CN113388010A - 新型冠状病毒重组蛋白s1抗原及双抗原夹心elisa抗体检测试剂盒 - Google Patents

新型冠状病毒重组蛋白s1抗原及双抗原夹心elisa抗体检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN113388010A
CN113388010A CN202010167856.3A CN202010167856A CN113388010A CN 113388010 A CN113388010 A CN 113388010A CN 202010167856 A CN202010167856 A CN 202010167856A CN 113388010 A CN113388010 A CN 113388010A
Authority
CN
China
Prior art keywords
recombinant protein
novel coronavirus
enzyme
solution
kit
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010167856.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113388010B (zh
Inventor
田克恭
邓均华
谭菲菲
张许科
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Luoyang Pu Tai Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Luoyang Pu Tai Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Luoyang Pu Tai Biotechnology Co ltd filed Critical Luoyang Pu Tai Biotechnology Co ltd
Priority to CN202010167856.3A priority Critical patent/CN113388010B/zh
Publication of CN113388010A publication Critical patent/CN113388010A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113388010B publication Critical patent/CN113388010B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及一种新冠病毒重组蛋白S1及双抗原夹心ELISA抗体检测试剂盒，该试剂盒含包被新冠病毒重组蛋白S1的支持介质、酶标记重组蛋白S1的稀释液以及用于对新冠病毒的抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照。本发明的试剂盒可检测不同动物的血清，只要存在新冠病毒抗体，不论是IgM或IgG抗体，均可以发生特异性反应；可用于新冠病毒溯源检测，追溯新冠病毒自然宿主和中间宿主动物；可用于猪、鸡等家畜、家禽及经济动物是否感染新冠病毒的排查检测；可用于犬、猫等宠物是否感染新冠病毒的排查检测；可用于新冠病毒动物感染模型研究，及基于动物模型的致病机理研究、药物筛选和疫苗评价。

Description

新型冠状病毒重组蛋白S1抗原及双抗原夹心ELISA抗体检测 试剂盒
技术领域
本发明涉及一种新型冠状病毒重组蛋白S1抗原及双抗原夹心 ELISA抗体检测试剂盒，属于生物医药领域。
背景技术
冠状病毒(Coronaviridae)属于冠状病毒科冠状病毒属。冠状病毒属的病毒是具外套膜的正链单股RNA病毒，直径约80～120nm，其遗传物质是所有RNA病毒中最大的，感染宿主范围宽，可感染人、鼠、猪、猫、犬、禽类脊椎动物。冠状病毒的一个变种是引起非典型肺炎的病原体，属于RNA病毒。
2003年人严重急性呼吸综合征(SARS)疫情爆发后，科学家们先通过大量检测不同动物血清，发现蝙蝠血清中存在SARS冠状病毒抗体，然后通过病毒分离、基因序列分析最终确定蝙蝠为自然宿主的。因此，针对新冠病毒溯源及其传播途径的研究，当前迫切需要可用于不同动物血清中新冠病毒抗体的高通量检测方法和试剂，以解决不同动物溯源的问题。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种新型冠状病毒重组蛋白S1抗原，以及含该重组蛋白的双抗原夹心ELISA抗体检测试剂盒。
本发明涉及一种新型冠状病毒重组蛋白S1，其中，所述新型冠状病毒重组蛋白S1为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列编码的蛋白。
本发明涉及一种新型冠状病毒ELISA抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括：包被所述新型冠状病毒重组蛋白S1的支持介质、酶标试剂以及用于新型冠状病毒抗原抗体的检测试剂、阴性对照、阳性对照，其中，所述酶标试剂为含酶标记所述新型冠状病毒重组蛋白S1的溶液。
本发明制备的试剂盒不需要样品稀释液，组分简单。该试剂盒可用于新冠病毒溯源检测，追溯新冠病毒的自然宿主和中间宿主动物。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述试剂盒中，所述包被新型冠状病毒重组蛋白S1的含量为0.2～1.5μg/ml，优选为0.4～1.0μg/ml，更优选为0.5μg/ml。
所述包被抗原浓度可以为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、 1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5μg/ml。
作为本发明的一种实施方式，所述支持介质为微量滴定板。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述试剂盒中，所述酶标试剂为酶标记新型冠状病毒重组蛋白S1的1∶6000～1∶15000的稀释液，优选为1∶8000的稀释液。
所述酶标记新型冠状病毒重组蛋白S1的稀释倍数可以为1∶6000、 1∶7000、1∶8000、1∶9000、1∶10000、1∶11000、1∶12000、1∶13000、 1∶14000、1∶15000。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述试剂盒中，所述酶标试剂经酶标稀释液稀释，所述酶标稀释液为含20％V/V新生牛血清、 0.05％V/V ProClin300、0.05％V/VTween-20的磷酸盐缓冲液。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述试剂盒中，所述酶标记的酶为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-D-半乳糖甘酶。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述试剂盒中，所述用于新型冠状病毒抗原抗体的检测试剂为显色液A、显色液B，所述显色液A为每1L水中含磷酸氢二钠14.7g、柠檬酸9.3g、过氧化脲0.3g，所述显色液B为每1L水中含四甲基联苯二胺0.2g、无水乙醇100ml。
作为本发明的一种实施方式，所述阳性对照为新型冠状病毒重组蛋白S1免疫兔的血清，所述阴性对照为含20％V/V新生牛血清、0.05％V/V ProClin-300的磷酸盐缓冲液。
作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒还包括终止液、洗涤液，所述终止液为2MH2SO4溶液，所述洗涤液为磷酸盐缓冲液。
本发明还涉及所述试剂盒的制备方法，其中，所述制备方法包括：
步骤1)用基因工程手段制备SEQ ID No.1编码的新型冠状病毒重组蛋白S1，按包被浓度0.2～1.5μg/ml、100μl/孔包被于微量滴定板，2～ 8℃包被16～24小时或37℃包被2小时后洗涤、封闭、干燥；
步骤2)酶标记所述新型冠状病毒重组蛋白S1，并用酶标稀释液将酶标记所述新型冠状病毒重组蛋白S1按1∶6000～1∶15000稀释作为酶标试剂；
步骤3)分别制备洗涤液、显色液、终止液、阳性对照、阴性对照；
步骤4)将所述步骤1)包被的微量滴定板、所述步骤2)的酶标试剂及所述步骤3)制备的洗涤液、显色液、终止液、阳性对照、阴性对照组装成试剂盒。
作为本发明的一种实施方式，所述步骤1)中的所述包被浓度优选为0.4～1.0μg/ml，更优选为0.5μg/ml。
作为本发明的一种实施方式，所述步骤1)中所述封闭用封闭液封闭，所述封闭液为含5％M/V蔗糖、20％V/V新生牛血清、0.05％V/V ProClin300的磷酸盐缓冲液，所述封闭的条件为2～8℃封闭16～24小时或37℃封闭2小时。
作为本发明的一种实施方式，所述步骤1)中所述干燥的条件为在18℃～26℃、相对湿度不高于30％的条件下干燥3～6小时。
作为本发明的一种实施方式，所述步骤2)中所述稀释倍数为1∶ 8000。
作为本发明的一种实施方式，所述步骤2)中所述酶标稀释液为 20％V/V新生牛血清、0.05％V/V ProClin300、0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液。
作为本发明的一种实施方式，所述步骤3)中所述显色液包括显色液A、显色液B，所述显色液A为每1L水中含磷酸氢二钠14.7g、柠檬酸9.3g、过氧化脲0.3g，所述显色液B为每1L水中含四甲基联苯二胺0.2g、无水乙醇100ml。
作为本发明的一种实施方式，所述步骤3)中所述阳性对照为新型冠状病毒重组蛋白S1免疫兔的血清，所述阴性对照为含20％V/V新生牛血清、0.05％V/V ProClin-300的磷酸盐缓冲液。
作为本发明的一种实施方式，所述步骤3)中所述终止液为2M H2SO4溶液。
作为本发明的一种实施方式，所述步骤3)中所述洗涤液为磷酸盐缓冲液。
本发明涉及所述试剂盒的应用，所述应用包括新型冠状病毒溯源、动物感染新型冠状病毒的排查、离体血清的流行病学调查、动物模型的致病机理研究、药物筛选和疫苗评价。
本发明的优势在于：
本发明制备的试剂盒不需要样品稀释液，组分简单；还可在1小时左右快速完成检测。
本发明制备的试剂盒应用的待检血清可以是不同动物的血清，只要存在新型冠状病毒抗体，不论是IgM或是IgG抗体，均可以发生特异性反应。
本发明制备的试剂盒与动物的其它冠状病毒抗体均无交叉反应，特异性良好；可检测多种动物血清，包括家畜、家禽及经济动物(猪、马、牛、羊、鸡、鸭、鹅)、野生动物(穿山甲、骆驼、竹鼠、斑狐猴、羊
本发明制备的试剂盒主要用于新冠病毒溯源检测，追溯新冠病毒的自然宿主和中间宿主动物；用于猪、鸡等家畜、家禽及经济动物是否感染新冠病毒的排查检测，确保养殖业稳定生产和动物源性食品安全；用于犬、猫等宠物是否感染新冠病毒的排查检测，确保公共卫生安全和社会稳定；用于新冠病毒动物感染模型研究，以及基于动物模型的致病机理研究、药物筛选和疫苗评价。
具体实施方式
术语“新型冠状病毒肺炎”(Novel coronavirus pneumonia,NCP) 简称新冠肺炎，指由2019新型冠状病毒(简称新冠病毒，2019Novel coronavirus，2019-nCoV)感染导致的肺炎。
术语“SARS-CoV-2”感染患者通常表现为肺炎样症状(发热、干咳和呼吸困难等)和腹泻等胃肠道症状，其次为严重急性呼吸道感染，部分病例会出现急性呼吸窘迫症合并严重呼吸道并发症，甚至导致死亡。目前感染患者没有特定的治疗方法，早期诊断并及时管控是阻止疫情进一步播散和控制新感染线索的关键。此外，SARS-CoV-2可能的自然宿主和中间宿主尚未确定，如何尽快确定并从源头上采取针对性的防控措施，对控制该病的传播具有重要意义。
术语“新型冠状病毒S1蛋白”位于新型冠状病毒S蛋白的功能区之一。新型冠状病毒S蛋白为新型冠状病毒结构蛋白之一，为纤突蛋白(spike蛋白)，位于病毒粒子表面的纤突糖蛋白。
术语“酶”包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖甘酶。其中，辣根过氧化物酶所使用的底物为邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)，优选为四甲基联苯胺(TMB)；碱性磷酸酶所使用的底物为对-硝基苯磷酸酯(p-NPP)；β-D-半乳糖甘酶所使用的底物为4-甲基伞形酮-β-D半乳糖苷(4MUG)。
术语“磷酸盐缓冲液”是指含有磷酸或其盐并被调至理想pH值的溶液，是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液。一般地，磷酸盐缓冲液是从磷酸或磷酸盐(包括但不限于钠和钾盐)制备的。本领域已经知道一些磷酸盐，例如磷酸二氢钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸氢二钾、磷酸钠和磷酸钾。已经知道磷酸盐是以盐的水合物形式存在的。由于缓冲液的二级解离作用，缓冲的pH值范围很宽，例如约4-10的范围，优选约5-9的范围，更有选约6-8的范围，最优选约7.4。进一步优选地，所述磷酸盐缓冲液为含氯化钠和氯化钾的磷酸盐缓冲液。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所用的磷酸盐缓冲液为pH值7.4的PBS，其1L 体积配方为：NaCl8.0g、KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、KH2PO4 0.2g，用超纯水定容至1L，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1新型冠状病毒重组蛋白S1的制备及鉴定
1.1制备
根据已报道的新型冠状病毒S蛋白的序列，将S1蛋白序列按照杆状病毒表达时昆虫细胞密码子偏爱进行了密码子优化，获得SEQ ID No.1所示核苷酸序列。将该序列交由金唯智公司合成，获得新型冠状病毒重组蛋白S1基因的质粒。
通过Primer premier5.0软件设计引物序列(如下)，并交由金唯智公司合成。
tS-F：CGCGGATCCATGTCCTCCCAATGCGTCAACCTCACTACC
tS-R：CCCAAGCTTTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTAGATGCCCTTCTCCACGGTGAAAGAC
PH-F：5’-GGATTATTCATACCGTCCCA-3’
PH-R：5’-AACCTCTACAAATGTGGTATGGCTG-3’
PCR扩增总体积为50μl，体系如下：重组蛋白S1基因的质粒1μl、 PrimeSTAR 0.5μl、5×PrimeSTAR 10μl、dNTPs(25mmol/L)4μl、tS-F (10pmol/L)1μl、tS-R(10pmol/L)1μl、ddH2O 32.5μl。混匀后，经 PCR扩增程序扩增，扩增程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸60秒，循环35次，最后72℃延伸10 分钟。扩增产物用1％凝胶电泳进行鉴定，结果：扩增产物于约900bp 处出现扩增出目的条带。将目的条带用回收试剂盒进行回收。
用BamH I和Hind III双酶切后将回收的目的基因克隆入 pFastBac载体中获得连接产物，经1％凝胶电泳鉴定：于约4800bp 出现载体条带、约900bp出现目的基因大小的条带，表明连接产物初步鉴定成功。将连接产物转入DH5α感受态细胞，于LB液体培养基中转化并获得转化菌液，37℃培养过夜。挑取单菌落于含有Amp+的 LB液体培养基中37℃，220转/分钟振荡培养过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒。对提取的质粒进行酶切鉴定，酶切体系为质粒1μl， BamHⅠ0.5μl，HindⅢ0.5μl，10×Green buffer 2μl，补加ddH2O至20μl， 37℃酶切30分钟。将酶切产物用1％凝胶电泳进行酶切鉴定，将鉴定正确的重组质粒送金唯智公司进行测序分析，结果：测得的基因序列与SEQ ID No.1的基因序列一致。酶切和测序鉴定均正确的质粒命名为pFB-tS。
将鉴定正确的质粒pFB-tS转化DH10Bac感受态细胞，菌液涂布于含有IPTG、X-gal、卡那霉素、四环素、庆大霉素的LB平板上， 37℃培养48小时之后进行蓝白斑筛选。挑取白色菌落PCR鉴定正确后摇菌用Plasmid DNA Miniprep Kit提取获得的重组Bacmid，以提取Bacmid DNA为模板，用PH-F和PH-R进行PCR扩增，取扩增产物以1％琼脂糖凝胶进行电泳，结果：于约1000bp出现目的条带，表明目的片段已成功转座至杆状病毒基因组中，重组Bacmid构建成功，命名为Bacmid-S1。
将重组Bacmid-S1转染Sf9细胞(细胞密度为2.0×106～2.5×106个/mL)，27℃、120转/分钟培养72小时待出现细胞病变后收集细胞上清，记为P0代重组杆状病毒rnCoV-S1株。P0代重组病毒 rnCoV-S1株感染Sf9细胞，经扩大培养后，收集细胞上清。
1.2鉴定
将收集的细胞上清8000转/分钟离心20分钟，取上清经0.22μm 滤膜过滤获得滤液。取样进行SDS-PAGE、Western Blot鉴定，重组蛋白S1于约32KDa处出现特异性条带。将剩余滤液经三次层析纯化，方法如下：
(1)用亲和层析柱(Ni HisTrap HP)对滤液进行蛋白纯化，分别用去离子水和A液(20mmol/L Tris-NaCl，150mmol/L NaCl，pH 8.0)平衡镍柱，以1mL/min～2mL/min的流速将滤液上样至镍柱；上样结束后加入含30mmol/L咪唑的A液洗脱杂蛋白，再加入含 300mmol/L咪唑的A液洗脱目的蛋白并收集，将收集液在B液 (20mmol/L NaH2PO4，50mmol/L NaCl，pH6.5)中于2～8℃透析过夜。
(2)将透析后的蛋白用阳离子交换柱(SP Sepharose HP)层析进行进一步纯化，分别用去离子水和B液平衡SP柱，以1mL/min～ 2mL/min的流速将透析后蛋白上样；上样结束后用含200mmol/L NaCl的B液洗脱杂蛋白，再用含500mmol/L NaCl的B液洗脱目的蛋白。
(3)将SP柱纯化后的蛋白通过分子筛(Hiload 16/600，Superdex 200pg)进行层析纯化。分别用去离子水和C液(20mmol/L NaH2PO4， 150mmol/L NaCl，pH7.4)平衡层析柱后，以1mL/min流速上样，上样结束后继续用C液分离目的蛋白，在出峰体积75.5mL～78mL时收集蛋白，即为新型冠状病毒重组蛋白S1。
经BCA测定蛋白含量为0.5mg/ml，纯度≥99％，并于约32KDa处出现特异性条带。
实施例2酶标蛋白的制备及鉴定
2.1制备
采用改良过碘酸钠法对实施例1制备的新型冠状病毒重组蛋白 S1进行辣根过氧化物酶(HRP)的标记。称取20mg辣根过氧化物酶 (HRP)溶于1ml超纯水中，加入1ml新鲜配制的NaIO4溶液(20mg NaIO4溶于1ml超纯水)，混匀，2～8℃避光作用30分钟；在上述溶液中加入20μl乙二醇，2～8℃避光作用30分钟；按照1mg重组蛋白S1加100μl上述混合液的比例，将两者混匀后，加入到透析袋中，混匀，用碳酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH9.6)于2～8℃透析6小时。整个操作需避光进行。将透析后的混合液转移至1.5ml EP管中，加入10μl新鲜配制的NaBH4溶液(10mg NaBH4溶于1ml超纯水)，室温作用2小时，每隔30分钟混匀一次。
将得到的产物用用分子筛(Hiload 16/600，Superdex 200pg)层析去除游离的辣根过氧化物酶。分别用去离子水和C液(20mmol/L NaH2PO4，150mmol/L NaCl，pH 7.4)平衡层析柱后，以1mL/min流速上样，上样结束后继续用C液分离目的蛋白，在出峰体积70.5mL～73mL时收集蛋白，即为酶标记新型冠状病毒重组蛋白S1，-70℃以下保存。
2.2鉴定
外观：室温下，为红棕色液体，未见絮状物沉淀。
质量评价：用紫外分光光度计检测酶标抗体在403nm和280nm 的吸光值A。按照公式计算相应的酶参数：
酶量(mg/ml)＝A403nm×0.4×稀释倍数。
IgG量(mg/ml)＝(A280nm-A403nm×0.3)×0.62×稀释倍数。
克分子比值(E/P)＝酶量×4/IgG量。
标记率＝A403nm/A280nm。
经过吸光值检测和计算，具体结果见表1：
表1酶标记新型冠状病毒重组蛋白S1的质量评价
Figure BDA0002408103350000101
实施例3双抗原夹心ELISA抗体检测试剂盒的制备及检测方法
3.1试剂盒的制备
抗原包被板：用碳酸盐缓冲液(pH值9.6，0.05mol/L)将实施例1 制备的新型冠状病毒重组蛋白S1分别稀释至优选的终浓度进行包被， 100μl/孔，2～8℃包被16～24小时，用洗涤液洗涤后，按150μl/孔加入封闭液(含5％M/V蔗糖、20％V/V新生牛血清、0.05％V/VProClin300 的磷酸盐缓冲液)，2～8℃封闭16～24小时或37℃封闭2小时，弃去封闭液后在18℃～26℃、相对湿度不高于30％的条件下干燥3～6小时，密封后于2～8℃储存备用。
酶标试剂：取200ml新生牛血清、0.5ml ProClin300、0.5ml Tween-20，补加磷酸盐缓冲液定容至1000mL，作为酶标稀释液。将实施例2制备的酶标记新型冠状病毒重组蛋白S1用酶标稀释液按适当比例稀释后作为酶标试剂，过滤后无菌分装。
20×浓缩洗涤液：取氯化钠160g、磷酸氢二钠58g、磷酸二氢钾4.8g、氯化钾4g、超纯水800mL、吐温20 10mL，完全溶解后用超纯水定容至1000mL，用0.22μm滤膜过滤，无菌分装。使用时用蒸馏水稀释20 倍。
阳性对照：将实施例1制备的新型冠状病毒重组蛋白S1皮下注射免疫健康兔(500μg/只)，间隔14日后再免疫1次，14日后采血并分离血清，收集血清即为阳性血清。取新生牛血清200ml、阳性血清10ml、 0.5ml ProClin-300混匀并补加磷酸盐缓冲液定容为1000mL，过滤后无菌分装。
阴性对照：取新生牛血清200ml、0.5ml ProClin-300混匀，并补加磷酸盐缓冲液定容为1000mL，过滤后无菌分装。
显色液：取磷酸氢二钠14.7g、柠檬酸9.3g、过氧化脲0.3g，溶于纯化水，定容至1000mL，混匀、过滤后无菌分装，为显色液A。取四甲基联苯二胺(TMB)0.2g，无水乙醇100ml，溶于纯化水定容至1000mL，混匀、过滤后无菌分装，为显色液B。
终止液：2M H2SO4溶液。
3.2检测方法的建立
操作步骤如下：
(1)加样：分别在相应孔中加入待检样品100μl，设置阳性对照、阴性对照各2孔(均为100μl)，封板后置37℃温育30分钟。
(2)洗涤：用洗涤液洗涤5遍，最后一次扣干。
(3)加酶标试剂：每孔加入酶标试剂稀释液100μl，封板后置37℃温育30分钟。
(4)洗涤：用洗涤液洗涤5遍，最后一次扣干。
(5)显色：每孔加入显色液A、显色液B各50μl，混匀，37℃或室温避光显色15分钟。
(6)终止并检测：每孔加终止液50μl，10分钟内用酶标仪测定各孔OD450nm值，根据以下结果判定标准进行判定。
当阳性对照孔OD450nm值≥0.3、阴性对照孔OD值＜0.1时试验成立，否则无效。试验成立时，临界值(CUT OFF)计算：临界值＝0.26+ 阴性对照孔OD值均值(阴性对照孔OD值均值低于0.03者以0.03计算)。结果判定：
样品OD值≥临界值(CUT OFF)者为新型冠状病毒抗体阳性。
样品OD值＜临界值(CUT OFF)者为新型冠状病毒抗体阴性。结果判定为阳性的，需现场调查、采样进行病原学验证。
3.3包被原包被浓度的选择
用碳酸盐缓冲液(pH值9.6，0.05mol/L)将实施例1制备的新型冠状病毒重组蛋白S1分别稀释至终浓度0.1、0.2、0.4、0.5、1.0、1.5、 2.0μg/ml进行包被以制备抗原包被板，按照检测方法分别检测阳性对照、阴性对照，取P/N值(阳性对照孔OD值均值/阴性对照孔OD值均值)较大者的稀释度为包被浓度，结果(见表2)：当包被浓度为0.2～ 1.5μg/ml时P/N值均＞50，明显高于包被浓度为0.1、2.0μg/ml时的P/N 值(均＜50)，可有效分辨阴性样品、阳性样品；特别地，当包被浓度为0.4～1.0μg/ml时P/N值优于包被浓度为0.2、1.5μg/ml时的P/N值(均＜50)，以包被浓度为0.5μg/ml时P/N值为最高。
表2新冠病毒重组蛋白S1包被浓度的选择结果
Figure BDA0002408103350000121
3.4酶标试剂工作液的选择
将新冠病毒重组蛋白S1按0.5μg/ml包被以制备抗原包被板。再取实施例2制备的酶标记新型冠状病毒重组蛋白S1，用酶标稀释液按1∶ 5000、1∶6000、1∶8000、1∶10000、1∶15000、1∶16000进行稀释，按照检测方法分别检测阳性对照、阴性对照，取P/N值(阳性对照孔 OD值均值/阴性对照孔OD值均值)较大者的稀释度为酶标试剂，结果 (见表3)：当酶标记新型冠状病毒重组蛋白S1稀释倍数为1∶6000～ 1∶15000时P/N值均＞50，明显高于酶标记新型冠状病毒重组蛋白S1 稀释倍数为1∶5000、1∶16000时的P/N值(均＜50)，可有效分辨阴性样品、阳性样品；特别地，以酶标记新型冠状病毒重组蛋白S1稀释倍数为1∶8000时为最高。
表3酶标记新冠病毒重组蛋白S1工作液的选择结果
Figure BDA0002408103350000131
根据以上结果，将酶标记新冠病毒重组蛋白S1稀释倍数为1∶8000 制备酶标试剂，将包被浓度为0.4μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml分别包被制备的抗原包被板，按实施例3.1试剂盒的制备方法制备试剂盒，分别命名为试剂盒1、试剂盒2、试剂盒3。
实施例4试剂盒检测抗体类型的研究
4.1不同动物源阳性血清的制备
将实施例1制备的新型冠状病毒重组蛋白S1分别(500μg/只)注射SPF小鼠、健康兔各5只，同时各设置5只作为未免疫对照组。分别于免疫后第0、1、3、5、7、9、10、14天采血，收集血清。
4.2间接ELISA方法IgM抗体检测试剂盒的制备
取实施例3制备的新冠病毒重组蛋白S1包被浓度为0.5μg/ml的抗原包被板，将商品化酶标记羊抗鼠IgM抗体、酶标羊抗兔IgM抗体1∶ 10000倍稀释液分别作为二抗，连同洗涤液、显色液、终止液、终止液制备间接ELISA IgM抗体试剂盒，简称鼠IgM试剂盒、兔IgM试剂盒。
4.3间接ELISA方法IgG抗体检测试剂盒的制备
取实施例3制备的新冠病毒重组蛋白S1包被浓度为0.5μg/ml的抗原包被板，将商品化酶标记羊抗鼠IgG抗体、酶标羊抗兔IgG抗体1∶ 10000倍稀释液分别作为二抗，连同洗涤液、显色液、终止液、终止液制备间接ELISA IgG抗体试剂盒，简称鼠IgG试剂盒、兔IgG试剂盒。
4.4不同试剂盒检测小鼠IgM、IgG抗体的比较
用试剂盒1、试剂盒2、试剂盒3以及鼠IgM试剂盒、鼠IgG试剂盒分别检测小鼠第0、1、3、5、7、9、10、14天的血清，结果(见表4)：对照组血清检测均为阴性，试验成立，鼠IgM试剂盒仅能在免疫后第3～9天可检测到抗体，鼠IgG试剂盒仅能在第7～14天可检测到抗体，而试剂盒1～试剂盒3于免疫后第3～14天均可检测到抗体且检测的抗体相当于IgM、IgG抗体的总和，以试剂盒2的检测效果为最优。
表4检测免疫小鼠不同天的结果
Figure BDA0002408103350000141
4.5不同试剂盒检测兔IgM、IgG抗体的比较
用试剂盒1、试剂盒2、试剂盒3以及兔IgM试剂盒、兔IgG试剂盒分别检测兔第0、1、3、5、7、9、10、14天的血清，结果(见表5)：对照组血清检测均为阴性，试验成立，兔IgM试剂盒仅能在免疫后第3～ 9天可检测到抗体，兔IgG试剂盒仅能在第7～14天可检测到抗体，而试剂盒1～试剂盒3于免疫后第3～14天均可检测到抗体且检测的抗体相当于IgM、IgG抗体的总和，以试剂盒2的检测效果为最优。
表5检测免疫兔不同天的结果
Figure BDA0002408103350000142
表明试剂盒1～试剂盒3可用于不同动物血清的检测，只要存在新型冠状病毒抗体，不论是IgM或是IgG抗体，均可以发生特异性反应。
实施例5试剂盒的应用
5.1不同SPF动物血清的非特异性检测
取5种SPF动物血清103份，包括SPF小鼠血清32份、SPF大鼠血清22份、SPF鸡血清30份、SPF鸭血清9份、SPF猪血清10份，经试剂盒1～试剂盒3检测，结果均为阴性。表明该试剂盒1～试剂盒 3检测多种动物血清均无非特异性反应。
5.2不同动物源其它冠状病毒抗体阳性血清的检测
取4种动物6种冠状病毒抗体阳性血清128份，包括1种禽冠状病毒即鸡传染性支气管炎病毒抗体阳性血清26份，3种猪冠状病毒(包括猪流行性腹泻病毒抗体阳性血清20份、猪传染性胃肠炎病毒抗体阳性血清20份、猪δ冠状病毒抗体阳性血清20份)，1种小鼠冠状病毒即小鼠肝炎病毒抗体阳性血清22份，1种大鼠冠状病毒即大鼠涎泪腺炎病毒抗体阳性血清20份，经试剂盒1～试剂盒3检测，结果均为阴性。表明该试剂盒与不同动物源(包括禽源、猪源、小鼠源、大鼠源) 的其它冠状病毒均无交叉反应。
5.3试剂盒的临床应用
收集26种动物964份临床血清，包括家畜、家禽及经济动物(猪 45份、马10份、牛49份、羊54份、鸡45份、鸭81份、鹅19份)、野生动物(穿山甲17份、骆驼31份、竹鼠8份、斑狐猴1份、羊驼5 份、虎8份、犀牛5份、水貂20份、狐狸20份、孔雀4份、雕1份)、宠物(犬234份、猫51份)和实验动物(小鼠32份、大鼠22份、豚鼠20份、兔20份、比格犬130份、猫2份、雪貂2份、猕猴28份)。经试剂盒1～试剂盒3检测，结果均为阴性。表明该试剂盒可用于多种动物感染新型冠状病毒的检测和监测，可用于经济动物、实验动物、宠物等是否感染新型冠状病毒的排查及新型冠状病毒人工感染动物模型的研究与评价。
综上所述，本发明制备的试剂盒应用的待检血清可以是不同动物的血清，只要存在新型冠状病毒抗体，不论是IgM或是IgG抗体，均可以发生特异性反应。本发明制备的试剂盒可用于新型冠状病毒溯源检测，追溯SARS-CoV-2的自然宿主和中间宿主动物；可用于猪、鸡等家畜、家禽及经济动物是否感染新型冠状病毒的排查检测，确保养殖业稳定生产和动物源性食品安全；可用于犬、猫等宠物是否感染新型冠状病毒的排查检测，确保公共卫生安全和社会稳定；可用于SARS-CoV-2动物感染模型研究，以及基于动物模型的致病机理研究、药物筛选和疫苗评价。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 洛阳普泰生物技术有限公司
<120> 新型冠状病毒重组蛋白S1抗原及双抗原夹心ELISA抗体检测试剂盒
<130> 2020-03-10
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 939
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atgttcgttt tcctcgtgct cctccccctc gtttcctccc aatgcgtcaa cctcactacc 60
cgtacccagc tcccaccagc ctacaccaac agcttcactc gcggtgtgta ctaccccgac 120
aaggtcttcc gttccagcgt gctgcacagc actcaggacc tgttcctgcc attcttctct 180
aacgtgacct ggttccacgc catccacgtg agcggcacca acggcactaa gcgcttcgac 240
aaccctgtgc tgcccttcaa cgacggtgtc tacttcgctt ccaccgagaa gtctaacatc 300
atccgtggat ggatcttcgg caccactctg gactcaaaga ctcagtccct gctgatcgtc 360
aacaacgcca ccaacgtggt catcaaggtg tgcgagttcc agttctgcaa cgaccctttc 420
ctgggcgtct actaccacaa gaacaacaag agctggatgg agtctgagtt ccgcgtctac 480
tcttcagcta acaactgcac tttcgagtac gtgagccagc ccttcctgat ggacctggaa 540
ggaaagcagg gtaacttcaa gaacctgagg gagttcgtgt tcaagaacat cgacggatac 600
ttcaagattt actcaaagca cacccctatc aacctggtgc gcgacctgcc acagggtttc 660
tccgctctgg agcctctggt ggacctgccc atcggcatca acatcacccg cttccagact 720
ctgctggctc tgcaccgttc ctacctgact cctggcgact ccagctctgg atggaccgcc 780
ggagctgccg cttactacgt gggttacctg caacccagga ccttcctgct gaagtacaac 840
gaaaacggaa ccatcacaga cgctgtggac tgcgctctgg accccctgag cgaaaccaag 900
tgcactctga agtctttcac cgtggagaag ggcatctac 939

Claims (10)

1.一种新型冠状病毒重组蛋白S1，其中，所述新型冠状病毒重组蛋白S1为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列编码的蛋白。
2.一种新型冠状病毒ELISA抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括：包被权利要求1所述新型冠状病毒重组蛋白S1的支持介质、酶标试剂以及用于新型冠状病毒抗原抗体的检测试剂、阴性对照、阳性对照，其中，所述酶标试剂为含酶标记权利要求1所述新型冠状病毒重组蛋白S1的溶液。
3.根据权利要求2所述试剂盒，其中，所述包被所述新型冠状病毒重组蛋白S1的含量为0.2～1.5μg/ml，优选为0.4～1.0μg/ml，更优选为0.5μg/ml；所述支持介质优选为微量滴定板。
4.根据权利要求2所述试剂盒，其中，所述酶标试剂为酶标记新型冠状病毒重组蛋白S1的1∶6000～1∶15000的稀释液，优选为1∶8000的稀释液；
优选地，所述酶标试剂用酶标稀释液稀释，所述酶标稀释液为含20％V/V新生牛血清、0.05％V/V ProClin300、0.05％V/V Tween-20的磷酸盐缓冲液；
优选地，所述酶标记的酶为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-D-半乳糖甘酶。
5.根据权利要求2所述试剂盒，其中，所述用于新型冠状病毒抗原抗体的检测试剂为显色液A、显色液B，所述显色液A为每1L水中含磷酸氢二钠14.7g、柠檬酸9.3g、过氧化脲0.3g，所述显色液B为每1L水中含四甲基联苯二胺0.2g、无水乙醇100ml；
优选地，所述阳性对照为新型冠状病毒重组蛋白S1免疫兔的血清，所述阴性对照为含20％V/V新生牛血清、0.05％V/V ProClin-300的磷酸盐缓冲液；
优选地，所述试剂盒还包括终止液、洗涤液，所述终止液为2M H2SO4溶液，所述洗涤液为磷酸盐缓冲液。
6.本发明还涉及权利要求2所述试剂盒的制备方法，其中，所述制备方法包括：
步骤1)用基因工程手段制备SEQ ID No.1编码的新型冠状病毒重组蛋白S1，按包被浓度0.2～1.5μg/ml、100μl/孔包被于微量滴定板，2～8℃包被16～24小时或37℃包被2小时后洗涤、封闭、干燥；
步骤2)酶标记所述新型冠状病毒重组蛋白S1，并用酶标稀释液将酶标记所述新型冠状病毒重组蛋白S1按1∶6000～1∶15000稀释作为酶标试剂；
步骤3)分别制备洗涤液、显色液、终止液、阳性对照、阴性对照；
步骤4)将所述步骤1)包被的微量滴定板、所述步骤2)的酶标试剂及所述步骤3)制备的洗涤液、显色液、终止液、阳性对照、阴性对照组装成试剂盒。
7.根据权利要求6所述制备方法，其中，所述步骤1)中的所述包被浓度优选为0.4～1.0μg/ml，更优选为0.5μg/ml；
优选地，所述步骤1)中的所述封闭用封闭液封闭，所述封闭液为含5％M/V蔗糖、20％V/V新生牛血清、0.05％V/V ProClin300的磷酸盐缓冲液，所述封闭的条件为2～8℃封闭16～24小时或37℃封闭2小时。
优选地，所述步骤1)中的所述干燥的条件为在18℃～26℃、相对湿度不高于30％的条件下干燥3～6小时。
8.根据权利要求6所述制备方法，其中，所述步骤2)中所述稀释倍数为1∶8000；
优选地，所述步骤2)中所述酶标稀释液为20％V/V新生牛血清、0.05％V/VProClin300、0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液。
9.根据权利要求6所述制备方法，其中，所述步骤3)中所述显色液包括显色液A、显色液B，所述显色液A为每1L水中含磷酸氢二钠14.7g、柠檬酸9.3g、过氧化脲0.3g，所述显色液B为每1L水中含四甲基联苯二胺0.2g、无水乙醇100ml；
优选地，所述阳性对照为新型冠状病毒重组蛋白S1免疫兔的血清，所述阴性对照为含20％V/V新生牛血清、0.05％V/V ProClin-300的磷酸盐缓冲液；
优选地，所述终止液为2M H2SO4溶液；
优选地，所述洗涤液为磷酸盐缓冲液。
10.一种权利要求2所述试剂盒的应用，所述应用包括新型冠状病毒溯源、动物感染新型冠状病毒的排查、离体血清的流行病学调查、动物模型的致病机理研究、药物筛选和疫苗评价。
CN202010167856.3A 2020-03-11 2020-03-11 新型冠状病毒重组蛋白s1抗原及双抗原夹心elisa抗体检测试剂盒 Active CN113388010B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010167856.3A CN113388010B (zh) 2020-03-11 2020-03-11 新型冠状病毒重组蛋白s1抗原及双抗原夹心elisa抗体检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010167856.3A CN113388010B (zh) 2020-03-11 2020-03-11 新型冠状病毒重组蛋白s1抗原及双抗原夹心elisa抗体检测试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113388010A true CN113388010A (zh) 2021-09-14
CN113388010B CN113388010B (zh) 2022-09-13

Family

ID=77615431

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010167856.3A Active CN113388010B (zh) 2020-03-11 2020-03-11 新型冠状病毒重组蛋白s1抗原及双抗原夹心elisa抗体检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113388010B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114624434A (zh) * 2022-05-16 2022-06-14 湖南冠牧生物科技有限公司 一种辣根过氧化物酶（hrp）快速标记蛋白的制备方法及试剂盒

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1453590A (zh) * 2003-06-18 2003-11-05 广州万孚生物技术有限公司 SARS冠状病毒抗体IgG免疫印迹诊断试剂盒
WO2004109289A1 (en) * 2003-06-10 2004-12-16 Agency For Science, Technology And Research Method of diagnosing sars corona virus infection
CN1796565A (zh) * 2004-12-30 2006-07-05 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 表达sars冠状病毒纤突蛋白的重组病毒及其制备方法
US20060199176A1 (en) * 2004-07-15 2006-09-07 Yeau-Ching Wang Coronavirus S peptides
CN107011417A (zh) * 2017-04-12 2017-08-04 河北农业大学 重组蛋白、其编码基因、其应用及猪流行性腹泻病毒抗体的检测试剂盒及检测方法
CN107085115A (zh) * 2017-05-03 2017-08-22 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 一种水貂阿留申病毒双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒
CN109880843A (zh) * 2019-03-27 2019-06-14 扬州大学 一种猪德尔塔冠状病毒抗原制备方法及利用该抗原制备的间接elisa试剂盒
CN110361542A (zh) * 2019-07-25 2019-10-22 扬州大学 猪德尔塔冠状病毒n蛋白的双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004109289A1 (en) * 2003-06-10 2004-12-16 Agency For Science, Technology And Research Method of diagnosing sars corona virus infection
CN1453590A (zh) * 2003-06-18 2003-11-05 广州万孚生物技术有限公司 SARS冠状病毒抗体IgG免疫印迹诊断试剂盒
US20060199176A1 (en) * 2004-07-15 2006-09-07 Yeau-Ching Wang Coronavirus S peptides
CN1796565A (zh) * 2004-12-30 2006-07-05 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 表达sars冠状病毒纤突蛋白的重组病毒及其制备方法
CN107011417A (zh) * 2017-04-12 2017-08-04 河北农业大学 重组蛋白、其编码基因、其应用及猪流行性腹泻病毒抗体的检测试剂盒及检测方法
CN107085115A (zh) * 2017-05-03 2017-08-22 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 一种水貂阿留申病毒双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒
CN109880843A (zh) * 2019-03-27 2019-06-14 扬州大学 一种猪德尔塔冠状病毒抗原制备方法及利用该抗原制备的间接elisa试剂盒
CN110361542A (zh) * 2019-07-25 2019-10-22 扬州大学 猪德尔塔冠状病毒n蛋白的双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
C.M. CHAN ET AL.: "Examination of seroprevalence of coronavirus HKU1 infection with S protein-based ELISA and neutralization assay against viral spike pseudotyped virus", 《JOURNAL OF CLINICAL VIROLOGY》 *
邓均华 等: "动物血清中SARS-COV-2抗体检测方法的建立与评价", 《动物医学进展》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114624434A (zh) * 2022-05-16 2022-06-14 湖南冠牧生物科技有限公司 一种辣根过氧化物酶（hrp）快速标记蛋白的制备方法及试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
CN113388010B (zh) 2022-09-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110093356B (zh) 编码非洲猪瘟病毒抗原的dna序列、由其编码的抗原的组合物及其在免疫学检测中的应用
CN107543923B (zh) 检测禽白血病病毒a/b/j亚群特异性抗体的试剂盒及其检测方法
CN111929433B (zh) 一种非洲猪瘟病毒抗体elisa检测试剂盒及其制备方法
Kazakova et al. Recombinant protein p30 for serological diagnosis of African swine fever by immunoblotting assay
CN109900902B (zh) 一种猪伪狂犬病毒gB阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用
CN111925436B (zh) 非洲猪瘟病毒p30蛋白的单克隆抗体及其应用
CN108956987B (zh) fiber2蛋白及其重组蛋白在检测鸭血清中鸭2型腺病毒抗体方面的应用
CN112724208A (zh) 一种SADS-CoV重组S蛋白胞外段及其制备方法与应用
CN108918869B (zh) fiber2蛋白及其重组蛋白在检测血清4型禽腺病毒抗体方面的应用
Mazalovska et al. Detection of serum antibodies to hepatitis E virus based on HEV genotype 3 ORF2 capsid protein expressed in nicotiana benthamiana
KR101667122B1 (ko) 개선된 백신 진단
CN110967480A (zh) 一种猪流行性腹泻病毒IgA抗体ELISA试剂盒的制备及应用
CN113388010B (zh) 新型冠状病毒重组蛋白s1抗原及双抗原夹心elisa抗体检测试剂盒
CN111999497A (zh) 检测狂犬病毒糖蛋白抗原的酶联免疫试剂盒及其应用
US20230375548A1 (en) Indirect enzyme-linked immunosorbent assay detection kit based on p30 protein and p22 protein of african swine fever virus
CN108693357B (zh) 一种检测新型鸡呼肠孤病毒抗体的间接elisa检测试剂盒及应用
CN106771237A (zh) 一种检测猪萨佩罗病毒抗体的elisa试剂盒
CN109425738B (zh) 猪圆环病毒3型抗体检测试剂盒及其应用
CN114778852A (zh) 一种检测prrsv plp2抗体的间接elisa方法
KR20220117953A (ko) 화학 발광 기반의 코로나 바이러스 검출용 조성물 및 이의 용도
CN111537736A (zh) 一种鸡毒支原体抗体的间接elisa检测试剂盒及检测方法
CN111896744A (zh) 一种羊棘球蚴抗体elisa检测试剂盒及其制备方法和应用
CN113884681A (zh) 新冠病毒抗体检测试纸条、试剂盒及其制备方法和应用
CN110967483B (zh) 恶性卡他热病毒的检测试剂盒、制备方法及其用途
KR100888793B1 (ko) 사스 코로나바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질 및이것의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant