CN114624434A - 一种辣根过氧化物酶（hrp）快速标记蛋白的制备方法及试剂盒 - Google Patents

一种辣根过氧化物酶（hrp）快速标记蛋白的制备方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种辣根过氧化物酶（HRP）快速标记蛋白的制备方法及试剂盒：制备方法首先利用高碘酸钠在酸性条件下将HRP分子中邻羟基氧化为醛基，在进行蛋白标记时，将其pH值恢复至碱性条件，二者按一定比例混合1h反应形成以shiff碱形式的结合物，结束后加入一定浓度的海藻糖水等溶液后，‑4度条件下保存半年；所述试剂盒包括所述制备方法制备得到的辣根过氧化物酶（HRP）快速标记蛋白；本发明操作简易快速，2小时且历经三步完成整个标记，无需繁琐的透析和离心等操作，‑4℃条件下可保存半年；本发明的方法标记蛋白实现产品的快速转产，提高企业产生效率。

Description

一种辣根过氧化物酶（HRP）快速标记蛋白的制备方法及试 剂盒
技术领域
本发明涉及标记蛋白相关技术领域，特别涉及一种辣根过氧化物酶（HRP）快速标记蛋白的制备方法及试剂盒。
背景技术
辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP），是临床检验试剂中的常用酶。该产品不但广泛用于多个生化检测项目，也广泛运用于免疫类（ELISA）试剂盒。过氧化物酶作为多个试剂盒显色体系的关键成分，对试剂盒的质量有重要影响。
标记蛋白主要应用ELISA，酶促发光，免疫组化，免疫斑点等，HRP标记的蛋白作为示踪物用于检测。对于大规模人力ELISA实验，如单克隆抗体筛选，极大提高了研发人员的工作效率。
现有的辣根过氧化物酶（HRP）标记蛋白的方法耗时长，操作复杂。
发明内容
发明的目的在于提供一种辣根过氧化物酶（HRP）快速标记蛋白的制备方法及试剂盒，解决了现有的辣根过氧化物酶（HRP）标记蛋白的方法耗时长，操作复杂的问题。
本发明是这样实现的，一种辣根过氧化物酶（HRP）快速标记蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
S1、制备辣根过氧化物酶（HRP）溶液，将体积V1的辣根过氧化物酶（HRP）溶液加入到V3体积的pH=5.5-6.5的缓冲液中，再加入V2体积的无水乙醇混匀后继续加入体积为V4的过碘酸钠溶液，混合均匀避光反应10-15min，得到总体积为V总的混合液A；所述V2=1/20V总；
S2、将所述混合液A中加入（1%-2%）V总的乙二醇，反应10-15min，颜色由绿色变成黄褐色后，用PH=5.5-6.5的缓冲液4-6℃透析后，用弱酸性补给液补充体积至酶浓度为透析前酶浓度，得活化酶；
所述透析中间更换透析液3次后，每隔4小时更换透析液。
S3、按照抗体：活化酶=1-4:1的质量比的比例进行标记，加入pH=9.0-10的缓冲液，反应后加入稳定液，反应后保存。
所述过碘酸钠溶液现配现用。
本发明的进一步技术方案是：所述步骤S1中制备辣根过氧化物酶（HRP）溶液为：将辣根过氧化物酶（HRP）用纯化水溶液到浓度为10mg/mL；过碘酸钠溶液浓度为0.0214-0.214g/ml。
本发明的进一步技术方案是：所述V1:V2:V3 :V4=8:1:7:4。
本发明的进一步技术方案是：所述PH=5.5-6.5的缓冲液为0.1M的醋酸-醋酸钠缓冲液、醋酸缓冲液以及醋酸钠缓冲液中的任意一种。
本发明的进一步技术方案是：所述弱酸性补给液为0.1M醋酸-醋酸钠缓冲液、醋酸缓冲液以及醋酸钠缓冲液中的任意一种。
本发明的进一步技术方案是：所述步骤S3中pH=9.0-10的缓冲液为0.05M 碳酸盐缓冲液。
本发明的进一步技术方案是：所述pH=9.0-10的缓冲液的体积为所述活化酶的体积的1/4，然后温室反应1h。
本发明的进一步技术方案是：所述步骤S3中加入稳定剂的体积为所述活化酶的体积的1/4，反应30min；所述稳定剂为100%蔗糖溶液、0.1M PB + 0.1% BSA + 30%蔗糖+5%Tween20以及0.1M PB + 0.1% BSA + 50% 甘油+5%Tween20中的至少一种。
本发明的进一步技术方案是：所述制备方法还包括步骤S4：加入活化酶体积的1/20的还原剂，4-6℃避光反应2小时，透析。
所述还原剂为NaBH4溶液，所述NaBH4溶液浓度为10mg/ml，4℃现配。
本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包括所述制备方法制备得到的辣根过氧化物酶（HRP）快速标记蛋白。
本发明的有益效果：本发明操作简易快速，2小时且历经三步完成整个标记，无需繁琐的透析和离心等操作；
制备方法利用高碘酸钠在酸性条件下将HRP分子中邻羟基氧化为醛基，在进行蛋白标记时，将pH值恢复至碱性条件，按一定比例混合1h反应形成以shiff碱形式的结合物，结束后加入一定浓度的海藻糖水等溶液后，-4℃条件下可保存半年；
本发明的方法标记蛋白实现产品的快速转产，提高企业产生效率。
附图说明
图1是本发明提供的一种辣根过氧化物酶（HRP）快速标记蛋白的制备方法的流程图；
图2是本发明提供的采用实施例1中辣根过氧化酶标记蛋白与对比例1中传统方法辣根过氧化酶标记蛋白的相关性曲线。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
需要说明的是，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
实施例1：
一种辣根过氧化物酶（HRP）快速标记蛋白的制备方法，包括以下步骤：
酶活化
10mg/ml 酶配制：用纯化水将酶固体配制成10mg/ml溶液，4℃保存。
0.1M 醋酸缓冲液配制：配制0.1mol/L 醋酸钠溶液，用醋酸将其pH调节至6.0。
0.0214g/ml过碘酸钠溶液：称取0.0214g过碘酸钠固体，用纯化水将其溶解。
取10mg/ml的酶原液200ul，加入0.1M pH=6.0醋酸缓冲液175ul，相继加入25ul乙醇、浓度为0.0214g/ml的过碘酸钠溶液100ul（现配现用），颜色由黄褐色变成绿色，混合均匀后避光反应10min。
加入5ul乙二醇，避光终止15min，颜色由绿色变成黄褐色，用0.01M 醋酸缓冲液4℃过夜透析3次后，每隔4小时更换透析液，用0.01M且pH=6.0的醋酸缓冲液补充体积至酶浓度为3mg/ml，体积为Va。
标记抗体
按质量比抗体/蛋白：酶=3：1进行标记；
取体积Va活化好的酶的质量m毫克，加入质量为3m毫克的抗体/蛋白，再加入1/4Va的 0.05M 且pH =9.6的 CB缓冲液，混匀后置15-35℃下反应1h；
加入1/4 Va 的100%蔗糖溶液，反应30min，即可使用。
对比例1：
传统的HRP标记蛋白的方法包括以下步骤：
待标记抗体：用0.05M pH 9.6 CB将抗体稀释至2mg/ml（若小于2mg/ml无需稀释）后，将其置于口径小于20KD的透析袋内，4℃ 1×CB透析4.5-5h，每隔1.5h更换一次透析液。
HRP活化：称取HRP a mg + a/20 ml H2O（HRP溶解后，用铝箔纸包好、避光）；称取NaIO4 b mg + b/25 ml H2O，将a/25 ml NaIO4 溶液滴加到HRP溶液中，边滴加NaIO4 溶液边摇晃试剂瓶。将HRP与NaIO4混合液放置2-8℃冰箱内静置30min。量取10%乙二醇（用纯化水将乙二醇配置成10%的浓度）(10×a mg) ul ，将HRP + NaIO4 + 乙二醇 混合液置于24℃水浴锅30 min。
将活化好的HRP加入装有待标记抗体的透析袋内，按照抗体与HRP的标记质量比=1:1加入，4℃ 1×CB透析过夜。
将浓度为5mg/ml的NaHB4溶液（将NaHB4用纯化水配制成5mg/ml）按照(16×a mg)ul的量加入到纯化好的酶标抗体中，4℃反应2h，每隔半小时摇晃一次。
加入等体积饱和硫酸铵溶液，4℃作用1h，10000rpm离心10min，弃上清。
按体积比，1×PBS（0.02M PBS pH 7.4） ：胎牛血清：甘油 = 4：1：5，将沉淀按抗体量复溶至0.5-1mg/ml。
结果：采用实施例1中辣根过氧化酶标记蛋白与对比例1中传统方法辣根过氧化酶标记蛋白的相关性数据如表1所示，相关性曲线如图2所示；
表1 实施例1中标记蛋白与对比例1标记蛋白的相关性列表
Figure DEST_PATH_IMAGE001
采用传统方法标记蛋白耗时长但是标记蛋白的稳定性高且反应效率高，通过本发明记载的方法对蛋白进行标记，与传统方法进行对比，其相关性在0.98以上，同时反应强度也趋于一致，说明本发明记载的蛋白标记方法的有效性以及稳定性且灵敏度高。
对比例2：
采用现有的技术生物素/亲和素快速标注抗体，与本发明中记载的实施例1中的活性酶标记抗体对比。
结果：采用实施例1中的活性酶标记抗体以及对比例2生物素/亲和素标记抗体的ELISA测试结果对比如表2；采用实施例1中的活性酶标记不同抗体的ELISA测试结果表3所示；
表2 实施例1中的活性酶标记抗体以及对比例2生物素标记抗体的ELISA测试结果对比
Figure 909329DEST_PATH_IMAGE002
表3 实施例1中的活性酶标记不同抗体的ELISA测试结果
Figure DEST_PATH_IMAGE003
本发明专利所述方法对抗体进行标记，与生物素标记方法对比，其反应强度高于生物素标记方法。
实施例二：
一种试剂盒，所述试剂盒包括实施例一所述制备方法制备得到的辣根过氧化物酶（HRP）快速标记蛋白。
发明公开了一种辣根过氧化物酶（HRP）快速标记蛋白的制备方法：首先利用高碘酸钠在酸性条件下将HRP分子中邻羟基氧化为醛基，在进行蛋白标记时，将其pH值恢复至碱性条件，二者按一定比例混合1h反应形成以shiff碱形式的结合物，结束后加入一定浓度的海藻糖水等溶液后，-4度条件下保存半年。HRP可以标记含有自由氨基（-NH2）的一类蛋白或是肽，因为HRP是一种糖蛋白，其所带的糖基上的糖环能被氧化开环，2，3位羟基能被氧化位醛基，在碱性条件下可与被标记物的自由氨基（-NH2）形成Shiff碱。使用本技术，可以为企业实现产品的快速转产，提高企业产生效率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种辣根过氧化物酶（HRP）快速标记蛋白的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
S1、制备辣根过氧化物酶（HRP）溶液，将体积V1的辣根过氧化物酶（HRP）溶液加入到V3体积的pH=5.5-6.5的缓冲液中，再加入V2体积的无水乙醇混匀后继续加入体积为V4的过碘酸钠溶液，混合均匀避光反应10-15min，得到总体积为V总的混合液A；所述V2=1/20V总；
S2、将所述混合液A中加入1%-2%V总的乙二醇，反应10-15min，用PH=5.5-6.5的缓冲液4-6℃透析后，用弱酸性补给液补充体积至酶浓度为透析前酶浓度，得活化酶；
S3、按照抗体：活化酶=1-4:1的质量比的比例进行标记，加入pH=9.0-10的缓冲液，反应后加入稳定液，反应后保存；
所述V1:V2:V3 :V4=8:1:7:4。
2.根据权利要求1所述的一种辣根过氧化物酶（HRP）快速标记蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中制备辣根过氧化物酶（HRP）溶液为：将辣根过氧化物酶（HRP）用纯化水溶液到浓度为10mg/mL；过碘酸钠溶液浓度为0.0214-0.214g/ml。
3.根据权利要求1所述的一种辣根过氧化物酶（HRP）快速标记蛋白的制备方法，其特征在于，所述PH=5.5-6.5的缓冲液为0.1M的醋酸-醋酸钠缓冲液、醋酸缓冲液以及醋酸钠缓冲液中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的一种辣根过氧化物酶（HRP）快速标记蛋白的制备方法，其特征在于，所述弱酸性补给液为0.1M醋酸-醋酸钠缓冲液、醋酸缓冲液以及醋酸钠缓冲液中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的一种辣根过氧化物酶（HRP）快速标记蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中pH=9.0-10的缓冲液为0.05M 碳酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1所述的一种辣根过氧化物酶（HRP）快速标记蛋白的制备方法，其特征在于，所述pH=9.0-10的缓冲液的体积为所述活化酶的体积的1/4，然后温室反应1h。
7.根据权利要求1所述的一种辣根过氧化物酶（HRP）快速标记蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中加入稳定剂的体积为所述活化酶的体积的1/4；所述稳定剂为100%蔗糖溶液、0.1M PB + 0.1% BSA + 30%蔗糖+5%Tween20以及0.1M PB + 0.1% BSA + 50% 甘油+5%Tween20中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的一种辣根过氧化物酶（HRP）快速标记蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括步骤S4：加入活化酶体积的1/20的还原剂，4-6℃避光反应2小时，透析。
9.一种试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1-8中任意一项所述制备方法制备得到的辣根过氧化物酶（HRP）快速标记蛋白。
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