CN112251539B - 一种非洲猪瘟病毒环境拭子采集液 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种非洲猪瘟病毒环境拭子采集液，它由以下重量配比的成分组成：甘氨酸0.5‑1.5％；氢氧化钠0.1‑0.9％；牛血清白蛋白0.1‑1％；D‑海藻糖0.5‑2％；SDS缓冲液0.5‑2％，余量为水，pH为10‑11。本发明筛选出更为适用于非洲猪瘟病毒的环境采集液，有效提高了环境拭子的采样量和检测准确性，该采集液无需添加任何类抗生素，易于保存，十分适用于基层采样，对规模化猪场环境净化、复工复产具有重要意义。

Description

一种非洲猪瘟病毒环境拭子采集液
技术领域
本发明属于病毒检测领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒环境拭子采集液。
背景技术
非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)是具有囊膜的双股DNA病毒，直径达175～215nm，可感染家猪、野猪和软蜱(钝缘蜱属)。自1921年在肯尼亚首次发现到2018年8月传入我国，经过两年的传播发展，由开始的急性型死亡率高达100％发展为现今慢性型症状居多。现今，各规模化猪场正在进行全面的消毒防护工作，完成猪场环境的全方位检测、净化，我国生猪养殖业的复产、净化需要严谨、慎重、科学的推进。
目前对于ASFV环境样品的检测通常使用普通PCR或荧光定量PCR等抗原检测方法，但不论何种检测方法，前提均需采集到质量较为合格的环境拭子。现在常用的ASFV采样方法是使用生理盐水湿棉拭子擦拭地面、墙壁、围栏等硬件设施后封存于EP管或EP袋中送入实验室进行抗原检测。然而，由于采样工作不够细致严谨、采样液的保护力不够强以及病毒在保存运输过程中的衰减，即便使用荧光定量PCR检测方法，最终很难检测到原有环境中所含病毒量，对ASFV环境监测与评估的工作可能产生一定程度上的误导。在缺乏疫苗的情况下，这对我国各规模化猪场的环境净化、复工复产造成了十分严重的潜在威胁，于是我们从环境样品采集方法入手，筛选较为适用于ASFV的环境拭子采集液，经试验证明，该环境拭子采集液相比常用的生理盐水具有良好的病毒保护效果，能够有效提高病毒检出率，十分适用于我国生猪存栏量多、基层需求庞大的基本国情。
发明内容
本发明目的是针对目前非洲猪瘟病毒环境拭子样品采集病毒量低，从而造成对检测结果分析的误导，提供一种新的非洲猪瘟病毒环境样品采集液，旨在提高非洲猪瘟病毒环境样品检测的准确性。
上述目的是通过以下技术方案实现的：
一种非洲猪瘟病毒环境拭子采集液，它由以下重量配比的成分组成：
甘氨酸0.5-2％；氢氧化钠0.1-0.5％；牛血清白蛋白0.2-1.2％；D-海藻糖0.2-2.5％；SDS缓冲液0.2-2％，余量为水，pH为10-11。
优选地，所述的非洲猪瘟病毒环境拭子采集液由以下重量配比的成分组成：
甘氨酸1-1.5％；氢氧化钠0.3-0.5％；牛血清白蛋白0.8-1.2％；D-海藻糖1.5-2.5％；SDS缓冲液0.5-1.5％，余量为水，pH为10.3-10.8。
最佳地，所述的非洲猪瘟病毒环境拭子采集液由以下重量配比的成分组成：
甘氨酸1.5％；氢氧化钠0.4％；牛血清白蛋白1％；D-海藻糖2％；SDS缓冲液1％，余量为水，pH为10.5。
本发明的有益效果是：
本发明筛选出更为适用于非洲猪瘟病毒的环境采集液，有效提高了环境拭子的采样量和检测准确性。该采集液无需添加任何类抗生素，易于保存，十分适用于基层采样，对规模化猪场环境净化、复工复产具有重要意义。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例采用的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒购自青岛立见诊断技术发展中心，采用的甘氨酸、氢氧化钠、海藻糖、SDS均为国产分析纯试剂。
实施例1
甘氨酸1.5％；氢氧化钠0.4％；牛血清白蛋白1％；D-海藻糖2％；SDS缓冲液1％，余量为水，pH为10.5。
(1)SDS缓冲液的配制：将100g十二烷基磺酸钠溶解于900ml纯水中，加热至68℃溶解并定容至1000ml。
(2)称取甘氨酸1.5g、氢氧化钠0.4g、牛血清白蛋白1g、D-海藻糖2g、SDS缓冲液1g，加水至100g，搅拌溶解，即得采集液，pH 10.5。
实施例2
甘氨酸0.8％；氢氧化钠0.2％；牛血清白蛋白0.4％；D-海藻糖0.5％；SDS缓冲液0.5％，余量为水，pH 10。
实施例3
甘氨酸0.6％；氢氧化钠0.2％；牛血清白蛋白0.2％；D-海藻糖0.5％；SDS缓冲液0.5％，余量为水，pH为10。
实施例4
甘氨酸1.2％；氢氧化钠0.3％；牛血清白蛋白0.8％；D-海藻糖1.5％；SDS缓冲液1.5％，余量为水，pH为10.4。
实施例5
甘氨酸0.5％；氢氧化钠0.2％；牛血清白蛋白0.2％；D-海藻糖0.2％；SDS缓冲液0.2％，余量为水，pH为10。
实施例6
甘氨酸1％；氢氧化钠0.2％；牛血清白蛋白0.6％；D-海藻糖1％；SDS缓冲液1％，余量为水，pH为10。
实施例7
甘氨酸2％；氢氧化钠0.5％；牛血清白蛋白1.2％；D-海藻糖2.5％；SDS缓冲液2％，余量为水，pH为10.7。
实施例8
将实施例1-7配制的采集液用于非洲猪瘟病毒环境拭子的采样，在水泥地面划出若干区域，在各区域中均匀添加同等体积的阳性血清模拟含有相同病毒量的环境样品，24h后采样。具体采集方法如下：
准备锡箔纸封口装有采集液的玻璃瓶、一次性注射器、EP管、棉拭子。使用一次性注射器吸取采集液后加入EP管中，每EP管0.5-1ml(不超过1ml)。将棉拭子插入EP管中浸湿后擦拭需采样区域(每根棉拭子4cm2以内区域)，插入EP管中浸泡5-10分钟后可再取出采样一次(可提高病毒采集率)。将EP管盖好送检。
处理样品：加入洗脱液浸泡5-10min后取出棉拭子，离心后取上清液提取核酸。通过荧光定量PCR检测进行结果比对分析。每个采集液重复五次，计算平均值，同时用生理盐水作对照，结果见下表。
Figure BDA0002685837820000031
Figure BDA0002685837820000041
从以上结果可以看出，实施例1-7检测到的病毒含量明显高于生理盐水，说明本发明提供的配方对非洲猪瘟病毒具有更好的采集和保护效果，其中实施例1检测到的病毒含量最高，其检测到病毒含量比对照高出4-5个Ct值以上，相当于提高了几百倍的病毒采集量。

Claims (1)

1.一种采集液在非洲猪瘟病毒环境拭子采样中的应用，所述采集液由以下重量配比的成分组成：甘氨酸1.5%；氢氧化钠0.4%；牛血清白蛋白1%；D-海藻糖2%；SDS缓冲液1%，余量为水，pH为10.5，
所述SDS缓冲液的配制方法是：将100g十二烷基磺酸钠溶解于900ml纯水中，加热至68℃溶解并定容至1000ml。
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