CN116790577B

CN116790577B - 一种rna保存液及其用途

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Publication number: CN116790577B
Application number: CN202311034075.7A
Authority: CN
Inventors: 杨宇; 宋悦谦; 赵婷婷; 刘莉; 郭铮蕾
Original assignee: China Customs Science And Technology Research Center
Current assignee: China Customs Science And Technology Research Center
Priority date: 2023-08-17
Filing date: 2023-08-17
Publication date: 2023-11-17
Anticipated expiration: 2043-08-17
Also published as: CN116790577A

Abstract

本发明涉及一种RNA保存液及其应用，所述RNA保存液包括蛋白变性剂、螯合剂、还原剂和pH缓冲液，所述保存液的pH为3.5‑5.0，所述蛋白变性剂用于抑制ＲNA酶活性，所述蛋白变性剂包括异硫氰酸胍和氯化锂（LiCl）。相对于已知的RNA保存液，本发明的保存液在不同温度，保存较长时间之后均可以稳定地稳定地扩增出RNA，并保持较高的Ct值。

Description

一种RNA保存液及其用途

技术领域

本发明属于医学生物检测领域，具体涉及一种RNA保存液及其用途。

背景技术

核糖核苷酸（ RNA) ，普遍存在于动物、植物、微生物及某些病毒和噬菌体内，是遗传信息的载体。尽管高质量的 RNA 可通过立即从新鲜外周血或其他组织样本中抽提得到，但在实际检查中，外周血样本多不具备立即抽提的条件。因此，如何保存样本从而获得高质量的 RNA 至关重要。目前常用的RNA 抽提前血样保存的方法主要有低温冻存、PAX-gene全血RNA管保存、样本中添加RNA保存液。

低温冻存是目前较为普遍的一种血样处理方法，使用乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝管采集并储存外周血，过程简便、无须额外处理且可避免外源性因素的影响，但外周血中RNA 容易受内源性因素，如大量存在的核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）的影响，在收集和储存过程中RNA易发生降解。

使用 PAXgene全血RNA管保存能够显著提高从血样中分离出的RNA 质量，但PAXgene全血RNA管过于昂贵，样本的收集成本过高。

样本采集后如果无法立即进行提取，可以保存在RNA保存液中，RNA保存液中主要成分是蛋白变性剂，通过抑制RNase的活性防止RNA降解。但现有的保存液效果不稳定，当样本需要运输，反复冻融，保存时间较长，温度的变化可能会影响样本中RNA的检测。

发明内容

为了克服上述缺陷，提供一种低成本，并能在不同保存时长、不同温度变化时保持样本中RNA稳定的RNA保存液，具体的，

本发明第一方面，提供一种RNA保存液，所述保存液包括蛋白变性剂、螯合剂、还原剂和pH缓冲液，所述保存液的pH为3.5-5.0，所述蛋白变性剂用于抑制ＲNA 酶活性，所述蛋白变性剂包括异硫氰酸胍和氯化锂（LiCl）。

优选的，所述pH为3.8-5.0，可以是上述范围的任一值，例如4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、4.0、3.9、3.8。

优选的，所述异硫氰酸胍：LiCl的摩尔质量比为1：（1-2），具体比例可以是1:1.5。

更进一步优选的，所述蛋白变性剂还包括氧钒核糖核苷复合物。

优选的，所述蛋白变性剂的终浓度为1-10M。可以是上述范围的任一值，或者任一范围，例如1.0、1.5、1.8、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.2、5.5、5.8、6.0、6.3、6.6、6.8、7.0、7.2、7.5、7.8、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0M。

更优选的，所述蛋白变性剂包括1.5-3.0M的异硫氰酸胍和1.5-6.0M的LiCl。进一步优选的，所述蛋白变性剂包括1.5-3.0M的异硫氰酸胍、1.5-6.0M的LiCl和5-20mM的氧钒核糖核苷复合物。

在一个具体的实施方式中，所述蛋白变性剂包括2M的异硫氰酸胍和3M的LiCl。

在一个具体的实施方式中，所述蛋白变性剂包括2M的异硫氰酸胍、3M的LiCl和10mM的氧钒核糖核苷复合物。

优选的，所述螯合剂包括EDTA、乙二胺四乙酸二钾和/或乙二胺四乙酸三钾。更优选的，所述螯合剂包括EDTA。

优选的，所述螯合剂的终浓度为0.3-2.0mM，可以是上述范围的任一值，或者任一范围，例如0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0mM。

更优选的，所述螯合剂包括终浓度为0.7-1.5mM的EDTA，进一步优选的，所述螯合剂包括终浓度为1.0mM的EDTA。

优选的，所述还原剂包括三（2－羧乙基）膦、β－巯基乙醇和二硫苏糖醇中的一种或多种。

更优选的，所述还原剂包括β－巯基乙醇。

优选的，所述还原剂的终浓度为质量百分比0.5%-3%，更优选的，可以是上述范围的任一值，或者任一范围，例如0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8、2.0、2.5、3.0%。

进一步优选的，所述还原剂包括0.5%-2%的β－巯基乙醇，优选为0.8%-1.5%。

在一个具体的实施方式中，所述还原剂包括1%的β－巯基乙醇。

优选的，所述RNA保存液还包括表面活性剂。

更优选的，所述表面活性剂包括阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂或两性表面活性剂中的一种或多种，例如Tween20、SDS、Triton X-100、十二烷基硫酸锂等等。

优选的，所述表面活性剂的终浓度为质量百分比0.2%-5.0%，更优选的，可以是上述范围的任一值，或者任一范围，例如0.2、0.3、0.4、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8、2.0、2.5、3.0、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0%。

优选的，所述RNA保存液还包括盐离子，例如硫酸铵、焦磷酸钠等等。

更优选的，所述盐离子的终浓度为5-30mM，例如，2.5-15mM硫酸铵和2.5-15mM的焦磷酸钠。可以是上述范围的任一值，或者任一范围，例如2.5、3.0、3.5、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.2、5.5、5.8、6.0、6.3、6.6、6.8、7.0、7.2、7.5、7.8、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0mM。

优选的，所述RNA保存液还包括甘氨酸，所述甘氨酸终浓度为30-70mM，可以是上述范围的任一值，或者任一范围，例如30、35、40、45、50、55、60、65、70mM。

优选的，所述RNA保存液的pH缓冲液包括浓盐酸、Tris缓冲液、柠檬酸缓冲液、乙酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液和HEPES等，维持保存液的pH为3.5-5.0。

在一个具体的实施方式中，所述RNA保存液包括2M异硫氰酸胍，3M LiCl，1mMEDTA，10mM 硫酸铵，1%Tween20，10mM 焦磷酸钠，1% β－巯基乙醇，50mM 甘氨酸，缓冲液为浓盐酸，pH为4.8。或者，

所述RNA保存液包括2M异硫氰酸胍，3M LiCl，1mM EDTA，10mM 氧钒核糖核苷复合物，10mM 硫酸铵，1%Tween20，10mM 焦磷酸钠，1% β－巯基乙醇，50mM 甘氨酸，缓冲液为浓盐酸，pH为4.8。

上述百分浓度为质量百分比。

本发明第二方面，提供一种上述RNA保存液的制备方法，所述制备方法包括将RNA保存液的各种组分混合配置，其中用pH缓冲液调节pH，过滤获得RNA保存液。

RNA保存液的各种组分如上所定义。

本发明第三方面，提供一种包含RNA的样本的保存方法，所述保存方法包括利用上述任一的RNA保存液对样本进行保存。

优选的，所述样本来源于任一的样本，包括但不仅限于组织、细胞、体液、空气、土壤和/或物体表面等等。更优选的，所述体液来自唾液、血液、血清、组织液、尿液、精液、羊水、脊髓液、结膜液、阴道液、粪便或汗液等等。

进一步优选的，所述样本来自咽拭子采集样本、痰液样本、肺泡灌洗液样本、外周血样本、血浆样本、血清样本、淋巴结样本、胃肠组织样本、粪便样本或尿液样本等等。

优选的，所述的保存方法并不属于疾病的诊断和/或治疗方法。

本发明的有益效果：

1、采用本发明的RNA保存液可适用于不同的保存温度，例如4℃，室温，37℃，可以避免反复冻融导致的RNA损伤，有利于温度条件变化时的储存以及长途转运。

2、采用本发明的RNA保存液能稳定的保证样本中的RNA总量，保存时间长，至少可以达到7天，即便是在37℃下，保存7天后，扩增Ct值依然与4℃即时检测的Ct值相同。本保存液具有良好的稳定性。

附图说明

图1所示为使用全血RNA对PBGD进行浓度梯度的扩增曲线。

图2所示为Qiagen病毒试剂盒纯化后RT-qPCR的扩增曲线。

图3所示为三个温度（1 是4℃, 2是室温，3是37℃）保存24h后A液和B液的RT-qPCR扩增曲线。

图4所示为三个温度（1 是4℃, 2是室温，3 是37℃）保存3天后A液和B液的RT-qPCR扩增曲线。

图5所示为三个温度（1 是4℃, 2是室温， 3是37℃）保存7天后A液和B液的RT-qPCR扩增曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明所述技术方案做进一步的说明。可以理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，其并不作为对本发明的限制。若非特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。在不偏离于本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。本领域的技术人员将会意识到或能够确认，仅仅使用常规实验，许多等同物都能应用于本文所描述的特定步骤中。这些等同物被认为处在本发明的范围之内。

实施例中所涉及的仪器、试剂与耗材如下：

1．实验仪器：ABI 7500荧光定量PCR仪

2．实验试剂与耗材：

表1：实验试剂与耗材

表2：RNA保存液B液

配制后用浓盐酸调pH值至4.8，然后用0.22 μm滤膜进行过滤。

实施例1 RNA保存液在不同温度下的保存效果

使用Takara RNAiso Blood提取全血RNA，进行下列实验：

实验1：RNA浓度梯度确定

1-1：检测步骤

将全血RNA分三个10ng，1ng和0.1ng浓度梯度做RT-qPCR，选择人内参基因，按表3配制反应扩增体系，设计合成引物序列，引物见表4，反应条件见表5。

表3：扩增体系

表4：引物探针序列

表5：RT-qPCR反应条件

1-2 检测结果

因Ct值小于35即可判断为阳性，因此，观察哪个浓度的Ct值更接近30，结果表明：总量在10ng时，Ct值在28左右，1ng的全血RNA的Ct值在30左右，0.1ng的全血RNA的Ct值在32左右；可见0.1ng-10ng之间的Ct值在28-32之间，上述终浓度范围检测是可行的（参见图1，其中曲线从左至右分别为10ng、1ng、0.1ng（其中0.1ng重复两个批次），而NoRT-10ng组处于水平状态）。

实验2：RNA保存液保存即时检测

2-1 检测步骤：

将60ng的全血RNA分别混到140 μL A液（A组）, B液（B组）和10mM Tris（pH8.0）（C组）中。POS-CTR作为阳性对照（POS-CTR）。用Qiagen Viral RNA Mini Kit按照说明提取RNA，最后溶于50 μL DEPC水中，取5 μL（RNA大约1ng）做RT-qPCR，具体操作步骤同实验1的步骤。

2-2检测结果：

结果见图2，结果显示，经保存液（A，B，C）处理后即时进行检测，Ct值在30左右，三种保存液对于RNA的提取效率影响相同，Ct值较阳性对照（POS-CTR）稍有延后，但整体在可接受范围内（参见图2，其中曲线从左至右分别为保存液POS-CTR，A，B，C处理组，重复两个批次）。

实验3：RNA保存液保存不同温度和时长后检测

3-1 检测步骤：

将A液（A组）和B液（B组）各分为三份，每份体积约640 μL，混入320 ng的全血RNA（RNA浓度约为0.5 ng/μL）, 三份溶液分别保存于4℃，室温和37℃；同时做一个保存于10mMTrisHCl（pH8.0）（P组）并冻于-80℃的阳性对照；

在1天，3天，7天和一个月的时候从每管的液体中取出140 μL 用Qiagen ViralRNA Mini Kit按照说明提取RNA，最后每管均溶于50 μL DEPC水中；

RT-qPCR时取5 μL作为模板，做两个重复；使用PBGD靶标，探针为FAM标记，操作条件同实验1。

3-2 检测结果：

三种温度条件（1是4℃，2是室温，3是37℃，分别用A液和B液保存）下24h保存后的RT-qPCR结果显示，在4℃保存的A液（A1）的Ct值以后出现延后，在34左右，而B液（B1)和阳性对照（P）的Ct值基本相同，都在30左右（参见图3左上图，从左至右的三组曲线（两条为一组）分别为B1、P和A1）；室温和37℃条件下，24h后A液（室温和37℃不同温度分别标记为A2和A3）的扩增曲线已经没有起峰，而B液（不同温度分别标记为B2和B3）和阳性对照的Ct值基本相同，在30左右（分别参见图3右上图，从左至右的两组曲线（两条为一组）分别为B2、P；图3左下图，从左至右的两组曲线（两条为一组）分别为B3、P））；阴性对照（NTC）没有起峰（参见图3右下图）；以上结果说明在不同温度下，本发明的保存液可以稳定地保存RNA。

三天后，在4℃保存的A液还略有起峰，但Ct值比较靠后（38左右）；室温和37℃没有扩增（图4中右上角和左下角图中的水平线）；而B液和阳性对照在三个温度条件下的扩增Ct值依然相同，在30左右（见图4，标识同图3）；

七天后，A液在三个温度条件下保存的RNA提取后都没有扩增（图5的左上图、右上图和左下图中的水平线），B液和阳性对照在三个温度条件下的扩增Ct值依然相同，在30左右（见图5，标识同图3）。

以上结果说明，即便是在室温和37℃保存一周，利用本发明的保存液（B液）RNA保存效果要明显好于A液，可以防止RNA降解，稳定地扩增出RNA，并保持较高的Ct值，可以与阳性对照相同。

将B液中去除氧钒核糖核苷复合物后得到的保存液也可以获得和实验3中的B液基本相同的结果。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims

1.一种RNA保存液，其特征在于，所述RNA保存液包括2M异硫氰酸胍，3M LiCl，1mMEDTA，10mM 硫酸铵，1%Tween20，10mM 焦磷酸钠，1% β－巯基乙醇，50mM 甘氨酸，余量为DEPC水，配制后用缓冲液浓盐酸调pH值至4.8，或者所述RNA保存液包括2M异硫氰酸胍，3MLiCl，1mM EDTA，10mM 氧钒核糖核苷复合物，10mM 硫酸铵，1%Tween20，10mM 焦磷酸钠，1%β－巯基乙醇，50mM 甘氨酸，余量为DEPC水，配制后用缓冲液浓盐酸调pH值至4.8，所述百分浓度为质量百分比。

2.权利要求1所述的RNA保存液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将RNA保存液的各种组分混合配置，用pH缓冲液调节pH，过滤获得RNA保存液。

3.一种包含RNA的样本的保存方法，其特征在于，所述保存方法包括利用权利要求1所述的RNA保存液对样本进行保存。

4.根据权利要求3所述的保存方法，其特征在于，所述样本来源于包括组织、细胞、体液、空气、土壤和/或物体表面。