CN111979227A - 一种rna保存液及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及体外诊断领域，特别涉及一种RNA保存液及其制备方法和应用。该RNA保存液包括如下组分：Tris‑HCl、EDTA‑Na2、蛋白酶K、NP‑40、甘油、Carrier RNA及DEPC水。本发明的RNA保存液洗脱后可以使RNA在室温保存1个月、在2‑8℃保存6个月，解决了RNA提取后保存不稳定的问题；而且本发明中使用的成分均无毒无害，具有安全性，制造成本低廉。

Description

一种RNA保存液及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及体外诊断领域，特别涉及一种RNA保存液及其制备方法和应用。

背景技术

核糖核酸(Ribonucleic acid，RNA)存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。由至少几十个核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的一类核酸，因含核糖而得名。每个RNA分子都由核苷酸单元长链组成，每个核苷酸单元含有一个含氮碱基、一个核糖和一个磷酸基。含RNA的生物样品一旦从体内采集分离，它的RNA会变得非常不稳定，极易被降解。且RNA是单链结构，在提取过程或保存过程中都极易发生降解。因此，RNA的提取和保存过程需要进行严格的处理，防止RNA发生特异或非特异的降解。

RNA为细胞的主要成分之一，参与细胞的各种功能活动，是生物学、医学和药学等生命有关学科的重要研究对象，RNA检测更是分子生物学研究的一个重要技术，包括生物芯片、基因表达矩阵分析(Array Analysis)和定量RT-PCR检测等。大多数情况下，由于各种各样的原因，RNA从生物样本中提取出来后并不能立刻得到检测，而需进行保存，以便后续的研究使用。因此，RNA保存过程中的质量和完整性会显著影响检测结果的准确性和可靠性。

在生物样品中广泛存在并极度稳定的RNase对RNA的水解作用很强，许多RNase对RNA的降解作用不需任何辅助因子，给RNA的纯化、储存和使用带来极大困难。因此，一种能够有效防止RNA降解，不影响后续检测结果的RNA保存液，对RNA的分子生物学检测非常重要，也是目前RNA保存迫切需要解决的技术难题。

申请公布号CN111172239A的发明专利公开了一种病毒样本保存液，包括硫氰酸胍、吐温-20、聚多卡醇、乙醇、柠檬酸三钠、柠檬酸和二硫苏糖醇。但该保存液仅保证RNA在室温下保存24小时内不降解。

申请公布号CN 110616218 A的发明专利公开了一种血液RNA保存液，由如下组分组成：异硫氰酸胍、KCl、EDTA、Tween 20、8-羟基喹啉、巯基乙醇和水。该血液RNA保存液可以使血液中RNA在4℃保存至少一周不降解，-20℃保存至少4周不发生降解。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种RNA保存液及其制备方法和应用。该RNA保存液可以使RNA在室温保存1个月、在2-8℃保存6个月，解决了RNA提取后保存不稳定的问题。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种RNA保存液，RNA保存液包括如下组分：

Tris-HCl、EDTA-Na2、蛋白酶K、NP-40、甘油、Carrier RNA及DEPC水。

作为优选，RNA保存液中各组分浓度为：

优选地，RNA保存液中各组分浓度为：

更优选地，RNA保存液中各组分浓度为：

作为优选，RNA保存液的pH值为6.6～7.6。

优选地，RNA保存液的pH值为7.2。

本发明还提供了该RNA保存液的制备方法，将Tris-HCl、EDTA-Na2、蛋白酶K、NP-40、甘油、Carrier RNA和DEPC水混合，调节pH值。

本发明还提供了该RNA保存液作为磁珠法提取RNA的洗脱液的应用，或者作为提取RNA后的RNA稀释液的应用。也可以直接加入扩增反应液内进行下一步实验。

在本发明中，RNA为mRNA、miRNA、snRNA、scRNA中的一种或几种。

本发明还提供了一种RNA的保存方法，将RNA溶于上述RNA保存液，置于-80～30℃下保存。

作为优选，保存温度为-20～8℃。

本发明提供了一种RNA保存液及其制备方法和应用。该RNA保存液包括如下组分：Tris-HCl、EDTA-Na2、蛋白酶K、NP-40、甘油、Carrier RNA及DEPC水。本发明具有的技术效果为：

本发明的RNA保存液洗脱后可以使RNA在室温保存1个月、在2-8℃保存6个月，解决了RNA提取后保存不稳定的问题；

而且本发明中使用的成分均无毒无害，具有安全性，制造成本低廉。

具体实施方式

本发明公开了一种RNA保存液及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

术语解释：

Tris-HCl：中文别名为三(羟甲基)氨基甲烷、氨丁三醇、缓血酸铵、三羟甲基氨基甲烷、Tris，英文名称为Tris(hydroxymethyl)aminomethane；

EDTA-Na2：中文别名为乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸二钠盐、依地酸二钠、EDTA二钠，英文名为Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt；

NP-40：NonidetP 40的缩写，中文译为乙基苯基聚乙二醇；

Carrier RNA：是片段在200-3000nt之间的RNA混合物，溶解于RNA保护剂中，浓度为6μg/μL。在柱纯化微量核酸的过程中，比如病毒RNA纯化、病毒DNA纯化及微量DNA提取等，微量的核酸在纯化柱上的结合和洗脱效率降低，导致不能回收到足够的PCR模板，最终导致检测失败。在柱纯化核酸纯化体系中添加Carrier RNA，可提高10倍以上微量核酸的回收效率，同时由于CarrierRNA的存在，还可特别保护微量的RNA模板，减少RNA酶对微量RNA模板的攻击机率；

DEPC水：是用DEPC(diethylpyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的超纯水(一级水)，无色液体。经检测不含杂质RNA、DNA和蛋白质。

本发明提供的RNA保存液及其制备方法和应用中所用试剂或仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1本发明保存液的配制

根据需要确定配制体积，按标准配方计算出各种原料的用量。在容器中加入所需量的各组分，其中Tris-HCl缓冲液浓度为10mM、EDTA-Na2终浓度为0.1mM、蛋白酶K浓度为10μg/mL、NP-40浓度为0.01％、甘油浓度为5％、CarrierRNA浓度为2μg/mL，加DEPC水至终体积的80％，使其充分混匀；测pH值，调整pH至7.2；使用DEPC水定容至所需体积。配制完毕，放置于室温保存。

实施例2本发明保存液的保存效果

使用磁珠法提取血清中HCV病毒RNA，在最后一步对RNA进行洗脱时使用本保存液；洗脱后的RNA混匀后分装每支60μL用于测试。分别置于室温和2-8℃，室温检测0/7/14/28天时的Ct值，每次3个复孔。2-8℃检测0、1/2/3/6月时的Ct值。检测结果如下：

表1 RNA保存稳定性检测

结论：从表1可以看出，本发明的RNA保存液可以使RNA在室温保存28天，在2-8℃保存6个月。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种RNA保存液，其特征在于，所述RNA保存液包括如下组分：

Tris-HCl、EDTA-Na2、蛋白酶K、NP-40、甘油、Carrier RNA及DEPC水。

2.根据权利要求1所述的RNA保存液，其特征在于，所述RNA保存液中各组分浓度为：

3.根据权利要求1所述的RNA保存液，其特征在于，所述RNA保存液中各组分浓度为：

4.根据权利要求1所述的RNA保存液，其特征在于，所述RNA保存液中各组分浓度为：

5.根据权利要求1至4中任一项所述的RNA保存液，其特征在于，所述RNA保存液的pH值为6.6～7.6。

6.根据权利要求5所述的RNA保存液，其特征在于，所述RNA保存液的pH值为7.2。

7.权利要求1至6中任一项所述RNA保存液的制备方法，其特征在于，将Tris-HCl、EDTA-Na2、蛋白酶K、NP-40、甘油、Carrier RNA和DEPC水混合，调节pH值。

8.权利要求1至6中任一项所述RNA保存液作为磁珠法提取RNA的洗脱液的应用，或者作为提取RNA后的RNA稀释液的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述RNA为mRNA、miRNA、snRNA、scRNA中的一种或几种。

10.一种RNA的保存方法，其特征在于，将RNA溶于权利要求1至6中任一项所述RNA保存液，置于-80～30℃下保存。