CN111304175A

CN111304175A - 一种用于病毒核酸临床检测的病毒样品保存液及其使用方法

Info

Publication number: CN111304175A
Application number: CN202010094243.1A
Authority: CN
Inventors: 赵庆顺
Original assignee: Nanjing Ysy Biotech Co ltd
Current assignee: Nanjing Ysy Biotech Co ltd
Priority date: 2020-02-15
Filing date: 2020-02-15
Publication date: 2020-06-19

Abstract

本发明公开了一种可用于在包含高温灭活步骤的病毒核酸临床检测程序中的病毒样品保存液和试剂盒，以及其一种涉及使用所述样品保存液或试剂盒的病毒核酸临床检测方法。本发明的样品保存液、试剂盒以及临床检测方法，可以在利用高温灭活病毒的情况下，确保该病毒核酸的完整性和数量，从而能够有效地保证病毒核酸免受降解，显著提高临床检测程序中病毒核酸的检出准确率。

Description

一种用于病毒核酸临床检测的病毒样品保存液及其使用方法

技术领域

本发明公开了一种可用于在包含高温灭活步骤的冠状病毒核酸临床检测程序中的病毒样品保存液和试剂盒，以及其一种涉及使用所述病毒样品保存液或试剂盒的冠状病毒核酸的临床检测程序。

背景技术

新冠病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,或SARS-CoV-2)据信是目前病毒感染性肺炎(Corona Virus Disease 2019，或COVID-19)流行的罪魁祸首。是否携带新冠病毒成为判断是否感染的关键临床指标之一。包括两次新冠病毒核酸检测均为阴性也是COVID-19肺炎治愈的临床标准之一。然而，众多来源的消息显示，临床检测中新冠病毒核酸检出的假阴性率较高。假阴性意味着漏检，不仅会导致临床中对疑似患者不能迅速确诊，也会导致漏检的病毒携带者成为潜在的病毒传染源。因此，提高新冠病毒核酸检出率十分迫切。

目前的新冠病毒核酸检测主要采用的是荧光定量RT-PCR技术。PCR是一项非常灵敏的技术。理论上，哪怕模板只有1个拷贝(1个病毒)，就有可能被检测出来，在模板量大于100个拷贝的情况下，PCR扩增结果就会非常稳定。新冠病毒是一个单股正链RNA病毒。病毒基因的模板是从病人样品中通过核酸提取的办法获得的。北京协和医院依据国家卫健委颁发的《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南(第三版)》制作的核酸检测过程教学视频(网络版，视频3分08秒至3分40秒)显示：在准备模板前，需将采集到的样品在56℃条件下进行30分钟灭活。国家卫健委颁发的《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南(第四版)》也涉及灭活材料的操作：“感染性材料或活病毒在采用可靠的方法灭活后进行的核酸检测、抗原检测、血清学检测、生化分析等操作应当在生物安全二级实验室进行”。中华医学会检验医学分会发布的《新型冠状病毒肺炎病毒核酸检测专家共识》(中华医学杂志,2020,100(00):E003-E003.DOI:10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2020.0003)明确指出需将样品56℃孵育至少45分钟或更高温度进行灭活。这个过程的目的是灭活病毒。由于新型冠状病毒传染性强，主要的传播途径包括呼吸道飞沫传播、接触传播、气溶胶传播和粪口传播，为了保护临检人员的安全，导致将采集到的样品在56℃条件下进行30分钟灭活成为必不可少的步骤。

但是，本发明的发明人发现，先把样品放在56℃孵育30分钟来灭活病毒，会促进样品内的病毒核酸的降解，从而会导致样品中的新冠病毒核酸的数量不足，最终导致检测出现假阴性。如何在确保临检人员安全的情况下，同时显著提高样品中病毒核酸的检出正确率，避免假阴性的产生，是目前病毒核酸的临床检测程序中亟待解决的问题。

发明内容

本发明公开了一种可用于在包含高温灭活步骤的病毒核酸临床检测程序中的病毒样品保存液和试剂盒，以及一种涉及使用所述病毒样品保存液或试剂盒的病毒核酸的临床检测程序。

一方面，本发明提供了一种核酸降解抑制剂在制备用于保存病毒样品的病毒核酸临床检测产品中的用途，其中所述病毒核酸临床检测产品为病毒样品保存液或包含该病毒样品保存液的试剂盒。

进一步，所述病毒样品保存液应用于保存的病毒样品进行高温灭活处理的步骤；所述高温灭活条件优选为56℃以上。

所述核酸降解抑制剂选自弱蛋白变性剂、蛋白酶、和核酸酶结合蛋白中的一种或多种。

在一个具体实施例中，所述弱蛋白变性剂选自Triton X-100、Tween 20、NP-40和SDS中的一种或多种。

在一个具体实施例中，所述蛋白酶为蛋白酶K。

在一个具体实施例中，所述核酸降解抑制剂为南京诺唯赞病毒样品保存液R503。

在一个具体实施例中，所述病毒选自冠状病毒，优选为新型冠状病毒。

另一方面，本发明提供了一种用于在病毒核酸临床检测程序中的高温灭活步骤中保护病毒样品的病毒样品保存液，其包含有核酸降解抑制剂。

所述核酸降解抑制剂可以选自弱蛋白变性剂、蛋白酶、和核酸酶结合蛋白中的一种或多种。

在一个具体实施例中，所述蛋白酶为蛋白酶K。

又一方面，本发明提供了一种将上述包含有核酸降解抑制剂的病毒样品保存液应用于病毒核酸临床检测程序中的高温灭活步骤的应用。

在一个具体实施例中，所述蛋白酶为蛋白酶K。

再一方面，本发明还提供了一种病毒核酸的临床检测方法，其包含使用前述包含有核酸降解抑制剂的、专门用于在病毒核酸临床检测程序中保存病毒样品的病毒样品保存液的步骤，以及将保存有病毒样品的该病毒样品保存液进行高温灭活处理的步骤。

进一步，所述病毒核酸的临床检测方法还可以包括PCR扩增或检测步骤。

在一个具体实施例中，所述病毒为冠状病毒，优选为新型冠状病毒。

在一个具体实施例中，所述病毒样品取自咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物或呼吸道抽取物、深咳痰液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、血液样品、血清样品、粪便样品、眼结膜拭子样品。

本发明提供的病毒样品保存液、试剂盒以及临床检测程序，可以在病毒核酸检测程序中包含高温灭活处理病毒样品的步骤的情况下，有效地保证病毒核酸免受降解，确保病毒核酸的完整性和数量，从而显著提高临床检测程序中病毒核酸的检出准确率。

附图说明

图1是斑马鱼胚胎细胞总RNA质量电泳鉴定结果图。自左向右第1泳道为DNAMarker：从下向上依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp、3000bp、5000bp；其中第2～4泳道为56度加TriZol后提取的总RNA；第5～7泳道为4度加TriZol后提取的总RNA；第8～10泳道为56度加PBS后提取的总RNA。

图2是人细胞总RNA质量电泳鉴定结果图。自左向右第1泳道为DNA Marker：从下向上依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp、3000bp、5000bp；其中第2～3泳道为加RNA保存液1提取的总RNA，点样顺序为放置56度与放置4度；第4～5泳道和第6～7泳道为加RNA保存液2和加RNA保存液3提取的总RNA，点样顺序都与加RNA保存液1提取的总RNA一致。

图3是Hanks溶液作为保存液保存的样品经不同灭活处理后提取的核酸的琼脂糖凝胶电泳结果。

图4是Hanks溶液作为保存液保存的样品经不同灭活处理后提取的核糖核酸的紫外分光光度计检测结果。

图5是Hanks溶液作为保存液保存的样品经不同灭活处理后提取的RNA病毒核酸的荧光定量qRT-PCR的CT值结果。

图6是诺唯赞R503作为保存液保存的样品经不同灭活处理后提取的核酸的琼脂糖凝胶电泳。

图7是诺唯赞R503作为保存液保存的样品经不同灭活处理后提取的核糖核酸的紫外分光光度计检测结果。

图8是诺唯赞R503作为保存液保存的样品经不同灭活处理后提取的RNA病毒核酸的荧光定量qRT-PCR的CT值结果。

图9是Hanks溶液作为保存液保存的样品经不同灭活处理后提取的RNA病毒核酸的荧光定量qRT-PCR的典型荧光定量PCR扩增曲线图。

图10是Hanks溶液和诺唯赞R503作为保存液保存的样品在4℃保存条件后提取的RNA病毒核酸的荧光定量qRT-PCR的典型荧光定量PCR扩增曲线图。

图11是Hanks溶液和诺唯赞R503作为保存液保存的样品在经历56℃灭活处理30分钟后提取的RNA病毒核酸的荧光定量qRT-PCR的典型荧光定量PCR扩增曲线图。

图12是Hanks溶液和诺唯赞R503作为保存液保存的样品在经92℃灭活处理5分钟后提取的RNA病毒核酸荧光定量qRT-PCR的典型荧光定量PCR扩增曲线图。

图13是Hanks溶液和诺唯赞R503作为保存液保存的样品经不同灭活处理后提取的DNA病毒核酸的在不同条件下的荧光定量qRT-PCR的CT值结果。

具体实施方式

下面将通过具体描述，对本发明作进一步的说明。

除非另有限定，本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解相同的含义。

本发明中所使用的“高温灭活”步骤，是指将病毒样品置于高温中一定时间，从而导致病毒灭活。根据具体情况灵活调整病毒灭活的温度和时间，但通常不应低于50℃，优选为56℃以上；提高温度后可适当缩减灭活时间。灭活条件要保证样品中的病毒能在有效温度下有足够时间灭活。

本发明中所使用的“样品”指获自疑似患有冠状病毒或其他病毒性疾病的人或其它动物的病毒样品。其包括来自咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物或呼吸道抽取物、深咳痰液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、血液、血清、粪便、眼结膜拭子、尿液、脊髓液及组织。此外，包括例如用于感染实验等的细胞、及其培养液、或从获自人或其他动物的样品或培养细胞分离的病毒的样品也可用作样品。这样的样品可以经过比如分离、提取、浓缩或纯化这样的预处理。

本发明中所使用的“有效剂量”指能使得样品中病毒核酸的降解程度低于在75％、50％、25％、10％、5％或免于降解。

本发明中所使用的“核酸酶抑制剂”指通过抑制核酸酶活性(例如，DNase/RNase抑制分子)、通过造成DNase/RNase变性(例如蛋白变性剂，具体地如Triton X-100、Tween 20、SDS、NP-40)、通过蛋白的普遍降解(例如蛋白酶，具体地如蛋白酶K)、或通过结合核酸酶而保护DNAs/RNAs的核酸酶伴侣蛋白(例如RNA酶-结合蛋白)等方式从而达到抑制核酸的活性、保护病毒核酸免于降解的试剂。核酸酶抑制剂包括但不限于盐酸胍、尿素、巯基试剂、DTT二硫苏糖醇、CTAB、EDTA、BSA、氰化物、PVP、饱和酚、苯酚、氯仿、异戊醇、DEPC、乙醇、甲酰胺、乙基黄原酸钾、PEG、Triton X-100、Tween 20、SDS、NP-40、蛋白酶K等。

本发明中所使用的“保护核酸免受降解的试剂”指通过保护病毒核酸免受降解，来消除或至少减轻不利于样品中的病毒核酸保存(含量、质量等方面)的一些或全部不利因素，从而提高后续核酸检测的灵敏性和准确性。保护核酸免受降解的试剂包括但不限于市售的核酸保存液、保存液、采集液等，例如南京诺唯赞生物科技有限公司的病毒样品保存液。

本发明中的“病毒性疾病”包括但不限于由选自以下的病毒感染引起的疾病：α病毒感染、黄病毒感染、寨卡病毒感染、基孔肯雅病毒感染、罗斯河病毒感染、严重急性呼吸综合征冠状病毒感染、中东呼吸综合征、禽流感感染、流感病毒感染、人呼吸道合胞病毒感染、埃博拉病毒感染、黄热病病毒感染、登革热病毒感染、人类免疫缺陷病毒感染、呼吸道合胞病毒感染、汉坦病毒感染、盖塔病毒感染、辛德毕斯病毒感染、布尼亚病毒感染、西尼罗河病毒感染、日本脑炎病毒B型感染、兔痘病毒感染、乳酸脱氢酶升高病毒感染、呼肠孤病毒感染、狂犬病病毒感染、口蹄疫病毒感染、猪繁殖与呼吸综合征病毒感染、猿猴出血烧病毒感染、马传染性贫血病毒感染、山羊关节炎病毒感染、非洲猪瘟病毒感染、慢病毒感染、BK乳多空病毒感染、墨累谷脑炎病毒感染、肠道病毒感染、巨细胞病毒感染、肺病毒感染、麻疹病毒属感染和麻疹病毒感染。

实施例

通过以下实施例，可以进一步说明本发明。提供实施例仅用于说明目的，并且不应被解释为以任何方式限制本发明的范围或内容。

实施例1：以Trizol保存样品经56℃灭活处理对细胞内RNA质量影响

收集72hpf幼鱼，用于提取总RNA，每组15尾，将水分吸干后，用TriZol法获得总RNA。

1)总共分为3个实验组，每组为3个重复：第1组为每个重复组加入500μl Trizol，放到56度水浴锅中，水浴30分钟后，使用匀浆机匀浆(以不成块为最佳)；第2组为每个重复组加入500μl Trizol，放到4度冰箱中，静置30分钟后，使用匀浆机匀浆(以不成块为最佳)；第3组为每个重复组加入500μl 1xPBS，放到56度水浴锅中，水浴30分钟后，将PBS溶液吸干，加入500μl Trizol，使用匀浆机匀浆(以不成块为最佳)。

2)向上述裂解液中加入100μl体积氯仿。盖紧离心管盖，剧烈震荡15秒，室温静置3分钟。

3)4℃，12,000g离心15分钟。

4)小心吸取上层水相至新离心管中，加入250μl体积异丙醇。颠倒混匀后室温放置10分钟。

5)4℃，12,000g离心10分钟。

6)小心弃去上清，加入500μl 75％乙醇(DEPC水配制)。涡旋充分洗涤，并轻弹管底，让沉淀悬浮起来。

7)4℃，7500g离心分钟，弃上清，注意不要丢失RNA沉淀。

8)重复步骤6～7。

9)在通风橱干燥10分钟。加入15μl DEPC水溶解RNA，待完全溶解后，取少量使用Nano Drop进行检测。

测量结果如下：

利用斑马鱼胚胎进行总RNA的提取实验，发现在没有核糖核酸酶抑制剂的保护下，56℃灭活这一步骤导致了RNA的明显降解，普通的琼脂糖凝胶电泳(图1)显示，RNA出现了明显的拖尾现象，其中代表性的小分子量RNA条带减少的更为明显。将斑马鱼胚胎样品保存在含有TRIZOL这种超强的RNase抑制剂中,然后进行56℃灭活，再实施总RNA的提取，结果更加糟糕，代表性的28S RNA条带明显变弱，提示了更多的RNA的被降解。

实施例2：不同保存液保存的样品经耐受56℃灭活处理对细胞内RNA质量影响

收集人细胞溶液每管1800μl，1500g离心10分钟后，弃掉上清液，保留沉淀，一共收集6管，用TriZol法获得总RNA。

1)6管细胞平分为3个实验组：第1组为加入500ul RNA保存液1(100mM Tris(PH7.5)，12.5mM EDTA，150mM Nacl，250ug/ml蛋白酶K)，一管放到56度水浴锅中，水浴30分钟，另一管放到4度冰箱中，静置30分钟；第2组为加入500μlRNA保存液2(0.5％SDS，100mMNacl，10mM Tris-Hcl(PH8.0)，50mM EDTA，100ug/ml蛋白酶K)，一管放到56度水浴锅中，水浴30分钟，另一管放到4度冰箱中，静置30分钟；第3组为加入500μl RNA保存液3(100mMEDTA(PH8.0)，100mM Nacl，50mM Tris-Hcl(PH8.0)，36.5ml ddH₂O，0.5％SDS)，一管放到56度水浴锅中，水浴30分钟，另一管放到4度冰箱中，静置30分钟；30分钟后，所有样品4℃，12,000g离心5分钟，小心弃去上清后加入2ml TriZol溶液。

2)向上述裂解液中加入400μl体积氯仿。盖紧离心管盖，剧烈震荡15秒，室温静置3分钟。

3)4℃，12,000g离心15分钟。

4)小心吸取上层水相至新离心管中，加入1000μl体积异丙醇。颠倒混匀后室温放置10分钟。

5)4℃，12,000g离心10分钟。

6)小心弃去上清，加入1000μl 75％乙醇(DEPC水配制)。涡旋充分洗涤，并轻弹管底，让沉淀悬浮起来。

7)4℃，7500g离心5分钟，弃上清，注意不要丢失RNA沉淀。

8)重复步骤6～7。

9)在通风橱干燥10分钟。加入20μl DEPC水溶解RNA，待完全溶解后，取少量检测。

测量结果如下：

利用人细胞进行总RNA的提取实验，普通的琼脂糖凝胶电泳(图2)显示，加RNA保存液1高温对其影响比较大，而加RNA保存液2与3都影响较小。结果显示SDS这类弱蛋白变性剂的保护作用效果好。此外，RNAase降解酶蛋白酶K与SDS联用的保护效果更好。

实施例3：Hanks溶液和诺唯赞(Vazyme)病毒样品保存液保存的样品经56℃灭活处理对细胞内RNA质量影响

采用HEK-293细胞(自培养)、猪流行性腹泻病毒(Procine epidemic diaherravirus,PEDV)(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所)和λDNA(Takara#3010)作为实验样品。

将PEDV用10mL PBS充分溶解，分装后于-20℃保存待用。按上述表格配置混合管，按1.5mL/管分装，分装后分别置于4℃冰箱，56℃水浴锅，92℃水浴锅进行不同时间处理。

诺唯赞病毒样品保存液(Vazyme#R503)预先分装200μL无水乙醇至1.5mL RNase-free离心管，再加入500μL病毒样品保存液保存的样品，涡旋混匀。Hanks溶液在1.5mLRNase-free离心管中加入500μL裂解液，多个样品可预先分装，再加入200μL Hanks溶液样品，涡旋混匀。按照病毒DNA/RNA提取试剂盒(Vazyme#RC311-C1)的方法，提取并得到的DNA/RNA保存。

按照HiScript II U+One Step qRT-PCR Probe Kit(Vazyme#Q222-CN)的方法和Qubit荧光仪的操作说明，对细胞gDNA浓度Qubit检测，按照Equalbit RNA HS Assay Kit(Vazyme#EQ211)的方法Qubit荧光仪的操作说明，对细胞RNA浓度Qubit检测。通过凝胶成像，对细胞gDNA与RNA完整性检测。

使用HiScript II U+One Step qRT-PCR Probe Kit(Vazyme#Q222-CN)，以ABIStepOnePlusTM为测试机型，提取微量样品DNA/RNA检测。其中使用的引物和探针如下：

一步式qRT-PCR扩增的反应体系单个样品为25μL：12.5μL 2×One Step U+Mix，1.25μL One Step U+Enzyme Mix，0.5μL 50×ROX Reference Dye 1，0.5μL引物PEDV-F1或lambda DNA-QF4，0.5μL引物PEDV-R1或lambda DNA-QR4，0.25μL，TaqMan探针(10μM)，5μL模板；用RNase-Free超纯H₂O将反应体系补足25μL。

一步式qRT-PCR扩增的反应条件为：55℃逆转录15分钟；95℃预变性30秒；95℃变性10秒，60℃退火延伸30秒，共进行45个循环。实验结束后从仪器中获得CT值。

3.1 56℃或以上温度灭活病毒导致以Hanks作为保存液中的人细胞内总RNA明显降解

以Hanks作为细胞保存液，然后将该悬浮细胞的溶液置于56℃分别进行30、45、和60分钟的孵育，另一组放在92℃中进行孵育，再一组放在4℃中作为对照。

待全部孵育时间后，按常规方法分别提取各组的核酸(DNA和RNA)，然后进行1.2％的凝胶电泳(图3)，结果发现，与保存在4℃对照组样品相比，经过56℃30-60分钟孵育的核酸无论是DNA还是RNA都呈现明显的RNA降解，其中28S和18S RNA条带均变得模糊至不可见，而92℃孵育5分钟后，则几乎看不到任何电泳条带。紫外分光光度计的检测结果(图4)显示56℃或92℃的灭活处理导致细胞内的RNA含量均显著降低。其中95℃灭活5分钟后测得的RNA量大约只有4℃保存条件下的10％左右。56℃30分钟处理测的浓度只有原来的29％左右。

3.2 56℃或以上温度灭活病毒导致以Hanks作为保存液中的病毒RNA明显降解

荧光定量qRT-PCR结果(图5)显示56℃或以上灭活病毒导致以Hanks作为保存液中的病毒RNA明显降解(具体CT值)。阴性对照均未检出。与4℃对照组相比，56℃孵育30分钟即导致接近1个循环的差异，意味着对应的猪PEDV病毒的模板量损失了一半；而如果使用高温92℃孵育5分钟处理则使得CT增加了至少5，意味着对应的猪PEDV病毒的模板量不到原来的3.2％。可见高温处理对病毒的模板量影响比较大。

3.3 56℃或以上温度灭活病毒虽然导致诺唯赞R503保存液中的人细胞内总RNA也是明显降解，但与Hanks液，R503保存液对病毒核酸的完整性有明显的保护作用

以诺唯赞R503作为细胞保存液，然后将该悬浮细胞的溶液置于56℃分别进行30、45、和60分钟的孵育，另一组放在92℃中进行孵育，再一组放在4℃中作为对照。

待全部孵育时间后，按常规方法分别提取各组的核酸(DNA和RNA)，然后进行1.2％的凝胶电泳(图6)，结果发现，与保存在4℃对照组样品相比，经过56℃30-60分钟孵育的核酸无论是DNA还是RNA也都呈现明显的RNA降解，28S和18S RNA条带附近有明显的拖尾现象，而92℃孵育5分钟后，则几乎看不到基因组DNA条带和28S条带。不过，紫外分光光度计的检测结果(图7)显示56℃的灭活处理对R503液中人细胞内的RNA含量影响相对较小。其中，56℃处理30分钟后，总RNA浓度仍有88％左右，而92℃处理后，总RNA浓度也有66％左右。这些结果显示，与Hanks液相比，R503对核酸的保护作用比较明显。

3.4 56℃或以上灭活病对以诺唯赞R503保存液中的病毒RNA的模板数无明显影响

荧光定量qRT-PCR结果(图8)显示56℃或以上灭活病毒对以诺唯赞R03作为保存液中的病毒RNA无明显降解(具体CT值)。阴性对照均未检出。与4℃对照组相比，56℃或以上温度孵育灭活对保存液中的微量RNA或RNA的检出效果均无明显影响。

3.5 56℃及以上温度灭活处理对Hanks溶液保存的样品中的病毒检出率影响明显

与4℃保存组相比，经历56℃灭活处理30分钟和92℃灭活处理5分钟后(图9)，同一种保存液保存的样品内的检出率均呈明显差异。其中56℃灭活处理30分钟组与4℃组之间的循环数平均值之间差为0.996(p<0.01)，即同是Hanks液保存的样品如果经过56℃灭活处理30分钟后可检出的病毒模板数只有未经灭活处理的1/2^0.9967＝0.5011＝50.11％。

如果是经92℃灭活处理5分钟，那么与4℃组之间的循环数平均值之间差为4.8947(p<0.0001)，即同是Hanks液保存的样品如果经过92℃灭活处理5分钟后可检出的病毒模板数只有未经灭活处理的1/2^4.8947＝0.0336＝3.36％。

3.6与Hanks溶液相比，诺唯赞R503溶液保存的样品对微量RNA病毒模板具有良好的保护作用(样品灭活处理后，阳性检出率显著高于Hanks液)

在4℃保存条件下(图10)，两者之间没有影响。两种保存液下病毒的检出率相似，对应的循环数平均值之间小于0.5。

经历56℃灭活处理30分钟后(图11)，两种保存液下病毒的检出率呈明显差异(p<0.0001)，对应的循环数平均值之间差为1.6305；即Hanks液保存的样品经过56℃灭活处理30分钟后可检出的病毒模板数只有R503保存液的1/2^1.6305＝0.3230＝32.3％。

经历92℃灭活处理5分钟后(图12)，两种保存液下病毒的检出率呈明显差异(p<0.0001)，对应的循环数平均值之间差为5.4125；即Hanks液保存的样品经过92℃灭活处理5分钟后可检出的病毒模板数只有R503保存液的1/2^5.4125＝0.0235＝2.35％。

3.7 56℃及以上温度的灭活处理导致DNA病毒核酸检出率(噬菌体DNA)的下降

前述凝胶电泳显示，56℃及以上温度的灭活处理导致了样品中的基因组DNA降解严重。采用荧光定量PCR法对样品中微量的病毒DNA进行检测，结果发现，虽然灭活处理对病毒检出率影响没有对RNA病毒那么大，但是影响也还是很显著的(图13)。

就同是Hanks溶液保存的样品而言，与4℃保存组相比，经历56℃灭活处理30分钟组与4℃组之间的循环数平均值之间差为0.5230(p<0.01)，即同是Hanks液保存的样品如果经过56℃灭活处理30分钟后可检出的病毒模板数只有未经灭活处理的1/2^0.5230＝0.6959＝69.59％。

如果是经92℃灭活处理5分钟，那么与4℃组之间的循环数平均值之间差为2.0343(p<0.0001)，即同是Hanks液保存的样品如果经过92℃灭活处理5分钟后可检出的病毒模板数只有未经灭活处理的1/2^2.0343＝0.2441＝24.41％。

3.8R503可降低56℃及以上温度的灭活处理对病毒核酸检出率(噬菌体DNA)的影响

图13示出Hanks溶液和诺唯赞R503作为保存液在不同条件下的荧光定量qRT-PCR的CT值结果。

在4℃条件下，两种保存液下DNA病毒的检出率即呈明显差异(p<0.0001)，对应的循环数平均值之间差为1.4130；即Hanks液保存的样品检出的病毒模板数只有R503保存液的1/2^1.4130＝0.3755＝37.55％。

在56℃处理30分钟条件下，两种保存液下DNA病毒的检出率呈明显差异(p<0.0001)，对应的循环数平均值之间差为1.8335；即Hanks液保存的样品检出的病毒模板数只有R503保存液的1/2^1.8335＝0.2805＝28.05％。

在92℃处理5分钟条件下，两种保存液下DNA病毒的检出率呈明显差异(p<0.0001)，对应的循环数平均值之间差为2.6820；即Hanks液保存的样品检出的病毒模板数只有R503保存液的1/2^2.6820＝0.1558＝15.58％。

实施例4：采集样品的方法

1.咽拭子：用2根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子头浸入含3ml前述保存液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。

2.鼻拭子：将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。取另一根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子以同样的方法采集另一侧鼻孔。上述两根拭子浸入同一含3ml前述保存液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。

3.鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液或从气管抽取呼吸道分泌物。将收集器头部插入鼻腔或气管，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出，收集抽取的粘液，并用前述保存液冲洗收集器1次(亦可用小儿导尿管接在50ml注射器上来替代收集器)。

4.深咳痰液：要求病人深咳后，将咳出的痰液收集于含3ml前述保存液的50ml螺口塑料管中。

5.支气管灌洗液：将收集器头部从鼻孔或气管插口处插入气管(约30cm深处)，注入5ml生理盐水，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。收集抽取的粘液，并用前述保存液冲洗收集器1次(亦可用小儿导尿管接在50ml注射器上来替代收集)。

6.肺泡灌洗液：局部麻醉后将纤维支气管镜通过口或鼻经过咽部插入右肺中叶或左肺舌段的支管，将其顶端契入支气管分支开口，经气管活检孔缓缓加入灭菌生理盐水，每次30～50ml，总量100～250ml，不应超过300ml。采集样品放入适量的前述保存液。

7.血液样品：建议使用含有EDTA抗凝剂的真空釆血管采集血液样品5ml，室温静置30分钟，1500～2000rpm离心10分钟，分别收集血浆和血液中细胞于无菌螺口塑料管中。然后放入适量的前述保存液。

8.血清样品：用真空负压采血管采集血液样品5ml，室温静置30分钟，1500～2000rpm离心10分钟，收集血清于无菌螺口塑料管中。然后放入适量的前述保存液。

9.粪便样品：如患者发病早期出现腹泻症状，则留取粪便样品3-5ml；然后放入适量的前述保存液。

10.眼结膜拭子样品：眼结膜表面用拭子轻轻擦拭后，将拭子头进入采样管中，保存于然后放入适量的前述保存液，尾部弃去，悬紧管盖。

前述实施例被认为是说明性的，而不是对本文所述的本发明的限制。本发明的范围由所附权利要求书而不是由前述说明书表示，并且意在将落入权利要求书的等同物的含义和范围内的所有改变包括在其中。

序列表

<110> 南京尧顺禹生物科技有限公司

<120> 一种用于冠状病毒核酸临床检测的样品保护液及其使用方法

<130> AJ7332PI2000001

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<223> PEDV-F1

<400> 1

cgtgagcctg gcttagtctt g 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<223> PEDV-R1

<400> 2

catacgtcgc gatgaaacaa a 21

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<223> (FAM)PEDV-P1

<400> 3

cgcatgaact tcaaaatcat actgcgacg 29

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<223> lambda DNA-QF4

<400> 4

tttgctgcgg ttgcagaa 18

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<223> lambda DNA-QR4

<400> 5

atgattcggt tttcaggaac atc 23

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<223> (FAM)lambda DNA-QP4

<400> 6

ttaccgtcac cgccagttaa tccgg 25

Claims

1.核酸降解抑制剂在制备用于保存病毒样品的病毒核酸临床检测产品中的用途，其中所述病毒核酸临床检测产品为病毒样品保存液或包含病毒样品保存液的试剂盒。

2.如权利要求1所述的用途，其中所述病毒样品保存液需用于病毒样品在核酸检测前的高温灭活处理。

3.如权利要求2所述的用途，其中所述高温灭活条件为56℃以上。

4.如权利要求1所述的用途，所述核酸降解抑制剂选自弱蛋白变性剂、蛋白酶、和核酸酶结合蛋白中的一种或多种。

5.如权利要求4所述的用途，所述弱蛋白变性剂选自Triton X-100、Tween 20、NP-40和SDS中的一种或多种。

6.如权利要求4所述的用途，所述蛋白酶为蛋白酶K。

7.如权利要求1所述的用途，所述核酸降解抑制剂为南京诺唯赞病毒样品保存液R503。

8.如权利要求1-7任一项所述的用途，所述病毒选自冠状病毒。

9.如权利要求8所述的用途，所述冠状病毒为新型冠状病毒。

10.一种用于在病毒核酸临床检测程序中的高温灭活步骤中保护病毒样品的病毒样品保存液，其包含有核酸降解抑制剂。

11.如权利要求10所述的病毒样品保存液，所述核酸降解抑制剂选自弱蛋白变性剂、蛋白酶、和核酸酶结合蛋白中的一种或多种。

12.如权利要求11所述的病毒样品保存液，所述弱蛋白变性剂选自Triton X-100、Tween 20和SDS中的一种或多种。

13.如权利要求11所述的病毒样品保存液，所述蛋白酶选自蛋白酶K。

14.如权利要求10所述的病毒样品保存液，所述核酸降解抑制剂为南京诺唯赞病毒样品保存液R503。

15.如权利要求10-14任一项所述的病毒样品保存液，所述病毒为冠状病毒。

16.如权利要求15所述的病毒样品保存液，所述冠状病毒为新型冠状病毒。

17.一种病毒核酸的临床检测方法，包含

1)使用如权利要求10-16所述的病毒样品保存液保存病毒样品的步骤，以及

2)将保存有病毒样品的病毒样品保存液进行高温灭活处理的步骤。

18.如权利要求17所述的方法，进一步包括PCR扩增或检测。

19.如权利要求17-18任一项所述的方法，其中所述病毒样品取自咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物或呼吸道抽取物、深咳痰液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、血液样品、血清样品、粪便样品、眼结膜拭子样品。

20.如权利要求17-19任一项所述的方法，其中所述病毒为冠状病毒。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述冠状病毒为新型冠状病毒。