CN109425738B - 猪圆环病毒3型抗体检测试剂盒及其应用 - Google Patents

猪圆环病毒3型抗体检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种猪圆环病毒3型ELISA抗体检测试剂盒，该ELISA抗体检测试剂盒包括包被有猪圆环病毒3型Cap蛋白的支持介质、二抗、显色液。本发明还涉及一种猪圆环病毒3型抗体检测试纸，其中，该抗体检测试纸检测线上固定化有猪圆环病毒3型Cap蛋白。ELISA抗体检测试剂盒和抗体检测试纸均可用对PCV3抗体进行特异性检测，避免了与其它病原所引起的抗体进行混淆；且具有操作简便、快速的优点，可准确用于检测猪场特别是小规模化猪场中的猪群。

Description

猪圆环病毒3型抗体检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及猪圆环病毒3型抗体检测试剂盒、其制备方法与应用，属于生物技术领域。
背景技术
猪圆环病毒(Porcine circoviruses，PCV)是单股环状的DNA病毒，基因组长度约为1.7kb，是最小的动物DNA病毒之一。已经确定有两种类型的PCV，即猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)。PCV1于1974年首次在PK细胞培养物中作为一种污染物鉴定而发现，其对猪只没有致病性。PCV2于1998年首次报道，其在临床条件下能引起猪只的猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus associated diseases，PCVAD)，主要引起仔猪多系统衰竭综合征、肺炎、猪皮炎和肾病综合征和繁殖障碍，主要表现为呼吸、泌尿、肠道、淋巴、心血管、神经、繁殖系统以及皮肤的功能紊乱，对全世界的生猪养殖造成了重大的经济损失。
近来，在一起猪的繁殖障碍病例中，分离到一株病毒基因组为2.0kb的圆环病毒，经后续试验证实，其与已知的圆环病毒无论在核苷酸还是氨基酸序列的同源性均小于50％，根据国际病毒学分类委员会的标准，圆环病毒属中同一种的病毒应该具有＞75％的基因组核苷酸序列的同源性，Cap蛋白＞70％的氨基酸序列的同源性，因此可以肯定这是一种新的猪圆环病毒。其能引起猪的皮炎肾病综合征、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应。
目前，该病毒的检测方法为免疫组化IHC和聚合酶链式反应PCR方法，但这两种方法均需要专业的技术人员和专门的仪器设备且耗时长，不利于进行流行病学的调查，不利于养殖场特别是小规模或散户对动物的快速检测，不便于了解动物群是否感染及感染后抗体高低，进一步无法根据检测结果及时采取相应的治疗和防控措施；也不利于针对已经免疫的猪群检测其产生的抗体水平的高低，以及根据该结果进一步采用何种加强防控手段，给养殖业造成巨额经济损失。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供了猪圆环病毒3型抗体检测试剂盒及其制备方法与应用。
本发明涉及PCV3ELISA抗体检测试剂盒，所述PCV3ELISA抗体检测试剂盒能准确检测血清中的PCV3抗体，灵敏度高，能较现有技术更快地检测到PCV3的感染。同时能用于对免疫后猪血清中抗体水平进行监测。
本发明涉及猪圆环病毒3型抗体检测试纸，能准确检测血清中的PCV3抗体，检测快速、准确，能用于对猪血清中PCV3抗体的现场检测。
本发明还涉及上述试剂盒和试纸条在检测血清中PCV3抗体和抗体水平中的应用。
由于所制备的试剂盒和试纸条可对PCV3抗体进行特异性检测，避免了与其它引发猪的皮炎肾病综合征、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应病原所引起的抗体进行混淆；临床可准确判断是否由PCV3导致的感染；有利临床快速判断、检测猪场特别是小规模化猪场中的猪群是否存在PCV3抗体，以确定该猪群是否引发感染；可用于流行病学调查，便于了解该病在动物群中发生的特征，便于对疫病进行诊断和防控；检测最短需要10分钟，最长需要2～3小时，便于进行田间试验，弥补了现有技术中的产品或方法无法监测动物样本的问题。
所制备的ELISA试剂盒可检测出感染动物抗体的高低，便于根据结果及时采取相应的预防和治疗措施，以挽回疫病感染、误诊、不当防控措施所带来的损失。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
猪圆环病毒3型为一种基因组2.0kb的圆环病毒，其与已知的圆环病毒无论在核苷酸还是氨基酸序列的同源性均小于50％，是一种新的猪圆环病毒，现在已知其能引起猪的皮炎肾病综合征、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应。
术语“猪圆环病毒3型Cap蛋白”可以是重组表达的Cap蛋白，其表达体系可以为原核表达系统、真核表达系统，也可以是通过人工合成的合成肽抗原。真核表达系统包括酵母表达系统和哺乳动物细胞表达系统。
术语“磷酸盐缓冲液”指含有磷酸或其盐并被调至生理性或要求的pH值的溶液，是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液。一般地，磷酸盐缓冲液是从磷酸或磷酸盐(包括但不限于钠和钾盐)制备的。本领域已经知道一些磷酸盐，例如磷酸二氢钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸氢二钾、磷酸钠和磷酸钾可以用于制备磷酸盐缓冲液。已经知道磷酸盐是以盐的水合物形式存在的，因此该水合物可以用于制备磷酸盐缓冲液。由于缓冲液的二级解离作用，缓冲的pH值范围很宽，例如约pH4至约pH10的范围，优选约pH5至pH9的范围，更优选约pH6至约pH8的范围，最优选约pH7.4。进一步优选地，所述磷酸盐缓冲液为含氯化钠和氯化钾的磷酸盐缓冲液。
本发明涉及一种猪圆环病毒3型ELISA抗体检测试剂盒，其中，所述ELISA抗体检测试剂盒包括包被有猪圆环病毒3型Cap蛋白的支持介质、二抗、显色液。
本发明的猪圆环病毒3型ELISA抗体检测试剂盒能够准确检测血清中PCV3抗体，以确定PCV3的感染状况。
作为本发明的一种实施方式，所述ELISA抗体检测试剂盒中，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白为序列SEQ ID No.1编码的蛋白。
本发明的ELISA抗体检测试剂盒能用于对血清中抗体水平进行检测，可以据此提供相应的预防措施，为猪场，特别是小型猪场提供有效的保护。
作为本发明的一种优选实施方式，所述ELISA抗体检测试剂盒中，所述包被有猪圆环病毒3型Cap蛋白的支持介质为微孔板，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白的包被浓度为2～4μg/ml，包被量为200～400ng/孔。
作为本发明的一种实施方式，所述ELISA抗体检测试剂盒中，所述试剂盒还包括样品稀释液、洗涤液、终止液、阳性对照、阴性对照。
本发明的试剂盒能在血清样品10倍稀释的条件下，仍能灵敏检测其中PCV3抗体，并对该抗体水平进行检测。
作为本发明的一种优选实施方式，所述ELISA抗体检测试剂盒中，所述样品稀释液为磷酸盐缓冲液；所述洗涤液为含0.05％V/V Tween-20的磷酸盐缓冲液；所述二抗为酶标记的羊抗猪二抗或酶标记的兔抗猪二抗；所述显色液包括A液和B液，所述A液为TMB 20mg加入10ml无水乙醇后用双蒸水定容至100ml，混匀后无菌分装；B液为柠檬酸2.1g、无水Na2HPO42.82g、0.75％的过氧化氢尿素0.64ml用双蒸水溶解并定容至100ml，混匀后无菌分装；所述终止液为2M H2SO4。
本发明涉及所述ELISA抗体检测试剂盒的制备方法：步骤1)用基因工程手段制备序列SEQ ID No.1编码的猪圆环病毒3型Cap蛋白；步骤2)将所述制备的猪圆环病毒3型Cap蛋白按2～4μg/ml、100μl/孔包被于微孔板，2～8℃包被过夜或37℃包被2小时后洗涤、封闭；步骤3)分别配制样品稀释液、洗涤液、二抗、显色液、终止液、阳性对照、阴性对照；步骤4)将所述步骤2)包被的微孔板及所述步骤3)制备的样品稀释液、洗涤液、二抗、显色液、终止液、阳性对照、阴性对照组装成试剂盒。
本发明的ELISA抗体检测试剂盒，PCV3 Cap蛋白包被浓度仅为2～4μg/ml，包被量仅为200～400ng/孔，即能实现灵敏检测。
作为本发明的一种实施方式，所述步骤2)中封闭时所用封闭液为1～5％牛血清白蛋白BSA、5％脱脂奶、5％羊血清、5％兔血清、1％明胶或1％酪蛋白。
本发明还涉及所述ELISA抗体检测试剂盒的检测方法：步骤①收集临床血清或血浆样品作为待检样品，先将样品稀释液按100μl/孔加入已包被的微孔板中，再按10μl/孔加入所述待检样品，同时设阳性对照、阴性对照，置于37℃温育45-90分钟或室温孵育60分钟；步骤②弃反应液，用洗涤液洗涤2～4次，拍干或抽干；步骤③将二抗用样品稀释液稀释按1:800～1:2000，按100μl/孔加入后并置37℃温育30-45分钟或室温孵育45分钟；步骤④按步骤②进行洗涤；步骤⑤加显色液A液、B液各50μl/孔，置37℃温育10分钟或室温孵育15分钟；步骤⑥加终止液50μl/孔，10分钟内用酶标仪读取吸光度OD450nm或OD450nm-630nm值(简称为OD值)，根据判定标准进行判定。
本发明还涉及一种猪圆环病毒3型抗体检测试纸，其中，所述抗体检测试纸包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述硝酸纤维素膜与金标垫接触或与样品垫、金标垫接触使得抗体的结合体能在其上向底板第二端迁移；所述硝酸纤维素膜上包括一条检测线和一条质控线，所述检测线上固定化有猪圆环病毒3型Cap蛋白。
本发明的猪圆环病毒3型抗体检测试纸能实现快速、灵敏的临床检测。
作为本发明的一种实施方式，本发明猪圆环病毒3型抗体检测试纸中，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白为序列SEQ ID No.1编码的蛋白；所述检测线上固定的猪圆环病毒3型Cap蛋白固定时Cap蛋白含量为1.0mg/ml。
作为本发明的一种实施方式，本发明猪圆环病毒3型抗体检测试纸中，所述金标垫上含有胶体金标记的金黄色葡萄球菌A蛋白，所述质控线上固定化有鸡抗SPA抗体或兔抗SPA抗体；或者所述金标垫上含有胶体金标记的兔抗猪IgG，所述质控线上固定化有金黄色葡萄球菌A蛋白；或者所述金标垫上含有胶体金标记的金黄色葡萄球菌A蛋白，所述质控线上固定化有猪IgG。
本发明的猪圆环病毒3型抗体检测试纸中，可以通过多种蛋白对之间的结合过程以监测检测试纸系统抗原抗体反应的正常进行，实现质量检测过程。
作为本发明的一种实施方式，本发明猪圆环病毒3型抗体检测试纸中，所述质控线上固定的鸡抗SPA抗体或兔抗SPA抗体含量为1.0～3.0mg/ml，或者质控线上固定的所述金黄色葡萄球菌A蛋白含量为2.0～3.0mg/ml，或质控线上固定的所述猪IgG含量为2.0～3.0mg/ml；所述检测线、质控线蛋白固定量为1μl/cm。
作为本发明的一种实施方式，所述抗体检测试纸还包括样品处理液，所述样品处理液为磷酸盐缓冲液。
本发明涉及所述抗体检测试纸的制备方法，所述制备方法包括：步骤(1)制备胶体金并使用胶体金标记金黄色葡萄球菌SPA或兔抗猪IgG，并将胶体金标记金黄色葡萄球菌或胶体金标记兔抗猪IgG吸附在金标垫上；步骤(2)用基因工程手段表达猪圆环病毒3型Cap蛋白，作为检测线包被液，连同质控线包被液分别固定于硝酸纤维素膜的检测线、质控线处；步骤(3)将样品垫、步骤(1)制备的金标垫、步骤(2)制备的硝酸纤维素膜、吸水垫组装成检测试纸。
作为本发明的一种实施方式，所述步骤(1)中所述猪圆环病毒3型Cap蛋白为序列SEQ ID No.1编码的蛋白。
作为本发明的一种实施方式，所述步骤(1)中，所述金标垫上吸附胶体金标记金黄色葡萄球菌时，所述步骤(2)中质控线包被液包括鸡抗SPA抗体或兔抗SPA抗体，或猪IgG；所述金标垫上吸附胶体金标记兔抗猪IgG时，所述步骤(2)中质控线包被液包括金黄色葡萄球菌A蛋白。
作为本发明的一种实施方式，所述步骤(2)所述检测线包被液中所述猪圆环病毒3型Cap蛋白的含量为1.0mg/ml；所述质控线包被液中，所述鸡抗SPA抗体或兔抗SPA抗体含量为1.0～3.0mg/ml，或所述金黄色葡萄球菌A蛋白含量为2.0～3.0mg/ml，或所述猪IgG含量为2.0～3.0mg/ml。
本发明涉及所述抗体检测试纸的检测方法，所述检测方法包括：步骤①收集临床血清或血浆样品，将其与样品处理液按1︰1V/V混合，取50～150μl混合液加入加样孔中心，水平静置；步骤②10分钟后在检测试纸条的检测区观察记录结果，并依据判定标准进行判定。
本发明涉及所述ELISA抗体检测试剂盒及所述抗体检测试纸的应用，所述应用包括疫苗免疫后的效果评价、离体组织的流行病学调查等。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1猪圆环病毒3型Cap蛋白的制备
1.1猪圆环病毒3型的分离鉴定
病料来源：在国内一商品化猪场，与历史平均值相比，出现母猪死亡率增加9.4％，受孕率降低了1.2％，木乃伊胎增加8.2％的现象。临床表现上，受影响的母猪表现出厌食，呈多灶性丘疹，斑点和表面皮炎的症状。在流产的窝中含有不同胎龄的木乃伊化胎儿，与PCV2感染引起流产的症状一致。虽然在母猪中观察到的总体临床表现以及流产症状与PCV2导致的繁殖障碍疾病一致，但所有母猪的不同组织，包括肾、淋巴结、肺、皮肤以及死胎，通过免疫组化和定量PCR对PCV2、PRRSV、PPV、CSFV、猪肺炎支原体检测均为阴性。为进一步查清原因，选取各组织病料进行病原分离。
病毒株的分离与培养：将病料以1：10(体积比)加入DMEM培养液，研磨，制备组织悬液，组织悬液经反复3次冻融后，于12000r/min离心15min，收集上清液，上清液再经0.22μm滤膜滤器过滤，滤液在PK15细胞上传代，37℃培养1h，替换加入含2％犊牛血清的DMEM培养液，置于37℃培养5日。收获病毒，经2次冻融后，收获含病毒的培养液。
PCR及测序分析鉴定病毒种属：取以上步骤的病毒培养物，用核酸提取试剂盒提取病毒样品的核酸，使用圆环病毒种属特异性引物进行PCR扩增鉴定，结果显示，PCR扩增出2000bp目的条带。PCR产物送测序公司进行核苷酸序列测定，序列测定结果进行遗传进化分析。结果显示该病毒株全基因组序列和氨基酸序列同已经报道过的其他圆环病毒的同源性都少于50％，而根据国际病毒学分类委员会的标准，圆环病毒属中同一种的病毒应该具有＞75％的基因组核苷酸序列的同源性，Cap蛋白＞70％的氨基酸序列的同源性，因此可以肯定，它是一种新的猪圆环病毒，也是目前猪体上发现的第三种圆环病毒。
1.2 pET28a-PCV3-Cap表达载体的构建
PCV3病毒DNA的提取：病毒DNA提取试剂盒购自天根生物；T4DNA Ligase购自BioLab；pET28a质粒购自Novagen；琼脂糖凝胶胶回收试剂盒购自天泽生物，其他试剂均为分析纯。按照病毒DNA提取试剂盒说明书，取0.2ml猪圆环病毒3型病毒液于无菌1.5ml离心管中，加0.4ml VB于病毒液中，旋涡混匀，室温静置10分钟。加0.45ml AD buffer于病毒液中，用力混匀。将VB柱放入2ml收集管中，取0.6ml混合液加入VB柱中，14000g离心1分钟，将剩余的混合液加入VB柱中，14000g离心1分钟，弃掉2ml收集管，将VB柱放入新的2ml收集管中，加入0.4ml W1 buffer，14000g离心30秒，加0.6ml Wash buffer于VB柱，14000g离心30秒，然后不加buffer再空置离心3分钟，将VB柱放入新的1.5ml EP管中，加入50μl RNasefree water置于膜中央，静置3分钟，14000g离心1分钟，EP管中离心下来的液体即为DNA基因组溶液。
Cap基因扩增：根据Cap基因5’和3’末端的保守区序列合成寡聚核苷酸引物，进行PCR。设计引物序列Cap-F：CCACAGAAGGCGCT ATGTC，Cap-R：CCGCATAAGGGTCGTCTTG。进行PCR扩增Cap蛋白基因片段。将PCR产物送Invitrogen公司测序，根据测序结果对Cap基因进行密码子优化，优化后的Cap基因序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
表达载体构建：优化后Cap基因送苏州泓迅生物科技股份有限公司进行全序列合成，并连接到pET28a质粒上。连接后的质粒和分子伴侣质粒pG-Tf2共转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单克隆在含有100μg/ml卡那霉素和20μg/ml氯霉素的LB培养基中培养过夜，提取质粒后测序分析，阳性克隆即为表达菌株pET28a-PCV3-Cap/pG-Tf2/E.Coli BL21(DE3)。
1.3 PCV3 Cap蛋白的表达
将实施例1.2中制备的pET28a-PCV3-Cap/pG-Tf2/E.Coli BL21(DE3)菌株接种到含50-100μg/ml卡那霉素和20μg/ml氯霉素的LB培养基中，同时LB培养基中含有5-10ng/ml四环素用于分子伴侣蛋白的诱导表达，接种量为1％V/V，37℃振荡培养。当OD600nm＝0.4～0.6时，于28℃放置30分钟。加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为0.1～1.0mM，28℃振荡培养24小时。培养结束后，收集菌体，并用磷酸盐缓冲液重悬菌体，超声破碎，离心取上清。表达产物中可溶性目的蛋白含量较高，表达量可达菌体蛋白总量的25％。经浓缩、纯化，用碧云天公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒方法测定PCV3 Cap蛋白含量为1.8mg/ml。
实施例2猪圆环病毒3型ELISA抗体检测试剂盒的制备
2.1 ELISA抗体检测试剂盒的制备
ELISA抗体检测试剂盒(简称试剂盒1)包括以下组分：
包被的微孔板：用pH9.6碳酸盐缓冲液将实施例1制备的猪圆环病毒3型Cap蛋白按包被浓度2～4μg/ml、包被量200～400ng/孔、100μl/孔包被于微孔板，2～8℃包被过夜或37℃包被2小时；弃包被液，用磷酸盐缓冲液洗涤2～4次，拍干或抽干；加入封闭液(如1～5％牛血清白蛋白BSA、5％脱脂奶、5％羊血清、5％兔血清、1％明胶或1％酪蛋白)于37℃封闭1.5～2小时；弃封闭液，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，拍干或抽干。
样品稀释液：磷酸盐缓冲液。
洗涤液：含0.05％V/V Tween-20的磷酸盐缓冲液。
二抗：酶标的羊抗猪二抗如过氧化物酶HRP标记羊抗猪IgG、碱性磷酸酶AP标记羊抗猪IgG，或酶标的兔抗猪二抗如过氧化物酶HRP标记兔抗猪IgG、碱性磷酸酶AP标记兔抗猪IgG，使用时进行1:800～1:2000稀释。
显色液：包括A液和B液，其中，A液为TMB 20mg加入10ml无水乙醇，用ddH2O定容至100ml，混匀后无菌分装；B液为柠檬酸2.1g、无水Na2HPO4 2.82g、0.75％的过氧化氢尿素0.64ml，用ddH2O定容至100ml，混匀后无菌分装。
终止液：2M H2SO4。
阳性对照：用猪圆环病毒3型强毒株攻毒猪只，经PCR方法检测PCV3为阳性的猪血清。
阴性对照：经PCR方法检测PCV3为阴性的猪只或未吃初乳仔猪的血清或由样品稀释液代替。
另外根据Palinski等(Palinski et al.A Novel Porcine CircovirusDistantly Related to Known Circoviruses Is Associated with Porcine Dermatitisand Nephropathy Syndrome and Reproductive Failure.Journal of Virology,2017,91(1):e017879-16)的报道，按其制备方法及序列制备PCV3 Capsid蛋白(简称为PCV3 Cap-2017)，并作为包被原按该报道中的2μg/ml包被于微孔板中，按上述方法制备试剂盒，作为试剂盒1VS，判定标准：OD值≥0.87为阳性，OD值＜0.87为阴性。
2.2试剂盒1的检测方法
试剂盒1的检测方法包括：①收集临床血清或血浆样品作为待检样品，先将样品稀释液按100μl/孔加入已包被的微孔板中，再按10μl/孔加入待检样品，即稀释倍数为10倍；同时设阳性对照、阴性对照，置37℃温育45-90分钟或室温孵育60分钟；②弃反应液，用洗涤液洗涤2～4次，拍干或抽干；③将二抗用样品稀释液稀释，稀释倍数按1:800～1:2000，按100μl/孔加入后置37℃温育30-45分钟或室温孵育45分钟；④弃反应液，用洗涤液洗涤2～4次，拍干或抽干；⑤加显色液A液、B液各50μl/孔，置37℃温育10分钟或室温孵育15分钟；⑥加终止液50μl/孔，10分钟内用酶标仪读取吸光度OD450nm或OD450nm-630nm值(简称为OD值)，根据判定标准进行判定。
试剂盒1的判定标准为：OD值≥0.3+OD阴性对照均值，判为PCV3抗体阳性；OD值＜0.3+OD阴性对照均值，判为PCV3抗体阴性。
2.3试剂盒1与试剂盒1VS加样模式的优化
取实施例2.1制备的试剂盒1、1VS，分别将阳性对照、阴性对照与样品稀释液V/V按照下列几种比例加样：1:1(50μl+50μl)、1:2(40μl+80μl)、1:4(20μl+80μl)、1:6(15μl+90μl)、1:10(10μl+100μl)，同时设空白对照，按实施例2.2的检测方法分别检测PCV3阳性对照、阴性对照系列稀释液，记录OD值，计算相应阳性对照OD值与阴性对照OD值的比值即P/N值，选择P/N值最大的加样模式作为该试剂盒的加样模式，结果详见表1。
表1试剂盒1与试剂盒1VS加样模式的优化结果
Figure BDA0001396930590000111
注：试剂盒1空白对照的OD值为0.016，试剂盒1VS空白对照OD值为0.018。
由表1可知：试剂盒1不同加样模式相比，只有将待检样品与样品稀释液按V/V1:10(10μl+100μl)加样后检测的P/N值才最大(可达88.1)，且阴性对照的OD值与空白对照的OD值更为接近；试剂盒1VS不同加样模式相比，将待检样品与样品稀释液按V/V1:1(50μl+50μl)加样后检测的P/N值最大(可达16.2)，但阴性对照OD值远远高于空白对照OD值。相比而言，试剂盒1检测待检样品时再少量待检样品(10μl)的情况下便可获得准确的结果，在节省样本的情况下还具有更好的特异性和敏感性。
实施例3猪圆环病毒3型抗体胶体金检测试纸条的制备
为便于在现场对采集后临床样品的初步检测和评判，制备快速检测试剂盒。
3.1胶体金检测试纸条的制备
胶体金的制备：胶体金可用常规技术制备，如：白磷还原法、抗坏血酸还原法、柠檬酸三钠还原法、鞣酸-柠檬酸钠还原法、硼氢化钠还原法中的任一方法。本实施例以柠檬酸三钠还原法为例描述，详情为：配制0.01％氯金酸HAuC14水溶液，取100ml加热煮沸，搅拌下准确加入1.0ml的1％柠檬酸三钠Na3C6H5O7·2H2O水溶液，继续加热煮沸15min，冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积100ml即为胶体金溶液，置于2～8℃避光保存。
胶体金标记金黄色葡萄球菌A蛋白(简称胶体金-SPA复合物)的制备：取10ml胶体金溶液，用0.1mol/l K2CO3调节胶体金溶液pH5.9～6.2，加入50～60μg金黄色葡萄球菌A蛋白(Staphylococal Protein A,SPA)匀速搅拌10min，逐滴加入适量聚乙二醇PEG，匀速搅拌30min后置于4℃，2小时后4℃2000转/分钟离心20min，弃去沉淀，上清用13000转/分钟继续离心30min，弃上清，收集沉淀复溶于1ml含0.2mg/ml PEG的磷酸盐缓冲液中，即为胶体金-SPA复合物，2～8℃避光保存备用。
胶体金标记兔抗猪IgG(简称胶体金-兔抗猪IgG复合物)的制备：取10ml胶体金溶液，用0.1mol/l K2CO3调节胶体金溶液pH9.0，滴加30～40μl 1mg/ml的兔抗猪IgG，匀速搅拌30min后加入适量的10％BSA，继续匀速搅拌30min后置于4℃，2小时后4℃2000转/分钟离心20min，弃去沉淀，上清用13000转/分钟继续离心30min，弃上清，收集沉淀复溶于1ml含终浓度1％BSA的磷酸盐缓冲液中，即为胶体金-兔抗猪IgG复合物，2～8℃避光保存备用。
试剂盒2的制备：将胶体金-SPA复合物均匀加到玻璃纤维膜上，于干燥间(温度为20～25℃、湿度低于30％)干燥12～16小时即为金标垫；将实施例1制备的PCV3 Cap蛋白用磷酸盐缓冲液稀释至1mg/ml，用喷膜仪按1μl/cm喷至硝酸纤维素膜靠近金标垫处作为检测线T，将鸡抗SPA抗体或兔抗SPA抗体用磷酸盐缓冲液稀释至1～3mg/ml，用喷膜仪按1μl/cm喷至硝酸纤维素膜T下方作为质控线C，即为含T/C的硝酸纤维素膜；将玻璃纤维膜制成的样品垫、金标垫、含T/C的硝酸纤维素膜、吸水纸制成的吸水垫依序纵向粘贴于底板，彼此衔接紧密，用自动斩切机横向裁成合适大小，即为试剂盒2。
试剂盒3的制备：将胶体金-兔抗猪IgG复合物均匀加到玻璃纤维膜上，于干燥间(温度为20～25℃、湿度低于30％)干燥12～16小时即为金标垫；将实施例1制备的PCV3 Cap蛋白用磷酸盐缓冲液稀释至1mg/ml，用喷膜仪按1μl/cm喷至硝酸纤维素膜靠近金标垫处作为检测线T，将金黄色葡萄球菌A蛋白用磷酸盐缓冲液稀释至2～3mg/ml，用喷膜仪按1μl/cm喷至硝酸纤维素膜T下方作为质控线C，即为含T/C的硝酸纤维素膜；将玻璃纤维膜制成的样品垫、金标垫、含T/C的硝酸纤维素膜、吸水纸制成的吸水垫依序纵向粘贴于底板，彼此衔接紧密，用自动斩切机横向裁成合适大小，即为试剂盒3。
试剂盒4的制备：将胶体金-SPA复合物均匀加到玻璃纤维膜上，于干燥间(温度为20～25℃、湿度低于30％)干燥12～16小时即为金标垫；将实施例1制备的PCV3 Cap蛋白用磷酸盐缓冲液稀释至1mg/ml，用喷膜仪按1μl/cm喷至硝酸纤维素膜靠近金标垫处作为检测线T，将猪IgG用磷酸盐缓冲液稀释至2～3mg/ml，用喷膜仪按1μl/cm喷至硝酸纤维素膜T下方作为质控线C，即为含T/C的硝酸纤维素膜；将玻璃纤维膜制成的样品垫、金标垫、含T/C的硝酸纤维素膜、吸水纸制成的吸水垫依序纵向粘贴于底板，彼此衔接紧密，用自动斩切机横向裁成合适大小，即为试剂盒4。
3.2试剂盒2～4的检测方法
试剂盒2～4的检测方法包括：①收集临床血清或血浆样品，将其与样品处理液按1︰1V/V混合，取50～150μl混合液加入加样孔中心，水平静置；②10分钟后在检测试纸条的检测区观察记录结果，并依据判定标准进行判定。
结果判定标准：质控线显色即试验成立，此时检测线显色即为阳性、不显色即为阴性；质控线未显色即试验不成立，无论检测线是否显色均判定为无效结果，需重测。
实施例4试剂盒1～4及试剂盒1VS特性研究及应用
4.1特异性研究
收集临床猪圆环病毒2型PCV2阳性血清、猪圆环病毒1型PCV1阳性血清、猪伪狂犬病病毒PRV阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV阳性血清、猪瘟病毒CSFV阳性血清、猪口蹄疫病毒FMDV阳性血清以及PCV3强毒株攻毒后的阳性血清，均经相应商品化试剂盒验证，用实施例2～3制备的试剂盒1～4按相应的检测方法进行检测。结果：试剂盒1与PCV3强毒株攻毒后的阳性血清检测OD值为0.5，根据判定标准判为阳性，而与其它病毒的阳性血清检测OD值均≤0.150，根据判定标准均判为阴性；试剂盒2～4与PCV3强毒株攻毒后的阳性血清检测为阳性，与其它病毒的阳性血清检测结果均为阴性，表明试剂盒1～4均不与其它猪只常见病毒发生交叉反应，特异性良好，可用于后续研究。
4.2敏感性研究
将实施例2～3制备的试剂盒1～4、1VS按照相应的检测方法、加样模式分别检测PCV3强毒株攻毒后42天的阳性血清，结果均为阳性。将阳性血清2倍梯度稀释后分别用试剂盒1～4检测。结果见表2，试剂盒1检测稀释倍数1:2～1:32的样品均为阳性，稀释倍数1:64～1:128的样品为阴性；试剂盒2～4检测稀释倍数1:2～1:16的样品均为阳性，稀释倍数1:32～1:128的样品均为阴性，而试剂盒1VS仅检测稀释倍数1:2～1:8的样品为阳性、其余均为阴性。表明试剂盒1的灵敏度比试剂盒2～4、1VS均高，试剂盒2～4灵敏度比试剂盒1VS也高，而且试剂盒1耗时2～4小时，试剂盒2～4仅需10分钟，具有更加简单快速的特点。
表2试剂盒1～4及1VS敏感性检测结果汇总
Figure BDA0001396930590000151
注：+表示阳性，－表示阴性。
4.3应用
4.3.1抗体监测
4.3.1.1仔猪的抗体监测
选择未吃初乳20头仔猪奶粉人工喂养至28～30日龄，经PCR检测PCV2、PCV3均为阴性，随机分成①、②、③、④4组，5头/组。①、②、③组分别免疫实施例1猪圆环病毒3型Cap蛋白按常规方式制备的免疫原性组合物(终含量为100、50、20μg/ml，2ml/头)；④组仔猪不免疫作为攻毒对照组，接种生理盐水2ml/头。免疫前及后7日、14日、21日、28日、35日分别采血分离血清用试剂盒1～4、1VS按相应的检测方法及加样模式进行检测(结果见表3)，同时于免疫后35日各组进行攻毒，攻毒剂量为猪圆环病毒3型SG株(Porcine Circovirus type 3，strain SG，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.V201712，保藏日期为2017年3月23日，保藏地址：中国武汉·武汉大学)，105.0TCID50/头，观察攻毒后各组仔猪的临床症状，结果见表3。
表3试剂盒1～4监测仔猪抗体结果
Figure BDA0001396930590000161
注：试剂盒1和试剂盒1VS的阳性判界均为0.305。
由表3可知：对照组即④组发病明显，试验成立。试剂盒1具有良好的敏感性，①组免疫后21天OD均值为0.449，5/5均转阳；②组免疫后28天OD均值为0.412，5/5均转阳；③组免疫后35天OD均值为0.414，5/5均转阳；①～③均与④组有显著性差异。试剂盒2～4检测的结果具有良好的一致性，①组免疫后21天有阳性样品，阳性率均为3/5，免疫后28天和35天均5/5阳性；②组免疫后28天有阳性样品，阳性率均为1/5，免疫后35天均5/5阳性；③组免疫以后35天有阳性样品，阳性率均为2/5。而根据已有报道制备的试剂盒1VS检测时，①组免疫后35天OD均值为0.929，5/5均转阳；②组免疫后35天OD均值为0.959，5/5均转阳；③组免疫后35天OD均值为0.781，5/5均仍为阴性。结合表3可知，当使用试剂盒1评价不同免疫剂量的免疫效果时，上升趋势更为明显，检出时间更早；当用试剂盒2～4检测时，虽检出时间稍微滞后，但检测趋势一致、结果准确，均能较好反应不同免疫剂量的免疫效果；而根据已有报道制备的试剂盒1VS仅检测较高免疫量时才能反应抗体消长趋势，较低免疫量时检测易出现假阴性。
4.3.1.2母猪的抗体监测
选择20头母猪经PCR检测PCV2、PCV3均为阴性，随机分成⑤、⑥、⑦、⑧4组，5头/组。将实施例1猪圆环病毒3型Cap蛋白按常规方式制备免疫原性组合物，于怀孕前10天左右接种免疫原性组合物，⑤、⑥、⑦组分别接种终含量为100、50、20μg/ml，2ml/头，⑧组注射生理盐水2ml/头，接种前、接种后7、14、21、28、35天采血收集血清，分别实施例2～3制备的试剂盒1～4、1VS检测PCV3抗体水平，并与接种后35天攻毒，攻毒剂量为猪圆环病毒3型SG株，105.0TCID50/头，观察攻毒后各组母猪的临床症状。结果见表4。
表4试剂盒1～4监测母猪抗体检测结果
Figure BDA0001396930590000171
Figure BDA0001396930590000181
注：试剂盒1的阳性判界均为0.305；试剂盒1VS的阳性判界为0.87。
由表4可知：对照组即⑧组发病明显，试验成立。试剂盒1具有良好的敏感性，⑤组免疫后21天OD均值为0.447，5/5均转阳；⑥组免疫后28天OD均值为0.437，5/5均转阳；⑦组免疫后35天OD均值为0.458，5/5均转阳。试剂盒2～4检测结果具有良好的一致性，⑤组免疫后21天有阳性样品，阳性率为4/5，免疫后28天和35天均5/5阳性；⑥组免疫后28天有阳性样品，阳性率为2/5，免疫后35天均为5/5阳性；⑦组免疫后35天有阳性样品，阳性率为1/5。而根据已有报道制备的试剂盒1VS检测时，⑤组免疫后35天OD均值才为0.905，5/5均转阳；⑥组免疫后35天OD均值为0.934，5/5均转阳；⑦组免疫后35天OD均值为0.598，5/5均仍为阴性。结合表4可知，当使用试剂盒1评价不同免疫剂量的免疫效果时，上升趋势更为明显，检出时间更早；当用试剂盒2～4检测时，虽检出时间稍微滞后，但检测趋势一致、结果准确，均能较好反应不同免疫剂量的免疫效果；而根据已有报道制备的试剂盒1VS仅检测较高免疫量时才能反应抗体消长趋势，较低免疫量时检测易出现假阴性。
综上所述，试剂盒1～4均具有较好的敏感性，且能很好的反应疫苗免疫后的抗体消长趋势，而试剂盒1VS的敏感性较差，且免疫后的抗体增长趋势不明显。特别地，从试剂盒1的检测结果及攻毒后临床症状的表现可以看出，当猪圆环病毒3型Cap蛋白的免疫剂量为20～100μg/ml，2ml/头接种仔猪或母猪，均可以让猪群获得良好的免疫效果，当免疫剂量较大时，如100μg/ml，2ml/头时，可快速刺激动物机体产生良好的免疫反应，获得高的抗体水平；当免疫剂量较小时，如20μg/ml，2ml/头时，需较长时间动物机体才能获得有效的抗体水平。因此试剂盒1的检测结果不仅可以判断动物机体的免疫水平，同时也可以指导疫苗免疫程序的优化。
4.3.2临床应用
收集母猪流产且PCR检测PCV3阳性率高的3个猪场(编号为A、B、C)的母猪血清样品各30份，收集母猪发生流产但流产胎儿PCR检测PCV3阴性的另3个猪场(编号为D、E、F)母猪血清样品各30份，共180份血清样品，分别实施例2～3制备的试剂盒1～4、1VS按相应的检测方法进行检测，结果：母猪发生流产且PCR检测PCV3阳性的发病猪场(编号为A、B、C)血清，试剂盒1检测阳性率≥87％，试剂盒1VS检测的阳性率为59％、试剂盒2～4检测的阳性率均≥67％；对于母猪发生流产但PCR检测PCV3阴性的发病猪场(编号为D、E、F)血清，试剂盒1检测阳性率≤10％，、试剂盒2～4检测阳性率均≤3％，而根据已有报道制备的试剂盒1VS为阴性，表明试剂盒1～4特别是试剂盒1可用于临床PCV3感染状态的准确评估，结果见表5。
表5不同试剂盒临床检测情况汇总
Figure BDA0001396930590000191
同时结合实施例4.3.1的结果，猪场A、B、C应尽快实施高剂量如50～100μg/ml2ml/只的免疫程序接种，必要时可免疫2次，以让猪群快速产生高水平PCV3抗体，获得有效的免疫保护力；而猪场D、E、F必须进行低剂量免疫20～50μg/ml 2ml/只的免疫程序接种，以避免猪群突发感染PCV3疫病或遭受PCV3侵袭而无抵抗力，避免造成经济损失。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 洛阳普莱柯万泰生物技术有限公司 斯澳生物科技（苏州）有限公司
<120> 猪圆环病毒3型抗体检测试剂盒及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 645
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒3型（Porcine Circovirus type 3）
<400> 1
atgcgtcacc gtgctatctt ccgtcgtcgt ccgcgtccgc gtcgtcgtcg tcgtcaccgt 60
cgtcgttacg ctcgtcgtaa actgttcatc cgtcgtccga ccgctggtac ctactacacc 120
aaaaaatact ctaccatgaa cgttatctct gttggtaccc cgcagaacaa caaaccgtgg 180
cacgctaacc acttcatcac ccgtctgaac gaatgggaaa ccgctatctc tttcgaatac 240
tacaaaatcc tgaaaatgaa agttaccctg tctccggtta tctctccggc tcagcagacc 300
aaaaccatgt tcggtcacac cgctatcgac ctggacggtg cttggaccac caacacctgg 360
ctgcaggacg acccgtacgc tgaatcttct acccgtaaag ttatgacctc taaaaaaaaa 420
cactctcgtt acttcacccc gaaaccgctg ctggctggta ccacctctgc tcacccgggt 480
cagtctctgt ctttcttctc tcgtccgacc ccgtggctga acacctacga cccgaccgtt 540
cagtggggtg ctctgctgtg gtctatctac gttccggaaa aaaccggtat gaccgacttc 600
tacggtacca aagaagtttg gatccgttac aaatctgttc tgtaa 645

Claims (9)

1.一种猪圆环病毒3型ELISA抗体检测试剂盒，其中，所述ELISA抗体检测试剂盒包括包被有猪圆环病毒3型Cap蛋白的支持介质、二抗、显色液；所述猪圆环病毒3型Cap蛋白为序列SEQ ID No.1编码的蛋白。
2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒3型ELISA抗体检测试剂盒，其中，所述包被有猪圆环病毒3型Cap蛋白的支持介质为微孔板，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白的包被浓度为2~4μg/ml，包被量为200～400ng/孔。
3.根据权利要求1所述的猪圆环病毒3型ELISA抗体检测试剂盒，其中，所述试剂盒还包括样品稀释液、洗涤液、终止液、阳性对照、阴性对照。
4.根据权利要求3所述的猪圆环病毒3型ELISA抗体检测试剂盒，其中，所述样品稀释液为磷酸盐缓冲液；所述洗涤液为含0.05%V/V Tween-20的磷酸盐缓冲液；所述二抗为酶标记的羊抗猪二抗或酶标记的兔抗猪二抗；所述显色液包括A液和B液，所述A液为TMB 20mg加入10ml无水乙醇后用双蒸水定容至100ml，混匀后无菌分装；B液为柠檬酸2.1g、无水Na2HPO42.82g、0.75%的过氧化氢尿素0.64ml用双蒸水溶解并定容至100ml，混匀后无菌分装；所述终止液为2M H2SO4。
5.一种猪圆环病毒3型抗体检测试纸，其中，所述抗体检测试纸包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；
所述硝酸纤维素膜与金标垫接触或与样品垫、金标垫接触使得抗体的结合体能在其上向底板第二端迁移；所述硝酸纤维素膜上包括一条检测线和一条质控线，所述检测线上固定化有猪圆环病毒3型Cap蛋白，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白为序列SEQ ID No.1编码的蛋白。
6.根据权利要求5所述的猪圆环病毒3型抗体检测试纸，其中，所述检测线上固定的猪圆环病毒3型Cap蛋白固定时Cap蛋白含量为1.0mg/ml。
7.根据权利要求5所述的猪圆环病毒3型抗体检测试纸，其中，所述金标垫上含有胶体金标记的金黄色葡萄球菌A蛋白，所述质控线上固定化有鸡抗SPA抗体或兔抗SPA抗体；或者
所述金标垫上含有胶体金标记的兔抗猪IgG，所述质控线上固定化有金黄色葡萄球菌A蛋白；或者
所述金标垫上含有胶体金标记的金黄色葡萄球菌A蛋白，所述质控线上固定化有猪IgG。
8.根据权利要求7所述的猪圆环病毒3型抗体检测试纸，其中，所述质控线上固定的鸡抗SPA抗体或兔抗SPA抗体含量为1.0～3.0mg/ml，或者质控线上固定的所述金黄色葡萄球菌A蛋白含量为2.0～3.0mg/ml，或质控线上固定的所述猪IgG含量为2.0～3.0mg/ml；所述检测线、质控线蛋白固定量为1μl/cm。
9.根据权利要求5所述的猪圆环病毒3型抗体检测试纸，其中，所述抗体检测试纸还包括样品处理液，所述样品处理液为磷酸盐缓冲液。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112946262A (zh) * 2021-01-26 2021-06-11 石河子大学 一种pcv3双抗原夹心elisa抗体检测试剂盒及其应用
CN115819567B (zh) * 2022-11-19 2023-09-01 深圳盛源生物技术有限公司 一种单克隆抗体及其在检测试剂盒中的应用

Citations (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1584597A (zh) * 2004-06-15 2005-02-23 浙江大学 猪圆环病毒2型抗原或抗体检测elisa试剂盒
WO2006093797A2 (en) * 2005-02-28 2006-09-08 Mj Biologics, Inc. Method and kit for detecting porcine reproductive and respiratory syndrome virus
CN101358182A (zh) * 2007-07-31 2009-02-04 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组杆状病毒毒株、其构建方法及应用
CN101629956A (zh) * 2009-07-09 2010-01-20 湖南农业大学 检测猪圆环病毒2型抗体的elisa试剂盒
CN102329790A (zh) * 2011-09-28 2012-01-25 河南省农业科学院 双标记核酸恒温扩增方法及检测试纸条
CN102735680A (zh) * 2012-07-05 2012-10-17 北京大北农科技集团股份有限公司 一种猪圆环病毒2型抗体胶体金快速检测试纸条
CN102731615A (zh) * 2011-05-27 2012-10-17 华威特（北京）生物科技有限公司 Prrsv的检测试剂和检测方法
CN101408548B (zh) * 2008-11-13 2013-07-03 浙江大学 猪圆环病毒pcv1和pcv2鉴别检测试纸卡
CN103255171A (zh) * 2013-03-07 2013-08-21 江苏省农业科学院 猪圆环病毒2型密码子优化的orf2基因的重组病毒样粒子
CN103308688A (zh) * 2012-03-14 2013-09-18 武汉中博生物股份有限公司 猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA检测试剂盒及制备方法
CN103698514A (zh) * 2013-12-17 2014-04-02 广西大学 检测猪胞内劳森氏菌抗体的elisa试剂盒
CN103941001A (zh) * 2013-03-15 2014-07-23 河南省农业科学院 猪副嗜血杆菌快速检测试纸条
EP2949341A1 (en) * 2013-01-25 2015-12-02 Fundacao De Amparo A Pesquisa Do Estado De Minas Gerais - Fapemig Recombinant antigens of porcine circovirus 2 (pcv-2) for vaccine formulations, diagnostic kit and use thereof
CN105606802A (zh) * 2015-12-26 2016-05-25 哈药集团生物疫苗有限公司 同时检测八种猪病相关抗体试剂盒及其使用方法
CN105675873A (zh) * 2016-01-04 2016-06-15 洛阳普莱柯万泰生物技术有限公司 一种检测试剂盒及其应用
CN105717293A (zh) * 2014-12-03 2016-06-29 洛阳普莱柯万泰生物技术有限公司 一种用于检测猪圆环病毒2型的试剂盒
WO2016160761A2 (en) * 2015-03-30 2016-10-06 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Pcv2 orf2 carrier platform
CN106405082A (zh) * 2016-08-31 2017-02-15 洛阳普莱柯万泰生物技术有限公司 猪伪狂犬病病毒检测试纸
CN108627648A (zh) * 2017-03-24 2018-10-09 华南农业大学 一种新型猪圆环病毒3型的elisa抗体检测试剂盒及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104017813A (zh) * 2014-06-03 2014-09-03 斯澳生物科技（苏州）有限公司 截短的pcv2型衣壳蛋白orf2病毒样颗粒及其制备方法
CN104725490A (zh) * 2015-03-23 2015-06-24 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 猪圆环病毒2型elisa抗体检测试剂盒
CN106543290A (zh) * 2016-12-08 2017-03-29 中崇信诺生物科技泰州有限公司 一种重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的纯化方法

Patent Citations (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1584597A (zh) * 2004-06-15 2005-02-23 浙江大学 猪圆环病毒2型抗原或抗体检测elisa试剂盒
WO2006093797A2 (en) * 2005-02-28 2006-09-08 Mj Biologics, Inc. Method and kit for detecting porcine reproductive and respiratory syndrome virus
CN101358182A (zh) * 2007-07-31 2009-02-04 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组杆状病毒毒株、其构建方法及应用
CN101408548B (zh) * 2008-11-13 2013-07-03 浙江大学 猪圆环病毒pcv1和pcv2鉴别检测试纸卡
CN101629956A (zh) * 2009-07-09 2010-01-20 湖南农业大学 检测猪圆环病毒2型抗体的elisa试剂盒
CN102731615A (zh) * 2011-05-27 2012-10-17 华威特（北京）生物科技有限公司 Prrsv的检测试剂和检测方法
CN102329790A (zh) * 2011-09-28 2012-01-25 河南省农业科学院 双标记核酸恒温扩增方法及检测试纸条
CN103308688A (zh) * 2012-03-14 2013-09-18 武汉中博生物股份有限公司 猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA检测试剂盒及制备方法
CN102735680A (zh) * 2012-07-05 2012-10-17 北京大北农科技集团股份有限公司 一种猪圆环病毒2型抗体胶体金快速检测试纸条
EP2949341A1 (en) * 2013-01-25 2015-12-02 Fundacao De Amparo A Pesquisa Do Estado De Minas Gerais - Fapemig Recombinant antigens of porcine circovirus 2 (pcv-2) for vaccine formulations, diagnostic kit and use thereof
CN103255171A (zh) * 2013-03-07 2013-08-21 江苏省农业科学院 猪圆环病毒2型密码子优化的orf2基因的重组病毒样粒子
CN103941001A (zh) * 2013-03-15 2014-07-23 河南省农业科学院 猪副嗜血杆菌快速检测试纸条
CN103698514A (zh) * 2013-12-17 2014-04-02 广西大学 检测猪胞内劳森氏菌抗体的elisa试剂盒
CN105717293A (zh) * 2014-12-03 2016-06-29 洛阳普莱柯万泰生物技术有限公司 一种用于检测猪圆环病毒2型的试剂盒
WO2016160761A2 (en) * 2015-03-30 2016-10-06 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Pcv2 orf2 carrier platform
CN105606802A (zh) * 2015-12-26 2016-05-25 哈药集团生物疫苗有限公司 同时检测八种猪病相关抗体试剂盒及其使用方法
CN105675873A (zh) * 2016-01-04 2016-06-15 洛阳普莱柯万泰生物技术有限公司 一种检测试剂盒及其应用
CN106405082A (zh) * 2016-08-31 2017-02-15 洛阳普莱柯万泰生物技术有限公司 猪伪狂犬病病毒检测试纸
CN108627648A (zh) * 2017-03-24 2018-10-09 华南农业大学 一种新型猪圆环病毒3型的elisa抗体检测试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"A Novel Porcine Circovirus Distantly Related to Known Circoviruses Is Associated with Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome and Reproductive Failure";Rachel Palinski 等;《Journal of Virology》;20161026;第91卷(第1期);第1-13页 *
"Differential Proteome Analysis of Host Cells Infected with Porcine Circovirus Type 2";Xin Zhang 等;《Journal of Proteome Research》;20090827;第8卷(第11期);第5111-5119页 *
"猪圆环病毒3的流行及应对措施研究";王彩霞 等;《中国兽医杂志》;20170702;第53卷(第7期);第101-104页 *
"猪圆环病毒-II型抗体检测免疫层析试纸的研制及单克隆抗体的筛选与鉴定";金前跃;《万方数据博士学位论文》;20140225;第34页-第67页 *

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Publication number Publication date
CN109425738A (zh) 2019-03-05

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