CN112626166A - 一种病毒样本rna保存液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种病毒样本RNA保存液及其制备方法，其中保存液包括以下组分：Tris‑HCl、乙二胺四乙酸/8‑羟基‑5‑喹啉磺酸、硫氰酸胍/十二烷基硫酸钠、曲拉通X‑100、柠檬酸钠；其中主要成分乙二胺四乙酸/8‑羟基‑5‑喹啉磺酸的浓度为1mM～10mM，硫氰酸胍/十二烷基硫酸钠的浓度为0.1M～2M/(m/v)，曲拉通X‑100的浓度为0.1％～2％(v/v)。采用本发明制备的病毒样本RNA保存液成本低廉的同时，能够有效避免室温下病毒样本RNA降解，保护病毒RNA长达一周。本发明保存液可应用于拭子、唾液样本中新型冠状病毒和其他病毒RNA的保存；采用本发明保存液的样本可适用于磁珠法提取实现RNA自动化提取，亦可适用于一步法专用PCR试剂盒直接进行病毒RNA扩增。
Description
技术领域
本发明涉及核酸技术领域，具体涉及一种病毒样本RNA保存液及其制备方法。
背景技术
目前，常用的病毒保存液主要成分为Hanks’平衡盐溶液、胎牛血清、抗生素，采样后需4℃保存且不能长时间保存，同时由于胎牛血清的加入有利于细菌及霉菌的生长，且增加外源蛋白和核酸的污染几率；钒核糖核苷复合物、RNA酶的蛋白抑制剂能够有效抑制剂RNA 酶减少病毒RNA降解，但价格昂贵。
因此，开发一种成本低廉、无蛋白源且能够在常温下长时间稳定保存病毒样本RNA的保存液，是保护RNA免受RNA酶降解、优化病毒样本采集的关键，也是为后续荧光定量或测序检测提供有质量保证核酸的关键，对病毒的核酸检测具有重要意义。
发明内容
为了解决上述技术问题，一方面，本发明公开的一种病毒样本 RNA保存液，包括以下组分Tris-HCl、乙二胺四乙酸/8-羟基-5-喹啉磺酸、硫氰酸胍/十二烷基硫酸钠、曲拉通X-100、柠檬酸钠。
作为本发明实施方式的进一步改进，各组分浓度范围：Tris-HCl 的浓度为10mM～100mM，乙二胺四乙酸/8-羟基-5-喹啉磺酸的浓度为 1mM～10mM，硫氰酸胍/十二烷基硫酸钠的浓度为0.1M～2M/(m/v)，曲拉通X-100的浓度为0.1％～2％(v/v)，柠檬酸钠的浓度为10mM～100mM。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述Tris-HCl，pH为7.5～8.5。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述螯合剂为乙二胺四乙酸 /8-羟基-5-喹啉磺酸为一种或两种。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述硫氰酸胍/十二烷基硫酸钠为一种或两种。
另一方面，本发明还公开了上述的病毒样本RNA保存液的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
S1、使用Tris制备pH缓冲溶液，用盐酸将pH调节至7.5～8.5；
S2、在乙二胺四乙酸或8-羟基-5-喹啉磺酸中加入氢氧化钠直至溶液变澄清；
S3、在硫氰酸胍/十二烷基硫酸钠中加入无核酸酶水搅拌使其溶解；
S4、在柠檬酸钠中加入无核酸酶水搅拌使其溶解；
S5、将S1-S4所制备得到的各溶液按比例混合并搅拌均匀，再加入曲拉通X-100，用无核酸酶水定容，使各组分达到权利要求1中各组分所述浓度，制备得到所述病毒样本RNA保存液。
本发明与现有病毒RNA保存液相比，其有益效果为：(1)通过优化病毒RNA保存液组分及其浓度范围，选用常见试剂配置，成本低廉，使用简单，保护效果好，有效避免病毒RNA降解；(2)样本无须冷藏运输，可常温保存病毒样本。
附图说明
图1为本发明具体例1提供的经本发明保存液与市场上竞品保存液在-20℃、室温保存一周的新冠假病毒样本荧光定量PCR扩增结果图；
图2为本发明具体例2提供的经本发明保存液在4℃、室温保存保存一周的新冠假病毒样本直接荧光定量PCR扩增结果图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均可从正规渠道商购获得。
下面结合附图详细说明本发明的优选实施方式。
为了达到本发明的目的，本发明提供一种病毒样本RNA保存液及其制备方法。
本发明提供的一种病毒样本RNA保存液，包括以下组分 Tris-HCl、乙二胺四乙酸/8-羟基-5-喹啉磺酸、硫氰酸胍/十二烷基硫酸钠、曲拉通X-100、柠檬酸钠。
所述病毒样本RNA保存液中，Tris-HCl的浓度为10mM～100mM，乙二胺四乙酸/8-羟基-5-喹啉磺酸的浓度为1mM～10mM，硫氰酸胍/ 十二烷基硫酸钠的浓度为0.1M～2M/(m/v)，曲拉通X-100的浓度为 0.1％～2％(v/v)，柠檬酸钠的浓度为10mM～100mM。
在上述技术方案的基础上，还可做如下改进：
在一些实施例中，在所述病毒样本RNA保存液中，所述Tris-HCl， pH为7.5～8.5，所述乙二胺四乙酸/8-羟基-5-喹啉磺酸为一种或两种，所述硫氰酸胍/十二烷基硫酸钠为一种或两种。
在一些实施例中，制备方法包括以下步骤：
Tris溶液的配置，使用浓盐酸调pH至7.5～8.5；乙二胺四乙酸或 8-羟基-5-喹啉磺酸的配置，加入氢氧化钠直至溶液变澄清；硫氰酸胍 /十二烷基硫酸钠溶液的配置，加入于无核酸酶水搅拌使其溶解；在柠檬酸钠中加入无核酸酶水搅拌使其溶解。
将所制备得到的各溶液按比例混合并搅拌均匀，再加入曲拉通 X-100，用无核酸酶水定容，使各组分达到权利要求1中各组分所述浓度，制备得到所述病毒样本RNA保存液。
具体例1
本发明的保存液能够有效保护病毒RNA，其在病毒样本RNA保存中的一种实施例，包括如下步骤：
1、样本准备
以新型冠状病毒N基因假病毒作为RNA病毒代表样本，加入本发明与竞品保存液稀释成105个/mL、104个/mL、103个/mL、102个/mL，作为待测样本备用。将上述样本放置于-20℃冰箱，室温(20-25℃)、湿度(50％-60％)环境中保存7d后将样本取出。
2、病毒RNA提取
分别取保存液样本(200μL)，按照BeaverBeadsTM Viral DNA/RNA Kit(海狸生物Cat.70406)病毒核酸提取试剂盒说明书的流程进行核酸提取，最终假病毒RNA纯化产物洗脱体积为20μL，产物可直接进行RT-PCR检测或者放置于-20℃保存待测。
3、样本的荧光定量PCR检测
样本的荧光定量PCR检测引物、探针参考中国疾病预防控制中心的发布新型冠状病毒核酸检测序列，PCR检测反应体系配置和程序设置参考PrimeDirect Probe RT-qPCRMix(TAKARA，RR650A)试剂盒。
4、2019-nCOV假病毒提取产物PCR检测结果如表1。
表1待测样本在-20℃、室温条件下保存一周的检测数据
实验结果，参见图1和表1所示，图1为样品提取产物荧光定量 PCR检测结果图，具体为经本发明保存液与市场上竞品保存液在 -20℃、室温保存一周的新冠假病毒样本荧光定量PCR扩增结果图片。
由表1和图1可以看出，本发明保存液常温与-20℃条件下保存待测样本相比较，病毒RNA没有发生显著降解，稳定性高；本发明保存液能够保存低浓度待测样本(102个/mL)，且表现出较好的稳定性，理论上本发明保存液可以达到10拷贝以下的稳定性和灵敏度；与市场主流竞品相比，没有显著差异，处于一致水平。
具体例2
本发明的保存液保存的RNA病毒样本无需进行核酸提取，可适配商业化的一步法专用PCR试剂盒直接进行病毒核酸扩增的一种实施例，包括如下步骤：
1、以新型冠状病毒N基因假病毒作为RNA病毒代表样本，加入本发明保存液稀释成105个/mL、103个/mL，作为待测样本备用。将上述样本放置于4℃冰箱，室温(20-25℃)、湿度(50％-60％)环境中保存，分别在2d、3d、4d、7d后将样本取出。
2、样本的荧光定量PCR检测
使用PrimeDirectTM Probe RT-qPCR Mix(Takara，RR650A)试剂盒进行荧光定量PCR检测，反应体系配置、具体仪器及其他设置参考实施例1。按表2设置荧光定量PCR检测反应程序。
表2 2019-nCOV假病毒荧光定量PCR检测反应程序
3、2019-nCOV假病毒样本直接荧光定量PCR检测结果如表3、图2；图2为本发明具体例2提供的经本发明保存液在4℃、室温保存保存一周的新冠假病毒样本直接荧光定量PCR扩增结果图片。
表3假病毒样本在4℃、室温条件下保存一周内的检测数据
实验结果，参见图2和表3所示，图2为样本直接荧光定量PCR 检测结果图，由表3和图2可以看出，本发明保存液保存待测RNA 假病毒样本能够直接进行荧光定量PCR检测，数据稳定。
本发明提供的一种病毒样本RNA保存液及其制备方法，产生如下的有益效果：
1)本发明通过优化试剂配方和配比，选用常见试剂配置，成本低廉，使用简单，保护效果好提高后续检测的灵敏度及样本检出率。
2)本发明保存液，室温下能够有效避免RNA病毒降解，可常温保存病毒样本，样本无须冷藏运输。
3)本发明保存液，样本适用于磁珠法提取，利于实现RNA自动化提取，提高单位时间样品提取通量。
4)本发明保存液保存的RNA病毒样本无需进行核酸提取，可适配商业化的一步法专用PCR试剂盒直接进行病毒样本RNA扩增，减少检测试剂成本和检测时间。
以上的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种病毒样本RNA保存液，其特征在于包括以下组分Tris-HCl、乙二胺四乙酸/8-羟基-5-喹啉磺酸、硫氰酸胍/十二烷基硫酸钠、曲拉通X-100、柠檬酸钠。
2.根据权利要求1所述的病毒样本RNA保存液，其特征在于，主要成分包括乙二胺四乙酸/8-羟基-5-喹啉磺酸、硫氰酸胍/十二烷基硫酸钠、曲拉通X-100。
3.根据权利要求1所述的病毒样本RNA保存液，其特征在于，各组分浓度范围：Tris-HCl的浓度为10mM～100mM，乙二胺四乙酸/8-羟基-5-喹啉磺酸的浓度为1mM～10mM，硫氰酸胍/十二烷基硫酸钠的浓度为0.1M～2M/(m/v)，曲拉通X-100的浓度为0.1％～2％(v/v)，柠檬酸钠的浓度为10mM～100mM。
4.根据权利要求1所述的病毒样本RNA保存液，其特征在于，所述Tris-HCl，pH为7.5～8.5。
5.根据权利要求1所述的病毒样本RNA保存液，其特征在于，所述乙二胺四乙酸/8-羟基-5-喹啉磺酸为一种或两种。
6.根据权利要求1所述的病毒样本RNA保存液，其特征在于，所述硫氰酸胍/十二烷基硫酸钠为一种或两种。
7.一种权利要求1-6任意一项所述的病毒样本RNA保存液的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
S1、使用Tris制备pH缓冲溶液，用盐酸将pH调节至7.5～8.5；
S2、在乙二胺四乙酸或8-羟基-5-喹啉磺酸中加入氢氧化钠直至溶液变澄清；
S3、在硫氰酸胍/十二烷基硫酸钠中加入无核酸酶水搅拌使其溶解；
S4、在柠檬酸钠中加入无核酸酶水搅拌使其溶解；
S5、将S1-S4所制备得到的各溶液按比例混合并搅拌均匀，再加入曲拉通X-100，用无核酸酶水定容，使各组分达到权利要求1中各组分所述浓度，制备得到所述病毒样本RNA保存液。
8.根据权利要求7所述的病毒样本RNA保存液的制备方法，其特征在于，所述的病毒样本RNA保存液用于拭子、唾液样本中新型冠状病毒和其他病毒RNA的保存；可适用于磁珠法提取实现RNA自动化提取，一步法专用PCR试剂盒(TAKARA，RR650A)直接进行病毒RNA扩增。
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2020
- 2020-12-02 CN CN202011391579.0A patent/CN112626166A/zh active Pending
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