CN116606867B - 一种提高新冠全长S蛋白mRNA完整性的制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种提高新冠全长S蛋白mRNA完整性的制备方法及用途。该方法包括：(1)制备质粒线性化模板；(2)配制转录体系，进行体外转录；(3)体外转录后的产物经过滤后进行Oligo dT层析纯化；(4)将纯化后的产物进行浓缩，并使用缓冲液进行换液。本发明的方法解决了mRNA本身稳定性差，体外转录制备过程中易降解，从而导致完整性降低的问题，所制备的新冠全长S蛋白mRNA具有显著提高的完整性，同时对产量无任何影响，本发明的制备方法以及转录体系在mRNA疫苗生产中具有广泛应用前景。

Description

一种提高新冠全长S蛋白mRNA完整性的制备方法及用途

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体地涉及一种提高新冠全长S蛋白mRNA完整性的制备方法及用途。

背景技术

mRNA疫苗在Covid-19大流行期间成为人们关注的焦点，是许多公司用于开发疫苗的最前沿技术。在1990年首次发现，将编码的mRNA注射到小鼠骨骼肌中后观察到蛋白质的表达。这些早期实验证明，体外转录的mRNA可以诱导活组织中蛋白质的产生。

mRNA技术具有几个优点，使其成为传统型疫苗甚至DNA疫苗的升级替代品。与减毒或灭活疫苗不同，mRNA只表达特定的目的抗原并诱导有效的免疫反应。因为表达不需要进入核内，没有随机基因组整合的风险，所以与DNA疫苗相比，mRNA疫苗更安全。mRNA疫苗平台的灵活性有利于大规模制造，同时也利于生产的标准化。此外，由于mRNA的生产基于体外无细胞转录反应，因此可以最大限度避免其他平台中常见的细胞源性杂质和病毒成分等安全性问题。

近几年，作为疫情以来的热门技术，mRNA备受各大药企关注，越来越多的制药公司开始布局mRNA平台的研发，行业进入到加速发展期。截至目前，已经有两款mRNA疫苗产品上市。随着美国药典(USP)发布的“Analytical Procedures for mRNA Vaccine Quality”指南草案、国家药监局药审中心发布的《新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则(试行)》等5个指导原则，都彰显了监管机构对于mRNA技术的重视，同时也更加规范了mRNA技术行业。

在mRNA疫苗的研发及生产过程中，涉及对mRNA原料药特性、纯度、浓度、物理状态(包括外观、pH值、完整性等)和安全性等多方面的质量评估，其中对mRNA完整性的评估至关重要。

中国国家药品监督管理局药品审评中心发布的《新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则(试行)》中指出“应选用可充分鉴别产品相关杂质(截短mRNA、长RNA、双链RNA等)且具有足够灵敏度的检测方法对原液、制剂等不同阶段mRNA序列的完整性和纯度予以确认和控制，如毛细管电泳等。”；美国药典关于“Analytical Procedures for mRNAVaccine Quality”的指导草案中，也推荐使用毛细管凝胶电泳对mRNA完整性进行质控，其中推荐了Agilent System并详述了其实验方法。

考虑到mRNA的完整性会影响抗原蛋白的表达，需要开发一种可以有效提升新冠全长S蛋白mRNA完整性的制备方法。

发明内容

针对现有技术中存在的至少部分问题，如mRNA本身稳定性差的特性，体外转录制备过程中易降解，导致完整性降低，尤其对于长片段的mRNA更为显著的问题，本发明提供一种提高新冠全长S蛋白mRNA完整性的制备方法及用途。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种提高新冠全长S蛋白mRNA完整性的制备方法，其包括以下步骤：

(1)制备质粒线性化模板，其中，所述质粒包含来源于新冠全长S蛋白基因；

(2)配制转录体系，进行体外转录，其中所述转录体系包含聚合酶和转录缓冲液；

(3)将体外转录后的产物经过滤后进行Oligo dT层析纯化；

(4)将纯化后的产物进行浓缩，并使用缓冲液进行换液。

在某些实施方案中，根据本发明所述的提高新冠全长S蛋白mRNA完整性的制备方法，其中，所述聚合酶为T7 RNA聚合酶，所述转录缓冲液为包含镁离子盐的缓冲液。

在某些实施方案中，根据本发明所述的提高新冠全长S蛋白mRNA完整性的制备方法，其中，所述镁离子盐为氯化镁或醋酸镁。

在某些实施方案中，根据本发明所述的提高新冠全长S蛋白mRNA完整性的制备方法，其中，所述包含镁离子盐的缓冲液的浓度为15-40mM。

在某些实施方案中，根据本发明所述的提高新冠全长S蛋白mRNA完整性的制备方法，其中，进行体外转录的温度为35-75℃。

在某些实施方案中，根据本发明所述的提高新冠全长S蛋白mRNA完整性的制备方法，其中，步骤(4)的缓冲液为柠檬酸钠溶液。

本发明的第二方面，提供一种具有提高的完整性的新冠全长S蛋白mRNA，其通过第一方面所述的方法制备得到。

本发明的第三方面，提供一种用于提高新冠全长S蛋白mRNA完整性的转录反应液，其包含T7 RNA聚合酶和转录缓冲液，其中所述转录缓冲液为包含镁离子盐的缓冲液。

本发明的第四方面，提供一种用于新冠全长S蛋白mRNA制备的试剂盒，其包含根据第三方面所述的转录反应液。

本发明的第五方面，提供本发明所述的新冠全长S蛋白mRNA在制备mRNA疫苗中的用途。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用途，其中，所述药物为疫苗。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用途，其中，所述疫苗为mRNA疫苗。

本发明的优异技术效果包括但不限于：

对于易降解、完整性比例低的长片段mRNA(如新冠S蛋白全长mRNA)的制备，本发明通过在转录buffer中添加特定浓度的醋酸镁盐型，同时采用Oligo dT亲和层析对转录后的mRNA进行纯化，获得的终产品完整性比例高，三批次mRNA产品的完整性数据均高于Biontech同类产品完整性比例(55％-78％)中的最高值(78％)。此外，本发明通过对长片段mRNA完整性比例的提升优化，使得长片段mRNA的该项指标更能符合法规监管的要求，同时也能最大程度上保证mRNA表达效能的发挥。

附图说明

图1示出了新冠S蛋白全长mRNA在不同温度(65℃、70℃、75℃)及孵育时间(10-60min)条件下的稳定性。

图2为不同的镁离子盐型及不同浓度对于新冠S蛋白全长mRNA产量影响统计图。

图3为不同的镁离子盐型及不同浓度对于新冠S蛋白全长mRNA完整性影响统计图。

图4基于Oligo dT纯化的mRNA制备工艺流程图。

图5-7基于Oligo dT纯化制备的三批次新冠S蛋白全长mRNA完整性图谱。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

本发明所述的“S蛋白”为组成新型冠状病毒SARS-CoV-2的结构蛋白，名称为刺突蛋白。

制备方法

本发明的一个方面，提供一种新冠全长S蛋白mRNA的制备方法，该制备方法能够大大提高新冠全长S蛋白mRNA的完整性，其包括：(1)制备质粒线性化模板；(2)配制转录体系，进行体外转录；(3)将体外转录后的产物经过滤后进行Oligo dT层析纯化；(4)使用换液缓冲液进行膜包换液。下面进行详细说明。

在本发明的步骤(1)中，首先制备质粒线性化模板，在制备质粒线性化模板之前可选的包括目的基因(新冠全长S蛋白基因)的扩增、扩增产物与载体连接、重组质粒纯化等步骤，本领域熟知如何进行新型冠状病毒RNA的逆转录、全长cDNA的扩增等操作，虽然本发明未示出具体序列以及扩增引物等序列，但是本领域技术根据公开的基因数据库和新型冠状病毒基因序列能够进行相应的核酸序列设计并进行合成。这样的技术在许多出版物，例如《分子克隆实验指南(第四版)》(冷泉港实验室科学出版社)中进行了描述。

本发明的步骤(1)中，制备质粒线性化模板包括：

a.配制线性化模板酶切体系；

b.在适于酶切的条件下进行酶切，得到线性化模板；

c.使用醇溶液沉淀线性化模板，洗涤后复融备用。

在步骤a中，用于线性化模板酶切体系是本领域已知的，对此不特别限定，包括合适的限制性内切酶和缓冲液，对此不特别限定。本发明的质粒包含来源于新冠全长S蛋白的基因，可选地包括重组质粒的其他元件，例如启动子、5’UTR、3’UTR和polyA尾等基础质粒模板。在步骤b中，适于酶切的条件是指35-40℃，优选37℃下孵育1-6h，优选孵育4h。在步骤c中，适用于沉淀线性化模板的醇溶液包括但不限于乙醇或异丙醇，优选使用0.7倍体积的异丙醇沉淀。沉淀完成后可以使用70％的乙醇洗涤所述沉淀，并用无核酸酶水复溶。

本发明的步骤(2)中，配制转录体系，进行体外转录，其中所述转录体系包含聚合酶和转录缓冲液。在一个优选的实施方案中，聚合酶为T7 RNA聚合酶。除了聚合酶外，本发明的转录体系进一步包括RNA酶抑制剂和焦磷酸酶，RNA酶存在于真核、原核生物的所有细胞和组织中，通常有极强活性，RNA样本中微量的RNA酶污染足以导致其完全降解。通过RNA酶抑制剂保证mRNA制备过程不受RNA酶的影响。

本发明通过研究发现，特定的转录缓冲液能够显著提升所制备的mRNA的完整性。优选地，转录缓冲液为包含镁离子盐的缓冲液。在某些实施方案中，转录缓冲液为氯化镁缓冲液。在了另外的实施方案中，转录缓冲液为醋酸镁缓冲液。此外，本发明进一步对转录缓冲液的浓度进行了优化，发现浓度在15-40mM之间的转录缓冲液能够提升所制备的mRNA的完整性。优选地，转录缓冲液的浓度为18-30mM。进一步优选地，转录缓冲液的浓度为20-28mM，例如20、21、22、23、24、25、26、27、28mM。

本发明的步骤(2)中，进行体外转录的温度为35-75℃。本发明对新冠S蛋白全长mRNA在不同温度及孵育时间条件下的稳定性进行研究发现，在65℃条件下较稳定，1h以内未见明显的降解；70℃条件下孵育10min完整性尚可，20min及以上降解严重；75℃条件下整体降解严重。在一个优选的实施方案中，进行体外转录的温度为35-40℃。进行体外转录的时间为1-6h，优选为1-3h。

本发明的步骤(3)为体外转录后的产物经过滤后进行Oligo dT层析纯化的步骤。本发明采用囊式滤器进行过滤，囊式滤器优选为0.8μm/0.45μm的囊式滤器，从而便于后续的Oligo dT层析纯化。

本发明中，Oligo dT层析纯化可以采用本领域已知的层析装置，层析柱可以采用本领域已知的Oligo dT亲和层析填料，例如Oligo dT纤维素等，对此不特别限定。层析纯化的方法是本领域已知的，包括使用平衡缓冲液以及清洗缓冲液的步骤。其中平衡缓冲液包含20-80mM，优选40-60mM的Tris-HCl；1-4mM，优选1-3mM的EDTA；0.1-1mM，优选0.4-0.6mM的NaCl。清洗缓冲液包含20-80mM，优选40-60mM的Tris-HCl；1-4mM，优选1-3mM的EDTA；0.05-0.2mM，优选0.08-0.1mM的NaCl。

本发明的步骤(4)为将纯化后的产物进行浓缩，并使用缓冲液进行换液。浓缩优选使用超滤膜包对上清液进行浓缩，还优选使用50-300KD，进一步优选100KD的超滤膜包。进行膜包换液的缓冲液为柠檬酸钠溶液，其浓度为0.1-2mM，优选0.5-1.5mM，还优选为0.8-1.2mM。在某些实施方案中，柠檬酸钠溶液的pH为6.0-6.8，优选为6.2-6.6。

本领域技术人员应理解，只要能够实现本发明的目的，在上述步骤(1)-(4)前后，或步骤之间还可包含其他步骤或操作，例如进一步优化和/或改善本发明所述的方法。在某些实施方案中，本发明的制备方法进一步包括使用过滤器进行除菌过滤的步骤。

本发明还提供一种具有提高的完整性的新冠全长S蛋白mRNA，其通过本发明的制备方法得到。

用于提高新冠全长S蛋白mRNA完整性的转录反应液

本发明的另一方面，提供一种转录反应液，其能够提高mRNA的完整性，特别是提高新冠全长S蛋白mRNA完整性，同时对于mRNA的产量无明显影响。mRNA的长度不特别限定，但优选长片段的mRNA。本发明发现，相较于短片段mRNA，本发明的转录反应液均能够提高提高新冠全长S蛋白长片段mRNA完整性。优选地，mRNA的长度为1500-4500nt。还优选地，mRNA的长度为2000-4500nt。进一步优选地，mRNA的长度为3500-4500nt，例如3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500nt。

本发明的转录反应液包括转录缓冲液和酶制剂，其中，转录缓冲液优选为包含镁离子盐的缓冲液。还优选地，转录缓冲液为氯化镁缓冲液。进一步优选地，转录缓冲液为醋酸镁缓冲液。此外，转录缓冲液的浓度在15-40mM之间能够提升所制备的mRNA的完整性。优选地，转录缓冲液的浓度为18-30mM。进一步优选地，转录缓冲液的浓度为20-28mM，例如20、21、22、23、24、25、26、27、28mM。

可用于本发明转录反应液的酶制剂的实例包括但不限于T7 RNA聚合酶、RNA酶抑制剂和焦磷酸酶。

试剂盒

本发明的另一方面，提供一种用于制备mRNA，特别是新冠全长S蛋白mRNA制备的试剂盒，所述试剂盒包括：转录缓冲液和酶制剂。

在本发明的试剂盒中，转录缓冲液优选为包含镁离子盐的缓冲液。还优选地，转录缓冲液为氯化镁缓冲液。进一步优选地，转录缓冲液为醋酸镁缓冲液。此外，转录缓冲液的浓度在15-40mM之间能够提升所制备的mRNA的完整性。优选地，转录缓冲液的浓度为18-30mM。进一步优选地，转录缓冲液的浓度为20-28mM，例如20、21、22、23、24、25、26、27、28mM。

可用于本发明的试剂盒的酶制剂实例包括但不限于T7 RNA聚合酶、RNA酶抑制剂和焦磷酸酶。

除了上述组分之外，本发明的试剂盒还可包括以政府机构规定的形式与调控制造、使用或销售试剂盒相关的注意事项。另外，本发明的试剂盒还可提供有使用、储存和故障排除的详细说明书。试剂盒还可任选地设置在适合的优选用于以高通量设置的机器人操作的装置中。

在某些实施方案中，本发明的试剂盒的组分(例如转录酶)可设置于容器中。容器通常会包括至少一种小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器和/或其它容器手段，其中可选等分地放置溶剂。试剂盒还可包括用于包含无菌、药学上可接受的缓冲液和/或其它溶剂的第二容器的手段。

在某些实施方案中，本发明的试剂盒的组分可以溶液形式提供，例如水溶液的形式提供。在以水溶液状态存在的情况下，这些成分的浓度或含量是本领域技术人员能够根据不同需求而方便地确定的。例如，用于储存的目的时，例如转录酶的浓度可以较高的形式存在，当处于工作状态或使用时，可通过例如稀释上述较高浓度的溶液来将浓度降低至工作浓度。

在试剂盒中存在超过一种组分的情况下，该试剂盒还通常会包含可单独放置另外的组分的第二、第三或其它另外的容器。另外，可在容器中包含多种组分的组合。本文所述的任何组合或试剂可为试剂盒中的组分。

用途

本发明进一步提供具有提高的完整性的新冠全长S蛋白mRNA在制备用于预防和/或治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的药物中的用途，优选地，所述药物为疫苗，还优选为mRNA疫苗。本领域技术人员将理解的是，mRNA疫苗可以是全长mRNA疫苗，例如包含编码完整抗原蛋白的mRNA。mRNA疫苗也可以是包含mRNA片段的疫苗，例如包含编码抗原蛋白一部分的mRNA。mRNA疫苗也可以是针对新型冠状病毒的刺突蛋白(S蛋白)进行设计的mRNA疫苗，对此不特别限定。

实施例1

常见的引起mRNA降解的原因包括：RNA酶、物理因素-温度、化学因素-转录体系。鉴于mRNA本身稳定性差的特性，体外转录制备过程中易降解，导致完整性降低，尤其对于长片段的mRNA更为显著，本发明测试了两种不同长度的mRNA，片段长度分别为1800nt和4000nt。在同样的制备条件下，检测结果显示，短片段mRNA的完整性比例显著高于长片段mRNA的完整性比例(结果见表1)，多批次平均值分别为90.34％和68.79％；同时以BioNtech公司选择新冠全长S蛋白mRNA(BNT162b，长度约4000个碱基)为例，文献报道其完整性比例在55％-78％之间。

表1两种不同片段大小的mRNA完整性比例比较

本实施例从上述方面进行了深入研究，以提升mRNA制备过程中的完整性。

1、RNA酶

RNA酶存在于真核、原核生物的所有细胞和组织中，通常有极强活性，RNA样本中微量的RNA酶污染足以导致其完全降解。通过以下方式保证mRNA制备过程不受RNA酶的影响：(1)使用无RNA酶的溶液及试剂，如无RNA酶的一次性塑料器皿和带滤芯的吸头，mRNA生产用试剂需经过无RNA酶验证；(2)建立RNA工作专区，并仔细清洁表面；(3)移液器专用，不在RNA工作专区外使用；(4)转录体系中使用RNA酶抑制剂，以防止RNA酶的污染；(5)实验中佩戴手套和口罩。

2、物理因素-温度

本发明考察了新冠S蛋白全长mRNA在不同温度(65℃、70℃、75℃)及孵育时间(10-60min)条件下的稳定性。

由图1结果可以得出，新冠S蛋白全长mRNA在不同孵育温度及不同孵育时间条件下，表现出不同的稳定性/降解特性，如65℃条件下较稳定，1h以内未见明显的降解；70℃条件下孵育10min完整性尚可，20min及以上降解严重；75℃条件下整体降解严重。因此温度设定时应严格核对温度，严格避免高温情况的出现。

3、化学因素-转录体系

mRNA转录反应中，T7聚合酶的活性对于转录产量及mRNA质量有较大影响，本发明通过实验发现转录缓冲盐中的合适镁离子盐型及浓度，对于T7聚合酶最大活性的发挥至关重要，本发明测试了在mRNA转录体系中不同的镁离子盐型(氯化镁&醋酸镁)及不同浓度(16mM&24mM&32mM)对于新冠S蛋白全长mRNA产量及完整性的影响，试验设计见表2。

小试转录体系，经过氯化锂纯化后，测试转录产物的产量及完整性比例，结果汇总见表3，统计学分析见图2-3。

表2测试不同的镁离子盐型及不同浓度对于新冠S蛋白全长mRNA产量及完整性的影响

表3mRNA的完整性比例

以上结果得出：两种不同镁离子盐型的转录缓冲盐，对于mRNA的产量无明显影响，但24mM醋酸镁盐型条件下的转录产物，完整性比例明显高于其他条件下的转录产物，且具有统计学差异。提示合适的镁离子盐型和合适的浓度，在不影响转录产量的基础上，对转录产物的完整性有显著提升(完整性比例高于80％)。

4、通过基于Oligo dT纯化的mRNA制备方式，对mRNA完整性提升的结果进行验证。

基于Oligo dT纯化的mRNA制备工艺，制定的mRNA制备流程如图4所示。

4.1质粒线性化模板制备

在生物安全柜内配制线性化模板酶切体系，混匀后置于水浴锅中，37℃，孵育4h，反应完成后，加入0.7倍体积的异丙醇沉淀线性化模板，70％的乙醇洗涤沉淀后，用无核酸酶水复溶。

4.2体外转录

使用T7 RNA聚合酶、RNA酶抑制剂、焦磷酸酶和转录缓冲盐-5等其他试剂，对DNA线性化模板进行体外转录；配制体外转录体系，放入提前开启并设置为37℃恒温的水浴锅中，37℃，孵育3h。

4.3囊式滤器过滤

将体外转录后样品，用0.8μm/0.45μm囊氏滤器进行澄清过滤，便于后续的OligodT纯化。

4.4Oligo dT层析纯化

检查层析柱接口和零部件，A泵置于Buffer A(50mM Tris-HCl、2mM EDTA、0.5MNaCl)溶液中，B泵置于纯化水中。

安装层析柱后，用不少于10CV的纯化水清洗色谱柱。

层析柱清洗完成后，设置泵参数，用不少于10CV的Buffer A。

色谱柱平衡后，澄清过滤后样品中加入适量的4M NaCl溶液并混匀，至NaCl终浓度为0.5M。

将含有0.5M NaCl的澄清过滤后样品进行上样，用冲洗缓冲液Buffer B(50mMTris-HCl、2mM EDTA、0.1M NaCl)洗涤色谱柱。

最后用纯化水洗脱层析柱中结合的mRNA从UV260开始上升，且大于40mAU时开始收集，UV260达到最高值后开始回落，当下降过程中UV260小于100mAU时停止收集。

4.5膜包换液

用孔径100KD的超滤膜包，对澄清过滤后上清液进行浓缩。将超滤膜包连接到超滤系统，将Oligo dT纯化收集的样品浓缩至0.5±0.1mg/ml；使用1mM柠檬酸钠溶液(pH6.4)进行10倍体积换液。使用1mM柠檬酸钠溶液调整浓度，至mRNA终浓度为1±0.1mg/ml。

4.6mRNA除菌灌装及保存

使用0.22μm针头滤器对mRNA溶液进行除菌过滤，并将mRNA浓度调整在1.0±0.1mg/ml。

将mRNA按1ml/支分装到1.5ml联带旋盖螺口管中，分装完成后贴上标签。

置于-80℃冰箱中保存。

采取以上工艺流程，完成3批次新冠S蛋白全长mRNA的制备，三批次mRNA的完整性比例统计见表4，完整性比例图谱见图5-7。

表4基于Oligo dT纯化制备的三批次新冠S蛋白全长mRNA完整性比例检测结果

总的来说，采用优化过的转录缓冲盐-5新冠S蛋白全长mRNA进行转录，纯化采用基于Oligo dT的层析纯化方式，三批次制备的mRNA的完整性均高于80％，优于BioNtech相同产品的完整性指标。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

Claims (3)

1.一种提高新冠全长S蛋白mRNA完整性的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1) 制备质粒线性化模板，其中，所述质粒包含来源于新冠全长S蛋白基因；

(2) 配制转录体系，进行体外转录，其中所述转录体系包含T7 RNA聚合酶、RNA酶抑制剂、焦磷酸酶和转录缓冲液，所述转录缓冲液包含浓度为18-24 mM的醋酸镁缓冲液；

(3) 将体外转录后的产物经过滤后进行Oligo dT层析纯化；

(4) 将纯化后的产物进行浓缩，并使用缓冲液进行换液。

2.根据权利要求1所述的提高新冠全长S蛋白mRNA完整性的制备方法，其特征在于，进行体外转录的温度为35-75℃。

3.根据权利要求1所述的提高新冠全长S蛋白mRNA完整性的制备方法，其特征在于，步骤(4)所用的缓冲液为柠檬酸钠溶液。