CN113272314A - Rna保存溶液及制造方法和使用方法 - Google Patents
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Abstract
公开了核酸保存组合物及其制造方法和使用方法。组合物包括载体、离散剂、缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、醇和还原剂。组合物作为水性溶液可以包括水作为载体。优选的实施方式包括无RNA酶的水、氯化锂、柠檬酸钠、EDTA、CTAB或SLS、SDA 3C和TCEP，其中任选地添加HCl以调节pH。一些实施方式包括着色染料作为视觉指示剂。制造方法包括将组分合并到混合物诸如水性溶液中。使用方法包括提供包括核酸、优选RNA的生物样品，以及使所述生物样品与所述组合物接触。试剂盒包括生物样品收集装置和所述组合物。所述组合物任选地布置于所述收集装置的一部分中。
Description
背景技术
1.技术领域
本公开涉及保存核酸，特别是核糖核酸(RNA)。特别地，本公开涉及用于保存生物样品诸如唾液中的人RNA以进行进一步分析的组合物和方法。
2.相关技术
可以从包括细胞和/或无细胞的核酸的生物样品诸如体液和组织样品中提取核酸。提取的核酸(例如，RNA)可用于多种分析目的，包括基因表达谱分析。对于特定类型的核酸分析，经常需要对含核酸的生物样品进行适当处理。例如，分析技术，诸如RNA测序(RNA-Seq)、微阵列、表达序列标签(EST)、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、荧光原位杂交(FISH)和RNA印迹分析可能需要特定的处理或预处理步骤，其取决于要使用的特定平台。
在一些情况下，可能需要处理含核酸的生物样品，或者可能需要采取步骤，以稳定样品或其核酸。特别地，已知RNA在某些条件下(例如，在溶液中和/或当暴露于核酸酶、不利的温度、UV光和/或各种化学品时)高度不稳定和/或对降解敏感。经常在储存和处理步骤期间将稳定或保存试剂(例如，溶液)添加到含核酸的生物样品中，以确保至少一部分核酸特别是RNA的存活，直到可以对其进行分析为止。不受任何具体理论的束缚，通常认为RNA保存或稳定比DNA保存或稳定困难得多。
对于稳定来自某些生物样品诸如唾液的RNA，和/或对于某些类型的分析技术或用于进行其的设备而言，现有的稳定溶液可能不是最佳的。例如，为最佳或合适的qRT-PCR分析配制的RNA稳定溶液可能不是最佳的或不适合在EST平台中进行分析。在一些情况下，配制不当可能产生或导致分析伪影、高背景信号(或噪声)、微生物核酸的污染和/或保留，这可能掩盖人核酸的结果，和/或可能降低生物样品中的人核酸的总潜在产量、纯度和/或稳定性。
现有的稳定溶液也可能在控制微生物生命上不足。生物样品，诸如唾液、组织和细胞，可以包括一种或多种微生物(例如，细菌、真菌等)和/或被一种或多种微生物(例如，细菌、真菌等)污染。这些微生物包含核酸，这些核酸可能与生物样品的宿主或来源的核酸发生干扰或一起被检测到。保存溶液可能无意地稳定微生物核酸，或者甚至允许微生物生长。
因此，仍然需要RNA稳定溶液，这些RNA稳定溶液适用于多种分析技术和/或设备，与现有产品相比，提供生物样品中的RNA的更好的总产量、纯度和/或稳定性，与现有产品相比，增强生物样品的品质，诸如通过控制微生物生长和/或减少微生物核酸的污染，以及其组合。
附图说明
现在将参考附图讨论本公开的各种实施方式。应当理解，这些附图仅描绘了本公开的典型实施方式，并因此不应视为对其范围的限制。
图1说明了根据本公开的实施方式的各种RNA保存组合物的RNA的平均产量。
图2说明了根据本公开的实施方式的各种RNA保存组合物的平均RNA品质分数(RQS)。
图3A、3B和3C分别说明了根据本公开的实施方式的在收集于RNA保存组合物中后立即从唾液样品中提取的RNA的产量、纯度、保真性结果。
图4A、4B和4C分别说明了根据本公开的实施方式的在室温下在RNA保存组合物中储存48小时后从唾液样品中提取的RNA的产量、纯度、保真性结果。
图5A、5B和5C分别说明了根据本公开的实施方式的在RNA保存组合物中冷冻储存48小时后从唾液样品中提取的RNA的产量、纯度、保真性结果。
发明内容
本公开的实施方式用核酸(例如，RNA)保存、稳定和/或制备组合物、包括其的试剂盒以及其制造方法和使用方法解决了本领域中的前述或其他问题中的一个或多个。例如，本公开的一些实施方式包括用于保存、稳定和/或制备生物样品中的核酸(例如，RNA)的组合物。在某些实施方式中，所述生物样品可以是唾液或另一种体液。所述组合物可适用于多种分析技术和设备。特别地，所述组合物可被配制成可共用用于多种分析技术和设备。所述组合物可以产生大量的核酸(例如，RNA)，以用于随后的分析和/或处理。例如，所述组合物可以产生大量的人核酸(例如，RNA)，优选地和/或任选地具有少量的微生物(例如，细菌)核酸(例如，RNA和/或DNA)，以用于随后的分析和/或处理。所述组合物可以包括溶液或水基(例如，水性)液体，任选地(浅)蓝色。所述组合物可适用于稳定人核酸(例如，RNA)，并且优选地防止细菌污染和/或生长以及用于(长期)样品储存。
在至少一个方面，本公开的实施方式包括核糖核酸(RNA)保存组合物。所述保存组合物可以包括载体、缓冲剂(buffer/buffering agent)和(金属)螯合剂。所述组合物还可包括一种或多种额外的试剂，其优选选自由以下组成的组：离散剂、洗涤剂或表面活性剂、醇和还原剂。所述组合物还可以具有4-7的pH和/或适量至4-7的pH、优选5.5的pH的酸。所述组合物还可以包括任选的视觉指示剂。
在至少一个方面，本公开的实施方式包括RNA保存组合物，其包括载体、缓冲剂、螯合剂和离散剂。所述组合物还可包括一种或多种额外的试剂，其优选选自由以下组成的组：洗涤剂或表面活性剂、醇和还原剂。所述组合物还可以具有4-7的pH和/或适量至4-7的pH、优选5.5的pH的酸。所述组合物还可以包括任选的视觉指示剂。
在至少一个方面，本公开的实施方式包括RNA保存组合物，其包括载体、缓冲剂、螯合剂、离散剂和洗涤剂或表面活性剂。所述组合物还可包括一种或多种额外的试剂，其优选选自由醇和还原剂组成的组。所述组合物还可以具有4-7的pH和/或适量至4-7的pH、优选5.5的pH的酸。所述组合物还可以包括任选的视觉指示剂。
在至少一个方面，本公开的实施方式包括RNA保存组合物，其包括载体、缓冲剂、螯合剂、离散剂和醇。所述组合物还可包括一种或多种额外的试剂，其优选选自由洗涤剂或表面活性剂和还原剂组成的组。所述组合物还可以具有4-7的pH和/或适量至4-7的pH、优选5.5的pH的酸。所述组合物还可以包括任选的视觉指示剂。
在至少一个方面，本公开的实施方式包括RNA保存组合物，其包括载体、缓冲剂、螯合剂、离散剂、还原剂和醇。所述组合物还可包括洗涤剂或表面活性剂。所述组合物还可以具有4-7的pH和/或适量至4-7的pH、优选5.5的pH的酸。所述组合物还可以包括任选的视觉指示剂。
在至少一个方面，本公开的实施方式包括RNA保存组合物，其包括载体、离散剂、缓冲剂、(金属)螯合剂、洗涤剂(或表面活性剂)、醇和还原剂。在一些实施方式中，可以添加酸(或碱)以实现合适的最终pH。所述组合物可以具有4-7的pH和/或适量至4-7的pH、优选5.5的pH的酸。所述组合物还可以包括任选的视觉指示剂。
在至少一个方面，本公开的实施方式包括无醇的核糖核酸(RNA)保存组合物，其包括载体、缓冲剂和螯合剂，以及任选地，选自由以下组成的组的一种或多种试剂或成分：离散剂、洗涤剂或表面活性剂和还原剂。在一些实施方式中，可以添加酸(或碱)以实现合适的最终pH。所述组合物可以具有4-7的pH和/或适量至4-7的pH、优选5.5的pH的酸。所述组合物还可以包括任选的视觉指示剂。在一些实施方式中，所述组合物包括载体、缓冲剂、螯合剂、离散剂、洗涤剂或表面活性剂和还原剂。在一些实施方式中，可以添加酸(或碱)以实现4-7的合适的最终pH、优选5.5的pH。
在各个方面或其实施方式中，所述组合物可以是或包括液体或呈液体形式。优选地，所述组合物可以是或包括溶液。
在一些实施方式中，所述载体可以是流体或液体载体。在优选的实施方式中，所述载体是水性载体。所述载体可以包括水，优选过滤的、纯化的、蒸馏的和/或去离子的无RNA酶的水。
在一些实施方式中，所述组合物可包括约0.1％-10％w/w、优选约0.5％-5％w/w、更优选约1％-2％w/w的所述缓冲剂。在一些实施方式中，所述缓冲剂可以是或包括柠檬酸钠(例如，柠檬酸三钠二水合物；C6H5O7Na3·2H2O))或另一种合适的缓冲剂。
在一些实施方式中，所述组合物可包括约1％-10％w/w、优选约2％-8％w/w、更优选约3％-7％w/w、还更优选约3.33％-6.66％w/w的所述离散剂。在一些实施方式中，所述离散剂可以是或包括氯化锂(LiCl)或另一种合适的离散剂。
在一些实施方式中，所述组合物可包括约0.01％-1％w/w、优选约0.05％-0.5％w/w、更优选约0.1％-0.3％w/w、还更优选约0.2％w/w的所述(金属)螯合剂。在一些实施方式中，所述(金属)螯合剂可以是或包括乙二胺四乙酸(EDTA)、优选作为EDTA二钠盐、更优选作为EDTA二钠二水合物(亦称依地酸二钠二水合物)或另一种合适的(金属)螯合剂。
在一些实施方式中，所述组合物可包括约1％-10％w/w、优选约2％-8％w/w、更优选约3％-5％w/w、还更优选约4％w/w的所述洗涤剂(或表面活性剂)。在一些实施方式中，所述洗涤剂(或表面活性剂)可以是或包括N-月桂酰肌氨酸钠盐(亦称月桂酰肌氨酸钠(SLS)、Sarkosyl NL、N-十二烷酰基-N-甲基甘氨酸钠盐)或另一种合适的洗涤剂(或表面活性剂)。
在一些实施方式中，所述组合物可包括约0.5％-30％w/w、优选约1％-20％w/w、更优选约2％-15％w/w、还更优选约5％-10％w/w的所述醇。在一些实施方式中，所述醇可以是或包括乙醇、优选特异变性醇(SDA)或乙醇和异丙醇的混合物、更优选约95％v/v的乙醇和约5％v/v的异丙醇的混合物、或SDA 3C或另一种合适的醇。
在一些实施方式中，所述组合物可包括0.01％-1％w/w、优选约0.05％-0.5％w/w、更优选约0.1％-0.5％w/w、还更优选约0.1％-0.3％w/w、还更优选约0.2％w/w的所述还原剂。在一些实施方式中，所述还原剂可以是或包括三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)或另一种合适的还原剂。
在一些实施方式中，所述酸(如果有的话)可以是或包括盐酸。在一些实施方式中，可包括适量至4-7、优选4.5-6.5、更优选5-6、还更优选5.2-5.8、还更优选5.4-5.6、最优选5.5的pH的所述酸。
在一些实施方式中，所述任选的视觉指示剂可以是或包括着色剂，诸如染料(例如，FD&C蓝色1号)。
在一些实施方式中，所述组合物可以(适合)用于保存人RNA、优选来自人生物样品的人RNA。所述人生物样品可以是流体样品、优选人唾液或人唾液样品。因此，在某些方面，本公开的实施方式可以包括人RNA保存组合物或用于保存人RNA的RNA保存组合物。
在一些实施方式中，所述组合物可以包括约1％-10％w/w的所述离散剂、约0.1％-10％w/w的所述缓冲剂、约0.01％-1％w/w的所述螯合剂、约1％-20％w/w的所述表面活性剂、约1％-20％w/w的所述醇和/或约0.01％-1％w/w的所述还原剂，以及4-7、优选约5.5的pH。
在一些实施方式中，所述组合物可以包括约3％-7％w/w的所述离散剂、约0.5％-5％w/w的所述缓冲剂、约0.05％-0.5％w/w的所述螯合剂、约2％-6％w/w的所述表面活性剂、约2％-15％w/w的所述醇和/或约0.1％-0.5％w/w的所述还原剂，以及4-7、优选约5.5的pH。
在一些实施方式中，所述组合物可以包括约3.33％-6.66％w/w的所述离散剂、约1％-2％w/w的所述缓冲剂、约0.2％w/w的所述螯合剂、约4％w/w的所述表面活性剂、约5％-10％w/w的所述醇和/或约0.2％w/w的所述还原剂，以及4-7、优选约5.5的pH。
在一些实施方式中，所述组合物可以包括约2％-8％w/w的所述缓冲剂、约1％-10％w/w的所述离散剂、约0.01％-1％w/w的所述螯合剂、约1％-5％w/w的所述表面活性剂、约5％-30％w/w的所述醇和/或约0.01％-1％w/w的所述还原剂，以及4-7的pH。
在一些实施方式中，所述组合物可以包括约3％-7％w/w的所述离散剂、约4％-6％w/w的所述缓冲剂、约0.1％-0.3％w/w的所述螯合剂、约2％-4％w/w的所述表面活性剂、约9％-21％w/w的所述醇和/或约0.1％-0.25％w/w的所述还原剂，以及4-7的pH。
在一些实施方式中，所述组合物可以包括约3.33％-6.65％w/w的所述离散剂、约5.99％w/w的所述缓冲剂、约0.2％w/w的所述螯合剂、约2.99％w/w的所述表面活性剂、约9.98％-19.96％w/w的所述醇和/或约0.17％w/w的所述还原剂，以及4-7的pH。
各种实施方式可以包括适量至100％w/w的所述载体。
在至少一种实施方式中，所述组合物可以包括以下或基本上由以下组成：约3.33％-6.66％w/w的氯化锂(LiCl)、约1％-2％w/w的柠檬酸三钠二水合物、约0.2％w/w的乙二胺四乙酸(EDTA)二钠二水合物、约4％w/w的N-月桂酰肌氨酸钠盐(SLS)或鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)(优选CTAB)、约5％-10％w/w的醇(优选基本上由约95％v/v的乙醇和约5％v/v的异丙醇组成)、约0.2％w/w的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)、任选地着色染料以及适量至100％的无RNA酶的水，其中pH为4-7、优选约5.5。
一些实施方式可以进一步包括约0.00037％w/w的视觉指示剂(例如，FD&C蓝色1号)或其等同物(例如0.185％w/w的0.2％w/w视觉指示剂浓缩物(例如，在水中))。
在一些实施方式中，一种或多种(例如，每种)组分的量可以为±10％(其中“±/-10％”的20％w/w的组分或成分暗示从18％w/w至22％w/w，而不是10％w/w至30％w/w的范围)、优选±9％、更优选±8％、还更优选±7％、还更优选±6％、还更优选±5％、还更优选±4％、还更优选±3％、还更优选±2％、还更优选±1％。
在一些实施方式中，所述组合物可以具有的pH为4-7、优选pH为4.5-7、4.5-6.5、5-7或5-6.5、还更优选pH为5-6、还更优选pH为5.2-5.8、还更优选pH为5.4-5.6、最优选pH为5.5。
一种或多种实施方式可以(基本上)没有或不含(额外的或任何)一种或多种抗微生物剂(例如，一种或多种杀菌剂和/或抑菌剂)(例如，除了或不同于所述一种或多种醇、一种或多种离散剂、一种或多种表面活性剂/一种或多种洗涤剂和/或一种或多种还原剂)。一种或多种实施方式可以(基本上)没有或不含(额外的或任何)一种或多种核糖核酸酶抑制剂或一种或多种核糖核酸酶的抑制剂(例如，除了或不同于所述一种或多种离散剂)。一种或多种实施方式可以(基本上)不含(任何)一种或多种蛋白酶、蛋白酶K和/或一种或多种蛋白酶抑制剂。
一种或多种实施方式可以(基本上)没有或不含二硫苏糖醇(DTT)或β-巯基乙醇(BME)。一种或多种实施方式可以(基本上)没有或不含一种或多种咪唑鎓盐。一种或多种实施方式可以(基本上)没有或不含DNA酶。一种或多种实施方式可以(基本上)没有或不含硫氰酸胍、异氰酸胍和盐酸胍。一种或多种实施方式可以(基本上)没有或不含SDS和/或SLS。一种或多种实施方式可以(基本上)没有或不含Tris、Tris-HCl、
碱、柠檬酸盐、MES、BES、Bis-Tris、HEPES、MOPS、Bicine、Tricine、ADA、ACES、PIPES、碳酸氢盐、磷酸盐、TAE、TBE、硼酸钠和/或二甲胂酸钠(缓冲剂)。一种或多种实施方式可以(基本上)没有或不含甲醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、三氟乙醇、苯酚或2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚。
一些实施方式包括稳定核酸(例如，RNA)的方法。所述方法可以包括使包含RNA的生物样品与本公开的组合物接触(如本文所述)。所述生物样品可以包括人唾液。
在一些实施方式中，所述方法可以包括提供包含核酸(例如，RNA)的生物样品，以及将本公开的组合物与所述生物样品合并。所述方法还可以包括本领域已知的其他处理步骤。本公开的实施方式包括稳定核酸(例如人核酸，诸如人RNA)的方法。实施方式包括使包含核酸(例如，RNA)的生物样品与本公开的组合物接触。在实施方式中，所述生物样品包括体液，诸如(人)唾液、血液、尿等。在另一种实施方式中，所述生物样品包括生物组织或细胞。
一些实施方式包括生物样品保存试剂盒。所述试剂盒可包括样品收集装置和本公开的组合物，所述组合物优选布置于所述样品收集装置的溶液隔室中。
在一些实施方式中，所述试剂盒可包括样品收集装置和核酸(例如，RNA)保存组合物。所述样品收集装置可包括溶液隔室。所述核酸或RNA保存组合物可以布置于所述溶液隔室中。本公开的实施方式包括试剂盒，所述试剂盒包括布置于样品收集装置的一部分中的本公开的组合物。
一些实施方式包括制造本公开的组合物的方法。所述方法可以包括合并本公开的组分。所述方法还可以包括本领域已知的其他制造步骤。本公开的实施方式包括制造核酸或RNA稳定组合物的方法。实施方式包括获得载体以及向所述载体添加本公开的组合物的组分或成分。
本公开的示例性实施方式的额外的特征和优点将在以下描述中阐述，并且从描述中部分地将变得显而易见，或者可以通过实践这样的示例性实施方式来了解。这样的实施方式的特征和优点可以借助于所附权利要求中特别指出的仪器和组合来实现和获得。这些和其他特征将从以下描述和所附权利要求中变得更加完全显而易见，或者可以通过实践如下文阐述的这样的示例性实施方式来了解。
具体实施方式
在详细描述本公开的各种实施方式之前，应当理解，本公开不限于特别例示的系统、方法和/或产品的特定参数和描述，其可以从一种实施方式至下一种实施方式变化。因此，尽管将参照特定特征(例如，配置、参数、特性、步骤、组分、成分、成员、要素、零件和/或部分等)详细描述本公开的某些实施方式，但描述是说明性的，并且不应被解释为限制本公开和/或所要求保护的发明的范围。另外，本文使用的术语是为了描述实施方式的目的，并且不一定旨在限制本公开和/或所要求保护的发明的范围。
尽管详细描述被分成多个部分，但是每个部分中的部分标题和内容并不旨在成为独立的描述和实施方式。相反，详细描述中的每个部分的内容旨在作为共同整体来阅读和理解，其中一个部分的要素可以属于和/或通知其他部分。因此，在一个部分中特别地公开的实施方式也可以涉及和/或用作具有相同和/或类似系统、设备、方法和/或术语的另一部分中的额外的和/或替代的实施方式。
所定义术语的缩写清单
为了帮助理解前述和后续书面描述以及所附权利要求的范围和内容，下面直接定义了一些所选的术语。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，过渡短语“基本上由……组成(consisting essentially of)”意指权利要求的范围应解释为涵盖权利要求中所述的指定材料或步骤，“以及不实质地影响所要求保护的发明的一种或多种基本且新颖的特征的那些”。参见In re Herz,537F.2d 549,551-52,190U.S.P.Q.461,463(CCPA 1976)(在原文中强调)；也参见MPEP§2111.03。因此，当在本公开的权利要求中使用时，术语“基本上由……组成”不旨在被解释为等同于“包括(comprising)”。
如本文所用，术语“核酸”是指能够通过沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对与互补核酸杂交的天然存在的或合成的寡核苷酸或多核苷酸，无论是DNA或RNA还是DNA-RNA杂合体、单链的或双链的、有义的或反义的。本发明的核酸还可包括核苷酸类似物(例如，BrdU、dUTP、7-脱氮-dGTP)和非磷酸二酯核苷间键(例如，肽核酸(PNA)或硫代二酯键)。特别地，核酸可以包括但不限于DNA、RNA、cDNA、gDNA、ssDNA、dsDNA或其任何组合。
术语“样品”、“生物样品”等是指动物；来自动物的组织或器官；细胞(在受试者内，直接取自受试者，或保持在培养物中或来自培养细胞系的细胞)；细胞裂解物(或裂解物部分)或细胞提取物；包含来源于细胞、细胞材料或病毒材料的一种或多种分子(例如多肽或核酸)的溶液；或包含天然或非天然存在的核酸的溶液，其如本文所述分析或可以如本文所述分析。样品还可以是包含一种或多种细胞、细胞组分或核酸(包括但不限于细胞、核或无细胞的核酸)的任何体液或排泄物。
“体液”意指来自动物(例如，人或非人动物)的天然存在的流体，包括但不限于液体、半固体、充气的液体、液-气混合物等。这样的体液可包括但不限于唾液、痰、血清、血浆、血液、尿、黏液、汗液、眼泪或其他眼液、耳液、脓液(例如，来自水疱或疮)、胃液(gastricfluids or juices)、粪便液、胰液(pancreatic fluids or juices)、精液、泌乳或测定的产物、脊髓液、骨髓液或淋巴液。
“痰”意指包含在哺乳动物的鼻腔或口腔中或从其排出的类黏蛋白物质。如本文所用，痰通常包括唾液和来自包括肺在内的呼吸道的排出物。
“唾液”意指来自唾液腺(包括腮腺、颌下腺和舌下腺)中的任一种的分泌物或分泌物的组合，任选地与来自颊腺的分泌物混合。
“类黏蛋白”意指任何包含黏蛋白的体液。
“黏蛋白”意指任何黏蛋白质，其增加分泌其的细胞周围的培养基的粘度。
如本文所用，关于值，术语“约(about)”意指由此表示的所述值或量的+/-10％。例如，在整个本公开中，术语“约”与组分或成分的百分比浓度或组成结合使用(例如，在混合物，诸如流体或液体混合物、水性混合物、溶液等中，任选地或优选地测量为w/w百分比、w/v百分比、v/v百分比等)。在这样的情况下，术语“约”和/或术语“+/-10％”暗示和/或包括所述数值的+/-10％，而不是所述百分比的+/-10个百分点。举例来说，在20％w/w的组分或成分反映20g的组分或成分/100mL总混合物的情况下，术语“约”和/或术语“+/-10％”暗示和/或包括从18g至22g(即，从18％w/w至22％w/w)的所述范围，而不是10％w/w至30％w/w的范围。所谓的“约”值和/或+/-10％的替代包括所述值的+/-1％、+/-2％、+/-3％、+/-4％、+/-5％、+/-6％、+/1-1％、+/-8％或+/-9％，其中的每一个都被预期为本文的术语“约”或+/-10％的使用的合适的替代或取代。
如本文所用的，术语“大约(approximately)”和“基本上(substantially)”表示或暗示接近于所述量的(或任何)量(例如，其仍进行所需的功能或达到(所需的或期望的)结果)。例如，术语“大约”和“基本上”可以是指在所述量的10％、5％、1％、0.1％、0.01％或其他百分比之内或小于其的量。如本文所用，术语“基本上不含”意指：(1)检测不到的或量化不到的量，(2)小于或低于本领域技术人员通常认为反映可检测或可量化的量的量，和/或(3)小于或低于本领域技术人员通常认为是功能性的或能够实现(所需的或期望的)结果的量(例如，小于10％、5％、1％、0.1％、0.01％或其他百分比)。
“适量”(也称为“q.s.”或“qs”)意指足够的量。因此，组分或成分“适量100％”、“以适量100％提供”或“适量至100％”指示该组分或成分以足以完成组合物或使总数(所有组分的，无论是否叙述)达到100％的量提供或包括。然而，应注意，(最终的)组分或成分“适量100％”、“以适量100％提供”或“适量至100％”并不指示混合物由紧接“适量100％”组分之前列出或叙述的组分组成，基本上由紧接“适量100％”组分之前列出或叙述的组分组成，或仅包含紧接“适量100％”组分之前列出或叙述的组分。换句话说，“适量100％”和类似术语意指开放式表达，指示剩余物的来源，无论剩余物可能是什么。
“醇”意指包含羟基基团的与水混溶的有机化合物，包括含羟基的有机化合物的与水混溶的混合物。
“水性”意指包含30％或更多的水(按体积计或按重量计)的介质或物质。
“水性溶液”意指包含按体积计30％或更多的水的溶液或悬浮液。
“变性剂”意指改变其添加到的物质的天然状态的物质。
“离散剂”意指发挥离散活性的分子。如本领域技术人员所理解的，发挥离散活性的分子可能通过减弱疏水作用而破坏水分子之间的氢键网络，从而影响其他分子(溶液中的)，主要是大分子(蛋白质、核酸)的天然状态的稳定性。因此，发挥离散活性的分子可以具有蛋白质变性活性(或是蛋白质变性剂)。
“抗微生物剂”意指与其不存在时生物体的生长率相比，降低生物体的生长率的物质或物质的组。生物体的生长率的降低可以是至少5％、更理想地至少10％、甚至更理想地至少20％、50％或75％以及最理想地90％或更多。该定义还扩展到影响生物体的生存力、毒力或致病性的物质。抗微生物剂可以是天然的(例如，来源于细菌或其他来源)、合成的或重组的。抗微生物剂可以是抑菌的、杀菌的或两者。如果抗微生物剂抑制细胞分裂而不影响被抑制细胞的生存力，则它是抑菌的。如果抗微生物剂引起细胞死亡，则它是杀菌的。通常通过在液体生长培养基中没有细胞生长(例如，没有浊度)或在固体表面上没有细胞生长(例如，在琼脂上没有菌落形成)来检测细胞死亡。本领域技术人员知道，在给定浓度下为抑菌的物质或物质的组在更高浓度下可能是杀菌的。某些抑菌物质在任何浓度下都不是杀菌的。
如本文所用，术语“组合物”包括产品、制剂和混合物，以及设备、装置、组件、试剂盒等。类似地，术语“方法”包括过程、程序、步骤等。
本公开的各个方面，包括系统、方法和/或产品，可以参考本质上是示例性的一种或多种实施方式或实现方式来说明。如本文所用，术语“实施方式”和“实现方式”意指“充当实例、例子或示例”，并且不应必然被解释为比本文公开的其他方面优选或有利。另外，提及本公开或本发明的“实现方式”包括特定提及其一种或多种实施方式，并且反之亦然，并且旨在提供说明性实例，而不限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求而不是由其描述来指示。
如本文所用，本公开或本文公开的实施方式的“特征”是指特性、组分、成分、要素、零件、部分、(方法)步骤或当前主题的其他方面。
如在整个本公开中使用的，单词“可以(can)”和“可能(may)”以许可的含义(即，意指具有……的潜能)，而不是强制性含义(即，意指必须)使用。另外，术语“包括(including)”、“具有(having)”、“涉及(involving)”、“包含(containing)”、“特征在于(characterized by)”、其变型(例如，“包括(includes)”、“具有(has)”和“涉及(involves)”、“包含(contains)”等)，以及如本文(包括权利要求)使用的类似术语，应该是包括性的和/或开放式的，应该具有与单词“包括(comprising)”及其变型(例如，“包括(comprise)”和“包括(comprises)”)相同的含义，并且说明性地不排除额外的、未列举的要素或方法步骤。
如本文所用，单词“或”意指具体清单的任何一个成员，并且还包括该清单的成员的任何组合。
如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“所述/该(the)”各自预期、包括并特别地公开了单数和复数指示剂，除非上下文另外明确指出。例如，提及“蛋白质”预期并特别地公开了一种以及两种或更多种蛋白质。类似地，使用复数指示剂不一定需要多个这样的指示剂，而是预期、包括并特别地公开了一种以及两种或更多种这样的指示剂，除非上下文另外明确指出。
应注意，本公开的实施方式可以包括本文描述的特征中的两种或更多种的一种或多种组合。如本文所用，“一种或多种特征”和类似术语可以包括例如组合物、成分、组分、要素、成员、零件、部分、系统、方法、配置、参数、特性等。实施方式可包括在本公开中的其他地方，包括在本公开的其他方面或实施方式中阐述的任何特征、选项和/或可能性。还应注意，本文描述的前述、以下和/或其他特征中的每一个均表示本公开的不同实施方式。特征也可以以任何合适的组合和/或顺序与另一种或多种其他特征组合和/或可组合，随其包括或不包括一种或多种额外的特征或者在其间进行或不进行一种或多种额外的特征，以形成独特的实施方式，在本公开中预期了其中的其每一种。这样的特征中的任何两种或更多种的这样的组合表示本公开的不同实施方式。因此，本公开不限于本文详细描述的示例性实施方式的特定组合，并且相对于本公开的特定实施方式的某些特征的公开不应被解释为将所述特征的应用或包括限制于特定实施方式。
另外，除非在具体实施方式中将特征描述为是需要的，否则在各种实施方式中描述的特征可以是任选的，并且可以不包括在本公开的其他实施方式中。此外，除非特征被描述为需要与之组合的另一特征，否则本文的任何特征可以与本文公开的相同或不同实施方式的任何其他特征组合。同样，除非另有说明(明确或隐含地)，否则可以以任何合适的顺序进行在本文描述的任何方法中叙述的和/或在权利要求中叙述的任何步骤，并且任何步骤不必限于所描述和/或叙述的顺序。然而，在本公开的某些实施方式中，也可能需要以具体顺序进行这样的步骤。
还将理解，在公开或叙述了两个或更多个值，或值的范围(例如，小于、大于、至少和/或最高达某个值，和/或在两个叙述的值之间)的情况下，落入所公开的值或值的范围内的任何特定值或值的范围在本文中同样被特别地公开和预期。因此，小于或等于约10个单位或在0和10个单位之间的说明性度量(例如，长度、宽度、厚度等)的公开内容说明性地包括以下的特定公开：(i)9个单位、5个单位、1个单位或0和10个单位之间的任何其他值的度量，包括0个单位和/或10个单位；和/或(ii)在9个单位和1个单位之间、在8个单位和2个单位之间、在6个单位和4个单位之间和/或在0和10个单位之间的任何其他值范围的度量。
为了促进理解，在可能的情况下，已经使用相似的参考物(即，组分和/或要素的相似的命名)来指定与本公开的不同实施方式共同的相似的要素。类似地，在可能的情况下，相似的组分或具有相似功能的组分将被提供具有类似的参考指示。本文将使用特定语言来描述示例性实施方式。然而，应理解，并不因此旨在限制本公开的范围。相反，应当理解，用于描述说明性实施方式的语言仅是说明性的，而不应当被解释为限制本公开的范围(除非这样的语言在本文中被明确描述为必需的)。
说明性实施方式
以下实施方式的描述包括与本公开的一种或多种实施方式有关的公开内容。因此，一些实施方式可以包括在以下实例中公开的特征，而不脱离本公开的范围。换句话说，在以下实例中公开的特征可以被包括和/或结合到本文公开的任何一种或多种实施方式中。
组合物
本公开的一些实施方式包括组合物。这些组合物可以是或包括核糖核酸(RNA)保存组合物，优选呈液体形式。这些组合物可以稳定生物样品、优选(人)流体生物样品(例如，痰或唾液、组织、细胞等)中的RNA，和/或使生物样品成为用于纯化和分析的可行的RNA来源。这些组合物提供了化学稳定核酸(特别是核糖核酸(RNA))以及抑制核酸酶(包括核糖核酸酶)和微生物生长的有利特性。可以通过使用缓冲剂、酸、螯合剂、还原剂、离散剂、表面活性剂和醇来实现样品中核酸(例如，RNA)的化学稳定。特别地，本公开的发明组合物可以有利地导致关于任何污染性微生物核酸的更清洁的人RNA分析结果。这些组合物还可提供有利的特性，使保存的样品适合与多种分析方法和/或设备一起使用。
此外，本公开的组合物，当与生物样品(例如，含黏蛋白的体液、组织样品、细胞等)混合时，可以在室温(例如，在环境条件下)或低于室温(例如，冷藏或冷冻)下将核酸(例如，RNA)保存延长的时间段。在一些实施方式中，样品也可以被冷藏，但是在核酸(例如，RNA)回收和纯化之前可能不需要将样品冷冻。本公开的某些组合物的特性在于，它(a)化学稳定生物样品中的核酸，特别是RNA，(b)抑制样品中可能存在的核酸酶，以及(c)与用于纯化和/或处理(例如，扩增、测序、反转录等)寡核苷酸或多核苷酸的试剂相容。
因此，本公开的组合物可以提供用于来自流体生物样品的人RNA的“通用”保存溶液，该生物样品可以包括污染性微生物或微生物核酸。特别地，本公开的组合物被特别地配制为关于以下是“通用的”：(1)人受试者-因为一些受试者在其唾液中具有例如比其他受试者更多或不同的微生物，(2)储存条件-因为一些样品可以在室温下收集、运输和/或储存，而其他样品则被冷藏或冷冻，和/或(3)样品处理-因为一些RNA样品可用于RNA测序，而其他样品则使用RT-PCR或其他技术进行处理。
载体
在至少一种实施方式中，组合物可以包括载体。优选地，载体可以是液体载体或溶剂、更优选为水性载体或溶剂、还更优选为水。最优选地，载体可以是或包括纯化的、过滤的(例如，0.2微米过滤的)、蒸馏的和/或去离子的无RNA酶的水。因此，组合物可以包括载体。载体可以是或包括水，诸如过滤水、纯化水、蒸馏水或去离子水。
在一些实施方式中，组合物可以包括适量至100％的载体。在一些实施方式中，组合物可以包括10％-60％w/w、优选15％-55％w/w、更优选20％-50％w/w、还更优选25％-45％w/w、还更优选28％-40％w/w、还更优选30％-35％w/w、还更优选31％-34％w/w、还更优选32％-33％w/w，或其间的任何值或值的范围的载体。
离散剂
组合物可以包括离散剂(例如，一种或多种离散剂)。在一些实施方式中，离散剂可以是或包括氯化锂(LiCl)。在一些实施方式中，组合物可以包括离散剂，其基本上由氯化锂(LiCl)；MW 42.39组成。
在一些实施方式中，离散剂可以是或包括胍(或胍鎓)或其合适的盐，诸如硫氰酸胍、氯化胍、盐酸胍、碘化胍鎓、异硫氰酸胍、盐酸胍、硫氰酸钾、碘化钠、高氯酸钠、脲等。在至少一种实施方式中，离散剂可以是或包括硫氰酸盐或异硫氰酸盐。
然而，在一些实施方式中，组合物可以基本上没有或不含除了或不同于LiCl的一种或多种离散剂。在一些实施方式中，组合物可以包括LiCl且(基本上)没有或不含除了或不同于LiCl的一种或多种离散剂。在一些实施方式中，组合物可以基本上没有或不含胍(或胍鎓)或其合适的盐，诸如硫氰酸胍、氯化胍、盐酸胍、碘化胍鎓、异硫氰酸胍等。在至少一种实施方式中，组合物可以基本上没有或不含硫氰酸盐或异硫氰酸盐。
在一些实施方式中，离散剂可以呈、具有、包括或提供为干燥的、固体的、粉末状的、无水的和/或颗粒状的形式。在一些实施方式中，离散剂可以具有至少、最高达和/或约90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的纯度(如通过合适的材料测定测量的)。在一些实施方式中，离散剂可以包括具有任何合适浓度的储备溶液(例如在水中)或以具有任何合适浓度的储备溶液(例如在水中)的形式(提供)。
在一些实施方式中，组合物可包括约1％-20％w/w、优选约1％-10％w/w、更优选约3％-7％w/w、还更优选约3.33％-6.66％w/w或其间的任何值或值的范围的离散剂(例如，氯化锂)。在优选的实施方式中，组合物可以包括(约)3.33％w/w或(约)6.66％w/w的离散剂。最优选地，组合物可以包括(约)3.33％w/w或(约)6.66％w/w的氯化锂。
在一种或多种实施方式中，一种或多种离散剂可以是蛋白质变性剂。
缓冲剂
组合物可以包括缓冲剂(buffering agent)(或缓冲剂(buffer)、pH缓冲剂等)(例如，一种或多种缓冲剂(buffering agents)(或缓冲剂(buffers)、pH缓冲剂等)。在一些实施方式中，缓冲剂可以是或包括柠檬酸钠(例如，柠檬酸三钠二水合物(C6H5O7Na3·2H2O))。在一些实施方式中，组合物可以包括缓冲剂，其基本上由柠檬酸钠(例如，柠檬酸三钠二水合物(C6H5O7Na3·2H2O)；MW 294.1)组成。
在替代实施方式中，缓冲剂可以是或包括三(羟甲基)氨基甲烷(也称为Tris；Tris碱、2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇、THAM、氨丁三醇)或其合适的制剂(例如，三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐或Tris-HCl)、
碱(例如，在水中的Tris 40％(w/w)储备溶液)、柠檬酸盐、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、1,3-双(三(羟甲基)甲基氨基)丙烷(Bis-Tris)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、N-2-乙酰胺基-2-亚氨基二乙酸(ADA)、N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸)(PIPES)、碳酸氢盐、磷酸盐、TAE、TBE、硼酸钠、二甲胂酸钠，或其任何组合。
然而，在一些实施方式中，组合物可基本上没有或不含除了或不同于柠檬酸钠(例如，柠檬酸三钠二水合物(C6H5O7Na3·2H2O))的一种或多种缓冲剂。在一些实施方式中，组合物可包括柠檬酸钠(例如，柠檬酸三钠二水合物(C6H5O7Na3·2H2O))且基本上没有或不含除了或不同于柠檬酸钠(例如，柠檬酸三钠二水合物(C6H5O7Na3·2H2O)的一种或多种缓冲剂。在一些实施方式中，组合物可以基本上没有或不含三(羟甲基)氨基甲烷(也称为Tris；Tris碱、2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇、THAM、氨丁三醇)或其合适的制剂(例如，三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐或Tris-HCl)、
碱(例如，在水中的Tris 40％(w/w)储备溶液)、柠檬酸盐、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、1,3-双(三(羟甲基)甲基氨基)丙烷(Bis-Tris)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、N-2-乙酰胺基-2-亚氨基二乙酸(ADA)、N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸)(PIPES)、碳酸氢盐、磷酸盐、TAE、TBE、硼酸钠、二甲胂酸钠，或其任何组合。
在一些实施方式中，缓冲剂可以呈、具有、包括或提供为干燥的、固体的、粉末状的、无水的和/或颗粒状的形式。在一些实施方式中，缓冲剂可以具有至少、最高达和/或约90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的纯度(如通过合适的材料测定测量的)。在一些实施方式中，缓冲剂可以包括具有任何合适浓度的储备溶液(例如在水中)或以具有任何合适浓度的储备溶液(例如在水中)的形式(提供)。
在一些实施方式中，组合物可包括约0.05％-12％w/w、优选约0.1％-10％w/w、更优选约0.1％-8％w/w、还更优选约0.1％-6％w/w或其间的任何值或值的范围的缓冲剂，优选柠檬酸钠(例如，柠檬酸三钠二水合物(C6H5O7Na3·2H2O))。缓冲剂，优选柠檬酸钠(例如，柠檬酸三钠二水合物(C6H5O7Na3·2H2O))，可在一些实施方式中以约6％(或约5.99％)w/w、在其他实施方式中以约1.67％w/w以及在还其他实施方式中以约0.1％w/w包括在组合物中。
螯合剂
在至少一种实施方式中，组合物可以包括(金属)螯合剂(chelating agent)(或螯合剂(chelator))(例如，一种或多种螯合剂(chelating agent)(或螯合剂(chelator)))。在一些实施方式中，螯合剂包含、包括或提供有反荷离子(例如，钠)。在至少一种实施方式中，螯合剂包含、包括或提供为水合物(例如，二水合物)。在一些实施方式中，组合物可以包括一种或多种螯合剂。组合物的螯合剂可以选自由以下组成的组：乙二胺四乙酸(EDTA)、环己烷二胺四乙酸盐(CDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、四氮杂环十二烷四乙酸(DOTA)、四氮杂环十四烷四乙酸(TETA)、去铁亚胺(desferrioximine)、氨三乙酸(NTA)、乙二胺(或1,2-二氨基乙烷)，或其各自的螯合剂类似物、盐和/或水合物。优选地，螯合剂可以是或包括EDTA或其合适的盐和/或水合物(例如，作为EDTA二钠盐，优选作为EDTA二钠(盐)二水合物)。在一些实施方式中，组合物可以包括(金属)螯合剂，其基本上由EDTA或其合适的盐和/或水合物(例如，作为EDTA二钠盐，优选作为EDTA二钠(盐)二水合物；MW 372.2)组成。
在一些实施方式中，组合物可以包括螯合剂(chelating agent)(或螯合剂(chelator))，其基本上由EDTA或其合适的盐和/或水合物(例如，作为EDTA二钠盐，优选作为EDTA二钠(盐)二水合物)组成。
在至少一种替代实施方式中，螯合剂可以是或包括乙二醇四乙酸乙烯或二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)、环己烷二胺四乙酸盐(CDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、羟乙基亚乙基二胺三乙酸(HEDTA)、四氮杂环十二烷四乙酸(DOTA)、四氮杂环十四烷四乙酸(TETA)、去铁亚胺、氨三乙酸或N,N-双(羧甲基)甘氨酸(NTA)、乙二胺(或1,2-二氨基乙烷)，或其各自的螯合剂类似物、盐和/或水合物，或其任何组合。
然而，在一些实施方式中，组合物可以基本上没有或不含除了或不同于EDTA或其合适的盐和/或水合物(例如，EDTA二钠盐或EDTA二钠二水合物)的一种或多种缓冲剂。在一些实施方式中，组合物可以包括EDTA或其合适的盐和/或水合物(例如，EDTA二钠盐或EDTA二钠二水合物)且基本上没有或不含除了或不同于EDTA或其合适的盐和/或水合物(例如，EDTA二钠盐或EDTA二钠二水合物)的一种或多种缓冲剂。在一些实施方式中，组合物可以基本上没有或不含乙二醇四乙酸乙烯或二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)、环己烷二胺四乙酸盐(CDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、羟乙基亚乙基二胺三乙酸(HEDTA)、四氮杂环十二烷四乙酸(DOTA)、四氮杂环十四烷四乙酸(TETA)、去铁亚胺、氨三乙酸或N,N-双(羧甲基)甘氨酸(NTA)、乙二胺(或1,2-二氨基乙烷)，或其各自的螯合剂类似物、盐和/或水合物，或其任何组合。
在一些实施方式中，螯合剂(例如，EDTA)可以呈、具有、包括或提供为干燥的、固体的、粉末状的、无水的和/或颗粒状的形式。在一些实施方式中，螯合剂可以具有至少、最高达和/或约90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的纯度(如通过合适的材料测定测量的)。在一些实施方式中，螯合剂可以包括具有任何合适浓度的储备溶液(例如在水中)或以具有任何合适浓度的储备溶液(例如在水中)的形式(提供)。
在一些实施方式中，螯合剂可以以下范围包括在组合物中：约0.05％w/w至约5％w/w、优选约0.1％至约4％w/w、更优选约0.15％至约3％、还更优选约0.2％至约2.66％、或其间的任何值或值的范围或任何前述的摩尔当量。
在一些实施方式中，螯合剂可以以下范围包括在组合物中：约0.05％w/w至约0.5％w/w、或约1％w/w至约5％w/w、优选约0.1％w/w至约0.4％w/w、或约1.5％w/w至约4％w/w、更优选约0.15％至约0.3％w/w、或约2％w/w至约3％w/w、更优选约0.2％w/w或约2.66％w/w、或其间的任何值或值的范围或任何前述的摩尔当量。最优选地，组合物可以包括(约)0.2％w/w的EDTA或EDTA二钠(盐)二水合物或(约)2.66％w/w的EDTA或EDTA二钠(盐)二水合物或任何前述的摩尔当量。说明性地，在一些实施方式中，螯合剂(例如，EDTA)可以约5.4mM包括在组合物中。
不受任何理论的束缚，螯合剂可以使对于通过核酸酶催化RNA(和DNA)降解至关重要的过渡金属离子络合。螯合剂还可以具有抗菌活性。
表面活性剂
在至少一种实施方式中，组合物可以包括表面活性剂或洗涤剂(例如，一种或多种表面活性剂或洗涤剂)。优选地，表面活性剂可以是或包括月桂酰肌氨酸盐，更优选地，N-月桂酰肌氨酸钠盐或月桂酰肌氨酸钠(SLS；Sarkosyl洗涤剂；MW 293.4)或鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB；MW 364.4)。在一些实施方式中，表面活性剂或洗涤剂可以是或包括月桂酰肌氨酸盐，更优选地，N-月桂酰肌氨酸钠盐或月桂酰肌氨酸钠(SLS；Sarkosyl洗涤剂)。在一些实施方式中，表面活性剂或洗涤剂可以是或包括鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)。在一些实施方式中，组合物可以包括表面活性剂或洗涤剂，其基本上由以下组成：月桂酰肌氨酸盐，更优选地，N-月桂酰肌氨酸钠盐或月桂酰肌氨酸钠(SLS；Sarkosyl洗涤剂)和/或鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)。在一些实施方式中，组合物可以包括表面活性剂或洗涤剂，其基本上由以下组成：月桂酰肌氨酸盐，更优选地，N-月桂酰肌氨酸钠盐或月桂酰肌氨酸钠(SLS；Sarkosyl洗涤剂)。在一些实施方式中，组合物可以包括表面活性剂或洗涤剂，其基本上由鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)组成。
在一些实施方式中，SLS可以比SDS或其他(较不可溶的，但更受欢迎的)表面活性剂优选。不受任何理论的束缚，我们发现，当与本公开的组合物中的其他成分/组分组合和/或在其pH下时，SLS可以基本上比其他更受欢迎的一种或多种洗涤剂(例如，十二烷基硫酸钠(SDS)、脲、Tween等)更可溶。在一些实施方式中，CTAB可以比SDS或其他(较不可溶的，但更受欢迎的)表面活性剂优选。不受任何理论的束缚，我们发现，当与本公开的组合物中的其他成分/组分组合和/或在其pH下时，CTAB可以基本上比其他更受欢迎的一种或多种洗涤剂(例如，十二烷基硫酸钠(SDS)、脲、Tween等)更可溶。在一些实施方式中，CTAB可以比SLS优选。在一些实施方式中，SLS可以比CTAB优选。
在至少一种替代实施方式中，表面活性剂可以是或包括选自由脲、高氯酸盐和十二烷基硫酸盐(钠)(SDS)组成的组的一种或多种组分。在至少一种替代实施方式中，表面活性剂可以是或包括选自由以下组成的组的一种或多种组分：十二烷基硫酸钠(SDS)、脲、高氯酸盐、聚山梨酯(TweenTM)、月桂基二甲基氧化胺、聚乙氧基化醇、聚氧乙烯山梨聚糖、辛苯聚醇(Triton X100TM)、N,N-二甲基十二烷基胺-N-氧化物、十六烷基三甲基溴化铵(HTAB)、聚乙二醇10月桂基醚、胆盐(脱氧胆酸钠、胆酸钠)、聚乙二醇蓖麻油(CremophorTM)、壬基酚乙氧基化物(TergitolTM)、环糊精、卵磷脂、氯化甲苄乙氧铵(HyamineTM)、十二烷基硫酸锂(LDS)、牛磺脱氧胆酸钠(NaTDC)、牛磺胆酸钠(NaTC)、甘氨胆酸钠(NaGC)、脱氧胆酸钠(NaDC)、胆酸钠、烷基苯磺酸钠(NaABS)、N-月桂酰肌氨酸(NLS)、羧酸盐(即皂)、磺酸盐、硫酸盐、磷酸酯和多磷酸酯、烷基磷酸酯、磷酸单烷基酯(MAP)和/或全氟羧酸盐。
然而，在一些实施方式中，组合物可以基本上没有或不含除了或不同于SLS的一种或多种表面活性剂或一种或多种洗涤剂。在一些实施方式中，组合物可以基本上没有或不含除了或不同于CTAB的一种或多种表面活性剂或一种或多种洗涤剂。在一些实施方式中，组合物可以基本上没有或不含除了或不同于SLS和/或CTAB的一种或多种表面活性剂或一种或多种洗涤剂。在一些实施方式中，组合物可以包括SLS且基本上没有或不含除了或不同于SLS的一种或多种表面活性剂或一种或多种洗涤剂。在一些实施方式中，组合物可以包括CTAB且基本上没有或不含除了或不同于CTAB的一种或多种表面活性剂或一种或多种洗涤剂。在一些实施方式中，组合物可以包括SLS和/或CTAB且基本上没有或不含除了或不同于SLS和/或CTAB的一种或多种表面活性剂或一种或多种洗涤剂。
在一些实施方式中，组合物可以基本上没有或不含十二烷基硫酸钠(SDS)、脲、高氯酸盐、聚山梨酯(TweenTM)、月桂基二甲基氧化胺、聚乙氧基化醇、聚氧乙烯山梨聚糖、辛苯聚醇(Triton X100TM)、N,N-二甲基十二烷基胺-N-氧化物、十六烷基三甲基溴化铵(HTAB)、聚乙二醇10月桂基醚、胆盐(脱氧胆酸钠、胆酸钠)、聚乙二醇蓖麻油(CremophorTM)、壬基酚乙氧基化物(TergitolTM)、环糊精、卵磷脂、氯化甲苄乙氧铵(HyamineTM)、十二烷基硫酸锂(LDS)、牛磺脱氧胆酸钠(NaTDC)、牛磺胆酸钠(NaTC)、甘氨胆酸钠(NaGC)、脱氧胆酸钠(NaDC)、胆酸钠、烷基苯磺酸钠(NaABS)、N-月桂酰肌氨酸(NLS)、羧酸盐(即皂)、磺酸盐、硫酸盐、磷酸酯和多磷酸酯、烷基磷酸酯、磷酸单烷基酯(MAP)和/或全氟羧酸盐。在一些实施方式中，组合物可以基本上没有或不含SLS。在一些实施方式中，组合物可以基本上没有或不含CTAB。
在一些实施方式中，表面活性剂可以呈、具有、包括或提供为干燥的、固体的、粉末状的、无水的和/或颗粒状的形式。在一些实施方式中，表面活性剂可以具有至少、最高达和/或约90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的纯度(如通过合适的材料测定测量的)。在一些实施方式中，表面活性剂可以包括储备溶液(例如在水中)或以储备溶液(例如在水中)的形式(提供)，该储备溶液具有任何合适的浓度(例如，约10％、15％、20％、25％、28％、29％、30％、32％、35％、40％或45％w/w的水性溶液(例如，在水中)、优选约30％w/w或其摩尔当量)。
在一些实施方式中，表面活性剂(例如，SLS)可以约2.99％w/w或102mM包括在组合物中。在一些实施方式中，表面活性剂可以以下范围包括在组合物中：约1％至约5％w/w、优选约1.5％至约4.5％w/w、更优选约2％至约4％w/w、还更优选约2.5％至约3.5％w/w或任何前述的摩尔当量。在至少一种实施方式中，组合物可以(基本上)没有或不含除SLS外的表面活性剂或洗涤剂。
不受任何理论的束缚，表面活性剂或洗涤剂可用于裂解细胞，包括污染微生物(例如细菌)，使蛋白质变性并允许释放核酸。
醇
在至少一种实施方式中，组合物可以包括醇(例如，一种或多种醇)。优选地，醇可以是或包括乙醇。更优选地，醇可以是或包括乙醇和一种或多种额外的化学品或组分的混合物。在至少一种实施方式中，一种或多种额外的化学品或组分可以是或包括异丙醇。还更优选地，醇可以是或包括乙醇和异丙醇的混合物。在至少一种实施方式中，醇可以是或包括特异变性醇(SDA)。更优选地，醇可以是或包括SDA 3C，如本领域技术人员已知的，以包括约95％v/v的乙醇和约5％v/v的异丙醇的混合物。在至少一种实施方式中，组合物可以包括基本上由乙醇或乙醇和异丙醇的混合物组成的醇。在至少一种实施方式中，组合物可以包括基本上由特异变性醇(SDA)、优选SDA 3C(比重为0.79)组成的醇。一些实施方式可以是无醇的。
在至少一种替代实施方式中，醇可以是或包括乙醇与选自由以下组成的组的一种或多种额外的化学品或组分的混合物：甲醇、丙醇、丁醇、异丁醇等。组合物可以包括醇，诸如乙醇、甲醇、丙醇和/或异丙醇，优选乙醇与另一种醇(诸如甲醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、三氟乙醇、苯酚或2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)的混合物，更优选乙醇和异丙醇的混合物，还更优选特异变性醇(SDA)。在至少一种替代实施方式中，醇可以是或包括甲醇、正丙醇、正丁醇、三氟乙醇、苯酚或2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚。
然而，在一些实施方式中，组合物可以基本上没有或不含除了或不同于乙醇的一种或多种醇。在一些实施方式中，组合物可以基本上没有或不含除了或不同于乙醇和异丙醇的一种或多种醇。在一些实施方式中，组合物可以基本上没有或不含除了或不同于SDA3C的一种或多种醇。然而，在一些实施方式中，组合物可以包括乙醇且基本上没有或不含除了或不同于乙醇的一种或多种醇。在一些实施方式中，组合物可以包括乙醇和异丙醇且基本上没有或不含除了或不同于乙醇和异丙醇的一种或多种醇。在一些实施方式中，组合物可以包括SDA 3C且基本上没有或不含除了或不同于SDA 3C的一种或多种醇。在一些实施方式中，组合物可以基本上没有或不含甲醇、丙醇、正丙醇、丁醇、正丁醇、异丁醇、三氟乙醇、苯酚和/或2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚。
在一些实施方式中，醇可以呈、具有、包括或提供为液体的、水性的和/或溶液的形式。在一些实施方式中，醇可以包括具有任何合适浓度的醇(例如在水中)的储备溶液(例如在(无RNA酶的)水中)或以具有任何合适浓度的醇(例如在水中)的储备溶液(例如在(无RNA酶的)水中)的形式(提供)。在一些实施方式中，醇可以是基本上纯的，或者是基本上纯的醇的混合物。在一些实施方式中，醇可以具有至少、最高达和/或约90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的纯度(或纯的乙醇，200度(proof))(如通过合适的材料测定测量的)。
在一些实施方式中，醇可以是或包括：约95％v/v的乙醇和约5％v/v的异丙醇的混合物或储备溶液，或包括约95％v/v的乙醇和约5％v/v的异丙醇的混合物或储备溶液。在一些实施方式中，醇可以是或包括：90％-99％v/v的乙醇和约1％-10％v/v的异丙醇的混合物或储备溶液，或包括90％-99％v/v的乙醇和约1％-10％v/v异丙醇的混合物或储备溶液。在某些实施方式中，醇可包括50％-99％v/v的乙醇和1％-50％v/v的异丙醇的混合物。更优选地，醇可包括60％-98％v/v的乙醇和2％-40％v/v的异丙醇的混合物。还更优选地，醇可包括75％-97％v/v的乙醇和3％-25％v/v的异丙醇的混合物。还更优选地，醇可包括80％-96％v/v的乙醇和4％-20％v/v的异丙醇的混合物。还更优选地，醇可包括85％-95％v/v的乙醇和5％-15％v/v的异丙醇的混合物。还更优选地，醇可包括90％-95％v/v的乙醇和5％-10％v/v的异丙醇的混合物。还更优选地，醇可包括92％-95％v/v的乙醇和5％-8％v/v的异丙醇的混合物。还更优选地，醇可包括95％v/v的乙醇和5％v/v的异丙醇的混合物。最优选地，醇可以是或包括SDA 3C(比重＝0.79)。
在一些实施方式中，一种或多种醇(例如，优选包括乙醇，乙醇和异丙醇，或SDA3C)可以以下范围包括在组合物中：约1％w/w至约30％w/w、优选约2％w/w至约28％w/w、更优选约4％w/w至约25％w/w、还更优选约5％w/w至约20％w/w、或其间的任何值或值的范围或任何前述的摩尔当量。在一些实施方式中，一种或多种醇可以以下范围包括在组合物中：约1％w/w至约15％w/w、或约15％w/w至约25％w/w、优选约2％w/w至约12％w/w、或约18％w/w至约22％w/w、更优选约5％至约10％w/w、或约19％w/w至约21％w/w、还更优选约5％w/w、或约6％w/w、约10％w/w(约9.99％w/w)、或约20％w/w(约19.95％w/w或约19.99％w/w)、或其间的任何值或值的范围或任何前述的摩尔当量。
在一些实施方式中，组合物中包括的醇的量可以小于约20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、32％、35％、38％、40％、45％或50％w/w，或其间的任何值或值的范围。在一些实施方式中，组合物中包括的醇的量可比典型的、传统的或现有的核酸或RNA保存溶液更少(例如，少约5％、10％、15％、20％、22％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％)(例如，使组合物更适用于装运或运输)。
不受任何理论的束缚，醇可裂解细胞，包括污染微生物(例如细菌)和/或使蛋白质变性。
酸和pH
在至少一种实施方式中，组合物可以包括酸(例如，一种或多种酸)。优选地，酸可以是或包括盐酸(HCl)。
在至少一种替代实施方式中，酸可以是或包括氢溴酸(HBr)、高氯酸(HClO4)、硝酸(HNO3)或硫酸(H2SO4)。在至少一种实施方式中，酸可以是或包括碳酸(H2CO3)或乙酸(CH3COOH)。在至少一种实施方式中，酸可以是或包括磷酸(H3PO4)、硼酸(H3BO3)或祖母绿安全酸(Emerald Safe acid)(ESA)等。
然而，在一些实施方式中，组合物可以基本上没有或不含除了或不同于HCl的一种或多种酸。然而，在一些实施方式中，组合物可以包括HCl且基本上没有或不含除了或不同于HCl的一种或多种酸。在一些实施方式中，组合物可以基本上没有或不含氢溴酸(HBr)、高氯酸(HClO4)、硝酸(HNO3)、硫酸(H2SO4)、碳酸(H2CO3)、乙酸(CH3COOH)、磷酸(H3PO4)、硼酸(H3BO3)和/或祖母绿安全酸(ESA)。
在一些实施方式中，酸可以呈、具有、包括或提供为干燥的、固体的、粉末状的、无水的和/或颗粒状的形式。在一些实施方式中，酸可以具有至少、最高达和/或约90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的纯度(如通过合适的材料测定测量的)。在一些实施方式中，酸可以包括浓储备溶液(例如在水中)或以浓储备溶液(例如在水中)的形式(提供)，该储备溶液具有任何合适的浓度(例如，约10％、15％、20％、25％、30％、32％、35％、37％、38％、40％、45％、50％或更多w/w的水性溶液(例如，在水中)、优选约37％w/w或其摩尔当量(例如，在1M和约12M之间)。
在至少一种实施方式中，组合物可以具有在约pH 4-7、pH 4.5-6.5、pH4.5-6、pH5-7、pH 5-6.5或pH 5-6的范围(或其间的任何值或值的范围)内的pH。在一些实施方式中，组合物的pH可以大于4。在一些实施方式中，组合物的pH可以小于7。在一些实施方式中，组合物的pH可大于4且小于7、优选在约4.5至约6.5的pH范围内、更优选在约5至约6的pH范围内、还更优选在约5.2至约5.8的pH范围内、还更优选在约5.3至约5.7的pH范围内、还更优选在约5.4至约5.6的pH范围内以及最优选具有约5.5的pH。
在至少一种实施方式中，酸可以适量或以合适的量包括在组合物中，以使组合物的pH在约pH 4-7、pH 4.5-6.5、pH 4.5-6、pH 5-7、pH 5-6.5或pH 5-6的范围(或其间的任何值或值的范围)内、pH大于4、pH小于7、pH大于4且小于7、优选在约4.5至约6.5的pH范围内、更优选在约5至约6的pH范围内、还更优选在约5.2至约5.8的pH范围内、还更优选在约5.3至约5.7的pH范围内、还更优选在约5.4至约5.6的pH范围内以及最优选具有约5.5的pH。
说明性地，在一些实施方式中，可以将合适量的～37％w/w或～12M的HCl储备(水性)溶液添加或包括在组合物中，其为适量或以使组合物的pH在约pH 4-7、pH 4.5-6.5、pH4.5-6、pH 5-7、pH 5-6.5或pH 5-6的范围(或其间的任何值或值的范围)内、pH大于4、pH小于7、pH大于4且小于7、优选在约4.5至约6.5的pH范围内、更优选在约5至约6的pH范围内、还更优选在约5.2至约5.8的pH范围内、还更优选在约5.3至约5.7的pH范围内、还更优选在约5.4至约5.6的pH范围内以及最优选具有约5.5的pH。
不受任何理论的束缚，可以将一种或多种酸添加到组合物中以调节(即降低)组合物的pH。调节组合物的pH可以影响样品中RNA和/或其他(大)分子的稳定性。
不受任何理论的束缚，应注意，并且本领域技术人员将理解，不同的酸具有不同的“强度”或该酸失去质子(H+)的能力或趋势。强酸是在溶液(前提是存在足够的溶剂)中完全电离(解离)的酸。例如，在水中，一摩尔强酸HA溶解，产生一摩尔H+(作为水合氢离子H3O+和更高的聚集体)和一摩尔共轭碱A-。基本上，没有非电离酸HA留下。强酸的一些实例是盐酸(HCl)、氢碘酸(HI)、氢溴酸(HBr)、高氯酸(HClO4)、硝酸(HNO3)和硫酸(H2SO4)。在水性溶液中，这些中的每种基本上都100％电离。相比之下，弱酸仅部分解离。水中的实例包括碳酸(H2CO3)和乙酸(CH3COOH)。在平衡时，酸和共轭碱两者都存在于溶液中。较强的酸具有比较弱的酸更大的酸解离常数(Ka)和更小的对数常数(pKa＝-log Ka)。酸越强，它失去质子H+越容易。有助于易于去质子化的两个关键因素是H—A键的极性和原子A的尺寸，其决定了H—A键的强度。酸强度还取决于共轭碱的稳定性。
鉴于前述内容，使组合物的pH达到所需水平必需的每种酸的w/w量是不同的。例如，说明性地，尽管(约)4％的盐酸37％w/w(在水中)可足以使本公开的某些实施方式达到pH(约)5.5，但4％的乙酸37％w/w(在水中)可能太弱而无法使类似实施方式达到pH(约)5.5，4％的硫酸37％w/w(在水中)可能太强而无法使实施方式达到pH(约)5.5，4％的硝酸37％w/w(在水中)可氧化醇，等等。不受任何理论的束缚，即使是本领域普通技术人员，通过进一步的实验也可能无法能够确定哪些酸在本公开的一种或多种实施方式中是合适的。
还原剂
在至少一种实施方式中，组合物可以包括还原剂(例如，一种或多种还原剂)。优选地，还原剂可以是或包括三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP；MW286.65)或DL-二硫苏糖醇(DTT；MW 154.3)，更优选TCEP。在至少一种实施方式中，组合物可包括基本上由三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)或DL-二硫苏糖醇(DTT)、更优选TCEP组成的还原剂。在至少一种实施方式中，组合物可包括基本上由三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)组成的还原剂。在至少一种实施方式中，组合物可包括基本上由DL-二硫苏糖醇(DTT)组成的还原剂。
在一些实施方式中，TCEP可以比DTT或其他(更强、更受欢迎的)还原剂(例如，乙酰半胱氨酸(例如，N-乙酰半胱氨酸(NAC)，包括N-乙酰基-L-半胱氨酸、N-乙酰基-D-半胱氨酸，以及外消旋的N-乙酰半胱氨酸，或N-乙酰基-L-半胱氨酸和N-乙酰基-D-半胱氨酸的(外消旋的)混合物)、抗坏血酸、连二亚硫酸盐、异抗坏血酸盐(erythiorbate)、半胱氨酸、谷胱甘肽、2-巯基乙醇(BME)、二赤藓糖醇、树脂负载的硫醇、树脂负载的膦、维生素E和/或trolox或其盐、柠檬酸钠、柠檬酸钾、碘化钾、氯化铵、愈创木酚甘油醚(或愈创甘油醚)、吐鲁香脂(Tolu balsam)、鸭嘴花(Vasaka)、氨溴索、羧甲司坦、厄多司坦、美司坦、阿法链道酶等等优选。不受任何理论的束缚，一些(强)还原剂可具有通常使人不愉快的“腐烂的鸡蛋”气味。在一些实施方式中，使人不愉快的气味可比更弱的还原剂更不受欢迎。说明性地，在一些唾液收集设备、试剂盒和/或系统中，使用者可以使他们的鼻子足够靠近含溶液的(收集)容器以闻到还原剂。
然而，在至少一种替代实施方式中，还原剂可以是或包括乙酰半胱氨酸(例如，N-乙酰半胱氨酸(NAC)，包括N-乙酰基-L-半胱氨酸、N-乙酰基-D-半胱氨酸和外消旋的N-乙酰半胱氨酸，或N-乙酰基-L-半胱氨酸和N-乙酰基-D-半胱氨酸的(外消旋的)混合物)、抗坏血酸、连二亚硫酸盐、异抗坏血酸盐、半胱氨酸、美司坦、羧甲司坦谷胱甘肽、二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇(BME)、二赤藓糖醇、树脂负载的硫醇、树脂负载的膦、维生素E和/或trolox或其盐。
在一种或多种实施方式中，组合物不包含乙酰半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、N-乙酰基-L-半胱氨酸、N-乙酰基-D-半胱氨酸、外消旋的N-乙酰半胱氨酸或N-乙酰基-L-半胱氨酸和N-乙酰基-D-半胱氨酸的(外消旋的)混合物、抗坏血酸、连二亚硫酸盐、异抗坏血酸盐、二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇(BME)、二赤藓糖醇、树脂负载的硫醇、树脂负载的膦、维生素E、trolox和/或其盐。至少一种实施方式(基本上)不含乙酰半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、N-乙酰基-L-半胱氨酸、N-乙酰基-D-半胱氨酸、外消旋的N-乙酰半胱氨酸或N-乙酰基-L-半胱氨酸和N-乙酰基-D-半胱氨酸的(外消旋的)混合物、抗坏血酸、连二亚硫酸盐、异抗坏血酸盐、二硫苏糖醇、2-巯基乙醇、二赤藓糖醇、树脂负载的硫醇、树脂负载的膦、维生素E、trolox和/或其盐。在至少一种实施方式中，组合物可以(基本上)没有或不含DTT、BME、N-乙酰基-D-半胱氨酸和/或任何其他前述还原剂(例如，N-乙酰基-L-半胱氨酸)。在至少一种实施方式中，组合物可以(基本上)没有或不含除了(或不同于)TCEP之外的还原剂。在一些实施方式中，组合物可以包括TCEP且(基本上)没有或不含除了(或不同于)TCEP之外的还原剂。
在一些实施方式中，还原剂可以呈、具有、包括或提供为干燥的、固体的、粉末状的、无水的和/或颗粒状的形式。在一些实施方式中，还原剂可以具有至少、最高达和/或约90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的纯度(如通过合适的材料测定测量的)。在一些实施方式中，还原剂可以包括具有任何合适浓度的储备溶液(例如在水中)或以具有任何合适浓度的储备溶液(例如在水中)的形式(提供)。
还原剂(例如，TCEP)可以以下范围包括在组合物中：约0.01％至约1％、优选约0.05％至约0.5％、更优选约0.08％至约0.4％、还更优选约0.1％至约0.3％、还更优选约0.12％至约0.25％、还更优选约0.15％至约0.22％w/w、还更优选约0.17％至约0.2％w/w、还更优选约0.17％w/w或约0.2％w/w。
不受任何理论的束缚，还原剂可以是或包括溶黏蛋白剂和/或可以帮助使蛋白质变性(例如，通过还原或切割二硫桥)。另外，包含游离巯基基团的成分或组分(例如化学品或剂)可以充当抗氧化剂和/或可以帮助控制RNA稳定溶液中的溶解氧。在一些实施方式中，除了还原剂之外或代替还原剂，可以使用不是还原剂(用于还原半胱氨酸键)的溶黏蛋白剂。
任选的视觉指示剂
一些实施方式可以包括视觉指示剂。视觉指示剂可以是或包括着色剂。视觉指示剂可以是或包括染料或着色染料。染料或着色染料可以是或包括蓝色染料。蓝色染料可以是或包括FD&C蓝色1号(例如，羊毛罂红)。因此，在一些实施方式中，组合物可以包括视觉指示剂，优选着色剂、更优选着色染料、还更优选蓝色染料、还更优选FD&C蓝色1号。
在一些实施方式中，视觉指示剂可以呈、具有、包括或提供为干燥的、固体的、粉末状的、无水的和/或颗粒状的形式。在一些实施方式中，视觉指示剂可以具有至少、最高达和/或约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的纯度(如通过合适的材料测定测量的)。在一些实施方式中，视觉指示剂可以包括储备(溶液(例如，在水中))或以储备(溶液(例如，在水中))的形式(提供)，该储备(溶液(例如，在水中))具有任何合适的浓度(例如，约0.01％、0.05％、0.075％、0.1％、0.125％、0.15％、0.175％、0.2％、0.25％、0.3％或0.5％w/w的水性溶液(例如，在水中)、优选0.2％浓缩物)。在一些实施方式中，可以使用干燥的、固体的、粉末状的、无水的和/或颗粒状的材料制造储备溶液。
视觉指示剂(例如，FD&C蓝色1号)可以任何视觉上合适的量包括在组合物中，诸如范围为约0.00005％至约0.001％、优选约0.0001％至约0.00075％、更优选约0.0002％至约0.0005％w/w、还更优选约0.0003％至约0.00045％w/w、还更优选约0.00035％至约0.0004％w/w、还更优选约0.00037％w/w或约0.0004％w/w。
在至少一种实施方式中，视觉指示剂(例如，FD&C蓝色1号)可以作为浓缩物，诸如0.2％的浓缩物添加到组合物中。在一些实施方式中，浓缩物可以是水性或水基浓缩物。在一些实施方式中，组合物可包括约0.01％-2.5％w/w的0.01％-5％w/w(在水中)的视觉指示剂浓缩物、优选约0.05％-1％w/w的0.05％-1％w/w(在水中)的视觉指示剂浓缩物、更优选约0.075％-0.5％w/w的0.075％-0.5％w/w(在水中)的视觉指示剂浓缩物、还更优选约0.1％-0.25％w/w的0.1％-0.25％w/w(在水中)的视觉指示剂浓缩物、还更优选约0.185％w/w的0.2％w/w(在水中)的视觉指示剂浓缩物。在至少一种实施方式中，视觉指示剂(例如，FD&C蓝色1号)可以约0.185％w/w的～0.2％储备(水性)溶液或其等同物包括在组合物中。在一些实施方式中，视觉指示剂(例如，FD&C蓝色1号)可以约0.6％w/w的约0.2％w/w的浓缩物或储备(水性)溶液或其等同物包括在组合物中。
抗微生物剂
在一些实施方式中，组合物可以包括抗微生物剂。在一些实施方式中，一种或多种前述组分可以表现出抗微生物活性。例如，在一些实施方式中，醇、离散剂、表面活性剂和/或还原剂可以是抗微生物的或表现出抗微生物活性。因此，某些实施方式不必包括单独的抗微生物剂(例如，杀菌剂和/或抑菌剂)。在一种或多种实施方式中，即使在本公开的一种或多种所述实施方式中提供醇的较低浓度(例如，约9.99％-19.99％w/w等)，醇(例如，SDA3C)的抗微生物特性仍然存留。在一些实施方式中，组合物可以基本上没有或不含除了离散剂、表面活性剂、醇和还原剂之外的一种或多种抗微生物剂、一种或多种杀菌剂和/或一种或多种抑菌剂。
核糖核酸酶抑制剂
一些实施方式包括核糖核酸酶抑制剂或核糖核酸酶的抑制剂，诸如肝素、硫酸乙酰肝素、低聚(乙烯基磺酸)、聚(乙烯基磺酸)、低聚(乙烯基膦酸)和聚(乙烯基磺酸)或其盐。在某些(例如，优选的)实施方式中，组合物不包括核糖核酸酶抑制剂或核糖核酸酶的抑制剂，或(基本上)没有或不含一种或多种(例如，任何)核糖核酸酶抑制剂或核糖核酸酶的抑制剂(例如，除了离散剂诸如LiCl(其可具有内在的RNA酶抑制活性)、表面活性剂、醇和还原剂之外)。
蛋白酶
一些实施方式包括蛋白酶。在某些(例如，优选的)实施方式中，组合物不包括蛋白酶，或者(基本上)没有或不含一种或多种(例如，任何)蛋白酶。在一些实施方式中，组合物不包括或(基本上)不没有或不含蛋白酶K。不受任何理论的束缚，蛋白酶(protease)(或蛋白水解酶、肽酶或蛋白酶(proteinase))是通过水解破坏一个或多个肽键，从而将蛋白质转化为较小的蛋白质片段(或肽)或单个蛋白质亚基(或氨基酸)的酶类型。
蛋白质变性剂
一些实施方式包括一种或多种蛋白质变性剂。例如，在至少一种实施方式中，(i)离散剂可以是、包括或充当蛋白质变性剂(或使蛋白质变性或具有或表现出蛋白质变性活性)。在至少一种实施方式中，(ii)表面活性剂/洗涤剂可以是、包括或充当蛋白质变性剂(或使蛋白质变性或具有或表现出蛋白质变性活性)。在至少一种实施方式中，(iii)醇可以是、包括或充当蛋白质变性剂(或使蛋白质变性或具有或表现出蛋白质变性活性)。在至少一种实施方式中，(iv)还原剂可以是、包括或充当蛋白质变性剂(或使蛋白质变性或具有或表现出蛋白质变性活性)，诸如当一种或多种蛋白质包含可获得的二硫键或桥时。在一些实施方式中，(i)离散剂、(ii)表面活性剂/洗涤剂、(iii)醇和(iv)还原剂中的两种或更多种可以是、包括或充当蛋白质变性剂(或使蛋白质变性或具有或表现出蛋白质变性活性)。在一些实施方式中，(i)离散剂、(ii)表面活性剂/洗涤剂、(iii)醇和(iv)还原剂中的每种或所有可以是、包括或充当蛋白质变性剂(或使蛋白质变性或具有或表现出蛋白质变性活性)。
不受任何理论的束缚，一种或多种前述组分或成分的蛋白质变性活性可以是浓度和/或时间依赖性的。
制剂
本公开的各种实施方式包括核酸(例如，RNA)保存组合物(或制剂)，其包括载体、离散剂、缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、醇和/或还原剂。一些实施方式进一步包括任选的酸或碱，以使组合物达到优选的pH或pH范围。一些实施方式进一步包括任选的视觉指示剂。
本公开的实施方式包括核糖核酸(RNA)保存组合物，其包括载体、缓冲剂(buffer/buffering agent)和(金属)螯合剂。本公开的另一种实施方式包括RNA保存组合物，其包括载体、缓冲剂、螯合剂和离散剂。本公开的另一种实施方式包括RNA保存组合物，其包括载体、缓冲剂、螯合剂、离散剂和洗涤剂或表面活性剂。本公开的另一种实施方式包括RNA保存组合物，其包括载体、缓冲剂、螯合剂、离散剂和醇。本公开的另一种实施方式包括RNA保存组合物，其包括载体、缓冲剂、螯合剂、离散剂和还原剂。本公开的另一种实施方式包括RNA保存组合物，其包括载体、缓冲剂、螯合剂、离散剂、还原剂和醇。本公开的另一种实施方式包括RNA保存组合物，其包括载体、缓冲剂、螯合剂、离散剂、还原剂和洗涤剂(或表面活性剂)。本公开的另一种实施方式包括RNA保存组合物，其包括水性载体、离散剂、缓冲剂、(金属)螯合剂、洗涤剂(或表面活性剂)、醇和还原剂。
在一些实施方式中，可以添加酸(或碱)以实现合适的最终pH。组合物可以具有4-7的pH和/或适量至4-7的pH的酸。优选地，组合物可以具有约5.5的pH和/或适量至约5.5的pH的酸。所述组合物还可以包括任选的视觉指示剂。
实施方式可以包括例如1％-10％w/w的离散剂、1％-10％w/w的缓冲剂、0.01％-2％w/w的螯合剂、1％-5％w/w的表面活性剂、5％-40％w/w的醇和/或0.01％-0.2％w/w的还原剂。组合物可以具有pH 4-7，或适量至pH 4-7的酸。组合物可以具有适量至100％的载体。实施方式可以进一步包括0.005％-2.5％w/w的视觉指示剂。
实施方式可以包括例如约3％-7％w/w的离散剂、约4％-6％w/w的缓冲剂、约0.1％-0.3％w/w的螯合剂、约2％-4％w/w的表面活性剂、约9％-21％w/w的醇和/或约0.1％-0.25％w/w的还原剂。
实施方式可以包括例如约3.33％-6.65％w/w的离散剂、约5.99％w/w的缓冲剂、约0.2％w/w的螯合剂、约2.99％w/w的表面活性剂、约9.98％-19.96％w/w的醇和/或约0.17％w/w的还原剂。
在一些实施方式中，组合物可以基本上没有或不含微生物(例如，细菌、真菌和/或病毒)污染。在一些实施方式中，组合物可具有小于或等于(约)100cfu/g的细菌或细菌污染。在一些实施方式中，组合物可具有小于或等于(约)99、98、97、96、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5cfu/g的细菌或细菌污染。在一些实施方式中，组合物可具有小于或等于(约)100cfu/g的真菌(或真菌诸如酵母菌和/或霉菌)或真菌污染。在一些实施方式中，组合物可具有小于或等于(约)99、98、97、96、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5cfu/g的真菌(或真菌诸如酵母菌和/或霉菌)或真菌污染。如本文所用，“cfu/g”是指每克((最终和/或液体)组合物)的(一种或多种微生物的)菌落形成单位。
下表呈现了根据本公开的组合物的各种示例性非限制性实施方式。
表1a
表1b
表2
表3
表4
表5
表6
表7
表8
表9
表10
表11
表12
表13
表14
表15
表16
可以向任何前述制剂或本公开的其他实施方式中添加合适量的视觉指示剂(例如，0.2％w/w的FD&C蓝色1号(羊毛罂红)的0.2％浓缩物。
图1和2呈现了本公开的组合物的各种特定制剂的RNA产量(图1)和RNA品质分数数据(图2)。在每个实施例中，将1.5mL的所指示的RNA保存溶液添加到1.5mL的(人)唾液中。保存的样品测试在室温下5天后和冷藏下7天后进行。将理解的是，本公开的组合物的每种特定制剂产生足够量和品质的RNA用于随后的分析。较长的保存测试结果(未示出)指示，本发明的组合物使来自人唾液样品的溶液中的RNA在室温下稳定远超过5天以及在冷藏下稳定远超过7天。
图3A-3C、4A-4C和5A-5C各自说明了收集后立即(图3A-3C)、在RNA保存组合物1.0中在室温下储存48小时后(图4A-4C)以及在冷冻(-80℃)储存48小时后(图5A-5C)从唾液样品中提取的RNA的产量(A)、纯度(B)和保真性(C)结果。用两批独立的保存剂完成实验(其所有在产生后均在室温和4℃下储存30-60天)。使用5个独立的受试者对所有测试变量进行实验。针对全血DNA提取而优化的Chemagen基于珠的提取化学被用于所有RNA提取。评估了保存剂与唾液的若干种比率(2:1、1:1、1:2)。结果指示，在保持纯度和品质的同时，在本发明的RNA保存组合物中的储存可以比立即提取增加产量。此外，在一些实施方式中，保存剂与唾液的1:1比率或1:2比率(v/v)可以是最佳的。
试剂盒
本公开的一种或多种实施方式可包括试剂盒，诸如生物样品收集和/或保存试剂盒。在一种或多种实施方式中，本公开的组合物可包括在或并入试剂盒中。一些实施方式可以包括试剂盒，该试剂盒包括生物样品收集设备(或容器)和本公开的组合物。说明性的样品收集装置可以包括具有样品收集部分的容器或小瓶(例如，管)。例如，容器可以包括至少部分地成为内部隔室的界限的外壁。容器还可以具有与隔室流体连通的开口。容器还可以具有用于关闭或密封装置的开口的盖。
在至少一种实施方式中，组合物可以布置于样品收集装置的一部分中。说明性地，内部隔室可以包含组合物，可以向其中添加生物样品。替代地，可以将样品添加到隔室中，并在收集后将组合物添加到样品中。因此，收集设备(或容器)可以配置成接收生物样品(例如，在其内部隔室中)并具有向其添加的组合物。例如，装置可以包括用于在样品收集前或样品收集后将组合物添加到隔室中的组合物分配器。例如，在一些实施方式中，可以将组合物布置于设备的盖或盖子的一部分中。盖可以具有用于保持组合物直到将其添加到容器的隔室中的隔室。在一些实施方式中，闭合导线可以将组合物分配到其中布置生物样品的隔室中。
在一些实施方式中，试剂盒中的组合物可以基本上没有或不含微生物污染(如上所述)。
制造方法
一些实施方式包括制造本公开的组合物的方法。如本文所述，实施方式可以包括提供或获得载体。实施方式可包括向载体添加合适量的一种或多种本文所述的组分或成分(例如，至本文所述的最终浓度)。实施方式可包括向载体添加描述量的本文所述的一种或多种组分或成分的储备溶液。
至少一种实施方式包括向载体添加离散剂、缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、醇和/或还原剂。一种或多种实施方式可包括向载体添加任选的酸和/或视觉指示剂。
至少一种实施方式包括向(液体)载体添加离散剂至最终浓度为1％-10％w/w、缓冲剂至最终浓度为1％-10％w/w、螯合剂至最终浓度为0.01％-2％w/w、表面活性剂至最终浓度为1％-5％w/w、醇至最终浓度为5％-30％w/w和/或还原剂至最终浓度为0.01％-2％w/w。至少一种实施方式包括向(液体)载体添加任选的酸适量至pH 4-7(或大于4且小于7)和/或视觉指示剂至最终浓度为0.00005％-0.5％w/w。可以适量至100％包括载体。如本文所述，也预期了其他浓度。
在一些实施方式中，离散剂可以是或包括LiCl，缓冲剂可以是或包括柠檬酸钠，螯合剂可以是或包括EDTA或EDTA二钠(盐)二水合物，表面活性剂可以是或包括SLS，醇可以是或包括乙醇和/或异丙醇(例如，SDA 3C)，还原剂可以是或包括TCEP，酸可以是或包括HCl，载体可以是或包括(无RNA酶的)水，和/或任选的视觉指示剂可以是或包括FD&C蓝色1号。
制造核酸或RNA稳定和/或保存组合物的方法可以包括将载体添加到器皿中(例如，向混合罐中填充(过滤的、去离子的等)水)。在一些实施方式中，可以在将一种或多种额外的组分或成分添加到载体中之前激活混合器。在一些实施方式中，可以在将一种或多种额外的组分或成分添加到载体中之后激活混合器。在一些实施方式中，混合器可设置为2-8、优选3-7、更优选4-6、还更优选5的速度设置，和/或2-8、优选3-7、更优选4-6、还更优选5的扫描设置。在一些实施方式中，可以在将一种或多种额外的组分或成分添加到载体中之前将载体加热至合适的混合温度。在一些实施方式中，可以在将一种或多种额外的组分或成分添加到载体中之后将载体加热至合适的混合温度。在一些实施方式中，合适的混合温度可以是(约)55-95±5°F、优选60-90±5°F、更优选65-85±5°F、还更优选70-80±5°F、最优选75±5°F。
在一些实施方式中，可将合适量的离散剂(例如，LiCl)添加到载体中(例如，至最终浓度为组合物的约1％-10％w/w)。在一些实施方式中，可以将离散剂混合一段时间(例如，30-300分钟之间、优选60-240分钟、更优选120-180、还更优选140-160分钟、最优选150分钟，或直到离散剂溶解(在溶液中)在载体中。
在一些实施方式中，可将合适量的缓冲剂(例如，柠檬酸钠)添加到载体中(例如，至最终浓度为组合物的约1％-10％w/w)。在一些实施方式中，可以将缓冲剂混合一段时间(例如，1-90分钟之间、优选5-60分钟、更优选10-45、还更优选12-30分钟、还更优选15-25分钟、最优选(约)20分钟，或直到缓冲剂溶解(在溶液中)在载体中。
在一些实施方式中，可将合适量的螯合剂(例如，EDTA、EDTA二钠盐、EDTA二钠(盐)二水合物)添加到载体中(例如，至最终浓度为组合物的约0.01％-2％w/w)。在一些实施方式中，可以将螯合剂混合一段时间(例如，1-90分钟之间、优选5-60分钟、更优选10-45、还更优选12-30分钟、还更优选15-25分钟、最优选(约)20分钟，或直到螯合剂溶解(在溶液中)在载体中。在至少一种实施方式中，缓冲剂和螯合剂可以在有或没有预混合在一起的情况下，一起、在(大约)同时、同时期、伴随和/或(基本上)并发(或同时)添加到载体中。在一些实施方式中，可以将缓冲剂和螯合剂分别添加到载体中。
在一些实施方式中，可将合适量的表面活性剂(例如，SLS)添加到载体中(例如，至最终浓度为组合物的约1％-5％w/w)。在一些实施方式中，可以将表面活性剂混合一段时间(例如，1-90分钟之间、优选5-60分钟、更优选10-45、还更优选15-35分钟、还更优选20-30分钟、最优选(约)25分钟，或直到表面活性剂溶解(在溶液中)在载体中。
在一些实施方式中，可将合适量的醇(例如，乙醇，乙醇和另一化学品诸如异丙醇或SDA、优选SDA 3C的混合物)添加到载体中(例如，至最终浓度为组合物的约5％-30％w/w)。在一些实施方式中，可以将醇混合一段时间(例如，5-90分钟之间、优选10-75分钟、更优选15-60、还更优选25-45分钟、还更优选30-40分钟、最优选(约)35分钟，或直到醇溶解(在溶液中)在载体中。
在一些实施方式中，可将合适量的任选的视觉指示剂(例如，着色剂、染料，优选蓝色染料，诸如FD&C蓝色1号)添加到载体中(例如，至最终浓度为组合物的约0.00037％w/w)。在一些实施方式中，可以将视觉指示剂混合一段时间(例如，5-90分钟之间、优选10-60分钟、更优选15-45、还更优选10-30分钟、还更优选15-25分钟、最优选(约)20分钟，或直到醇溶解(在溶液中)在载体中。
在一些实施方式中，可将合适量的酸(例如，盐酸)添加到载体中(例如，适量至pH4-7)。在一些实施方式中，可以将酸混合一段时间(例如，5-90分钟之间、优选10-60分钟、更优选15-45、还更优选10-30分钟、还更优选15-25分钟、最优选(约)20分钟，或直到酸溶解(在溶液中)在载体中和/或混合物在所需pH下平衡。
在一些实施方式中，可将合适量的溶黏蛋白剂(或还原剂)(例如，TCEP)添加到载体中(例如，至最终浓度为组合物的约0.01％-2％w/w)。在一些实施方式中，可以将酸混合一段时间(例如，5-90分钟之间、优选10-60分钟、更优选15-45、还更优选10-30分钟、还更优选15-25分钟、最优选(约)20分钟，或直到酸溶解(在溶液中)在载体中和/或混合物在所需pH下平衡。
下面提供了说明性制造方法(参照表1-16)。
步骤1.在环境温度下在无RNA酶的容器中将成分1-4合并。
步骤2.将成分混合最少4小时，或直至明显完全溶解。
步骤3.将成分5-6添加到溶液中(溶液1.0中不包括项目5)。
步骤4.继续混合最少30分钟，或直至明显完全溶解。
步骤5.检查pH。用成分7调节至pH 5.5，并注意所用的量。
步骤6.将成分9添加到溶液中(仅在溶液1.0中使用成分8)。
步骤7.继续混合直至完全溶解。
步骤8.用额外的无RNA酶的水(成分1)调节最终体积至150mL。注意所用的量。
步骤9.通过0.2微米过滤器过滤到新的、标记的、无RNA酶的容器中(无菌过滤)。
步骤10.使用可密封的盖子封闭容器。溶液可以在室温下储存。
可以在制造期间的任何合适的点处进行品质控制测试。例如，在每个批次的批量制造过程完成后，使用用于获得样品的清洁和消毒的、批准且适当的工具从批量共混罐中从以下每个位置处无菌地获得两(2)个样品(每个大约4盎司)：靠近罐中心的批次的顶表面、靠近罐侧壁的批次的顶表面、靠近罐中心的批次的中间、靠近罐侧壁的批次的中间、靠近罐中心的批次的底部和靠近罐侧壁的批次的底部。将每个样品放置在无菌杯中并贴上标签。
测试每个样品的适当的外观、比重和pH。此外，进行了测定以测试螯合剂、醇和还原剂的协同作用(concertation)和/或有效性。另外，通过测量总需氧菌平板计数、酵母菌和霉菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococus aureus)和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)来测试污染(微生物限度)。表17呈现了各种品质控制测量的测试说明。
表17
在一些实施方式中，方法可包括将组合物密封在合适的储存器皿或样品收集装置的一部分(例如，容器或小瓶(例如，管)的组合物储存部分)中。还在储存器皿和样品收集装置中使样品经受受控室温(CRT)和加速(ACC)稳定性测试。
在一些实施方式中，方法可以产生或导致可能基本上没有或不含微生物污染(如上所述)的组合物。
使用方法
一些实施方式包括保存和/或稳定核酸的方法。该方法可以包括提供包含核糖核酸的生物样品，以及将本公开的组合物与生物样品合并。在至少一种实施方式中，生物样品可以是含黏蛋白的体液或组织，诸如痰或唾液。该方法可以包括降低含黏蛋白的体液或组织的粘度(例如，通过用溶黏蛋白剂或还原剂减少黏蛋白固有的二硫键)。在一些实施方式中，生物样品可以是体液样品，诸如血液样品、脑脊液样品、尿样品等等。在一些实施方式中，生物样品可以是细胞样品、器官样品或组织样品。在一些实施方式中，生物样品可以是癌细胞或组织样品。
在至少一种实施方式中，核酸是RNA。在一些实施方式中，组合物可以稳定核酸或RNA(例如，防止降解)。不受任何理论的束缚，已知RNA在某些条件下(例如，在溶液中和/或当暴露于核酸酶、不利的温度、UV光和/或各种化学品时)高度不稳定和/或对降解敏感。在储存、装运、处理和预处理步骤期间，需要稳定或保存试剂(例如，溶液)来保存和/或稳定生物样品(诸如唾液样品)中的RNA，以确保(至少一部分的)RNA存活，直到可以对其进行分析为止。RNA保存或稳定通常被认为比DNA保存或稳定困难得多，并且对于在运输、处理和/或预处理期间稳定来自某些生物样品诸如唾液的RNA，和/或对于某些类型的分析技术或用于进行其的设备而言，现有的RNA保存和/或稳定溶液可能不是最佳的。
在一些实施方式中，本公开的组合物可以稳定RNA(在溶液中和/或来自生物(例如，唾液)样品)持续第一时间段。在一些实施方式中，第一时间段可以大于或等于约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、21天、28天、30天、45天、60天、90天、120天、240天、300天或365天。在一些实施方式中，组合物可以将RNA(在溶液中和/或来自生物(例如，唾液)样品)(i)在室温、约15℃至30℃之间或约20℃至25℃之间，(ii)冷藏、约1℃至20℃之间或约1℃至15℃之间，(iii)冷冻、约-80℃至0℃之间或约-20℃至0℃之间，或(iv)其他合适的温度或温度范围，稳定持续第一时间段。实际上，本公开的组合物已示出将(合适量的)RNA(在溶液中和/或来自生物(例如，唾液)样品)在冷藏下(例如，约1℃至15℃之间、优选约1℃至10℃之间、更优选约1℃至8℃之间、还更优选约1℃至6℃之间、还更优选约2℃至6℃之间、最优选约4℃)，稳定持续至少7天。此外，本公开的组合物已示出将(合适量的)RNA(在溶液中和/或来自生物(例如，唾液)样品)在室温(例如，约15℃至30℃之间、优选约20℃至25℃之间、更优选约21℃至25℃之间、还更优选约22℃至24℃之间、最优选约23℃)，稳定持续至少5天。
尽管有前述内容，合适量的RNA似乎保持远超过7天(冷藏)和5天(在室温下)。虽然测试正在进行中，但是基于预测数据(未示出)，预期本公开的组合物将在室温(例如，约15℃至30℃之间、优选约20℃至25℃之间、更优选约21℃至25℃之间、还更优选约22℃至24℃之间、最优选约23℃)有效稳定(合适量的)RNA(在溶液中和/或来自生物(例如，唾液)样品)持续至少7天、优选至少8天、更优选至少9天、还更优选至少10天、还更优选至少11天、还更优选至少12天、还更优选至少13天、还更优选至少14天，以及在冷藏下(例如，约1℃至15℃之间、优选约1℃至10℃之间、更优选约1℃至8℃之间、还更优选约1℃至6℃之间、还更优选约2℃至6℃之间、最优选约4℃)有效稳定(合适量的)RNA(在溶液中和/或来自生物(例如，唾液)样品)持续至少10天、优选至少11天、更优选至少12天、还更优选至少13天、还更优选至少14天、还更优选至少15天、还更优选至少16天、还更优选至少17天、还更优选至少18天、还更优选至少19天、还更优选至少20天、还更优选至少21天。
在一些实施方式中，本公开的组合物可以在第二时间段内是稳定的(例如，贮存稳定的)。在一些实施方式中，第二时间段可以大于或等于约12个月、18个月、24个月、30个月或36个月。在一些实施方式中，组合物可以(i)在室温、约15℃至30℃之间或约20℃至25℃之间，(ii)冷藏、约1℃至20℃之间或约1℃至15℃之间，(iii)冷冻、约-80℃至0℃之间或约-20℃至0℃之间，或(iv)其他合适的温度或温度范围，稳定持续第二时间段。实际上，本公开的组合物已示出在冷藏下(例如，约1℃至15℃之间、优选约1℃至10℃之间、更优选约1℃至8℃之间、还更优选约1℃至6℃之间、还更优选约2℃至6℃之间、最优选约4℃)，(贮存)稳定持续至少60天。此外，本公开的组合物已示出在室温(例如，约15℃至30℃之间、优选约20℃至25℃之间、更优选约21℃至25℃之间、还更优选约22℃至24℃之间、最优选约23℃)，(贮存)稳定持续至少30天。
尽管有前述内容，本公开的组合物似乎(贮存)稳定远超过60天(冷藏)和30天(在室温下)。应注意，表1-16的实例组合物中所列的每种组分在所列浓度下在水中固有地稳定。在一些实施方式中，有意将每种成分的浓度保持足够低以在环境温度或室温以及冷藏下实现长期(贮存)稳定性。虽然测试正在进行中，但是预期在一种或多种公开的浓度范围内的表1-16中所示的组合物以及本公开的其他组合物、与其类似的组合物和/或包括一种或多种成分(例如，如所公开的如在本公开的实施方式中组合的)的组合物，将在环境温度或室温和冷藏下(贮存)稳定持续至少一年。
至少一种实施方式包括从唾液或痰中回收核酸(例如，RNA)的方法，该方法包括：i)从受试者获得唾液或痰，ii)使唾液或痰与本公开的组合物接触以形成样品混合物，iii)任选地使混合物与蛋白酶接触，以及iv)从混合物中回收核酸(例如，RNA)。在一些实施方式中，方法可进一步包括对回收的RNA进行RNA分析。在一种或多种实施方式中，将1.5mL本公开的RNA保存溶液(例如，如表1-16中说明性呈现的)添加到1.5mL(人)唾液或痰中。
至少一种实施方式包括从生物流体样品中回收核酸(例如，RNA)的方法，该方法包括：i)从受试者获得生物流体，ii)使生物流体与本公开的组合物接触以形成样品混合物，iii)任选地使混合物与蛋白酶接触，以及iv)从混合物中回收核酸(例如，RNA)。在一种或多种实施方式中，将1.5mL本公开的RNA保存溶液(例如，如表1-16中说明性呈现的)添加到1.5mL(人)体液中。
至少一种实施方式包括从组织样品中回收核酸(例如，RNA)的方法，该方法包括：i)从受试者获得组织，ii)使组织与本公开的组合物接触以形成样品混合物，iii)任选地使混合物与蛋白酶接触，以及iv)从混合物中回收核酸(例如，RNA)。在一种或多种实施方式中，1.5mL本公开的RNA保存溶液(例如，如表1-16中说明性呈现的)，合适体积或质量的组织或细胞样品。在一些实施方式中，可以在稳定溶液的存在下将组织均质化。
在一些实施方式中，当以合适的量添加到生物样品中时，本公开的组合物不显著抑制或干扰随后的核酸分析，诸如例如直接检测RNA(例如，Nanostring)、RNA反转录为cDNA、DNA扩增(例如，经由PCR)、核酸(DNA)测序(例如，下一代(NextGen)测序、微阵列分析等等，其可用于基因表达分析。
样品收集
本公开的一些实施方式包括获得、提供和/或收集生物样品(例如，来自受试者，诸如人受试者)。在一些实施方式中，生物样品可以是或包括(人)唾液、体液、组织等。(人)样品可以无菌收集(以避免(微生物)污染)。在一种或多种实施方式中，样品可以被收集到样品收集装置或其样品容器中。在一些实施方式中，样品收集装置或容器可以是试剂盒的一部分和/或可以包括本公开的组合物。实施方式可包括使样品与本公开的组合物接触。
RNA提取和分析：
本公开的一些实施方式包括从生物样品中提取核酸(例如，RNA)。以下是可适用于与本公开的组合物一起使用的各种提取模式或提取程序的非详尽清单或描述。
提取化学
有机–苯酚氯仿提取是研究和临床实验室两者中使用的常见程序/机理，且在其涉及组织来源时被认为是样品类型依赖性的。在本公开的一些实施方式中，进行和/或可以进行(手动)苯酚/氯仿提取方案，然后是氯仿反提取以帮助去除任何有机溶剂污染，以提取总RNA。
固相–不受任何理论的束缚，用于将DNA结合到固体支持物以进行核酸纯化的离心柱和真空歧管溶液可适用于RNA纯化。一旦RNA附接在支持物上，就可以进行一系列洗涤。最终，RNA可以以小体积从固体支持物上洗脱以用于分析。离心柱化学经常用于研究和临床实验室两者中。
基于珠–用各种结合部分或通过带电以结合总RNA来制备珠或(顺)磁珠。珠被磁场捕获，因此任何未与珠结合的物质都可以作为纯化过程的一部分被洗掉。一旦洗涤完成，就用溶解RNA的溶液将核酸从珠上洗脱，留下珠，随后通过再次施加磁场将其去除。在研究和临床环境中，这种方法有小体积和大体积的自动化解决方案两者。
在本公开的一些实施方式中，一种或多种可商购试剂盒或化学品的结合缓冲剂或其他缓冲剂、试剂等可以被修改(例如，优化)以与本公开的一种或多种组合物相容。例如，pH和缓冲剂组成的变化可对RNA与底物结合的效率具有直接影响，这会影响提取产量，并潜在地影响样品品质。
分析方法
一些实施方式包括处理和/或分析提取的核酸(例如，RNA)。若干种方法可用于分析提取的核酸(例如，RNA)。以下是可适用于与本公开的组合物一起使用的用于分析提取的核酸(例如，RNA)的各种方法的非详尽清单或描述。
RT-PCR
反转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析是用于定性和定量RNA分析的快速且有成本效益的手段。RNA被反转录和扩增，任选地同时实时监测扩增(例如，通过dsDNA结合染料荧光)。替代地，从所有反转录的cDNA模板产生一系列PCR反应(不同尺寸的扩增子)，并经由电泳解析正确尺寸的扩增产物。PCR扩增子尺寸的范围将提供有关所有RNA提取产物的保真性的信息。
qPCR
定量PCR(qPCR)使用双标记荧光探针对PCR扩增子进行定量。利用Taqman化学的绝对和差异基因表达将用于确定在所有提取方法中收集和提取的RNA转录物的绝对和相对量两者。对于丰度和所分析的所有变量之间的相对差异，将测量受试者的基因表达水平。所有定量测量都将以一式三份进行。
dPCR
数字PCR(dPCR)是一种新兴技术，用于以限制性量和/或限制性品质灵敏地检测样品中的基因表达靶标。将使用相同的Taqman测定来确定提取的每个RNA样品的绝对灵敏度。鉴于dPCR的灵敏度，我们将能够确定所分析的每种转录物的最终检测水平。
微阵列
当涉及单个RNA样品的发现和临床分类两者时，同时测量RNA转录物具有巨大的意义。灵敏度和特异性要求与基于QPCR的分析相当不同，并且基因表达定量的方法也有所不同，因为这种分析方法使用基于杂交的机理对RNA转录物进行定量。用不同的RNA提取化学处理的供体之间的相对基因表达水平将是关键的分析终点。
NextGen测序–RNA-Seq
如本文所用，“下一代测序”(NGS)，也称为高通量测序，是指基于非桑格(Sanger)的高通量RNA测序技术。通过NGS，可以对数百万或甚至数十亿条RNA链进行并行测序，产生显著更高的通量，并使对桑格基因组测序中经常使用的片段克隆方法的需求最小化。NGS是用于描述多种不同现代测序技术或平台的笼统术语，包括例如焦磷酸测序、合成测序、连接测序、离子半导体测序和如本领域已知的其他技术。
如本领域技术人员所理解的，NGS通常允许比桑格测序更加快速且负担得起地对大量RNA进行测序。在NGS中，大量的短读段在单冲程中被测序。为了做到这点，首先可以将输入样品切割成短段。这些段的长度取决于所使用的具体测序机器。特定NGS技术的说明性实例包括例如
(SBS化学)测序、Ion torrent、S5测序等等。
以前由Roche和Life Technologies提供的NextGen技术也可以在某些实施方式中是合适的。不受任何理论的束缚，Roche 454测序可比
适用于对更长的读段进行测序。像
一样，它可以通过读取添加碱基时的光学信号同时对多个读段测序来做到这点。像
中的一样，DNA或RNA被片段化为较短的读段，在这种情况下最高达1kb。将通用衔接子添加到末端，并将它们退火到珠上，每个珠一个DNA片段。然后使用衔接子-特异性引物通过PCR扩增片段。然后将每个珠放置在载玻片的单个孔中。因此，每个孔将包含单个珠，覆盖在单个序列的多个PCR拷贝中。这些孔还包含DNA聚合酶和测序缓冲剂。用四种NTP种类之一淹没载玻片。在该核苷酸是在序列中的下一个的情况下，它被添加到序列读段中。如果该单个碱基重复，则将添加更多。因此，如果我们充满鸟嘌呤碱基，并且序列中的下一个是G，则将添加一个G，然而如果序列的下一部分是GGGG，则将添加四个G。每个核苷酸的添加都释放光信号。信号的这些位置被检测并用于确定向哪些珠添加核苷酸。洗掉该NTP混合物。现在添加下一NTP混合物，并重复该过程，循环通过四种NTP。这类测序为每个序列读段生成图，示出每次核苷酸洗涤的信号密度。然后可以从每次洗涤的信号密度计算确定序列。我们从454中获得的所有序列读段都将具有不同的长度，因为每次循环都将添加不同数目的碱基。
在Illumina测序中，使用100-150bp读段。稍微较长的片段连接到通用衔接子上并使用衔接子退火到载玻片上。进行PCR以扩增每个读段，创建具有许多相同读段拷贝的点。然后将它们分成待测序的单链。载玻片充满核苷酸和DNA聚合酶。这些核苷酸被荧光标记，其中颜色与碱基相应。它们还具有终止子，使得一次只添加一个碱基。拍照载破片的图像。在每个读段位置，将存在荧光信号，指示已添加的碱基。然后为下一个循环准备载玻片。去除终止子，允许添加下一个碱基，并去除荧光信号，防止信号污染下一个图像。重复该过程，一次添加一个核苷酸并在其间进行成像。然后使用计算机来检测每个图像中每个位点处的碱基，并使用这些来构建序列。所有序列读段将具有相同的长度，因为读段长度取决于进行的循环数。
与
(和Roche 454)不同，Ion Torrent和S5测序不使用光学信号。而是，它们利用了将dNTP添加到DNA聚合物中释放H+离子的事实。像在其他种类的NGS中的一样，输入DNA或RNA被片段化，这次为～200bp。添加衔接子并将一个分子放置到珠上。通过乳液PCR在珠上扩增分子。将每个珠放置到载玻片的单个孔中。与Roche 454一样，载玻片充满单一种类的dNTP，连同缓冲剂和聚合酶，一次一个NTP。检测每个孔的pH，因为释放的每个H+离子都将降低pH。pH的变化允许我们确定该碱基是否以及其多少被添加到序列读段中。将dNTP洗掉，并通过不同的dNTP种类循环重复该过程。pH变化(如果有的话)用于确定每个循环内添加了多少碱基(如果有的话)。
另外或替代地，可以更一般地通过基于荧光的测序技术和/或任何基于电流的测序技术来进行测序。基于荧光的测序技术的说明性实例包括掺入与荧光团缀合的核苷酸的任何技术，诸如例如使用基于
的测序方法和系统进行测序。基于电流的测序技术的说明性实例包括任何测序技术(包括链测序方法)，其测量在多核苷酸通过插入到带电膜中的孔时的电流或以其他方式特异性地破坏传感器和/或带电膜的电流。
在一些实施方式中，例如，利用长读段技术的直接检测NGS(例如，OxfordNanopore，PacBio)也可以在某些实施方式中是合适的。直接检测NGS技术的非限制性实例包括Oxford NanoPore
的纳米孔DNA测序系统和方法。
作为说明性实例，生成具有0.5X覆盖率的数据的测序运行理论上将保留一半样品未表示。使用将核酸“切碎”成小片段进行测序的测序方法，最终产品可以是序列文库，约占总参考基因组的一半，其中对齐的参考基因组散落着少许较小的核酸匹配。另一方面，使用链测序方法，再次以低覆盖率(例如0.5X)，结果可以是再次约占总参考基因组的一半的序列文库。然而，当与参考基因组对齐时，匹配部分要长得多，并且可以提供更明确的信息，诸如哪些序列已被缺失、复制、插入等。这也可证明是有问题的。虽然基因组的较长的连续部分可以通过链测序方法表示，但基因组的长的连续部分也保留未知。因此，尽管链测序方法可允许对基因组的部分进行较高清晰度的观察，但较小的测序读段具有提供整个基因组的更全局的图片的潜能。以这种方式和其他方式，链测序可以提供用于分析拷贝数变异的稳健模型。
尽管前述说明了已知的测序技术及其对本文公开的本发明方法和系统的应用，但应当理解，这并不阻止为将尚未发现或以其他方式未公开的测序方法应用于本发明的范围内。也就是说，在许多实施方式中，测序方法本身不是必要的发明步骤(除非，例如，通过使用具体测序技术对方法和/或系统提供改进)；相反，对通过测序方法提供的测序数据所做的事情和/或如何应用哪些数据通常包括发明步骤。因此，应当理解，未来的测序技术(以及本文未明确列出的那些测序技术)，如果在所公开的方法或系统中用作工具，则包括在本申请的范围内。
另外，可以以任何数目或容量，以及用任何数目的流动池或影响为每个测序反应/运行提供的测序读段的总数的其他类似输入，使用任何前述测序技术。
下一代测序可能最终成为分析DNA和RNA靶标两者的标准。通过标准文库制备过程，为所有RNA样品创建了包括由qPCR、dPCR和基于阵列的靶标覆盖的RNA转录物的靶向组。将样品在NextGen平台上进行条形码化和多重复用以进行变体分析。对数据进行解多重复用和分析，以直接比较所有其他平台中的基因型调用。
结论
本公开的组合物令人惊讶地显著优于现有的RNA保存产品。特别地，令人惊讶且出乎意料的是，本公开的组合物如此很好地起作用(例如，产生大量的(人)核糖核酸(RNA)和/或具有或表现出低水平的微生物污染)。进一步令人惊讶且出乎意料的是，本公开的组合物如此很好地起作用，在一些实施方式中具有提供的低量的醇。例如，在一些实施方式中，组合物中包括的醇的量可比典型的、传统的或现有的核酸或RNA保存溶液更少(例如，少约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％)。另外，较少量的醇更经济和/或使组合物更适用于装运或运输(例如，通过更容易地遵守装运要求和规定、降低挥发性等)。
进一步令人惊讶且出乎意料的是，某些组分或成分如果不比更受欢迎的组分或成分更合适的话，则与更受欢迎的组分或成分一样适合用于RNA保存溶液中。例如，在一些实施方式中，对于保存来自唾液样品的人RNA，发现氯化锂(LiCl)是比更常见的硫氰酸胍、异氰酸胍和盐酸胍更有效的离散剂。类似地，在一些实施方式中，在保存来自唾液样品的人RNA方面，发现鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)是与(更强的)洗涤SDS、SLS等一样有效的洗涤剂。进一步令人惊讶且出乎意料的是，在RNA保存溶液的一些实施方式中，约5.5的pH是最佳的。进一步令人惊讶且出乎意料的是，柠檬酸钠(柠檬酸三钠二水合物)如果不比更受欢迎的缓冲剂更合适的话，则与更受欢迎的缓冲剂一样适合用于RNA保存溶液中，这些更受欢迎的缓冲剂诸如Tris、Tris-HC、
碱、柠檬酸盐、MES、BES、Bis-Tris、HEPES、MOPS、Bicine、Tricine、ADA、ACES、PIPES、碳酸氢盐、磷酸盐、TAE、TBE、硼酸钠、二甲胂酸钠。包括特异变性醇(例如SDA 3C)还具有避免各种法规遵从性问题和相关成本，同时保持乙醇的有效性的益处。
将理解的是，某些实施方式(例如，组合物、试剂盒、方法等)可以包括、并入或以其他方式包括在本文公开和/或描述的其他实施方式中描述的特征(例如，特性、组分、成分、要素、零件、部分、步骤等)。因此，一种实施方式的各种特征可以与本公开的其他实施方式兼容、组合、包括在和/或并入本公开的其他实施方式中。关于本公开的一种实施方式的某些特征的公开不应被解释为将所述特征的应用或包括限制到特定实施方式。相反，将理解的是，其他实施方式也可以包括所述特征，而不必脱离本公开的范围。此外，除非特征被描述为需要与之组合的另一特征，否则本文所述的任何特征可以与本文公开的相同或不同实施方式的任何其他特征组合。
所描述的实施方式在所有方面仅被认为是说明性的且非限制性的。因此，本发明的范围由所附权利要求而不是由前述描述指示。落入权利要求的等价的含义和范围内的所有改变均应包括在其范围内。可以对所说明的实施方式进行相关领域的并掌握本公开的技术人员想到的本文所说明的特征的各种改变和/或修改和额外的应用，而不脱离如由权利要求限定的本发明的精神和范围，并且被认为在本公开的范围内。尽管本文已经公开了各种特征和实施方式，但是预期其他特征和实施方式。例如，众所周知的特征和实施方式在本文中没有特别详细地描述，以避免使所描述的实施方式的各方面模糊。然而，本文也预期了这样的特征和实施方式。
Claims (20)
1.一种核糖核酸(RNA)保存组合物，其基本上由以下组成：
约3.33％-6.66％w/w的氯化锂(LiCl)；
约1％-2％w/w的柠檬酸三钠二水合物；
约0.2％-0.5％w/w的乙二胺四乙酸(EDTA)二钠二水合物；
约3％-4％w/w的N-月桂酰肌氨酸钠盐(SLS)或鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)；
约5％-20％w/w的醇，其基本上由约95％v/v的乙醇和约5％v/v的异丙醇组成；
约0.15％-0.3％w/w的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)；
任选地，着色染料；以及
适量至100％的无RNA酶的水，
所述组合物具有约5.5的pH。
2.一种核糖核酸(RNA)保存组合物，其包括：
载体；
缓冲剂；
螯合剂；以及
选自由以下组成的组的一种或多种：
离散剂；
洗涤剂或表面活性剂；
醇；以及
还原剂，
所述组合物具有4-7的pH。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中：
所述载体包括无RNA酶的水；
所述离散剂包括氯化锂(LiCl)；
所述缓冲剂包括柠檬酸钠或柠檬酸三钠二水合物；
所述金属螯合剂包括EDTA或EDTA二钠二水合物；
所述表面活性剂包括N-月桂酰肌氨酸钠盐(SLS)或鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)；
所述醇包括乙醇，优选地乙醇和异丙醇的混合物；和/或
所述还原剂包括三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)。
4.根据权利要求2或3所述的组合物，其中，所述组合物包括：
约3.33％-6.66％w/w的所述离散剂；
约1％-2％w/w的所述缓冲剂；
约0.2％-0.5％w/w的所述螯合剂；
约3％-4％w/w的所述表面活性剂；
约5％-20％w/w的所述醇；和/或
约0.15％-0.3％w/w的所述还原剂。
5.根据权利要求2或3所述的组合物，其中，所述组合物包括：
约3％-7％w/w的所述离散剂；
约0.5％-5％w/w的所述缓冲剂；
约0.05％-1％w/w的所述螯合剂；
约2％-6％w/w的所述表面活性剂；
约2％-25％w/w的所述醇；和/或
约0.1％-0.5％w/w的所述还原剂。
6.根据权利要求2或3所述的组合物，其中，所述组合物包括：
约1％-10％w/w的所述离散剂；
约0.1％-10％w/w的所述缓冲剂；
约0.01％-2％w/w的所述螯合剂；
约1％-20％w/w的所述表面活性剂；
约1％-30％w/w的所述醇；和/或
约0.01％-1％w/w的所述还原剂。
7.根据权利要求2-6中任一项所述的组合物，其中，所述组合物具有4.5-6.5、优选5-6、更优选5.2-5.8、还更优选5.4-5.6、最优选5.5的pH。
8.根据权利要求2-7中任一项所述的组合物，其中，所述组合物基本上没有或不含除了所述离散剂、所述表面活性剂、所述醇和所述还原剂之外的一种或多种抗微生物剂、一种或多种杀菌剂和/或一种或多种抑菌剂。
9.根据权利要求2-8中任一项所述的组合物，其中，所述组合物基本上没有或不含除了所述离散剂、所述表面活性剂、所述醇和所述还原剂之外的一种或多种核糖核酸酶抑制剂或一种或多种核糖核酸酶的抑制剂。
10.根据权利要求2-9中任一项所述的组合物，其中，所述组合物基本上没有或不含一种或多种蛋白酶、蛋白酶K和/或一种或多种蛋白酶抑制剂。
11.根据权利要求2-10中任一项所述的组合物，其中，所述组合物基本上没有或不含二硫苏糖醇(DTT)或β-巯基乙醇(BME)。
12.根据权利要求2-11中任一项所述的组合物，其中，所述组合物基本上没有或不含一种或多种咪唑鎓盐。
13.根据权利要求2-12中任一项所述的组合物，其中，所述组合物基本上没有或不含DNA酶。
14.根据权利要求2-13中任一项所述的组合物，其中，所述醇包括约95％v/v的乙醇和约5％v/v的异丙醇的混合物。
15.根据权利要求2-14中任一项所述的组合物，进一步包括染料或着色剂。
16.一种核糖核酸保存试剂盒，其包括：
样品收集装置；以及
根据权利要求1-15中任一项所述的组合物，其优选地布置于所述样品收集装置的溶液隔室中。
17.一种制造核酸保存组合物的方法，所述方法包括：
获得载体；
向所述载体添加缓冲剂、螯合剂以及选自由以下组成的组的一种或多种试剂：离散剂、洗涤剂或表面活性剂、醇和溶黏蛋白剂或还原剂，从而形成混合物；以及
如果所述混合物不具有4-7的pH，则调节所述混合物的pH至4-7。
18.一种稳定核糖核酸(RNA)的方法，所述方法包括使包含RNA的生物样品与根据权利要求1-15中任一项所述的组合物接触。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述生物样品包括人唾液。
20.一种无醇的核糖核酸(RNA)保存组合物，其包括：
载体，优选地包括无RNA酶的水；
缓冲剂，优选地柠檬酸三钠二水合物；
螯合剂，优选地包括EDTA；以及
选自由以下组成的组的一种或多种：
离散剂；
洗涤剂或表面活性剂；以及
还原剂，
所述组合物具有4-7的pH。
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