CN110511926B - 一种质粒、假病毒的保存液及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于临床检验技术领域，公开了一种质粒、假病毒的保存液及其用途与保存质粒或假病毒的方法。本发明所述保存液以HEPES缓冲液为基础，与防腐剂、盐类、糖类和络合剂组合而成。本发明的保存液可以使体外诊断试剂盒的校准品、质控品在2‑8℃稳定保存，在使用时无需冻融，使用便捷，更避免了因冻融导致校准品、质控品不稳定的情况；另外2‑8℃保存，试剂盒在使用、运输、保存过程中摆脱了冷冻条件的限制，大大降低了经济成本。实验表明，本发明所述保存液可以使DNA假病毒、RNA假病毒、质粒在2‑8℃稳定保存最少9个月。

Description

一种质粒、假病毒的保存液及其用途
技术领域
本发明属于临床检验技术领域，具体涉及一种质粒、假病毒的保存液及其用途，尤其是涉及一种可低温保存质粒、假病毒的保存液及其用途与保存质粒或假病毒的方法。
背景技术
质粒是包含目的基因的一段核酸序列；装甲病毒颗粒是由噬菌体蛋白外壳包裹靶基因序列由人工合成的装甲病毒（简称假病毒），噬菌体衣壳蛋白可保护靶基因序列耐受DNase或RNase的降解，与天然病毒样本的特性将近，具有稳定、制备简单、无传染性等优点。质粒和假病毒在体外诊断领域主要用来代替真实临床样本制备校准品、质控品。
国内外大多数厂家采用包含目的基因的质粒或者假病毒作为试剂盒的质控品、校准品，只有少部分采用真实临床样本，这主要是因为利用全病毒阳性样本制备质控品、校准品存在多方面的不足：（1）制备成本较高，阳性样本在临床检测中很难大量获得，病毒培养耗时且费用较高；（2）存在生物传染危险性，未经灭活的病毒颗粒具有传染性；（3）灭活的病毒虽然可以降低传染性，但仍然存在灭活不彻底的风险，且灭活试剂会破坏病毒核酸，影响核酸的提取；（4）培养的病毒颗粒在制备过程中难以完全去除细胞组分和外源蛋白，核酸提取不纯会抑制扩增反应。上述这些缺点限制了全病毒作为校准品、质控品在临床检验中的应用。而质粒和假病毒颗粒弥补了这些缺陷。以质粒或者假病毒作为核酸检测的校准品、质控品不仅制备简单，而且无生物安全等问题。
目前市面上绝大多数厂家以假病毒、质粒制备的产品都是冷冻保存，然而未来体外诊断领域检验技术自动化、快速化的发展趋势对诊断试剂盒保存条件提出了更高的要求。为了提高体外诊断产品的广泛适应性，要求校准品、校准品、质控品可以低温条件保存，而目前临床分子检测的校准品、质控品大多不能2-8℃稳定保存。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术中临床分子检测校准品、质控品不能2-8℃低温稳定保存的缺点，提供一种可低温保存质粒、假病毒的保存液及其用途与保存质粒或假病毒的方法。
为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案。
一种质粒、假病毒的保存液，由如下有效成分组成：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
本发明所述保存液以HEPES缓冲液为基础，与防腐剂、盐类、糖类和络合剂组合而成。其中，所述 HEPES（4-羟乙基哌嗪乙磺酸）缓冲液是一种氢离子缓冲剂，在生化诊断试剂盒、DNA/RNA提取试剂盒及PCR诊断试剂盒里应用较多，能较长时间控制恒定的pH范围，使缓冲体系在很长时间维持PH的稳定，从而质粒、假病毒的稳定性。
作为优选，所述HEPES缓冲液的浓度为5mM-25mM。更优选为15mM。
作为优选，本发明所述的保存液中所述防腐剂选自NaN3、P300、P950中至少一种。
在一些实施方案中，所述防腐剂为NaN3和P950。所述NaN3浓度为0.05-0.2%，所述P950浓度为0.1-0.2%。
作为优选，本发明所述的保存液中所述盐类选自NaCl、KCl、GaCl2中至少一种。所述盐类的浓度优选为0.8%-1.5%。
作为优选，本发明所述的保存液中所述糖类选自蔗糖、葡萄糖、海藻糖中至少一种。在一些实施方案中，所述糖类为海藻糖。所述海藻糖的浓度优选为2.5-5%。
作为优选，本发明所述的保存液中所述络合剂为EDTA。所述EDTA的浓度优选为1.0-1.8mM。
在一些实施方案中，本发明所述的保存液，由如下有效成分组成：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
在一些具体实施例中，本发明所述的保存液，由如下有效成分组成：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
在一些具体实施例中，本发明所述的保存液，由如下有效成分组成：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
在一些具体实施例中，本发明所述的保存液，由如下有效成分组成：
Figure DEST_PATH_IMAGE010
本发明还提供了所述保存液在低温保存质粒或假病毒中的用途。
其中，所述低温为2-8℃。
本发明还提供了一种保存质粒或假病毒的方法，将质粒或假病毒与所述保存液混合，2-8℃放置。
作为优选，本发明所述保存质粒或假病毒的方法中所述混合为所述质粒或假病毒与所述保存液按体积比≤1:9的比例混合。即所述质粒或假病毒的占比≤10%。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种质粒、假病毒的保存液及其用途与保存质粒或假病毒的方法。本发明所述保存液以HEPES缓冲液为基础，与防腐剂、盐类、糖类和络合剂组合而成。本发明的保存液可以使体外诊断试剂盒的校准品、质控品在2-8℃稳定保存，在使用时无需冻融，使用便捷，更避免了因冻融导致校准品、质控品不稳定的情况；另外2-8℃保存，试剂盒在使用、运输、保存过程中摆脱了冷冻条件的限制，大大降低了经济成本。实验表明，本发明所述保存液可以使DNA假病毒、RNA假病毒、质粒在2-8℃稳定保存最少9个月。
具体实施方式
本发明公开了一种质粒、假病毒的保存液及其用途。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。其中质粒、假病毒稳定保存判断依据《中华人民共和国医药行业标准》中核酸扩增检测用试剂（盒）5.4.2的规定。准确度绝对值偏差不超过±0.5个对数数量级；在PCR扩增中，模板浓度按照2n增加，经历约3.3个循环数（23.3≈10），模板浓度增加10倍，即模板浓度增加了一个对数数量级；在实时荧光定量PCR反应中，每增加一个循环数，Ct值增加1个Ct值，因此依据上述准确度的要求，则准确度绝对值偏差不超过±1.5Ct值。
实施例1：质粒、假病毒的保存液
1、保存液包括下述试剂组分：
1）HEPES，浓度5mM；
2）NaN3，浓度0.09%；
3）P950，浓度0.15%；
4）KCl，浓度1.2%；
5）海藻糖，浓度2.5%；
6）EDTA，浓度1.8mM。
2、使用上述保存液稀释DNA假病毒至500copies/mL（保证稀释后稀释液的占比≥90%），2-8℃放置0、3、6、9个月后，配合磁珠法提取试剂（安图生物，豫郑械备20180037号）进行核酸提取。
提取后产物用荧光定量PCR仪检测，结果如下表1所示：
表1保存液保存DNA假病毒不同时间后核酸提取结果
Figure DEST_PATH_IMAGE012
结果显示，DNA假病毒与本发明所述保存液混合后在2-8℃放置9个月核酸检测结果变化不明显。表明本发明所述保存液可以使DNA假病毒在2-8℃稳定保存最少9个月。
实施例2：质粒、假病毒保存液
1、保存液包括下述试剂组分：
1）HEPES，浓度20mM；
2）NaN3，浓度0.06%；
3）P950，浓度0.3%；
4）NaCl，浓度1.2%；
5）海藻糖，浓度4%；
6）EDTA，浓度1.2mM。
2、使用上述保存液稀释RNA假病毒至500copies/mL（保证稀释后稀释液的占比≥90%），2-8℃放置0、3、6、9个月后 ，配合磁珠法提取试剂（安图生物，豫郑械备20180037号）进行核酸提取。
提取后产物用荧光定量PCR仪检测，结果如下表2所示：
表2保存液保存RNA假病毒不同时间后核酸提取结果
Figure DEST_PATH_IMAGE014
结果显示，RNA假病毒与本发明所述保存液混合后在2-8℃放置9个月核酸检测结果变化不明显。表明本发明所述保存液可以使RNA假病毒在2-8℃稳定保存最少9个月。
实施例3：质粒、假病毒保存液
1、保存液包括下述试剂组分：
1）HEPES，浓度15mM；
2）NaN3，浓度0.15%；
3）P950，浓度0.1%；
4）NaCl，浓度1.0%；
5）海藻糖，浓度2.5%；
6）EDTA，浓度1.4mM。
2、使用上述保存液稀释质粒至500copies/mL（保证稀释后稀释液的占比≥90%），2-8℃放置0、3、6、9个月后，配合磁珠法提取试剂（安图生物，豫郑械备20180037号）进行核酸提取。
提取后产物用荧光定量PCR仪检测，结果如下表3所示：
表3保存液保存质粒不同时间后核酸提取结果
Figure DEST_PATH_IMAGE016
结果显示，质粒与本发明所述保存液混合后在2-8℃放置9个月核酸检测结果变化不明显。表明本发明所述保存液可以使质粒在2-8℃稳定保存最少9个月。

Claims (3)

1.保存液在低温保存质粒或假病毒中的用途；
所述保存液由如下有效成分组成：
HEPES缓冲液 5mM-25mM
NaN3 0.05%-0.2%
P950 0.1%-0.2%
NaCl或KCl 0.8%-1.5%
海藻糖 2.5%-5%
EDTA 1.0-1.8mM;
所述低温为2-8℃。
2.一种保存质粒或假病毒的方法，将质粒或假病毒保存液混合，2-8℃放置；
所述保存液由如下有效成分组成：
HEPES缓冲液 5mM-25mM
NaN3 0.05%-0.2%
P950 0.1%-0.2%
NaCl或KCl 0.8%-1.5%
海藻糖 2.5%-5%
EDTA 1.0-1.8mM。
3.根据权利要求2所述的方法，所述混合为所述质粒或假病毒与所述保存液按体积比≤1:9的比例混合。
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