CN116287120A - 一种可常温保存且可60℃高温下保存唾液样本中人源细胞核酸dna与rna的保存液及其制备方法 - Google Patents

一种可常温保存且可60℃高温下保存唾液样本中人源细胞核酸dna与rna的保存液及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及了一种可常温保存且可60℃高温下保存唾液样本中人源细胞核酸DNA与RNA的保存液及其制备方法。本发明的可常温保存且可60℃高温下保存唾液样本中人源细胞核酸DNA与RNA的保存液，包括以下组分：1，2‑环己烷二胺四乙酸CDTA，羟基乙基哌嗪‑2‑乙磺酸，SDS，氯化钠，乙醇和tween‑20。本发明具有如下技术效果：本发明提供的唾液DNA&RNA保存液，可在37℃条件下稳定保存唾液样本中核酸DNA至少2年。本发明提供的唾液DNA&RNA保存液，可在37℃条件下稳定保存唾液样本中核酸RNA至少30天。本发明提供的唾液DNA&RNA保存液，可在60℃条件下稳定保存唾液样本中核酸至少7天，利于样本转运至第三方检测机构进行检测。

Description

一种可常温保存且可60℃高温下保存唾液样本中人源细胞核 酸DNA与RNA的保存液及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及了一种可常温保存且可60℃高温下保存唾液样本中人源细胞核酸DNA与RNA的保存液及其制备方法。
背景技术
脱氧核糖核酸DNA是染色体的主要化学成分，DNA可组成遗传指令，以引导生物发育与生命机能运作。核糖核酸(Ribonucleic acid，RNA)是存在于细胞生物的遗传讯息中间载体，并参与蛋白质合成也参与基因表达调控。RNA是由核糖核苷酸经磷酸双酯键缩合而成长链状分子，与DNA不同的是，RNA一般为单股长分子，在提取过程或保存过程中都极易发生降解。因此，RNA的提取和保存有一定难度，要保证操作的严谨和准确，避免RNA发生特异或非特异的降解。DNA&RNA样本不仅在分子生物学研究中具有重要的地位而且在医学鉴定、检测与治疗等领域中也相当重要，因此DNA&RNA的质量会显著影响检测的结果的准确性。目前进行PCR扩增鉴定与检测的核酸多为血液样本，用其做样本存在一些不足，比如血液经过长时间保存会产生凝集，影响提取效果；其次血液样本对人体是一种有创的采集方式，就会对操作者有一定的技术要求。
唾液是由唾液腺分泌液、龈沟液和黏膜渗出液等构成的混合性液体，储存了大量的人类口腔微生物和口腔局部组织及DNA、RNA和蛋白质多样性的复杂生物学信息。提取的唾液DNA或RNA可与许多下游研究相结合，包括PCR，Southern印迹分析，测序和微阵列分析。相较于血液，唾液是一种比较容易采集、获得且对人体安全不会产生创伤的样本，对于患者不会产生畏惧心理，可以更好的接受，因此能最大限度地扩大基因研究的取样范围。因为唾液中含有淀粉酶、黏蛋白和溶菌酶等一些物质，加速唾液中DNA或RNA的降解，为此开发防止唾液中核酸的降解保存液至关重要。
目前已有的一些专利中对唾液中DNA或RNA保存，专利CN112438253A保存液中加入了防腐剂，可以抑制细菌、霉菌等微生物的繁殖和活性，无需冷冻保存也可延长DNA或RNA的保存时间。但是因为加入了防腐剂所以使用起来需要小心，可能会对人体有害不宜触碰到身体。
专利CN111020001A是一种固体的保存液，具体在生产中预先用高压喷雾保存在唾液采集管底部，取样结束快速用无尘烘干机高压烘干，使液态的唾液保存液转变成固态的唾液保存剂富集在唾液采集管底部。其优点固态的唾液保存剂相比液态唾液保存液更有利于，防止微生物的污染、保证DNA的片段完整性并且保证使用人员健康安全防止孩童误食等情况。但是因为是固态保存液，取样后需要将样本进行高压烘干处理，需要一定的仪器支持，极大的增加了成本同时取样过程变复杂，为操作人员带来了不便。
专利CN106561631A的唾液保存液加入DNA稳定剂及乙二胺四乙酸二钠盐和酒石酸；和微生物抑制剂及青霉素等既能维护细胞形态，使其不发生裂解，又能抑制微生物生长。该保存液主要针对唾液中口腔上皮细胞等其他人源细胞的完整性来使DNA不被降解，可以常温条件下长期保存，不应用于低温和高温保存，且进行之后的核酸提取时，需要另外将细胞裂解进而得到细胞中的核酸，增加提取的时间和程序。
专利CN114467919A发明了一种可以常温和低温保存的唾液中核酸的保存液，并且低温条件下也呈现液体状，不会因冻融使核酸降解破坏。但此发明只声明其保存液用于常温和低温保存，但在一些特殊情况下，例如在夏季高温运输，没有可以制冷低温运输的车辆条件情况下，高温环境可能会导致唾液中的核酸发生降解现象，并且制冷低温运输导致成本增加。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种可常温保存且可60℃高温下保存唾液样本中人源细胞核酸DNA与RNA的保存液及其制备方法。该保存液与唾液样本混合后，可迅速裂解唾液中的人源细胞，并且抑制细菌等微生物污染。在常温下即可长时间保存唾液样本中人源细胞DNA或RNA，维持稳定状态，避免外送检测运输过程中，样品无法低温保存可能出现的各种核酸降解风险。
为了实现上述目的，
在本发明的第一方面，提供了一种可常温保存且可60℃高温下保存唾液样本中人源细胞核酸DNA与RNA的保存液。
所述的保存液，包括以下组分：1，2-环己烷二胺四乙酸(CDTA)，羟基乙基哌嗪-2-乙磺酸，SDS，氯化钠，乙醇，tween-20；
所述的保存液中，
所述1，2-环己烷二胺四乙酸的摩尔浓度为0.1-10M；
所述羟基乙基哌嗪-2-乙磺酸的摩尔浓度为0.01-1M；
所述SDS的百分含量为0.1％-20％v/v；
所述氯化钠的百分含量为0.1％－1％w/v；
所述乙醇的百分含量为5％－80％v/v；
所述tween-20的摩尔浓度为0.5－1M。
进一步地，所述保存液的pH为6.0-10.0。
进一步地，所述1,2-环己烷二胺四乙酸(CDTA)的摩尔浓度为1-6M。
进一步地，所述羟基乙基哌嗪-2-乙磺酸的摩尔浓度为0.01-0.5M。
进一步地，所述SDS的百分含量为0.1％-10％v/v。
进一步地，所述氯化钠的百分含量为0.2％－0.8％w/v。
进一步地，所述乙醇的百分含量为10％－70％v/v。
进一步地，所述tween-20的摩尔浓度为0.5-0.8M。
进一步地，所述唾液来源于哺乳动物口腔。
进一步地，所述RNA为病毒RNA、口腔微生物RNA或人源细胞RNA。
进一步地，所述DNA为病毒DNA、口腔微生物DNA或人源细胞DNA。
在本发明的一种优选实施方式中，所述的保存液，含有如下组分：1，2-环己烷二胺四乙酸(CDTA)，羟基乙基哌嗪-2-乙磺酸，SDS，氯化钠，乙醇，tween-20；
所述的保存液中，
所述1，2-环己烷二胺四乙酸的摩尔浓度为2M；
所述羟基乙基哌嗪-2-乙磺酸的摩尔浓度为0.05M；
所述SDS的百分含量为0.5％v/v；
所述氯化钠的百分含量为0.5％w/v；
所述乙醇的百分含量为20％v/v；
所述tween-20的摩尔浓度为0.5M；
所述保存液的pH为7.0。
在本发明的另外一种优选实施方式中，所述的保存液，含有如下组分：1，2-环己烷二胺四乙酸(CDTA)，羟基乙基哌嗪-2-乙磺酸，SDS，氯化钠，乙醇，tween-20；
所述的保存液中，
所述1，2-环己烷二胺四乙酸的摩尔浓度为3M；
所述羟基乙基哌嗪-2-乙磺酸的摩尔浓度为0.1M；
所述SDS的百分含量为1％v/v；
所述氯化钠的百分含量为0.8％w/v；
所述乙醇的百分含量为40％v/v；
所述tween-20的摩尔浓度为0.7M；
所述保存液的pH为7.5。
本发明的保存液，具有如下作用：
(a)保持唾液样本中的病毒、口腔微生物或人源细胞核酸DNA&RNA的稳定；
(b)释放唾液样本中的DNA或RNA核酸。
本发明的保存液在使用时，所述样品与保存试剂的体积比为1:1。
在本发明的第二方面，提供了如本发明第一方面所述保存液的制备方法。
所述的制备方法，包括如下步骤：
1)将本发明第一方面各组分按照氯化钠，乙醇，1,2-环己烷二胺四乙酸(CDTA)，SDS，tween-20顺序进行配比混合，用羟基乙基哌嗪-2-乙磺酸缓冲溶液中组分调节pH，用去离子水定容；
2)过滤，即得到所述保存液。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
本发明具有如下技术效果：
1)本发明保存液没有使用胍盐，叠氮化钠等有毒危险的防腐剂，利用缓冲体系维持溶液pH稳定，从而达到延长保存时间，利用特定浓度的CDTA、SDS、tween-20等溶剂，对样本中的各种裂解酶等蛋白质杂质进行裂解和结合，从而促进核酸稳定性。现有技术无法同时保存唾液中DNA&RNA较长时间，而本发明通过对保存液配方的优化，可以较长时间保存唾液中DNA，也可以较长时间保存易被降解的RNA。本发明解决了一些因为运输或者其他原因无法实现低温保存而导致核酸的降解的问题，本发明保存液可以在60℃条件下稳定保存唾液中的核酸至少7天，利于样本转运至第三方检测机构进行检测。
2)本发明保存温度范围广、保存时间长，核酸完整度高。主要体现在60℃条件下稳定保存唾液样本中核酸至少7天，利于样本转运至第三方检测机构进行检测，并且本发明提供的唾液中核酸保存液，也可在37℃条件下稳定保存唾液样本中核酸DNA至少2年，37℃条件下稳定保存唾液样本中核酸RNA至少30天，比现有技术保存的温度更高，时间更久。
3)本发明主要技术贡献在于对配方的优化，关键就在于配方中物质种类的特定选择，以及特定浓度的选择。选定的化学物质必须在一定浓度范围内，才能实现对于唾液样本的长时间的DNA&RNA的保存，否则保存液无法保存唾液中DNA 2年，以及RNA 1个月时间。另外，CDTA、SDS、吐温20等物质是对唾液样本中的DNA酶，RNA酶等蛋白质酶结合或者裂解，从而防止酶对核酸DNA&RNA降解，以及对唾液样本中的微生物起到灭活的目的。羟基乙基哌嗪-2-乙磺酸、Nacl是对保存液的pH和离子强度起到缓冲、维持一定范围内pH和离子强度浓度基本不发生改变的目的。一定比例的乙醇则是对DNA&RNA起到一定的保护作用。
附图说明
图1为本发明唾液DNA&RNA保存液对唾液样本中核酸DNA的保存效果。
图2为本发明唾液DNA&RNA保存液与无RNA酶水对唾液样本中核酸RNA的短时间保存效果。
图3为本发明唾液DNA&RNA保存液对唾液样本中核酸RNA的长时间保存效果。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1唾液保存液配方
实施例1中，提供了两种唾液样本保存液，1号保存液和2号保存液，配方如下：
表1.唾液保存液配方
Figure BDA0004138512050000061
两种保存液的制备方法相同，包括如下步骤：
1)将各组分按照氯化钠，乙醇，1,2-环己烷二胺四乙酸(CDTA)，SDS，tween-20顺序进行配比混合，用羟基乙基哌嗪-2-乙磺酸缓冲溶液中组分调节pH，用去离子水定容；
2)过滤，即得到所述保存液。
实施例2.唾液DNA&RNA保存液保存唾液样本中人源DNA稳定性性能研究
实验材料：唾液样本
保存液：实施例1中的1、2号唾液DNA&RNA保存液
实验方法：
8名不同志愿者提供唾液样本，编号为1-8，分别将2mL唾液样本，置于实施例1中配制的2mL 1、2号唾液DNA&RNA保存液中，颠倒混匀，37℃保存。编号1-4唾液样本保存在1号保存液中，编号5-8唾液样本保存在2号保存液中。
提取前振荡混匀，采用磁珠法唾液DNA提取试剂盒(康为世纪，货号CW2506)进行DNA&RNA提取，使用移液器吸取唾液DNA&RNA保存液350ul于深孔板第1列中，具体实际操作步骤以及提取程序详见提取试剂盒说明书，提取的核酸样本置于-20℃环境中保存。
采用CW2683人类基因组DNA定量试剂盒，对提取第1天-14天-30天-6个月-12个月-24个月的核酸样本进行qPCR定量分析。20μL的基础反应体系如下：
试剂 20μL反应体系
2*GoldStar TaqMan Mixture 10μL
Primer Mix 3μL
Template 4μL
ddH2O 3μL
qPCR反应温度条件如下：
Figure BDA0004138512050000071
实验结果：
1)8名不同志愿者的qPCR反应结果，如图1所示，结果显示人源基因组定量Ct值稳定且无显著性变化(p>0.05)。
2)选择1号保存液中的编号为1、2的志愿者样本和2号保存液中编号为5、6号的志愿者样本，进行不同时期2种唾液DNA&RNA保存液对唾液中核酸的保存性能实验，结果如表2所示，唾液样本保存在2种保存液中第0天、1个月、第6个月、第12个月、第18个月与第26个月，核酸浓度无明显变化。
以上结果表明实施例1的保存液1和2均可保存唾液样本中人源核酸DNA至少2年。
表2不同时期2种唾液DNA&RNA保存液对唾液中核酸的保存性能
Figure BDA0004138512050000072
Figure BDA0004138512050000081
实施例3.唾液DNA&RNA保存液保存唾液样本中人源RNA稳定性性能研究
实验材料：唾液样本
保存液：实施例1中的1、2号唾液DNA&RNA保存液以及无RNA酶水实验方法：
实验组1：将4名志愿者的2mL左右新鲜唾液，置于实施例1中配制的2mL1号唾液DNA&RNA保存液中，振荡混匀，37℃保存。实验组1中4名志愿者的唾液样本对应图2中的编号1-4。
对照组：将1名志愿者的2mL左右新鲜唾液，置于实施例1中配制的2mL无RNA酶水中，振荡混匀，37℃保存。对照组中志愿者的唾液样本对应图2中的编号5。
实验组2：将8名志愿者的2mL左右新鲜唾液，置于实施例1中配制的2mL1、2号唾液DNA&RNA保存液中，振荡混匀，37℃保存。实验组2中8名志愿者的唾液样本对应图3中的编号1-8，其中，编号1-4唾液样本保存在实施例1的1号保存液中，编号5-8唾液样本保存在实施例1的2号保存液中。
提取前振荡混匀，采用磁珠法唾液DNA提取试剂盒(康为世纪，货号CW2506)进行DNA&RNA提取，使用移液器吸取唾液DNA&RNA保存液350ul于深孔板第1列中，具体实际操作步骤以及提取程序详见提取试剂盒说明书，提取的核酸样本置于-20℃环境中保存。
采用CW3149 1.26*HyperProbe OneStep RT-qPCR Kit(UNG)试剂盒，对提取的第1天-7天-14天核酸RNA样本进行qPCR定量分析。基础反应体系及反应温度条件详见该试剂盒说明书。
实验结果：
结果如图2所示，对照组中无RNA酶水保存的唾液背景下，7天后，提取人源细胞核酸RNA，qPCR结果显示Ct值显著上升，核酸RNA发生显著降解。同样，提取实验组1的实施例1的1号唾液DNA&RNA保存液的人源细胞核酸RNA，结果显示Ct值没有发生显著性变化(p＞0.05)。
结果如图3，对于实验组2的采用实施例1的1、2号唾液DNA&RNA保存液保存的样本在37℃保存30天后，与第0天、第15天Ct值相比，第30天检测的Ct差值在0.5以内，无显著差异(p＞0.05)。以上结果分析表明两种唾液DNA&RNA保存液在37℃条件下均能显著保护核酸RNA稳定至少30天。
实施例4.60℃条件下唾液DNA&RNA保存液保存唾液中核酸稳定性性能研究
实验材料：唾液样本
实验组保存液：采用上述实施例1中的1号唾液保存液
实验方法：
将8名志愿者的2mL左右新鲜唾液，置于实施例1中配制的2mL 1号唾液DNA&RNA保存液中，振荡混匀，60℃保存。分别在第0天和第7天，对于60℃保存的唾液保存液进行核酸提取。
提取前振荡混匀，采用磁珠法唾液DNA提取试剂盒(康为世纪，货号CW2506)进行DNA&RNA提取，使用移液器吸取唾液DNA&RNA保存液350ul于深孔板第1列中，具体实际操作步骤以及提取程序详见提取试剂盒说明书，提取的核酸样本置于-20℃环境中保存。
实验结果：
对于此实施例中，对1号唾液DNA&RNA保存液的唾液背景进行核酸提取，与第0天提取的核酸相比，第7天提取的核酸浓度无显著性变化。以上结果表明，1号唾液DNA&RNA保存液在60℃条件下显著保护核酸RNA稳定至少7天。
表3 1号唾液DNA&RNA保存液60℃温度下对唾液中核酸的保存性能
Figure BDA0004138512050000101
以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种可常温保存且可60℃高温下保存唾液样本中人源细胞核酸DNA与RNA的保存液，其特征在于：
所述的保存液，包括以下组分：1，2-环己烷二胺四乙酸CDTA，羟基乙基哌嗪-2-乙磺酸，SDS，氯化钠，乙醇和tween-20；
所述的保存液中，
所述1，2-环己烷二胺四乙酸的摩尔浓度为0.1-10M，
所述羟基乙基哌嗪-2-乙磺酸的摩尔浓度为0.01-1M，
所述SDS的百分含量为0.1％-20％v/v，
所述氯化钠的百分含量为0.1％－1％w/v,
所述乙醇的百分含量为5％－80％v/v,
所述tween-20的摩尔浓度为0.5－1M，
所述保存液的pH为6.0-10.0。
2.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，所述1,2-环己烷二胺四乙酸CDTA的摩尔浓度为1-6M。
3.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，所述羟基乙基哌嗪-2-乙磺酸的摩尔浓度为0.01-0.5M。
4.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，所述SDS的百分含量为0.1％-10％v/v。
5.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，所述氯化钠的百分含量为0.2％－0.8％w/v。
6.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，所述乙醇的百分含量为10％－70％v/v。
7.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，所述tween-20的摩尔浓度为0.5-0.8M。
8.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，所述唾液来源于哺乳动物口腔。
9.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，所述RNA为病毒RNA、口腔微生物RNA或人源细胞RNA，所述DNA为病毒DNA、口腔微生物DNA或人源细胞DNA。
10.如权利要求1-9任意一项所述保存液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将各组分按照氯化钠，乙醇，1,2-环己烷二胺四乙酸(CDTA)，SDS，tween-20顺序进行配比混合，用羟基乙基哌嗪-2-乙磺酸缓冲溶液中组分调节pH，用去离子水定容；
2)过滤，即得到所述保存液。
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