CN108627648A - 一种新型猪圆环病毒3型的elisa抗体检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型猪圆环病毒3型的ELISA抗体检测试剂盒及其应用。本发明的试剂盒组成包括：以重组PCV3 Cap蛋白作为包被抗原的酶标板、PCV3标准阳性血清、PCV3标准阴性血清、酶标二抗、洗涤液、血清稀释液、底物显色液A、底物显色液B和终止液；首次成功研制针对猪圆环病毒III型的新型PCV3 ELISA抗体检测试剂盒。本发明的试剂盒具有很好特异性和灵敏性，检测时间短，可同时检测大量样品；试剂盒保存时间长，稳定性好，为该病的诊断、检测和监测等提供了有力的工具。

Description

一种新型猪圆环病毒3型的ELISA抗体检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种新型猪圆环病毒3型的ELISA抗体检测试剂盒及其应用。

背景技术

圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属，其基因组为一个2kb左右的环状单链DNA。圆环病毒可以感染多种动物，包括猪、犬、鸭、鸡、狐狸和鱼类。圆环病毒主要编码两个开放性阅读框(rep和cap)。众所周知，有两个圆环病毒可以感染猪。猪圆环病毒2型(PCV2)感染可以导致不同的临床疾病，对养猪业造成严重的经济损失，而圆环病毒1型(PCV1)不引起临床疾病。2015年，美国研究人员通过宏基因组测序，在美国检测到一个新型圆环病毒(PCV3)，该圆环病毒与皮炎肾病综合征、繁殖障碍、心肌炎以及多系统炎症相关。PCV3属于新发猪重大疫病病原，2016年12月首次出现在中国，该病与仔猪多系统衰竭症以及母猪流产有关，正给猪养殖业带来严重威胁。2016年12月，华南农业大学宋长绪研究员组在我国首次检出致病性的新型猪圆环病毒—PCV3-China/GD2016病毒株，通过对PCV3毒株全基因组和其部分基因的遗传进化研究发现，PCV3与PCV1和PCV2处于不同的进化分支(图1)，属于新型的猪圆环病毒(Genome characterization of a porcine circovirus type 3in SouthChina,Changxu Song,Transbound Emerg Dis.2017Mar 13.)。猪圆环病毒III型是严重危害我国养猪业的一个猪病，抗体检测是防控的关键，然而目前国内外尚无成熟的、商品化的PCV3的ELISA抗体检测试剂盒。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种新型猪圆环病毒3型的ELISA抗体检测试剂盒。本发明以重组PCV3抗原(PCV3的Cap蛋白)为基础，研制灵敏度高、特异性和稳定性好的ELISA抗体检测试剂盒，可用于PCV3病毒抗体的快速检测。

本发明的又一目的在于提供所述的新型猪圆环病毒3型的ELISA抗体检测试剂盒的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种新型猪圆环病毒3型的ELISA抗体检测试剂盒，包括：以重组PCV3Cap蛋白作为包被抗原的酶标板。

所述的新型猪圆环病毒3型的ELISA抗体检测试剂盒还包括：PCV3标准阳性血清、PCV3标准阴性血清、酶标二抗、洗涤液、血清稀释液、底物显色液A、底物显色液B和终止液中的一种或至少两种。

所述的重组PCV3Cap蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

所述的重组PCV3Cap蛋白来自于猪圆环病毒3型核衣壳蛋白，特别是来自于猪圆环病毒PCV3-China/GD2016病毒株。

编码所述的重组PCV3Cap蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示。

所述的重组PCV3Cap蛋白通过以下步骤制备得到：

将编码所述的重组PCV3Cap蛋白的核苷酸序列克隆入表达载体构建重组表达载体；将所述重组表达载体转入表达系统中进行表达，纯化，得到所述的重组PCV3Cap蛋白。

所述的构建重组表达载体的具体步骤优选为：针对编码所述的重组PCV3Cap蛋白的核苷酸序列，通过设计引物进行PCR，将得到的PCV3-Cap基因片段双酶切后与表达载体连接构建得到重组表达载体。

其中，所述的引物为：

上游引物：5’-GGCggatccATGAGACACAGACCTATATTC-3’，下游引物为：5’-GGGctcgagGAGAACTGACTTGTAACGAAT-3’，其中，小写字母分别表示酶切位点BamHI和XhoI。

所述的双酶切的方法优选为通过限制性内切酶BamH I和Xho I对PCV3-Cap基因片段和载体分别进行双酶切。

所述的表达系统优选为大肠杆菌、杆状病毒表达系统、真核哺乳动物细胞表达系统和植物表达系统中的一种或至少两种；进一步优选为大肠杆菌(Rosetta菌株)和杆状病毒表达系统中的一种或至少两种。

上述的核苷酸序列、氨基酸序列，包含但不限于：将本发明所提供的序列，经突变(mutation)、删除(deletion)、插入(insertion)、或取代(replacement)等现有方式，将1至复数个核苷酸或氨基酸改变，但仍适用本发明目的。更优选地，其应至少具有80％的序列互补性(complementary)，或是至少90％的序列同一性(Identitty)。

所述的删除还包括删除第1～35位中的1至复数个氨基酸；进一步优选为删除包含第1-28位中的1至复数个氨基酸。

所述的以重组PCV3Cap蛋白作为包被抗原的酶标板，通过如下步骤制备得到：将重组PCV3Cap蛋白稀释到2μg/mL，100μL/孔加到酶标板，37℃温育24h；取包被好的酶标板，300μL/孔洗涤液洗板2～5次，2～5分钟/次；再加入150μL/孔封闭液，37℃温育2h；取封闭后的酶标板，300μL/孔洗涤液洗板2～5次，2～5分钟/次，制备得到以重组PCV3Cap蛋白作为包被抗原的酶标板。

所述的包被液优选为pH值为9.6的碳酸钠缓冲液。

所述的包被液优选通过如下步骤制备得到：将1.59g Na2CO3、2.93g NaHCO3溶于900mL双蒸水中至完全溶解后，调节pH至9.6，定容至1L，即得所述的包被液。

所述的封闭液优选为含3％明胶的PBST缓冲液。

所述的含3％明胶的PBST缓冲液优选通过如下步骤制备得到：取3％的明胶，溶于800mL稀释至1倍的洗涤液，完全溶解后，定容至1L，即得所述的含3％明胶的PBST缓冲液。

所述的酶标二抗优选为HRP标记的兔抗猪IgG抗体。

所述的底物显色液A优选为过氧化脲溶液；底物显色液B优选为四甲基联苯胺(TMB)溶液。

所述的洗涤液优选通过如下步骤制备得到：称取8.71g NaCl、0.26g KH2PO4、2.89g Na2HPO4·12H2O溶于900mL双蒸水中，至完全溶解后，加入0.5mL Tween-20，定容至1L，即得所述的洗涤液。

所述的血清稀释液优选为稀释至1倍的所述的洗涤液。

所述的终止液优选为2M浓硫酸。

所述的新型猪圆环病毒3型的ELISA抗体检测试剂盒在猪圆环病毒III型检测中的应用。

所述的应用包括以下步骤：

(1)用血清稀释液将待测血清样品稀释，将PCV3标准阳性血清、PCV3标准阴性血清、稀释后的待检血清样品各100μL/孔加到前述酶标板中，23～28℃孵育1h；

(2)用洗涤液洗板，300μL/孔，洗3～5次；

(3)每孔加入100μL酶标二抗，23～28℃孵育30分钟；

(4)用洗涤液洗板，300μL/孔，洗3～5次；

(5)取底物显色液A和底物显色液B等体积混匀，每孔加100μL，在暗处显色15分钟；

(6)每孔加入50μL的终止液终止反应；

(7)在波长为450nm处测OD值；

(8)结果判读：OD450nm(样本)≥0.4判为阳性，OD450nm(样本)＜0.2判为阴性，当0.2≤OD450nm(样本)＜0.4判为可疑。

本发明试剂盒的检测原理是：ELSIA技术是一种免疫学测定，主要通过抗原抗体反应监测液体样本中的抗体或抗原性物质，是一种应用免疫学技术测定标本中目的蛋白性质、功能和含量的方法。间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体(抗猪免疫球蛋白抗体)以检测与固相抗原结合的受检抗体。

酶标板上的每个孔均包被有相同量的抗原，加入待测血清后，固相包被抗原和待测血清中的抗体反应，形成固相抗原抗体复合物，洗涤除去未结合物质，再加入酶标二抗，固相免疫复合物上的抗体与酶标抗原结合，彻底洗涤未结合的酶标二抗，然后加入底物显色液显色，显色反应浅，用酶标仪检测的OD值低，表明血清中抗体水平低；反之，当待测血清中抗体含量高时，则所测的OD值高，显色反应深。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明的发明人以大肠杆菌和/或杆状病毒表达系统获得的CAP蛋白作为包被抗原，以此为基础首次成功研制针对猪圆环病毒III型的新型PCV3ELISA抗体检测试剂盒。

(2)本发明提供的检测试剂盒能够检测猪血清中的IgG，对猪血清中的PCV3病毒抗体具有很好特异性和灵敏性，检测时间短，能同时检测大量的样品，而且本发明试剂盒保存时间长，稳定性好。

(3)本发明对解决大批量样品猪血清中的PCV3病毒抗体检测具有重要的现实意义，通过对猪群抗体水平的检测，可以实时监控猪群的整体免疫效果以及感染情况，为该病的诊断、检测和监测等提供了有力的工具。

附图说明

图1是PCV3-China/GD2016病毒株的系统进化树图。

图2是实施例1中重组质粒pET28a-PCV3Cap的质粒图谱图。

图3是实施例2中重组质粒pFastBac-HTB-PCV3Cap的质粒图谱图。

图4是实施例1重组质粒转化的大肠杆菌(Rosetta菌株)SDS-PAGE分析电泳图，其中，对照为未诱导的重组大肠杆菌Rosetta，Marker为蛋白分子量标准，Cap-Ecoli为经IPTG诱导的重组大肠杆菌Rosetta。

图5是实施例2重组杆粒的SDS-PAGE分析电泳图，其中，M为蛋白marker，Cap-sf9为转染重组杆粒，对照为pFastBac-HTB空载杆粒。

图6是纯化后的Cap蛋白SDS-PAGE电泳图，泳道M为蛋白marker，泳道1为实施例1制得的重组蛋白Cap-Ecoli，泳道2为实施例2制得的重组蛋白Cap-sf9。

图7是酶标板保存期稳定性实验的结果分析图，其中，P1、P2、P3、P4为阳性血清，N1、N2为阴性血清。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1通过大肠杆菌表达重组Cap蛋白

1.基因扩增

以PCV3-China/GD2016病毒株(PCV3-China/GD2016已于论文中Genomecharacterization of a porcine circovirus type 3in South China,Changxu Song,Transbound Emerg Dis.2017Mar 13.中公开)为模板扩增Cap基因，反应体系如表1所示，反应程序如表2所示。

表1 Cap基因扩增的反应体系

其中，上游引物为：5’-GGCggatccATGAGACACAGACCTATATTC-3’，下游引物为：5’-GGGctcgagGAGAACTGACTTGTAACGAAT-3’，小写字母分别表示酶切位点BamHI和XhoI。

表2用于Cap基因PCR反应程序

(3)PCR扩增产物的凝胶电泳

参考《分子克隆实验指南》方法，配制1.2％琼脂糖凝胶，取5μL扩增产物加1μL 6×Loading Buffer混匀，加入上样孔，同时以标准DNA分子量DL2000作为对照。

2.Cap目的片段胶回收

按照小量胶回收试剂盒(购自Omega公司)使用说明书进行：

(1)在紫外灯下切下目的片段，放入1.5mL离心管中，加入300μL的GCBuffer，放入65℃水浴锅中，期间上下颠倒离心管，直至完全溶化，冷却至室温。

(2)把吸附柱放入2mL离心管中，将(1)中液体加入回收柱，10000r/min离心30s，弃去滤液。

(3)加入500μL DNA wash Buffer，10000r/min离心30s，弃去滤液。重复步骤(3)1次。

(4)12000r/min开盖离心2min，以彻底去除残留的乙醇。

(5)把吸附柱放于新的1.5mL的离心管中，加入50μL Elution Buffer，65℃水浴锅中放置5min，然后12000r/min离心1min，再将洗脱液加入柱子中，65℃水浴锅中放置5min，12000r/min离心1min，收集洗脱液-20℃保存。

3.pET28a质粒的提取

按质粒小抽提试剂盒(购自北京天根生物技术有限公司)说明书进行。

(1)取菌液，划板后，挑取单个菌落到5mL LB培养基中，37℃震荡14～16h，室温下10000r/min离心1min，收集菌体。

(2)向DNA收集管中加入500μL GBL，室温放置2min，12000r/min离心2min，弃去废液，收集管备用。

(3)向(1)收集的菌体中加入250μL Buffer A(确保已加入RNase A)，涡旋振荡，充分悬浮菌体。

(4)在步骤(3)中得到的重悬菌液中加入250μL Buffer B1，轻轻翻转10次，静置5min至溶液粘稠而澄清(不要剧烈震荡)，静置时间不超过5min。

(5)加入350μL Buffer N1(事先放入冰箱预冷)，立即反转10次，混合均匀，此时出现白色絮状沉淀，在室温下13000r/min离心10min。

(6)小心吸取离心后的上清至步骤(2)得到的DNA收集管中(勿吸起沉淀)，13000r/min离心1min，弃去废液。

(7)再将吸附柱放回收集管中，加入500μL DNA wash Buffer，13000r/min离心1min，弃去废液。重复步骤(7)1次。

(8)开盖，13000r/min离心2min，以彻底去除残留的乙醇。

(9)将吸附柱放入新的1.5mL的离心管中，加入50μL Elution Buffer，室温放置2min，13000r/min离心1min，再将洗脱液重新加入吸附柱中，13000r/min离心1min，收集洗脱液。-20℃保存备用。

4.Cap片段和pET-28a(+)双酶切

使用分光光度计测质粒和DNA浓度，然后分别用限制性内切酶BamH I和Xho I对Cap片段和pET-28a进行双酶切，按照限制酶使用说明书，配制pET-28a质粒双酶切反应体系见表3，Cap片段的双酶切体系见表4。

表3 pET-28a质粒的双酶切反应体系

表4 Cap片段的双酶切反应体系

质粒酶切混合液在37℃反应15min，Cap片段片段酶切混合液在37℃反应30min，反应完成后，琼脂糖凝胶电泳，切胶用凝胶回收试剂盒进行回收酶切后的质粒DNA和Cap片段。

5.Cap片段和pET-28a(+)连接

使用分光光度计测酶切回收后的Cap片段和pET-28a的浓度，用T4DNA连接酶(NEB公司)连接，根据T4DNA连接酶使用说明书配制反应体系见表5。将Cap片段克隆到pET-28a的BamH I和Xho I两个酶切位点之间。

表5 Cap片段和pET-28a连接体系

连接体系混匀后，置于4℃过夜。

6.连接产物转化DH5α

(1)从-80℃冰箱中取出100μL感受态细胞至于冰盒上，完全融化后加入10μL连接产物，DNA体积不超过总体积的10％，用吸头轻轻混匀，冰浴30min。

(2)42℃水浴锅内热击90s(不要超过90s)，冰浴3min。

(3)在超净台中加入700μL液体无抗LB培养基(配方为：胰蛋白胨(tryptone)10g，酵母提取物(yeast extract)5g，氯化钠(NaCl)10g，用水定容至1L，121℃，21分钟高压灭菌后，保存于4℃冰箱备用)，37℃200r/min振荡培养1h。

(4)4000r/min离心5min，弃约500μL上清，再重悬菌液。

(5)用灭菌L型涂布器将重悬菌体涂布在含Kna抗性的LB培养基的平板上。

(6)置于37℃温箱中，至完全吸收30min，待菌液渗入培养基后，倒置平皿继续培养12～16h。

7.重组子筛选

(1)PCR鉴定：当菌落长约12～16h时，于超净台上随机挑选单菌落。挑取平板上的单菌落，接至3mL Kna+抗性的LB液体培养液中，12～14℃振荡培养过夜，提取质粒(操作同前述“3.pET28a质粒的提取”)，按表1的反应体系和表2的反应程序进行PCR扩增及琼脂糖凝胶分析鉴定。

(2)双酶切鉴定：取PCR鉴定阳性的质粒用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ进行酶切鉴定。

(3)测序鉴定：将PCR鉴定和酶切鉴定阳性的质粒送广州美吉生物公司进行测序，测序结果如SEQ ID No.2所示。

用DNAMAN软件分析测序结果，以确定阅读框是否正确，将测序鉴定正确的阳性重组质粒命名为pET28a-PCV3Cap(图2)。

8.重组蛋白表达诱导表达

将测序正确的阳性重组子转化大肠杆菌(Rosetta菌株)(转化方法同实施例1中的“6.连接产物转化DH5α”)，37℃恒温培养12～16h，挑取单菌落接种于3mL LB(Kna+)液体培养基中，37℃恒温振荡培养约12h，次日菌液按1:50接种于300mL LB(Kna+)液体培养基中，以转速200r/min，在37℃条件下振荡培养至OD600＝0.4～1.0(约需2～3h)，取1mL菌液作为对照菌液；放4℃冷却，再加入IPTG至终浓度为0.1mol/L进行重组蛋白的诱导表达，诱导4h，取样1mL，4℃，10000r/min，离心2min，弃上清，收集菌体(命名为Cap-Ecoli)，于-20℃保存，用于后续的SDS-PAGE蛋白电泳分析。剩余菌液离心收集于50mL离心管中，存于-80℃，用于蛋白纯化。

将上述鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌(Rosetta菌株)并经IPTG诱导表达后收集得到的菌体Cap-Ecoli，以及前述加诱导剂前取的1mL对照菌液，处理后去上清进行SDS-PAGE分析。结果如图4所示，加诱导剂后，在Cap泳道的30KDa左右处出现明显特异性条带，与预期的重组Cap的蛋白分子量大小一致，说明Cap在大肠杆菌中得到表达，且表达蛋白为可溶的，将重组蛋白命名为重组蛋白Cap-Ecoli。

SDS-PAGE电泳：

①洗净玻璃板，固定在蛋白电泳制胶支架上。按分子克隆的方法配制12％的分离胶10mL，迅速注入两玻璃板之间，胶顶覆盖2mL双蒸水，待分离胶凝固后吸去水，用去离子水冲洗凝胶顶部数次，倒置空干液体，加入1.0mL 5％的积层胶溶液，插上梳子，等20min左右至胶凝固。

②将凝固好的胶板固定在电泳槽上，在电泳槽间加入Tris-甘氨酸缓冲液，数分钟后移去梳子，用注射器冲洗加样孔。

③分别向菌体Cap-Ecoli和对照菌液中入40μL去离子水，涡旋混合均匀后加10μL5×Loading Buffer，再次混合均匀，100℃煮沸5min裂解样品。室温放置数分钟使样品冷却，室温5000r/min离心4min后上样，取5μL上样。

④打开电源，用80V电压电泳至溴酚蓝进入分离胶，电压提高到100V，继续电泳2h～3h至溴酚蓝到凝胶底部。

⑤染色：取下凝胶用蒸馏水冲洗，用5倍体积的考马斯亮蓝染色液浸泡凝胶，在平缓摇动的摇床上室温染色过夜。

⑥脱色：取出凝胶，加入脱色液，在脱色摇床上进行脱色，期间更换脱色液3～4次。待蓝色背景完全脱净后，将凝胶浸入蒸馏水中终止脱色。(6)将SDS-PAGE分析条带正确的蛋白，加入透析袋中，放入预冷的PBS中4℃透析6～7h。

9.重组蛋白的纯化

采用碧云天生物科技有限公司的Ni-NTA His镍柱对重组蛋白进行纯化，具体纯化步骤如下：

(1)按照每克细菌沉淀湿重加入2～5mL非变性裂解液的比例，向步骤8中得到的菌体Cap-Ecoli中加入裂解液，充分重悬菌体。

(2)加入溶菌酶至终浓度为1mg/mL并混匀，冰水浴或冰上放置30min。

注：如果没有溶菌酶，也可以直接进入步骤(3)。

(3)冰上超声裂解细菌。超声功率200～300W，每次超声处理10s，每次间隔10s，共超声处理6次。

(4)(可选做)如果超声处理后裂解液非常粘稠，可以加入RNase A至10μg/mL及DNase I至5μg/mL，冰上放置10-15min。或者也可以使用适当的装好了较细针头的注射器，反复抽吸数次，以剪切粘稠的基因组DNA等。

(5)在4℃下10,000g离心20～30min，收集细菌裂解液上清并置于冰水浴或冰上。可以取20μL上清留作后续检测用。

注：上清必须保持澄清，即不含任何不溶物，才能进行下一步的纯化。上清中如果混有不溶性杂质会严重影响后续纯化获得蛋白的纯度。

(6)取适量混合均匀的50％BeyoGold^TMHis-tag Purification Resin，4℃离心(1000g×10s)弃去储存液，向凝胶中加入一个柱体积的非变性裂解液混匀以平衡凝胶，4℃离心(1000g×10s)弃去液体，再重复重复平衡1～2次，弃去液体。

(7)按照每0.5mL凝胶(相当于1mL 50％的凝胶)中加入4mL细菌裂解液上清的比例(1:8)，混合BeyoGold^TMHis-tag Purification Resin和细菌裂解液上清。4℃在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动60min。

(8)将裂解液和BeyoGold^TMHis-tag Purification Resin的混合物装入适当的空柱管中，如碧云天的亲和层析柱空柱管。

(9)将纯化柱底部的盖子打开，在重力作用下使柱内液体流出，收集约20微升穿流液作后续分析用。

(10)洗柱5次，每次加入1～2个柱体积的非变性洗涤液，每次均收集约20微升穿柱的洗涤液用于后续的分析检测用。例如1mL混合均匀的50％BeyoGold^TMHis-tagPurification Resin装柱后的柱体积为0.5mL，即1mL混合均匀的50％BeyoGold^TMHis-tagPurification Resin装柱后每次洗柱的洗涤液体积为0.5mL。洗柱及下一步洗脱过程中可以用Bradford法(P0006)简单快速地检测每次洗涤液和洗脱液中的蛋白含量，从而考虑增加或减少洗涤和洗脱的次数。

(11)洗脱目的蛋白6～10次，每次用一个柱体积的非变性洗脱液。将每次的洗脱液分别收集到不同的离心管中。收集获得的洗脱液即为纯化的His标签蛋白样品。对纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE分析，结果如图6所示，结果显示在大约25～35KDa处(泳道1)，有一较为单一条带，大约30KDa，与目的蛋白大小一致，从图片来看，其纯度较纯，杂质较少，可以用于下一步实验。

实施例2杆状病毒表达重组Cap蛋白

1.基因扩增

同实施例1。

2.Cap目的片段胶回收

同实施例1。

3.Cap片段和pFastBac-HTB双酶切

用BamHI和XhoI分别对得到的Cap基因片段和pFastBac-HTB质粒分别进行酶切，酶切体系表6、表7所示。

表6 pFastBac-HTB质粒的双酶切反应体系

表7 Cap基因片段的双酶切反应体系

37℃金属浴孵育20min，反应完成后，根据分子克隆手册，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，将目的片段回收，回收方法参考凝胶回收试剂盒(Omega公司)说明书。

4.Cap片段和pFastBac-HTB连接

使用分光光度计测酶切回收后的Cap片段和pFastBac-HTB的浓度，用T4DNA连接酶(NEB公司)连接，根据T4DNA连接酶使用说明书配制反应体系见表8。将Cap片段克隆到pFastBac-HTB的BamH I和Xho I两个酶切位点之间。

表8 Cap片段和pFastBac-HTB连接体系

连接体系混匀后，置于4℃过夜。

5.连接产物转化DH5α

(1)从-80℃冰箱中取出100μL感受态细胞至于冰盒上，完全融化后加入10μL连接产物，DNA体积不超过总体积的10％，用吸头轻轻混匀，冰浴30min。

(2)42℃水浴锅内热击90s(不要超过90s)，冰浴3min。

(3)在超净台中加入700μL液体无抗SOC，37℃200r/min培养1h。

(4)4000r/min离心5min，弃约500μL上清，再重悬菌液。

(5)用灭菌L型涂布器将重悬菌体涂布在含Amp抗性的LB培养基的平板上。

(6)置于37℃温箱中，至完全吸收30min，待菌液渗入培养基后，倒置平皿继续培养14h。

6.重组子筛选

PCR鉴定：当菌落长至直径为1～2mm(约12～16h)时，于超净台上随机挑选单菌落。挑取平板上的单菌落，接至3mL Amp+抗性的LB液体培养液中，12～14℃振荡培养过夜，提取质粒DNA，并对质粒进行PCR鉴定(步骤同实施例1中的“7.重组子筛选”)。

测序鉴定：将PCR鉴定和酶切鉴定阳性的质粒送广州美吉生物公司进行测序。测序结果如SEQ ID No.2所示。

用DNAMAN软件分析测序结果，以确定阅读框是否正确，将测序鉴定正确的阳性重组质粒命名为pFastBac-HTB-PCV3Cap(图3)。

7.转化DH10Bac^TM大肠杆菌

将测序正确的阳性重组子转化DH10Bac^TM大肠杆菌：

(1)每次转化，在冰上解冻一支博迈德公司的DH10Bac^TM感受态细胞。

(2)每次转化时，轻轻混匀100μLDH10Bac^TM细胞并转移至一支预冷的15mL圆底聚丙烯管内。

(3)加入适量的pFastBac-Cap重组体至细胞中，轻轻混匀。切勿上下吹打混，pFastBac-Cap重组体：1ng(5μL)。

(4)冰孵细胞30分钟。

(5)42℃热激细胞45秒，切勿摇晃。

(6)立即将试管转移至冰上，冷却2分钟。

(7)向试管中添加900μL的室温LB养基。

(8)pFastBac^TM转化：37℃下，225rpm振荡试管4小时。pFastBac-HTB直接转化DH10Bac：37℃下，225rpm振荡试管1小时。

(9)每次pFastBac^TM转化：使用LB培养基制备10倍连续稀释的细胞(10^–1、10^–2、10^–3)。将100μL各种稀释度的细胞接种在含有50μg/mL卡那霉素、7μg/mL庆大霉素、10μg/mL四环素、100μg/mL Bluo-gal和40μg/mL IPTG的LB琼脂板上。

(10)将琼脂板置于37℃下孵育48小时。挑选白斑菌落分析。

8.PCR鉴定

选择白色菌斑点，接种到3mL含有50μg/mL卡那霉素、7μg/mL庆大霉素、10μg/mL四环素的LB培养基中培养，培养18h，取1μL作为模板之后进行PCR鉴定；对于每种样本，在0.5mL微量离心管中建立如下的20μL PCR反应：

表9菌落PCR反应体系

其中，引物M13F的序列为：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’；

引物M13R的序列为：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’。

反应程序为：95℃，5min；以下反应34个循环：95℃，30s；55℃，30s；72℃，2min；之后72℃，5min；最后4℃保存。

9.分离重组杆粒DNA

将PCR鉴定正确的菌液，按照Thermo Fisher公司的PureLink^TMHiPure PlasmidMiniprep Kit(Invitrogen^TM)说明书进行分离操作。

10.杆粒转染Sf9细胞(CRL-1711^TM，购自ATCC)

(1)确认Sf9细胞处于对数期(1.5～2.5×10⁶个细胞/mL)，且存活率高于95％。

(2)如果细胞密度在1.5～2.5×10⁶个细胞/mL范围内，且培养物中无抗生素(如果细胞密度不在此范围内或者细胞培养物中含有抗生素)：温下贴壁15分钟。

a.将1.5mL添加有10％FBS的Grace昆虫细胞培养基(无抗生素，购自ThermoFisher公司)与8.5mL不含添加剂的Grace昆虫细胞培养基(无FBS或抗生素)混匀，制备10mL平板培养基。

b.吸出培养基，每孔中加入第(2)a步所述的平板培养基。

(3)对于每种转染样本，按下列方法制备复合物：

a.使用前混匀(购自ThermoFisher公司)，取8μL稀释于100μL不含添加剂的Grace培养基中(无抗生素或血清)。短暂涡旋混匀。

注：可以将该混合物置于室温下至多30分钟。

b.取1μL杆状病毒DNA稀释于100μL不含添加剂的Grace培养基中(无抗生素或血清)，轻轻混匀。

c.将步骤b得到的稀释后的DNA与步骤a得到的稀释后的混合(总体积209μL)。轻轻混匀并在室温下孵育15～30分钟。

(4)逐滴加入210μL DNA-脂质体混合物或转染混合物(第(3)c步)至第2步获得的细胞中。27℃下孵育细胞3～5小时。

(5)吸出转染混合物，加入2mL完全培养基(如含有添加剂的Grace昆虫细胞培养基和10％FBS)，可以选择使用抗生素。

(6)27℃下孵育细胞72小时，直至观察到病毒感染征象。

(7)转染2个孔(6孔板)，一个孔的细胞重悬，1500rpm离心5min，收集后用于SDS-PAGE分析，对照组同以上处理方法。另一个孔的细胞冻存，离心收集上清，此为病毒储液，用于蛋白大量培养。

收集转染重组杆粒和空载杆粒(pFastBac-HTB空载，对照)后的细胞，进行SDS-PAGE分析，结果如图5所示，转染重组杆粒样品(泳道Cap-sf9)在30KDa左右处出现明显特异性条带，与预期的重组Cap的蛋白分子量大小一致，说明Cap在sf9细胞中得到表达。

11.蛋白大量培养

将上述得到病毒储液按照1:100接种于500mL sf900II培养基(购自ThermoFisher公司)，130rpm振荡培养72h，1500rpm离心收集细胞，细胞加20mL非变性哺乳动物细胞裂解液(碧云天公司)，用于蛋白纯化步骤。

12.蛋白纯化

裂解液为非变性哺乳动物细胞裂解液，其余步骤和试剂同实施例1“9.重组蛋白的纯化”。将最终获得的重组蛋白命名为重组蛋白Cap-sf9。

将制得纯化后的Cap蛋白进行SDS-PAGE电泳分析结果如图6所示，如图所示，在泳道2大约25～35KDa处，有一较为单一条带，大约30KDa，与目的蛋白大小一致，从图片来看，其纯度较纯，杂质较少，可以用于下一步实验。

实施例3检测试剂盒的组建

1.以纯化的PCV3Cap蛋白作为包被抗原的酶标板的制备

(1)溶液配制：

包被液(pH值为9.6的碳酸钠缓冲液)：将1.59g Na₂CO₃、2.93g NaHCO₃溶于900mL双蒸水中至完全溶解后，定容至1L，过滤除菌，置2～8℃保存备用。

洗涤液(20倍浓缩PBST溶液)：称取8.71g NaCl、0.26g KH₂PO₄、2.89g Na₂HPO₄·12H₂O溶于900mL双蒸水中，至完全溶解后，加入0.5mL Tween-20，定容至1L，过滤除菌，置室温(15～25℃)保存备用；使用时稀释到1倍。

封闭液：取3％的明胶，溶于800mL稀释至1倍的洗涤液，完全溶解后，定容至1L，置2～8℃保存备用。

(2)将实施例2制得的重组蛋白Cap-sf9用包被缓冲液稀释到2μg/mL，加入96孔酶联反应板(康宁生物公司)，100μL/孔，在37℃水浴箱作用24h。

(3)甩去孔内液体，用上述稀释至1倍的洗涤液洗涤酶联反应板，300μL/孔，洗涤两次，2分钟/次。

(3)加入封闭液，150μL/孔，在37℃水浴箱封闭2h。

(4)洗涤，方法同步骤(3)。

(5)37℃温箱放置2小时烘干，密封保存备用，制备得到包被了重组Cap蛋白的酶标板。

2.PCV3标准阳性血清：以剂量为10⁶TCID50的PCV3-China/GD2016毒滴鼻感染猪，之后28天采集血清作为标准阳性。采集分离得到血清。

3.PCV3标准阴性血清：经过PCR检测，PCV3抗原阴性的猪血清。

4.酶标二抗：HRP标记的兔抗猪IgG抗体，购自Sigma公司。

5.血清稀释液为稀释至1倍的前述洗涤液。

5.底物显色液A：过氧化脲溶液(购自广州丽珠生物有限公司)。

6.底物显色液B：四甲基联苯胺(TMB)溶液(购自广州丽珠生物有限公司)。

7.终止液配方：2M浓硫酸。

成功组建包含以纯化的PCV3Cap蛋白作为包被抗原的酶标板、PCV3标准阳性血清、PCV3标准阴性血清、酶标二抗、洗涤液、血清稀释液、底物显色液A、底物显色液B和终止液的新型猪圆环病毒3型的ELISA抗体检测试剂盒。

实施例4检测试剂盒的使用方法

(1)采集血液后，室温放置1小时，1200r/min，室温条件下离心8分钟，收集上层血清，待测。

(1)检测前，将试剂盒各组分恢复到室温(23～28℃)

(2)用血清稀释液将待测血清样品稀释50倍，用于检测；将PCV3标准阳性血清、PCV3标准阴性血清、稀释后的待检血清各100μL/孔加到前述酶标板中，室温(23～28℃)孵育1h。

(2)按300μL/孔用稀释至1倍的洗涤液洗板，洗3次，并在吸水纸上拍干；

(3)每孔加入100μL酶标二抗，室温(23～28℃)孵育30分钟；

(4)按300μL/孔用稀释至1倍的洗涤液洗板，洗3次，并在吸水纸上拍干；

(5)取底物显色液A和底物显色液B等体积混匀，每孔加100μL，在暗处显色15分钟；

(6)每孔加入50μL的终止液终止反应；

(7)在波长为450nm处测OD值；

(8)结果判读：OD450nm(样本)≥0.4判为阳性，OD450nm(样本)＜0.2判为阴性。当0.2≤OD450nm(样本)＜0.4判为可疑。(标准阴性对照OD450nm值＜0.2，标准阳性对照OD450nm值≥0.4，检测有效。)

结果计算：用所建立的间接法ELISA方法检测30份阴性血清，血清50倍稀释，100μL/孔，每份血清重复2孔，按照以上已确立的ELISA程序进行ELISA测定，读出OD450值。根据统计学原则，确定阴阳性血清临界值及可疑区间，且OD450值平均数+3×标准方差为其临界值。用SPSS软件分析，血清OD值呈正态分布。在规定的实验条件下，99.9％置信区间上，OD450值平均数+3×标准方差时，阴阳性临界值0.2，在95％置信区间值上，阴阳性临界值0.4，OD450nm(样本)≥0.4判为阳性，OD450nm(样本)＜0.2判为阴性。当0.2≤OD450nm(样本)＜0.4为其可疑区间。

实施例5酶标板的保存期稳定性实验

所用血清(于广东省福冈县某猪场采集)先用间接免疫荧光IFA测定临床血清样本阴阳性。

将实施例3所构建的PCV3抗体检测试剂盒中的酶标板，置37℃恒温箱中加速老化，将其余成分仍放于4℃。酶标板于37℃恒温箱中分别放置1d、2d、3d、4d、5d、6d后，依次取出继续保存于4℃。当酶标板于37℃恒温箱中放置至第7d后，取出所有之前保存于4℃的酶标板，对背景已知的6份被检血清(3份阳性血清P1、P2、P3，3份阴性血清N1、N2、N3)进行450nm处OD值的检测，以判断酶标板的保存情况。保存期测定结果如表10和图7所示：

表10酶标板的稳定性实验结果

由表10和图7可知，酶标板在37℃恒温箱中放置7d，其检测结果数值仍较稳定，说明本发明的试剂盒中的酶标板在37℃恒温箱中可保存一周，即相对于4℃能保存一年。

实施例6检测试剂盒特异性实验

用实施例2制得的重组蛋白Cap-sf9以10倍的反应浓度与PCV3阳性血清混合，进行阻断试验。重组蛋白Cap-sf9吸附阳性血清后，所测抗体的OD值显著降低，(N-P)/N的值均大于0.5，阻断阳性。阻断试验的结果表明，以Cap蛋白为抗原建立的间接法ELISA具有较好的特异性。

(N-P)/N＝(未阻断孔OD值-阻断孔OD值)/未阻断孔OD值(此比值大于0.5即判为阻断阳性)

用本发明的酶标板，分别取猪链球菌阳性血清(MRP)、大肠杆菌阳性血清(ED)和口蹄疫阳性血清(FMDV)等，进行交叉试验。结果如表11所示，PCV3阳性血清ELISA试验P/N值较高，在4.0以上，而与猪链球菌阳性血清、大肠杆菌阳性血清和口蹄疫阳性血清反应的P/N值则比较低，均在2.0以下，结果说明建立的间接法ELISA具有较好的特异性。

根据阻断试验和交叉试验结果可知该试剂盒其特异性较好，可用于PCV3的血清学诊断。

表11特异性试验结果

实施例7试剂盒敏感性实验

选择保存的1份强阳性血清(S1)、1份阳性血清(S2)、2份弱阳性血清(S3、S4)，(其中，强阳性血清是攻毒后42天猪血清、阳性血清是攻毒后30天猪的血清、弱阳性血清是攻毒后14天的血清。)一份阴性血清S5，分别进行倍比稀释(25～6400)，设置重复孔，按本发明所建立的ELISA方法进行检测，测定其OD450nm值，结果如表12所示，强阳性血清经6400倍稀释，阳性血清经1600倍稀释，弱阳性血清经400倍稀释，OD值均大于0.2，而阴性样品经25～6400倍稀释，OD值均小于0.2，表明该方法具有良好的敏感性。

表12敏感性试验结果

实施例8与IFA的结果进行符合率比较

将实施例4建立的PCV3-Cap蛋白ELISA方法对120份临床血清的检测结果与IFA测试结果进行比较。

1.IFA测试步骤

(1)96孔板中，待细胞生长至单层，接种PCV3病毒，MOI为0.1，37℃CO₂培养箱内培养48h。

(2)用PBS(0.01mol/L，pH7.4)洗3次，每次5分钟。

(3)用预冷的95％乙醇固定15min。

(4)用PBS(0.01mol/L，pH7.4)洗3次，每次5分钟。

(5)用1×PBST将待检测血清稀释50倍，每孔加100μL，37℃孵育1h。

(6)用PBS(0.01mol/L，pH7.4)洗3次，每次5分钟。

(7)避光下，加2000倍稀释的FITC标记的羊抗猪IgG(H+L)(购自于Santa公司)，37℃孵育1h。

(8)用PBS(0.01mol/L，pH7.4)洗3次，每次5分钟。

(9)荧光倒置显微镜下观察结果。

2.实验结果

根据在荧光显微镜下观察，阳性样品的孔内出现绿色荧光。以此方法，测定120份血清的阴阳性，得到47份阳性，73份阴性。再用本发明所建立的ELISA方法，平行检测这些样品的OD450值，结果得到51份阳性，63份阴性，6份可疑，包括可疑的样品在内，有10份结果不一致，总体比对率91.7％。

实施例9不同方法制得的Cap蛋白作为包被抗原的ELSIA结果比较试验

构建以纯化后的重组蛋白Cap-Ecoli作为包被抗原的ELISA试剂盒，除了包被抗原来源不一样以外，其它制备以及检测方法均与包被抗原为重组蛋白Cap-sf9的实施例3和实施例4一致。根据以重组蛋白Cap-sf9作为包被抗原建立的ELSIA检测方法检测结果，选取30份血清，其中15份阳性血清，15份阴性血清，用实施例1制得的重组蛋白Cap-Ecoli作为包被抗原建立的ELSIA检测方法进行检测，比较二者差异性，结果如表13所示，15份阳性样品中有1份变为可疑，而在阴性样品中，有2份变为阳性，其它样品一致性较好，考虑到可疑样品的OD值接近阳性结果，因此算的总体比对率为93.3％。

表13 2种蛋白建立的ELISA检测方法比对结果

备注：Cap-sf9：实施例2通过杆状病毒表达的Cap蛋白

Cap-Ecoli：实施例1通过大肠杆菌表达的Cap蛋白

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种新型猪圆环病毒3型的ELISA抗体检测试剂盒及其应用

<130> 1

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 214

<212> PRT

<213> 猪圆环病毒3型（PCV-3）

<400> 1

Met Arg His Arg Pro Ile Phe Arg Arg Arg Pro Arg Pro Arg Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg His Arg Arg Arg Tyr Ala Arg Arg Arg Leu Phe Ile Arg Arg

20 25 30

Pro Thr Ala Gly Thr Tyr Tyr Thr Lys Lys Tyr Ser Thr Met Asn Val

35 40 45

Ile Ser Val Gly Thr Pro Gln Asn Asn Lys Pro Trp His Ala Asn His

50 55 60

Phe Ile Thr Arg Leu Asn Glu Trp Glu Thr Ala Ile Ser Phe Glu Tyr

65 70 75 80

Tyr Lys Ile Leu Lys Met Lys Val Thr Leu Ser Pro Val Ile Ser Pro

85 90 95

Ala Gln Gln Thr Lys Thr Met Phe Gly His Thr Ala Ile Asp Leu Asp

100 105 110

Gly Ala Trp Thr Thr Asn Thr Trp Leu Gln Asp Asp Pro Tyr Ala Glu

115 120 125

Ser Ser Thr Arg Lys Val Met Thr Ser Lys Lys Lys His Ser Arg Tyr

130 135 140

Phe Thr Pro Lys Pro Ile Leu Ala Gly Thr Thr Ser Ala His Pro Gly

145 150 155 160

Gln Ser Leu Phe Phe Phe Ser Arg Pro Thr Pro Trp Leu Asn Thr Tyr

165 170 175

Asp Pro Thr Val Gln Trp Gly Ala Leu Leu Trp Ser Ile Tyr Val Pro

180 185 190

Glu Lys Thr Gly Met Thr Asp Phe Tyr Asp Thr Lys Glu Val Trp Ile

195 200 205

Arg Tyr Lys Ser Val Leu

210

<210> 2

<211> 645

<212> DNA

<213> 猪圆环病毒3型（PCV-3）

<400> 2

atgagacaca gacctatatt cagaagaaga ccccgcccac gcagacgacg acgccacaga 60

aggcgctatg ccagaagaag actattcatt aggaggccca cagctggcac atactacaca 120

aagaaatact ccaccatgaa cgtcatctcc gttggaaccc ctcagaataa caagccctgg 180

cacgccaacc acttcattac ccgcctaaac gaatgggaaa ctgcaattag ctttgaatat 240

tataagatac taaagatgaa agttacactc agccctgtaa tctcaccggc tcagcaaaca 300

aaaactatgt tcgggcacac agccatagat ctagacggcg cctggaccac aaacacttgg 360

ctccaagacg acccttatgc ggaaagttcc actcgtaaag taatgacttc taaaaaaaaa 420

cacagccgtt acttcacccc taaaccaatt ctggcgggaa caacctccgc tcacccagga 480

caaagcctct tctttttctc caggcccacc ccatggctca acacatatga ccccaccgtt 540

caatggggag cactgctttg gagcatttat gtcccagaaa aaactggaat gacagacttc 600

tacgacacca aagaagtttg gattcgttac aagtcagttc tctaa 645

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PCR上游引物

<400> 3

ggcggatcca tgagacacag acctatattc 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PCR下游引物

<400> 4

gggctcgagg agaactgact tgtaacgaat 30

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 菌落PCR引物M13 F

<400> 5

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 菌落PCR引物M13R

<400> 6

caggaaacag ctatgacc 18

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 荧光定量PCR引物F

<400> 7

atagatctag acggcgcctg g 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 荧光定量PCR引物R

<400> 8

ggtttggggg tgaagtaacg g 21

Claims (10)

1.一种新型猪圆环病毒3型的ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：包括以重组PCV3Cap蛋白作为包被抗原的酶标板。

2.根据权利要求1所述的新型猪圆环病毒3型的ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于还包括：PCV3标准阳性血清、PCV3标准阴性血清、酶标二抗、洗涤液、血清稀释液、底物显色液A、底物显色液B和终止液中的一种或至少两种。

3.根据权利要求1所述的新型猪圆环病毒3型的ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述的重组PCV3Cap蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或是具有通过突变、删除、插入或取代方式将如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中的至少1个氨基酸改变的序列。

4.根据权利要求1所述的新型猪圆环病毒3型的ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述的重组PCV3Cap蛋白来自于猪圆环病毒3型核衣壳蛋白。

5.根据权利要求1所述的新型猪圆环病毒3型的ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的重组PCV3Cap蛋白通过以下步骤制备得到：将编码所述的重组PCV3Cap蛋白的核苷酸序列克隆入表达载体构建重组表达载体；将所述重组表达载体转入表达系统中进行表达，纯化，得到所述的重组PCV3Cap蛋白。

6.根据权利要求1所述的新型猪圆环病毒3型的ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述的以重组PCV3Cap蛋白作为包被抗原的酶标板，通过如下步骤制备得到：将重组PCV3Cap蛋白稀释到2μg/mL，100μL/孔加到酶标板，37℃温育24h；取包被好的酶标板，300μL/孔洗涤液洗板2～5次，2～5分钟/次；再加入150μL/孔封闭液，37℃温育2h；取封闭后的酶标板，300μL/孔洗涤液洗板2～5次，2～5分钟/次，制备得到以重组PCV3Cap蛋白作为包被抗原的酶标板。

7.根据权利要求1所述的新型猪圆环病毒3型的ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述的封闭液为含3％明胶的PBST缓冲液。

8.根据权利要求1所述的新型猪圆环病毒3型的ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述的酶标二抗为HRP标记的兔抗猪IgG抗体。

9.权利要求1～8任一项所述的新型猪圆环病毒3型的ELISA抗体检测试剂盒的应用，其特征在于：所述的应用为在猪圆环病毒III型检测中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的应用包括以下步骤：

(1)用血清稀释液将待测血清样品稀释，将PCV3标准阳性血清、PCV3标准阴性血清、稀释后的待检血清样品各100μL/孔加到前述酶标板中，23～28℃孵育1h；

(2)用洗涤液洗板，300μL/孔，洗3～5次；

(3)每孔加入100μL酶标二抗，23～28℃孵育30分钟；

(4)用洗涤液洗板，300μL/孔，洗3～5次；

(5)取底物显色液A和底物显色液B等体积混匀，每孔加100μL，在暗处显色15分钟；

(6)每孔加入50μL的终止液终止反应；

(7)在波长为450nm处测OD值；

(8)结果判读：OD450nm(样本)≥0.4判为阳性，OD450nm(样本)＜0.2判为阴性，当0.2≤OD450nm(样本)＜0.4判为可疑。