高温所引起的损伤,提高蛋白的稳定性;抑肽酶也称胰蛋白酶抑制剂,是一种天然广谱蛋白酶抑制剂,能与多种蛋白酶的活动中心竞争一个赖氨酞基而抑制其活性,从而提高ProGRP蛋白的稳定性;而在校准品中加入适量的表面活性剂,能够在一定程度上消除非特异性吸附,显著降低校准品的本底信号值,从而提高试剂盒的分析灵敏度。
综上所述,本发明提供的用于ProGRP含量测定的液态校准品,由于其中添加了糖类稳定剂、金属蛋白酶抑制剂(EDTA)、抑肽酶等成份,有效地提高了ProGRP蛋白的稳定性,使得制备的ProGRP液态校准品稳定性较好,可在2-8℃冷藏稳定保存12个月。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细的说明。
一、ProGRP含量测定用液态校准品的配制
1、针对不同的缓冲体系配制ProGRP液态校准品
1.1 100mL Tris缓冲液:
称取Tris 0.65g(北京益利精细化学品有限公司)、氯化钠0.8g(北京益利精细化学品有限公司)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)(北京益利精细化学品有限公司)2g,加入80mL纯化水,调节PH=8.0,加入鱼明胶3g(sigma)、加入Proclin 300 0.2mL(sigma)、加入MIT0.2mL,加入海藻糖2g(杭州四季青生物工程材料有限公司)、加入Tween-20 0.2mL(sigma),然后定容至100mL,搅拌至溶解。
1.2 100mL PBS缓冲液:
称取磷酸二氢钠(NaH2PO4.12H2O)0.59g、磷酸氢二钠 (Na2HPO4.2H2O)0.28g(北京益利精细化学品有限公司)、氯化钠0.8g(北京益利精细化学品有限公司)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)(北京益利精细化学品有限公司)2g,加入80mL纯化水,调节PH=7.4,加入鱼明胶3g(sigma)、加入Proclin 300 0.2mL(sigma)、加入MIT 0.2mL,加入海藻糖2g(杭州四季青生物工程材料有限公司)、加入Tween-20 0.2mL(sigma),然后定容至100mL,搅拌至溶解。
1.3 100mL MES缓冲液:
称取MES 0.65g(北京益利精细化学品有限公司)、氯化钠0.8g(北京益利精细化学品有限公司)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)(北京益利精细化学品有限公司)2g,加入80mL纯化水,调节PH=6.0,加入鱼明胶3g(sigma)、加入Proclin 300 0.2mL(sigma)、加入MIT 0.2mL,加入海藻糖2g(杭州四季青生物工程材料有限公司)、加入Tween-20 0.2mL(sigma),然后定容至100mL,搅拌至溶解。
1.4 100mL Taps缓冲液:
称取Taps 0.65g(北京益利精细化学品有限公司)、氯化钠0.8g(北京益利精细化学品有限公司)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)(北京益利精细化学品有限公司)2g,加入80mL纯化水,调节PH=7.4,加入鱼明胶3g(sigma)、加入Proclin 300 0.2mL(sigma)、加入MIT 0.2mL,加入海藻糖2g(杭州四季青生物工程材料有限公司)、加入Tween-20 0.2mL(sigma),然后定容至100mL,搅拌至溶解。
2、不同缓冲液的校准品对稳定性的影响
将上面配制的四种液态校准品分别配制成六种浓度梯度校准品(0pg/mL、20pg/mL、80pg/mL、400pg/mL、1250pg/mL、5000 pg/mL ,称作S0~ S5),然后各取一套校准品在37℃条件下放置10天,与相应在2~8℃保存的标准品比较,考核其稳定性降幅,结果见表1。
表1不同缓冲液对ProGRP校准品稳定性的影响
注:求均值时,校准品S0不参与计算
从表1结果可以看出,ProGRP在四种缓冲液中的稳定性相当。
二、ProGRP液态校准品的实时稳定性考核
将以上配制的ProGRP液态校准品分装后置于2-8℃保存,分别在0个月、2个月、4个月、6个月、9个月、12个月、14个月时分别取出来一份,使用郑州安图生物工程股份有限公司的胃泌素释放肽前体检测试剂盒(磁微粒化学发光法)检测ProGRP的含量,配套本公司的AutoLumo A2000plus考核该液态ProGRP校准品的稳定性。结果见表2:
表2 ProGRP校准品实时稳定性考核(信号值比值)
由表2可知,2~8℃保存12个月后,校准品中ProGRP的含量降解小于10%,说明该校准品具有良好的稳定性,可以取代冻干品的校准品使用,大大降低了成本,减少了操作麻烦,提高了临床检测的准确度。
三、不同表面活性剂对校准品本底的影响
液态校准品中加入适量的表面活性剂,能够在一定程度上消除非特异性吸附,显著降低校准品的本底信号值,从而提高试剂盒分析灵敏度。使用上述配制的Tris缓冲液配方配置校准品,添加不同的表面活性剂,与空白对照(不添加表面活性剂)比较本底差异,结果见表3:
表3 添加表面活性剂对校准品本底的影响
由表3可知,在液态校准品中加入适量的表面活性剂,能够在一定程度上消除非特异性吸附,显著降低校准品的本底信号值,从而提高试剂盒分析灵敏度。
四、校准品的标定
本发明提供的校准品包含六个浓度点S0-S5(理论浓度分别是0pg/mL、20pg/mL、80pg/mL、400pg/mL、1250pg/mL、5000pg/mL)。使用罗氏公司的胃泌素释放肽前体检测试剂盒(电化学发光法)对本校准品的S1-S5进行标定。选取不同的三个实验室的罗氏ProGRP标定本校准品,每个实验室检测10次,最终校准品各浓度点得到30个数据,求平均值,即为校准品的靶值。结果见表4:
表4 校准品的标定(单位:pg/mL)
从表4可以看出,六个浓度点的S0-S5值分别是0pg/mL、20.76pg/mL、81.03pg/mL、399.98pg/mL、1247.92pg/mL、4996.89pg/mL。表明靶值与理论值非常接近,保证了临床检测结果的准确性。
Claims (8)
1.一种ProGRP含量测定用液态校准品,其特征在于:包括以下组分:
缓冲液10~200mmol/L,防腐剂0.1~0.5%,蛋白质类稳定剂1~5%,糖类稳定剂5~10%,EDTA1~5%,表面活性剂0.1~0.5%,ProGRP抗原0~5000pg/mL,抑肽酶1~10mg/L。
2.根据权利要求1所述的ProGRP含量测定用液态校准品,其特征在于:所述缓冲液为Tris缓冲液、PBS缓冲液、MES缓冲液、Taps缓冲液或Mops缓冲液中的任一种,所述缓冲液的PH=6~8。
3.根据权利要求1所述的ProGRP含量测定用液态校准品,其特征在于:所述防腐剂为Proclin 300、MIT、Bro、IPBC或NaN3中的一种或两种以上的混合物。
4.根据权利要求1所述的ProGRP含量测定用液态校准品,其特征在于:所述蛋白质类稳定剂为酪蛋白、鱼明胶或牛血清白蛋白中的一种或两种以上混合物。
5.根据权利要求1所述的ProGRP含量测定用液态校准品,其特征在于:所述糖类稳定剂为蔗糖、海藻糖或葡萄糖中的一种或两种以上混合物。
6.根据权利要求1所述的ProGRP含量测定用液态校准品,其特征在于:所述表面活性剂包括Trotion X-100、Tween20、Tween60或辛基酚聚氧乙烯醚中的一种或两种以上混合物。
7.根据权利要求1所述的ProGRP含量测定用液态校准品,其特征在于:所述EDTA包括乙二胺四乙酸二钠或/和乙二胺四乙酸二钾。
8.根据权利要求1所述的ProGRP含量测定用液态校准品,其特征在于:所述ProGRP抗原分为0pg/mL、20pg/mL、80pg/mL、400pg/mL、1250pg/mL、5000 pg/mL六个浓度梯度。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180601 |
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