CN112684163B - 一种吖啶类化合物标记原料工作液及制备方法 - Google Patents
一种吖啶类化合物标记原料工作液及制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112684163B CN112684163B CN202110126091.3A CN202110126091A CN112684163B CN 112684163 B CN112684163 B CN 112684163B CN 202110126091 A CN202110126091 A CN 202110126091A CN 112684163 B CN112684163 B CN 112684163B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- raw material
- acridine
- acridine compound
- polyethylene glycol
- working solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种吖啶类化合物标记原料工作液及其制备方法，其中，被吖啶类化合物标记的原料为被聚乙二醇活化修饰剂修饰的蛋白质。本发明先将聚乙二醇活化修饰剂与蛋白质溶液混合，聚乙二醇活化修饰剂与蛋白质分子侧链上的活性基团进行修饰反应得到原料，再将吖啶类化合物与该原料进行反应，这样可以提高吖啶标记活性原料得到的复合物的空间位阻，提高稳定性，无需特殊的试剂储存液中即可实现稳定储存。
Description
技术领域
本发明属于化学发光免疫检测技术领域，特别涉及一种吖啶类化合物标记原料工作液及制备方法。
背景技术
化学发光免疫分析法是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。应用于临床检验的化学发光体系有多种，最主要的有鲁米诺及其衍生物、吖啶酯、螺旋金刚烷-1,2-二氧乙烷及其衍生物和电化学发光体系等。
吖啶类(吖啶酯或吖啶磺酰胺)化学发光体系，因不需要催化剂、只需改变溶液的pH等条件就能直接发光，反应迅速、背景发光低、信噪比高，已经广泛应用于生物及药物分析等领域。但是现有的吖啶类化合物标记原料复合物在试剂储存过程中容易出现不稳定、易水解的现象，研究者们为了提高试剂稳定性，通常选择在试剂储存液中添加较多的保护剂形成特殊的试剂储存液，这一方面对试剂储存液的要求高，另一方面试剂储存液中的保护剂对吖啶类化合物标记原料复合物试剂的检测会造成一定的干扰(特别是一些比较敏感的原料在不同保护剂条件下，反应性能差异较大)，导致检测的灵敏度和准确性下降。
发明内容
本发明的目的是提供一种稳定性好的吖啶类化合物标记原料工作液及制备方法。本研究克服了背景技术的缺陷，通过先对蛋白质进行聚乙二醇修饰得到原料，再进行吖啶标记，可以提高吖啶标记活性原料最终得到的复合物的空间位阻，提高稳定性，无需特殊的试剂储存液中即可实现稳定储存。
为实现本发明的目的，本发明提供了一种吖啶类化合物标记原料工作液，其中，被吖啶类化合物标记的原料为被聚乙二醇活化修饰剂修饰后的蛋白质。
进一步地，所述蛋白质被修饰前具有能够与聚乙二醇活化修饰剂反应的活性基团，所述活性基团为氨基、巯基或羧基，所述聚乙二醇活化修饰剂为mPEG-SCM、mPEG2-NHS、mPEG-SPA、mPEG-SC中的一种或几种。
进一步地，所述聚乙二醇活化修饰剂的分子量为20KD-40KD。
进一步地，所述吖啶类化合物为吖啶磺酰胺或吖啶酯。
本发明还提供了上述吖啶类化合物标记原料工作液的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
S1、将聚乙二醇活化修饰剂与蛋白质溶液混合，聚乙二醇活化修饰剂与蛋白质分子侧链上的活性基团进行修饰反应得到原料，所述活性基团包括氨基，巯基，羧基；
S2、将吖啶类化合物与步骤S1得到的原料进行反应。
进一步地，步骤S1中，所述蛋白质溶液的浓度为0.5mg/mL-2mg/mL。
进一步地，步骤S1中，蛋白质与聚乙二醇活化修饰剂的摩尔比为：1:3-1:5。
进一步地，步骤S1中，所述修饰反应的反应温度为2℃-8℃，反应时间为0.5h-2h。
进一步地，步骤S2中，所述吖啶类化合物为吖啶磺酰胺，所述吖啶类化合物与所述原料的摩尔比为15:1。
进一步地，步骤S1中，所述蛋白质为抗体或抗原。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括以下：
1、本发明通过先对蛋白质进行聚乙二醇修饰得到原料，再对原料进行吖啶标记，提高了吖啶标记活性原料最终得到的复合物的空间位阻，提高了稳定性，无需特殊的试剂储存液中即可实现稳定储存；
2、本发明中聚乙二醇活化修饰剂修饰蛋白质得到的原料水溶性增加，能减少吖啶标记过程中蛋白的聚集，进一步提高了稳定性。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种稳定性好的吖啶类化合物标记原料工作液及制备方法。
本发明公开的吖啶类化合物标记原料工作液，该被吖啶类化合物标记的原料为被聚乙二醇活化修饰剂修饰后的蛋白质。所述蛋白质再被修饰前具有能够与聚乙二醇活化修饰剂反应的活性基团，所述活性基团为氨基、巯基或羧基，所述聚乙二醇活化修饰剂为mPEG-SCM、mPEG2-NHS、mPEG-SPA、mPEG-SC中的一种或几种。所述聚乙二醇活化修饰剂的分子量为20KD-40KD。所述吖啶类化合物为吖啶磺酰胺或吖啶酯。
上述吖啶类化合物标记原料工作液的制备方法包括以下步骤：
S1、将聚乙二醇活化修饰剂与蛋白质溶液混合，聚乙二醇活化修饰剂与蛋白质分子侧链上的活性基团进行修饰反应得到原料，所述活性基团包括氨基，巯基，羧基；
聚乙二醇修饰又称分子的PEG(Polyethylene glycol，聚乙二醇)化，是20世纪70年代后期发展起来的修饰方法。将活化的聚乙二醇PEG与蛋白质分子相偶联，影响蛋白质的空间结构，最终导致蛋白质各种生物化学性质的改变：化学稳定性增加，抵抗水解的能力提高；同时可以把PEG的优良性质如亲水性的转移到蛋白质身上。活化的PEG与蛋白质分子侧链上的活性基团进行反应，活性基团包括氨基，巯基，羧基。
本发明具体实施例中使用的活化PEG(聚乙二醇活化修饰剂)与蛋白反应的的活性基团是氨基，蛋白质分子表面的游离氨基具有较高的亲核反应活性，一般不处于活性中心部位，因而成为化学修饰中最常用的被修饰基团。
S2、将吖啶类化合物与步骤S1得到的原料进行反应。
本发明具体实施例中用的吖啶类化合物是吖啶磺酰胺NSP-SA-NHS，其能与原料蛋白质上的氨基发生反应。在碱性条件下，NHS作为离去基团被取代，蛋白质与吖啶化合物形成稳定的酰胺键。反应完成后，多余的吖啶盐可通过透析袋除去。
活化的PEG与吖啶磺酰胺均与蛋白质的活性基团氨基反应，但二者的分子量差异较大，所使用的活化PEG分子量20000-40000，吖啶磺酰胺分子量681.73，空间位阻不同与蛋白质反应具有明显的差异性。为了保持蛋白质的的活性，同时减少对吖啶标记的影响，需要控制一定的修饰率。影响因素包括蛋白质与聚乙二醇活化修饰剂的摩尔比例；蛋白质的浓度；修饰反应的pH值，离子强度，修饰反应温度及修饰反应持续时间。本发明优选的控制条件为：步骤S1中，所述蛋白质溶液的浓度为0.5mg/mL-2mg/mL；蛋白质与聚乙二醇活化修饰剂的摩尔比为：1:3-1:5；所述修饰反应的反应温度为2℃-8℃，反应时间为0.5h-2h；修饰缓存液为10-50mM pbs，pH值为6.0-8.0。
为更加清楚的表示，下面结合更具体的实施例对本发明做详细的说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。若无特别说明，本发明选用的原料或设备均为市售所得。
实施例1:
1)取适量抗体用20mM pH为6.0的PBS修饰缓存液配置成1mg/mL的溶液，透析袋纯化；
2)纯化后的抗体中加入抗体5倍摩尔数的聚乙二醇活化修饰剂mPEG2-NHS；
3)4℃下避光反应0.5h；
4)未结合的聚乙二醇活化修饰剂用透析柱除去；缓冲液用50mM pH 9.6的CB(碳酸盐缓冲液)替换；
5)修饰好的抗体中加入抗体15倍摩尔数的吖啶磺酰胺NSP-SA-NHS，4℃下避光反应1h；
6)加入20倍抗体摩尔数的赖氨酸避光反应30min，多余的吖啶盐通过透析袋除去，得到吖啶标记原料浓缩液。
7)吖啶标记原料浓缩液中加入等体积甘油-20℃冻存，使用时用吖啶标记抗体储存液稀释至抗体浓度为0.02ug/ml，得到吖啶标记原料工作液。
吖啶标记抗体储存液成分：5g的甘油，5g的蔗糖，0.5g牛血清白蛋白，0.1g防腐剂proclin300，90g 10mM pH为6.5的PBS缓存液。
实施例2:
1)取适量抗体用10mM pH为7.0的PBS缓冲液配置成2mg/mL的溶液，透析袋纯化；
2)纯化后抗体中加入抗体3倍摩尔数的聚乙二醇活化修饰剂mPEG2-SCM，
3)4℃避光反应1h；
4)未结合的修饰剂用透析柱除去；缓冲液用50mM pH为9.6的CB替换；
5)修饰好的抗体中加入抗体15倍摩尔数的吖啶磺酰胺NSP-SA-NHS，4℃避光反应2h；
6)加入20倍抗体摩尔数的赖氨酸避光反应30min，多余的吖啶盐通过透析袋除去，得到吖啶标记原料浓缩液。
7)吖啶标记原料浓缩液中加入等体积甘油-20℃冻存，使用时用吖啶标记抗体储存液稀释至抗体浓度为0.04ug/ml，得到吖啶标记原料工作液。
吖啶标记抗体储存液成分：5g的甘油，5g的蔗糖，0.5g牛血清白蛋白，0.1g防腐剂proclin300，90g 10mM pH为6.5的PBS缓存液。
实施例3:
1)取适量抗体用50mM pH为7.0的PBS缓冲液配置成1mg/mL的溶液，透析袋纯化；
2)纯化后抗体中加入抗体5倍摩尔数的聚乙二醇活化修饰剂mPEG2-SC；
3)4℃避光反应2h；
4)未结合的修饰剂用透析柱除去；缓冲液用50mM pH为9.6的CB替换；
5)修饰好的抗体中加入15倍抗体摩尔数的吖啶磺酰胺NSP-SA-NHS，4℃避光反应3h；
6)加入20倍抗体摩尔数的赖氨酸避光反应30min，多余的吖啶盐通过透析袋除去，得到吖啶标记原料浓缩液。
7)吖啶标记原料浓缩液中加入等体积甘油-20℃冻存，使用时用吖啶标记抗体储存液稀释至抗体浓度为0.01ug/ml，得到吖啶标记原料工作液。
吖啶标记抗体储存液成分：5g的甘油，5g的蔗糖，0.5g牛血清白蛋白，0.1g防腐剂proclin300，90g 10mM pH为6.5的PBS缓存液。
对比例1：
对比例1与实施例1的不同之处在于：抗体不经过mPEG2-NHS修饰，直接用吖啶磺酰胺NSP-SA-NHS标记。
对比例2：
对比例2与实施例2的不同之处在于：抗体不经过mPEG2-SCM修饰，直接用吖啶磺酰胺NSP-SA-NHS标记。
对比例3：
对比例3与实施例3的不同之处在于：抗体不经过mPEG2-SC修饰，直接用吖啶磺酰胺NSP-SA-NHS标记。
实验：
分别将实施例1和对比例1的技术方案用于CA199(糖类抗原199，Carbohydrateantigen199)化学发光试剂检测，抗体经修饰后标记得到的试剂(实施例1)与未经修饰标记得到的试剂(对比例1)检测结果稳定性对比见表1。
表1实施例1与对比例1的检测结果稳定性对比表
分别将实施例2和对比例2的技术方案用于β-HCG化学发光试剂检测，抗体经修饰后标记得到的试剂(实施例2)与未经修饰标记得到的试剂(对比例2)检测结果稳定性对比见表2。
表2实施例2与对比例2的检测结果稳定性对比表
分别将实施例3和对比例3的技术方案用于CEA(癌胚抗原，carcinoembryonicantigen)化学发光试剂检测，抗体经修饰后标记得到的试剂(实施例3)与未经修饰标记得到的试剂(对比例3)检测结果稳定性对比见表3。
表3实施例3与对比例3的检测结果稳定性对比表
通过表1-表3的实验检测结果可知，本发明提供的吖啶类化合物标记原料工作液稳定性好，2-8℃储存1年后与新配置时的检测结果差距较小，与未经聚乙二醇活化修饰处理的蛋白质相比，稳定性显著提高。
以上实施例仅用以解释说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管上述实施例对本发明进行了具体的说明，相关技术人员应当理解，依然可对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，而未脱离本发明精神和范围的任何修改和等同替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围之中。
Claims (9)
1.一种吖啶类化合物标记原料工作液，其特征在于：被吖啶类化合物标记的原料为被聚乙二醇活化修饰剂修饰后的蛋白质；所述蛋白质被修饰前具有能够与聚乙二醇活化修饰剂反应的活性基团，所述活性基团为氨基；所述吖啶类化合物为吖啶磺酰胺，其能与所述活性基团反应。
2.根据权利要求1所述的吖啶类化合物标记原料工作液，其特征在于：所述聚乙二醇活化修饰剂为mPEG-SCM、mPEG2-NHS、mPEG-SPA、mPEG-SC中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的吖啶类化合物标记原料工作液，其特征在于：所述聚乙二醇活化修饰剂的分子量为20KD-40KD。
4.如权利要求1-3中任一项所述的吖啶类化合物标记原料工作液的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
S1、将聚乙二醇活化修饰剂与蛋白质溶液混合，聚乙二醇活化修饰剂与蛋白质分子侧链上的活性基团进行修饰反应得到原料，所述活性基团为氨基，所述吖啶类化合物为吖啶磺酰胺；
S2、将吖啶类化合物与步骤S1得到的原料进行反应。
5.根据权利要求4所述的吖啶类化合物标记原料工作液的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述蛋白质溶液的浓度为0.5mg/mL-2mg/mL。
6.根据权利要求4所述的吖啶类化合物标记原料工作液的制备方法，其特征在于：步骤S1中，蛋白质与聚乙二醇活化修饰剂的摩尔比为：1:3-1:5。
7.根据权利要求4所述的吖啶类化合物标记原料工作液的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述修饰反应的反应温度为2℃-8℃，反应时间为0.5h-2h。
8.根据权利要求4所述的吖啶类化合物标记原料工作液的制备方法，其特征在于：步骤S2中，所述吖啶类化合物与所述原料的摩尔比为15:1。
9.根据权利要求4-8中任一项所述的吖啶类化合物标记原料工作液的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述蛋白质为抗体或抗原。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110126091.3A CN112684163B (zh) | 2021-01-29 | 2021-01-29 | 一种吖啶类化合物标记原料工作液及制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110126091.3A CN112684163B (zh) | 2021-01-29 | 2021-01-29 | 一种吖啶类化合物标记原料工作液及制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112684163A CN112684163A (zh) | 2021-04-20 |
| CN112684163B true CN112684163B (zh) | 2022-08-09 |
Family
ID=75459461
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110126091.3A Active CN112684163B (zh) | 2021-01-29 | 2021-01-29 | 一种吖啶类化合物标记原料工作液及制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112684163B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114113610B (zh) * | 2021-12-08 | 2023-08-11 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | 吖啶酯标记复合物和检测试剂盒 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5656426A (en) * | 1988-08-01 | 1997-08-12 | Chiron Diagnostics Corporation | Functionaized hydrophilic acridinium esters |
| CN104109235A (zh) * | 2014-05-30 | 2014-10-22 | 厦门赛诺邦格生物科技有限公司 | 一种具有氮原子支化中心的单一官能化聚乙二醇、制备方法及其生物相关物质 |
| CN105153115A (zh) * | 2009-11-16 | 2015-12-16 | 西门子医疗保健诊断公司 | 含两性离子的吖啶*化合物 |
| CN106124777A (zh) * | 2016-07-05 | 2016-11-16 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | 吖啶标记结合物及其制备方法、化学发光试剂盒 |
| CN111855996A (zh) * | 2019-09-19 | 2020-10-30 | 潍坊市康华生物技术有限公司 | 一种能提高吖啶酯抗原抗体结合物稳定性并降低本底的稀释液及其制备方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6664043B2 (en) * | 2001-07-03 | 2003-12-16 | Bayer Corporation | Acridinium ester labels having hydrophilic modifiers |
| CA2753598C (en) * | 2009-02-27 | 2018-07-10 | Beckman Coulter, Inc. | Solution phase homogeneous assays |
| CN106053443A (zh) * | 2016-07-05 | 2016-10-26 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | 吖啶标记结合物及其制备方法、化学发光试剂盒 |
-
2021
- 2021-01-29 CN CN202110126091.3A patent/CN112684163B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5656426A (en) * | 1988-08-01 | 1997-08-12 | Chiron Diagnostics Corporation | Functionaized hydrophilic acridinium esters |
| CN105153115A (zh) * | 2009-11-16 | 2015-12-16 | 西门子医疗保健诊断公司 | 含两性离子的吖啶*化合物 |
| CN104109235A (zh) * | 2014-05-30 | 2014-10-22 | 厦门赛诺邦格生物科技有限公司 | 一种具有氮原子支化中心的单一官能化聚乙二醇、制备方法及其生物相关物质 |
| CN106124777A (zh) * | 2016-07-05 | 2016-11-16 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | 吖啶标记结合物及其制备方法、化学发光试剂盒 |
| CN111855996A (zh) * | 2019-09-19 | 2020-10-30 | 潍坊市康华生物技术有限公司 | 一种能提高吖啶酯抗原抗体结合物稳定性并降低本底的稀释液及其制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112684163A (zh) | 2021-04-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4228237A (en) | Methods for the detection and determination of ligands | |
| Heitzmann et al. | Use of the avidin-biotin complex for specific staining of biological membranes in electron microscopy | |
| US4578361A (en) | Creatinine antibody | |
| JP2627124B2 (ja) | 三官能共役体、その製造方法及びその使用方法 | |
| US6114180A (en) | Synthetic calibrators for use in immunoassays, comprising the analytes or partial sequences thereof which are conjugated to inert carrier molecules | |
| WO1993001498A1 (en) | Water-soluble, polymer-based reagents and conjugates comprising moieties derived from divinyl sulfone | |
| CN102269762B (zh) | 结合物的制备方法及相关试剂盒 | |
| JP3363166B2 (ja) | 相互に対する極めて高い特異的親和性を有するペプチド対をイン・ビトロ診断分野に使用する方法 | |
| CN104697830B (zh) | 用于hiv检测的酸性处理剂、样本预处理方法、试剂盒及检测方法 | |
| CN112684163B (zh) | 一种吖啶类化合物标记原料工作液及制备方法 | |
| CN117269517B (zh) | 一种血型抗原三糖b类似物蛋白偶联物在血型抗体检测中的应用 | |
| JPS61217763A (ja) | 免疫学的検定法 | |
| CN113311174B (zh) | 一种肌红蛋白抗体-酶标记物及其制备与应用 | |
| CN115711990A (zh) | 一种信号放大的免疫层析检测试纸及其制备方法、检测试剂盒及其检测方法 | |
| JPH0743378B2 (ja) | 可溶性および沈澱性ｈｒｐ―ｅｌｉｓａ用のｔｍｂ試薬 | |
| EP3483172B1 (en) | Acridine-marker conjugate and preparation method thereof, and chemiluminescence kit | |
| CN112147335A (zh) | 一种基于点击化学的标记配体组合物、试剂盒及系统 | |
| WO2023124154A1 (zh) | 磁珠包被物及其制备方法和检测试剂盒 | |
| Bachas et al. | Cooperative interaction of immobilized folate binding protein with enzyme-folate conjugates: an enzyme-linked assay for folate | |
| US5534414A (en) | Process for preparing conjugates consisting of a specific binding partner and a carbohydrate-containing protein | |
| JP3819612B2 (ja) | β−ｈＣＧの免疫学的測定方法 | |
| JPS6210070A (ja) | ヒスタミン誘導体、免疫原接合体およびそれに対してレイズされた抗体 | |
| EP0132292A2 (en) | Method of measuring biological ligands | |
| EP0210863A1 (en) | Immunoassay | |
| CN112305227A (zh) | 自交联蛋白、配体组合物、制备方法、试剂盒及系统 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A working solution and preparation method for labeling raw materials with acridine compounds Effective date of registration: 20230505 Granted publication date: 20220809 Pledgee: China Everbright Bank Limited by Share Ltd. Xiamen branch Pledgor: ANBIO (XIAMEN) PRODUCTS Inc. Registration number: Y2023980039764 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |