CN105153115A - 含两性离子的吖啶*化合物 - Google Patents

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Abstract

公开了含两性离子的亲水、化学发光吖啶化合物。当在免疫化学测定等中用作化学发光标记时，这些吖啶化合物显示出与固相减少的非特异性结合且提供增加的测定灵敏度。

Description

含两性离子的吖啶*化合物
本申请是2010年11月12日申请的发明名称为“含两性离子的吖啶化合物”、国家申请号为201080052010.X的发明专利申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及含有两性离子的亲水、化学发光吖啶化合物(acridiniumcompounds)。由于其亲水性质，这些吖啶化合物显示出与固相的低非特异性结合，并且对于改善测定灵敏度潜在有用。
发明背景
化学发光吖啶酯(acridiniumesters)已显现为用于免疫测定以及核酸测定的非常有用的标记。来自吖啶酯的光发射通过与碱性过氧化氢反应触发，这引起酚酯键的分裂和其为光发射种类的激发态吖啶酮的形成。在苯酚离去基团离开后二噁酮(dioxetanone)中间产物的形成已在反应机制中提出，并且假定是激发态吖啶酮的前体。取决于反应条件，来自吖啶酯的光发射的持续时间通常在数秒内完成，并且可以使用光度计进行定量测量。吖啶酯9-羧基苯基-N-甲基吖啶溴化物在免疫测定中的应用由Simpson，J.S.A.等人(Nature第279卷，第646-647页(1979)公开。然而，这种吖啶酯是非常不稳定的，从而限制其商业效用。这种不稳定性起于在苯酚和吖啶环之间的不稳定9-羧基苯基酯连接的水解。
在稳定吖啶酯中的酚酯的尝试中，Law等人(JournalofBioluminescenceandChemiluminescence，第4卷，第88-89页(1989)引入2个侧接甲基，以稳定这个酯键。发现所得到的立体稳定的吖啶酯，缩写为DMAE-NHS[2’，6’-二甲基-4’-(N-琥珀酰亚胺氧羰基)苯基10-甲基吖啶-9-羧酸盐]，具有与缺乏2个甲基的吖啶酯相同的光输出。另一方面，当与免疫球蛋白缀合时，前面一种化合物的稳定性是极佳的，并且甚至在37℃在pH7下1周后也未显示化学发光活性的丧失。相比之下，当实施相同处理时，未被取代的吖啶酯仅保留其10％的活性。
为了减轻DMAE及其衍生物的疏水性质，Law等人的美国专利号5,656,426公开了命名为NSP-DMAE-NHS酯的亲水形式的DMAE，其中N-甲基已由N-磺丙基(NSP)替换。DMAE和NSP-DMAE目前在SiemensHealthcareDiagnostics的商业、自动化免疫测定分析仪ACS：180TM和CentaurTM中广泛使用。
为了进一步增加NSP-DMAE的亲水性，Natrajan等人在美国专利号6,664,043B2中公开了具有与苯酚连接的亲水改性剂例如聚乙二醇和阴离子精胺衍生物的NSP-DMAE衍生物。称为NSP-DMAE-HEG-戊二酸酯-NHS(缩写为NSP-DMAE-HEG)且含有六乙二醇衍生物(HEG)的一种此类吖啶酯的结构在下述附图中举例说明。在这种化合物中，α，ω-二氨基六乙二醇(二氨基-HEG)部分连接至苯酚，以增加吖啶酯的水可溶性。戊二酸酯部分连接至二氨基-HEG的末端并且转化为NHS酯，以使得能够标记各种分子。除HEG外，衍生自具有磺酸根和羧酸根基团的精胺的阴离子改性剂也由Natrajan等人在美国专利号6,664,043B2中公开。
近来，Natrajan等人在美国专利号7,309,615B2中描述了在吖啶环的C2和/或C7上含有亲水烷氧基(OR*)的亲水、高量子产率吖啶化合物，其中R*是包含磺丙基部分或乙二醇部分或其组合的基团。来自此类化合物增强的光输出及其亲水性质使得其对于改善免疫测定的灵敏度有用。称为NSP-2，7-(OMHEG)2-DMAE-AC-NHS(缩写为HQYAE)的一种此类化合物的结构在下文举例说明。在美国专利号7,309,615B2中描述的这种化合物及其他化合物含有代替苯酚连接至吖啶环的聚乙二醇或阴离子磺酸根基团
如上述专利中公开的在吖啶酯的结构中掺入聚乙二醇(PEG)部分和阴离子意欲增加这些吖啶酯的亲水性质以及降低衍生自这些化合物的缀合物的非特异性结合。在使用固相例如颗粒或微量滴定板的测定中的非特异性结合是这些吖啶酯缀合物与这些固相的不需要的结合相互作用。这些不需要的结合相互作用一般增加测定的背景，导致在测定中信噪比的净降低且从而减少测定灵敏度。
衍生抵抗蛋白质吸收的惰性表面的聚乙二醇用途已在现有技术中描述。例如，Ostuni等在J.Am.Chem.Soc.2000，17，5605-5620中评估了连接至自装配单层用于抵抗蛋白质吸收的众多官能团，并且观察到赋予最佳抗性的聚乙二醇官能团。更近来，Ladd等人在Biomacromolecules2008，9，1357-1361中；及其他人已报道两性离子改良的亲水表面与PEG一样对于蛋白质吸收是惰性的，并且此外，已假定两性离子比PEG在化学上更稳定，这是由于后者对于氧化切割的倾向。某些常见两性离子例如磺基甜菜碱、羧基甜菜碱、磷基甜菜碱(phosphobetaines)和氧化胺的结构在下述附图中举例说明。如同PEG，这些两性离子通常是电学中性的，由于在给定结构内正和负电荷的平衡(R1-R4一般是烷基)。
两性离子的例子
其中氮原子是季氮的磺基甜菜碱在广泛pH范围内维持其电学中性。另一方面，具有三取代的氮的磺基甜菜碱在更高pH(pH＞7)下可以获得负电荷，因为它们可以在氮上去质子化，从而中和其正电荷。类似地，羧基甜菜碱在更高pH下是电学中性的但可以在羧酸根基团上质子化，并且在低pH(pH＜5)下获得净正电荷。
用于在蛋白组学中应用的两性离子改良的荧光染料近期已由Dratz和Grieco在美国专利申请号0259333A1(2007年11月)中报道。观察到由两性离子染料标记的蛋白质是水溶性的并且更顺应电泳分析，并且上述作者已请求保护使用两性离子染料用于蛋白质分析的方法。
现有技术未描述在化学发光吖啶酯中掺入电学中性、两性离子官能团，以改善其性质例如非特异性结合。此类化合物补充由Natrajan等人在美国专利号6,664,043B2和美国专利号7,309,615B2中描述的含PEG吖啶酯，并且具有改善测定灵敏度的潜力。
本领域存在关于用于免疫测定等的改善化学发光标记的持续需要。因此，本发明的目的是提供显示出与固相减少的非特异性结合的化学发光吖啶化合物。
发明概述
依照前述目的及其他，已惊奇地发现通过将两性离子基团掺入分子内以增加其亲水性且因而减少与固相的非特异性结合，化学发光吖啶化合物的性质得到改善。
在本发明的一个方面，提供了包含下述的化学发光吖啶化合物：(i)连接至吖啶核的氮原子的烃基团，所述烃基团任选由至多20个杂原子取代，和(ii)与取代的烃部分连接的、吖啶核的C9位置上的羧基或磺酰胺基团，其中吖啶化合物包含连接至吖啶核的C2位置、吖啶核的C7位置、与羧基或磺酰胺基团连接的烃部分、或连接至吖啶核的氮原子的烃基团的至少一个两性离子官能团；其中与不包含所述两性离子官能团的在其他方面等同的吖啶化合物比较，所述吖啶化合物显示出与固相减少的非特异性结合。
在一个实施方案中，化学发光吖啶化合物是具有式I中所示的下述结构的吖啶酯：
其中，
R1是C1-35烷基、烯基、炔基或芳烷基，其各自可以含有至多20个杂原子，或磺丙基或磺丁基，或R1是基团-Ra-Z；其中Ra是选自C1-35烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基的二价基团，其各自任选含有至多20个杂原子；
R2和R3独立地选自(i)氢、(ii)供电子基团或(iii)基团-Z；
Z是下述形式的两性离子基团：
X在每次出现时独立地选自键、-CH2-、氧、硫、-NRN-、酰胺(-NRN(CO)-)、氨基甲酸根(-NRNC(O)O-)或脲基(-NRNC(O)NRN-)；
R’和R”在每次出现时独立地选自C1-35烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基，其各自任选含有至多20个杂原子；
Z1是基团-Ra-Z2，其中Z2选自羧酸根(-COO-)、磺酸根(-SO3 -)、硫酸根(-OSO3 -)、磷酸根(-OP(O)(OR)(O-))或氧离子(-O-)；或在其中Z2是氧离子(-O-)的情况下，Ra可以是不存在的；
n在每次出现时独立地选自1-12的整数；和
R4和R8是相同或不同的，并且选自氢，C1-35烷基、烯基、炔基，烷氧基(-OR)，烷硫基(-SR)或取代的氨基(-NR2)；
R5、R6和R7独立地选自氢或基团-(CO)-R15，条件是R5、R6和R7中的2个是氢，并且R5、R6和R7之一是所述基团-(CO)-R15；
R15是基团-Z或基团-XaR*，其中Xa是氧、硫或-NRN-，并且R*选自氢，C1-35烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基，其各自任选含有至多20个杂原子，或R*是基团-Ra-L，其中L是用于与分析物、分析物类似物或关于分析物的结合配偶体形成缀合物的离去基团；条件是当R15是基团-Z时，那么X在每次出现时独立地选自键、-CH2-、氧、硫或-NRN-；
R在每次出现时独立地选自C1-35烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基，其各自含有至多20个杂原子；和
RN在每次出现时独立地选自氢，C1-35烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基，其各自含有至多20个杂原子；
条件是R1、R2、R3、R5、R6和R7中的至少一个是基团Z。
在另一个实施方案中，化学发光吖啶化合物是具有式II中所示的下述结构的吖啶磺酰胺：
其中，
R1是C1-35烷基、烯基、炔基或芳烷基，其各自可以含有至多20个杂原子，或磺丙基或磺丁基，或R1是基团-Ra-Z；
R2和R3独立地选自(i)氢、(ii)供电子基团或(iii)基团-Z；
Y和Y’独立地选自R、-Ra-Z或-Ra-L；其中L是包含离去基团、亲电子基团或亲核基团的可衍生官能团，用于与分析物、分析物类似物或关于分析物的结合配偶体形成缀合物；
Z是具有下述形式的两性离子基团：
X在每次出现时独立地选自键、-CH2-、氧、硫、-NRN-、酰胺(-NRN(CO)-)、氨基甲酸根(-NRNC(O)O-)或脲基(-NRNC(O)NRN-)；
R’和R”在每次出现时独立地选自C1-35烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基，其各自含有至多20个杂原子；
Z1是基团-Ra-Z2，其中Z2选自羧酸根(-COO-)、磺酸根(-SO3 -)、硫酸根(-OSO3 -)、磷酸根(-OP(O)(OR)(O-))或氧离子(-O-)；或在其中Z2是氧离子(-O-)的情况下，Ra可以是不存在的；
n在每次出现时独立地选自1-12的整数；
R在每次出现时独立地选自C1-35烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基，其各自含有至多20个杂原子；
RN在每次出现时独立地选自氢，C1-35烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基，其各自含有至多20个杂原子；
并且Ra是选自C1-35烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基的二价基团，其各自任选含有至多20个杂原子；
条件是R1、R2、R3、Y和Y’中的至少一个是所述两性离子基团Z。
在本发明的另一个方面，提供了用于检测分析物的试剂，其包含与分析物、分析物类似物或关于分析物的结合配偶体结合的化学发光吖啶化合物，所述吖啶化合物包含(i)连接至吖啶核的氮原子的烃基团，所述烃基团任选由至多20个杂原子取代，和(ii)与取代的烃部分(任选由至多20个杂原子取代)连接的、吖啶核的C9位置上的羧基或磺酰胺基团，其中所述吖啶化合物包含连接至吖啶核的C2位置、吖啶核的C7位置、与羧基或磺酰胺基团连接的烃基团、或连接至吖啶核的氮原子的烃基团的至少一个两性离子官能团；其中与不包含所述两性离子官能团的在其他方面等同的吖啶化合物比较，所述吖啶化合物显示出与固相减少的非特异性结合。
在本发明的一个进一步方面，提供了用于检测或定量大分子分析物的测定，其包含：(a)提供包含根据本发明的化学发光吖啶化合物的缀合物，所述化学发光吖啶化合物与对于分析物特异性的结合分子结合；(b)提供具有在其上固定了对于所述分析物特异性的第二种结合分子的固体载体；(c)混合缀合物、固相和怀疑含有分析物的样品以形成结合复合物；(d)分离在固体载体上捕获的结合复合物；(e)通过加入化学发光触发试剂，触发来自步骤(d)的结合复合物的化学发光；(f)用光度计测量光发射的量；和(g)通过比较由反应混合物发射的光量与标准剂量应答曲线，检测分析物的存在或计算分析物的浓度，所述标准剂量应答曲线使发射的光量与分析物的已知浓度联系。
在另外一个方面，提供了用于检测或定量小分子分析物的测定，其包含下述步骤：(a)提供分析物与根据本发明的化学发光吖啶化合物的缀合物；(b)提供固定有对于分析物特异性的结合分子的固体载体；(c)混合缀合物、固体载体和怀疑含有分析物的样品以形成结合复合物；(d)分离在固体载体上捕获的结合复合物；(e)通过加入化学发光触发试剂，触发来自步骤(d)的结合复合物的化学发光；(f)用光度计测量光量；和(g)通过比较由反应混合物发射的光量与标准剂量应答曲线，检测分析物的存在或计算分析物的浓度，所述标准剂量应答曲线使发射的光量与分析物的已知浓度联系。
在另外一个方面，提供了用于检测小分子分析物的测定，其包含：(a)提供固定有分析物或分析物类似物的固体载体；(b)提供对于分析物特异性的结合分子与根据本发明的化学发光吖啶化合物的缀合物；(c)混合固相、缀合物和怀疑含有分析物的样品以形成结合复合物；(d)分离在固体载体上捕获的结合复合物；(e)通过加入化学发光触发试剂，触发(d)的结合复合物的化学发光；(f)用光度计测量光量；和(g)通过比较由反应混合物发射的光量与标准剂量应答曲线，检测分析物的存在或计算分析物的浓度，所述标准剂量应答曲线使发射的光量与分析物的已知浓度联系。
本发明的这些及其他方面通过参考下述详述包括附加权利要求将得到更佳理解。
附图简述
图1提供了本发明的多个示例性含两性离子的吖啶化合物的化学结构。
图2提供了本发明的其他示例性含两性离子的吖啶化合物的化学结构。
图3提供了本发明的另一个示例性含两性离子的吖啶化合物的化学结构。
图4是作为时间函数标绘的，以相对光单位百分比(RLUs)表示的由对照(NSP-DMAE-HEG)和示例性含两性离子的吖啶(NSP-DMAE-Z-NHS)缀合物发射的光的曲线图。
图5是作为时间函数标绘的，以相对光单位百分比(RLUs)表示的由对照(HQYAE)和与2种抗体的示例性含两性离子的吖啶(NSP-2，7-DMG-DMAE)缀合物发射的光的曲线图。
图6是作为时间函数标绘的，以相对光单位百分比(RLUs)表示的由对照(NSP-DMAE-Z)和与抗TSHMab的示例性含两性离子的吖啶(ZC6M-AE和ZC8M-AE)缀合物发射的光的曲线图。
发明详述
本发明的主要目的是公开含两性离子的吖啶化合物的结构，当与缺乏这些结构特征的吖啶化合物比较时，其展示出与固相的低非特异性结合。本发明的另一个目的是公开吖啶化合物的2类两性离子修饰：(a)在吖啶环中含有两性离子的吖啶化合物，和(b)含有连接至苯酚离去基团的两性离子的吖啶化合物。本发明的另一个目的是公开当与不含这种结构修饰的吖啶化合物比较时，来自具有连接至苯酚的两性离子的吖啶化合物的出乎意料更快的光发射。本发明的另外一个目的是证实含两性离子的吖啶化合物与不含两性离子的吖啶化合物一样稳定，并且具有可比较的量子产率。
根据本发明的化学发光吖啶化合物可以是吖啶酯、吖啶磺酰胺等。在一个实施方案中，化学发光吖啶化合物包含(i)连接至吖啶核的氮原子的烃基团，所述烃基团任选由至多20个杂原子取代，和(ii)与取代的烃部分连接的、吖啶核的C9位置上的羧基或磺酰胺基团，其中吖啶化合物包含连接至吖啶核的C2位置、吖啶核的C7位置、与羧基或磺酰胺基团连接的烃部分、或连接至吖啶核的氮原子的烃基团的至少一个两性离子官能团；其中与不包含所述两性离子官能团的在其他方面等同的吖啶化合物比较，所述吖啶化合物显示出与固相减少的非特异性结合。
连接至氮原子的烃基团任选由至多20个杂原子取代，并且因此自身可以构成两性离子基团，例如在磺丙基或磺丁基连接的环氮的情况下，其中存在在环季氮上的正电荷和在-SO3基团上的负电荷。应当理解即使存在此类两性离子基团，根据本发明的化合物也将另外包含至少一个两性离子基团。换言之，根据本发明的化合物将包含在除吖啶核的氮或加上吖啶核的氮的原子上的正电荷。
在一个实施方案中，化学发光吖啶化合物是具有式I中所示的下述结构的吖啶酯：
其中，
R1是C1-35烷基、烯基、炔基或芳烷基，其各自可以含有至多20个杂原子，或磺丙基或磺丁基，或R1是基团-Ra-Z；其中Ra是选自C1-35烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基的二价基团，其各自任选含有至多20个杂原子；
R2和R3独立地选自(i)氢、(ii)供电子基团或(iii)基团-Z；
Z是下述形式的两性离子基团：
X在每次出现时独立地选自键、-CH2-、氧、硫、-NRN-、酰胺(-NRN(CO)-)、氨基甲酸根(-NRNC(O)O-)或脲基(-NRNC(O)NRN-)；
R’和R”在每次出现时独立地选自C1-35烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基，其各自任选含有至多20个杂原子；
Z1是基团-Ra-Z2，其中Z2选自羧酸根(-COO-)、磺酸根(-SO3 -)、硫酸根(-OSO3 -)、磷酸根(-OP(O)(OR)(O-))或氧离子(-O-)；或在其中Z2是氧离子(-O-)的情况下，Ra可以是不存在的；
n在每次出现时独立地选自1-12的整数；和
R4和R8是相同或不同的，并且选自氢，C1-35烷基、烯基、炔基，烷氧基(-OR)，烷硫基(-SR)或取代的氨基(-NR2)；
R5、R6和R7独立地选自氢或基团-(CO)-R15，条件是R5、R6和R7中的2个是氢，并且R5、R6和R7之一是所述基团-(CO)-R15；
R15是基团-Z或基团-XaR*，其中Xa是氧、硫或-NRN-，并且R*选自氢，C1-35烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基，其各自任选含有至多20个杂原子，或R*是基团-Ra-L，其中L是用于与分析物、分析物类似物或关于分析物的结合配偶体形成缀合物的离去基团；条件是当R15是基团-Z时，那么X在每次出现时独立地选自键、-CH2-、氧、硫或-NRN-；
R在每次出现时独立地选自C1-35烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基，其各自含有至多20个杂原子；和
RN在每次出现时独立地选自氢，C1-35烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基，其各自含有至多20个杂原子；
条件是R1、R2、R3、R5、R6和R7中的至少一个是基团Z。
在一个实施方案中，R1、R2、R3和R6中的至少一个或确切地一个包含基团-L或-Ra-L，其中L是包含离去基团、亲电子基团或亲核基团的可衍生官能团，用于与分析物、分析物类似物或关于分析物的结合配偶体形成缀合物。在某些实施方案中，L将选自：
在某些实施方案中，R15将选自：
(1)-OH；
(2)-O-N-琥珀酰亚胺基；
(3)-NH-(CH2)5-C(O)-O-N-琥珀酰亚胺基；
(4)-NH-(CH2)5-COOH；
(5)-NH-(C2H4O)i-C2H4NH-C(O)-(CH2)3-C(O)-O-N-琥珀酰亚胺基，其中i＝1-5；
(6)-NH-(C2H4O)i-C2H4NH-C(O)-(CH2)3-COOH，其中i＝1-5；
(7)-NH-(C2H4O)i-C2H4NH2，其中i＝1-5；和
(8)-NH-R-NHR；和
(9)-Z。
可以特别提及其中R15是-OH的情况。
在一个实施方案中，R’或R”包含基团-Ra-L，其中L是可衍生的离去基团、亲电子基团或亲核基团，用于与分析物、分析物类似物或关于分析物的结合配偶体形成缀合物。在某些实施方案中，L将选自上文提供的基团。在一个实施方案中，R’或R”在单次出现时是基团-Ra-C(O)-CH2CH2CH2-C(O)-N-琥珀酰亚胺基、-Ra-N-马来酰亚胺基、-Ra-C(O)-CH2-Br或-Ra-C(O)-CH2-I。
在某些实施方案中，R2和R3都是氢。在其他实施方案中，R2和/或R3可以选自例如供电子基团。一般的供电子基团包括但不限于OR、OH、SR、SH、NH2、NRNRN；其中R和RN在每次出现时独立地选择，且选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基和芳烷基，其各自含有至多20个杂原子。优选供电子基团是烷氧基(-OR)。
在某些实施方案中，R2和/或R3可以选自(i)烷氧基(-OR)，(ii)基团-O-(CH2CH2-O)1-CH3，其中1是1-12的整数，和(iii)基团-O-G，和(Vi)基团-Z；其中G是在每次出现时独立地选自下述的支链基团：
或；
其中R9、R10、R11R12、R13和R14在每次出现时独立地是甲基或基团-(CH2CH2O)mCH3，其中m是1-5的整数。
在一个实施方案中，根据本发明的化学发光吖啶酯化合物将具有式Ia中所示的结构：
其中R1、R4、R8、R15、R’、R”、X、Z1和n如式I中定义的，并且R’、R”、X、Z1和n在每次出现时独立地选择。
在特定实施方案中，R1可以适当地是烷基、磺丙基或磺丁基，R4和R8可以是低级烷基，特别是甲基，X可以是氧，和/或Z1可以是-SO3。在一个实施方案中，根据式Ia的吖啶酯具有下述结构：
其中，m是0(零)-3的整数，并且R15和n如上文对于式I定义的，m和n在每次出现时独立地选择。在一个实施方案中，化合物将具有下述结构：
其中n是1-12的整数，在每次出现时独立地选择。
根据式I的另一个代表性吖啶酯化合物具有式Ib中所示的结构：
其中R1、R2、R4、R8、R15、R’、R”、X、Z1和n如上文定义的。
在一个实施方案中，式Ib的化学发光吖啶酯化合物具有下述结构：
其中，m是0(零)-3的整数，并且R2、R15和n如上文定义的。在一个实施方案中，根据本发明的吖啶酯化合物具有下述结构：
其中n是1-12的整数，具有下述结构：
其中n是1-12的整数。根据式IB的另外一种化合物具有下述结构：
并且代表其中X是键(即X是完全不存在的)或亚甲基单位-CH2-的情况。
根据式I的化学发光吖啶酯化合物的另一个例子具有式Ic中所示的结构：
其中n’、m’和q’独立地是1-4的整数，并且R1、R2、R3、R4、R8、RN、R*、R’X和Z1如上文定义的。在一个实施方案中，R*包含基团-Ra-L，其中L是用于与分析物、分析物类似物或关于分析物的结合配偶体形成缀合物的离去基团。根据这个实施方案的代表性化合物具有下述结构：
其中R1、R2、R3、R4和R8如上文定义的。在某些实施方案中，R4和R4独立地是低级烷基，且特别是甲基；R1是烷基(例如甲基)、磺丙基(-CH2CH2CH2-SO3 -)或磺丁基(-CH2CH2CH2CH2-SO3 -)；R2和R3独立地选自氢或基团-O-G，其中G如上文定义的；并且R16选自(i)氢，(ii)-C(O)-CH2CH2CH2-C(O)-N-琥珀酰亚胺基，(iii)-R-N-马来酰亚胺基，其中R独立地是烷基、烯基、炔基或芳烷基，其各自可以任选包含至多20个杂原子，或(iv)-C(O)-CH2-X，其中X是溴(Br)或碘(I)。
在一个实施方案中，根据式Ic的化学发光吖啶化合物具有下述结构：
其中R2和R3如上文定义的。在一个实施方案中，R2和R3独立地选自氢或基团-O-G，其中G如本文定义的。
其中R1-R8和Z如就式I而言定义的，条件是当R1是烷基磺酸根基团时，那么X在每次出现时独立地选自键、-CH2-、氧或-NRN-。
根据式Id的某些化学发光吖啶化合物将具有式Ie中所示的结构：
其中R2、R3、R4、R8、R15、R’、R”、RN、Z1和n如式I中定义的。
根据式Ie的示例性化合物具有下述结构：
其中化合物任选包括抗衡离子A-，以平衡吖啶核的带正电的氮。虽然对抗衡离子的选择基本上没有限制，但在某些实施方案中，A-选自CH3SO4 -、FSO3 -、CF3SO4 -、C4F9SO4 -、CH3C6H4SO3 -、卤离子、CF3COO-、CH3COO-和NO3 -。
根据式Ie的示例性化学发光吖啶化合物(也显示于图3中)具有2个两性离子基团，其根据下述结构：
其中化合物任选包括抗衡离子A-，以平衡吖啶核的带正电的氮。
除上文描述的吖啶酯，本发明还涵盖能够经历化学发光的其他吖啶化合物，包括例如吖啶磺酰胺。在某些实施方案中，根据本发明的吖啶磺酰胺将具有式II的结构：
其中，
R1是C1-35烷基、烯基、炔基或芳烷基，其各自可以含有至多20个杂原子，或磺丙基或磺丁基，或R1是基团-Ra-Z；
R2和R3独立地选自(i)氢、(ii)供电子基团或(iii)基团-Z；
Y和Y’独立地选自R、-Ra-Z或-Ra-L；其中L是包含离去基团、亲电子基团或亲核基团的可衍生官能团，用于与分析物、分析物类似物或关于分析物的结合配偶体形成缀合物；
Z是下述形式的两性离子基团：
X在每次出现时独立地选自键、-CH2-、氧、硫、-NRN-、酰胺(-NRN(CO)-)、氨基甲酸根(-NRNC(O)O-)或脲基(-NRNC(O)NRN-)；
R’和R”在每次出现时独立地选自C1-35烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基，其各自含有至多20个杂原子；
Z1是基团-Ra-Z2，其中Z2选自羧酸根(-COO-)、磺酸根(-SO3 -)、硫酸根(-OSO3 -)、磷酸根(-OP(O)(OR)(O-))或氧离子(-O-)；或在其中Z2是氧离子(-O-)的情况下，Ra可以是不存在的；
n在每次出现时独立地选自1-12的整数；和
R在每次出现时独立地选自C1-35烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基，其各自含有至多20个杂原子；
RN在每次出现时独立地选自氢，C1-35烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基，其各自含有至多20个杂原子；和
Ra是选自C1-35烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基的二价基团，其各自任选含有至多20个杂原子；
条件是R1、R2、R3、Y和Y’中的至少一个包含所述两性离子基团Z。
在根据式II的吖啶磺酰胺的某些实施方案中，L是使得化合物能够与分析物、分析物类似物或关于分析物的结合配偶体等形成缀合物的官能团，并且可以选自：
在某些实施方案中，R’或R”包含基团-Ra-L。在其他实施方案中，R’或R”在每次出现时是基团-Ra-C(O)-CH2CH2CH2-C(O)-N-琥珀酰亚胺基、-Ra-N-马来酰亚胺基、-Ra-C(O)-CH2-Br或-Ra-C(O)-CH2-I。
在根据式II的化学发光吖啶磺酰胺化合物的另外实施方案中，R1将选自甲基、磺丙基(-CH2CH2CH2-SO3 -)、磺丁基(-CH2CH2CH2CH2-SO3 -)或具有下述结构的基团：
其中RN、R’、R”、Z1和n如对于式II定义的。
R2和R3中的一个或两个可以是例如基团Z，并且更具体而言，R2和R3中的一个或两个可以是基团：
其中n是1-12的整数，并且m是0-3的整数。
在根据式II的优选化学发光吖啶磺酰胺化合物中，Y’包含芳基、或烷基-芳基、或芳基、烷基，其各自任选由至多20个杂原子取代。一种此类吖啶磺酰胺化合物具有式IIb的结构：
其中Y包含基团-Ra-Z，其中Ra、R2、R3和Z如上文定义的。
根据式II的其他化学发光吖啶磺酰胺化合物具有式IIc的结构：
其中R*选自氢，C1-35烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基，其各自任选含有至多20个杂原子，或R*是基团-Ra-L，其中L是用于与分析物、分析物类似物或关于分析物的结合配偶体形成缀合物的离去基团；n’、m’和q’独立地是1-4的整数，并且R、RN、R1、R2、R3、R’和Z1如上文定义的。
应当理解与式I结合定义的取代基R1、R2、R3、RN、R*、R’、R”、Z、X、n、m等的选择，包括因此的优先选择，同样应用于依照式II的可比较参数的选择。
当与蛋白质例如抗体缀合时，本发明的含两性离子的吖啶化合物展示出低非特异性结合。如较早描述的，在使用固相例如颗粒或微量滴定板的测定中的非特异性结合是缀合物与这些固相的不需要的结合相互作用。这些不需要的结合相互作用一般增加测定的背景，导致在测定中信噪比的净降低且从而减少测定灵敏度。为了评估本发明的多种含两性离子的吖啶化合物的非特异性结合，我们使用针对分析物TSH(促甲状腺激素)产生的鼠单克隆抗体(抗TSHMab)，制备了这些化合物的抗体缀合物。这些缀合物的非特异性结合随后与使用NSP-DMAE-HEG和HQYAE制备的类似缀合物的非特异性结合比较。如较早提及和分别在美国专利号6,664,043B2和美国专利号7,309,615B2中描述的，后面2种亲水吖啶酯含有分别连接至苯酚和吖啶环的六乙二醇。后面一种化合物HQYAE也具有增加的光输出(更高的量子产率)，这是由于如美国专利号7,309,615B2中所述的在吖啶环中的2个烷氧基、供电子基团。在2种不同类别的颗粒上测量非特异性结合；来自商业卖主(DynalTM)的顺磁颗粒(PMP)和磁性胶乳颗粒(MLP)。2种颗粒在其固有组成中不同。PMPs主要由具有含胺的硅烷涂层的氧化铁颗粒制成。胺用于交联蛋白质与颗粒表面，其使用试剂例如戊二醛。另一方面，MLPs由具有掺杂磁铁矿的多孔聚苯乙烯制成，以使得磁性分离成为可能。在目前评估中使用的PMP在颗粒表面上由抗TSH抗体包被，其使用戊二醛偶联化学(固相“PMP”)。用于目前评估的MLPs(DynalM280-链霉抗生物素蛋白结合的生物素化的多克隆山羊抗PTH抗体(固相“M280”)和DynalM270-链霉抗生物素蛋白结合的生物素化的单克隆小鼠抗cTnI抗体(固相“M270”))具有在表面上固定的链霉抗生物素蛋白，这随后用于进一步固定能够结合分析物PTH(甲状旁腺激素)或cTNI(心肌肌钙蛋白I)的生物素标记的抗体。链霉抗生物素蛋白-生物素结合相互作用是众所周知且在测定中常用的。将2种类型的颗粒(PMPs和MLPs)与缀合物溶液混合特定时间段，并且随后将颗粒磁性分离，洗涤一次且随后测量与颗粒相关的化学发光。(实验细节可以在实施例18中找到)。这种化学发光值与总化学发光输入比较的比称为非特异性结合分数(fNSB)。具有低非特异性结合的缀合物将因此具有低fNSB值，并且本发明含两性离子的吖啶化合物的示例性实施方案的这些值(下文进一步描述的)连同对照化合物在下表1中制表。
表1.
PMP＝PMP-抗TSH抗体
M280＝DynalM280-链霉抗生物素蛋白结合的生物素化的多克隆山羊抗PTH抗体
M270＝DynalM270-链霉抗生物素蛋白结合的生物素化的单克隆小鼠抗cTnI抗体。
在PMP上的NSP-DMAE-HEG和HQYAE缀合物分别具有4×10-5和1.6×10-5的fNSB值。使用本发明的含两性离子的吖啶酯制备的所有其他缀合物具有与这些值可比较或更低的fNSB值。例如，衍生自NSP-DMAE-Z和ZC6M-AE的缀合物分别具有1.3×10-5和3.7×10-5的fNSB值。前面一种吖啶酯含有连接至苯酚的两性离子，而后面一种化合物含有在吖啶环中的两性离子。2种类型的两性离子修饰因此在减少关于PMP颗粒的fNSB中是有效的。在颗粒表面上具有抗PTH抗体的DynalMLP上，NSP-DMAE-HEG和HQYAE缀合物分别具有5.2×10-4和1.5×10-4的fNSB值。衍生自含两性离子的吖啶酯的所有其他缀合物具有基本上更低的fNSB值，除其fNSB(1.7×10-4)与HQYAE缀合物的那种可比较的ZC12-AE外。类似结果在其表面上固定了抗cTNI抗体的DynalMLP上观察到。含两性离子的吖啶酯缀合物因此在目前测试的MLPs上具有明显更低的fNSB值，并且如较早讨论的通过减少本底信号提供改善测定灵敏度的潜力。
如图3和4中的曲线图中举例说明的，当分别与衍生自NSP-DMAE-HEG和HQYAE的类似缀合物比较时，具有连接至苯酚的两性离子的NSP-DMAE-Z和NSP-2，7-DMG-DMAE-Z(DMG＝二甲氧基甘油氧基)的吖啶酯缀合物也出乎意料地显示出更快速的光发射。吖啶酯NSP-DMAE-Z-NHS类似于NSP-DMAE-HEG-戊二酸酯-NHS，因为2种吖啶酯含有相同吖啶环但连接至苯酚的不同官能团。前面一种化合物含有连接至苯酚的两性离子，而后面一种化合物含有六乙二醇衍生物。除含有连接至苯酚的两性离子外，含两性离子的化合物NSP-2，7-DMG-DMAE-Z-NHS还具有在吖啶环中的供电子二甲氧基甘油氧基(DMG)官能团。由于2个供电子基团，来自这种化合物的光输出类似于HQYAE的那种，并且高于NSP-DMAE-HEG的那种。
在光度计上进行光测量，并且在多个时间间隔测量由每种缀合物发射的光(表示为RLUs；相对光单位)。由每种缀合物发射的总光随后用于计算在每个时间间隔发射的光百分比(％RLU)。如由图4显而易见的，NSP-DMAE-HEG的抗TSHMab(Mab＝单克隆抗体)缀合物需要＞4秒用于完全光发射，而对于NSP-DMAE-Z的缀合物，光发射在2秒内完成。2种吖啶酯的BSA缀合物(BSA＝牛血清白蛋白)的类似比较指出对于含两性离子的吖啶酯明显更快速的光发射。
在图5中比较来自与2种不同抗体抗TSHMab和抗HBsAg-Mab(HBsAg＝乙型肝炎，表面抗原)的高光输出吖啶酯HQYAE和NSP-2，7-DMG-DMAE的抗体缀合物的光发射。在这种情况下，含两性离子的化合物也展示出明显更快速的光发射，其总光发射在＜2秒内完成，而衍生自HQYAE的缀合物花费～4秒用于完成光发射。此外，观察到2种吖啶酯的相对化学发光(Rel.CL)在2种不同抗体上是相同的。因此，在苯酚上的两性离子引入加速光发射，但不损害吖啶酯的总体光输出。
吖啶化合物是尤其在自动化免疫化学仪器例如CentaurTM和ACS：180TM(SiemensHealthcareDiagnostics)中非常有用的化学发光标记，所述仪器使用吖啶酯NSP-DMAE-HEG和HQYAE。这2种仪器都具有高通量，这意味着它们能够分别每小时运行执行大量免疫测定测试，分别为240和180测试。当外加含有0.5％过氧化氢的100mM硝酸，随后为0.25N氢氧化钠加上表面活性剂的第二种溶液触发其化学发光时，衍生自NSP-DMAE的试剂一般经过5秒的时期发射光。当与采用吖啶酯NSP-DMAE-HEG和HQYAE的在其他方面等同的测试比较时，由于其快速光发射(对于≥90％发射的总光≤2秒)，其中两性离子定位于苯酚上的本发明含两性离子的吖啶化合物可以用于自动化免疫化学仪器例如ADVIA：CentaurTM中，以增加其通量。
最后在图6中，来自含两性离子的吖啶酯ZC6M-AE、ZC8M-AE(其结构显示于图1中)和NSP-DMAE-Z-NHS的抗TSHMab缀合物的光发射的动力学与NSP-DMAE-HEG的那种比较。虽然在苯酚上具有两性离子修饰的NSP-DMAE-Z缀合物显示出比如上所述的NSP-DMAE-HEG更快速的光发射，其中两性离子定位于吖啶环中的ZC6M-AE和ZC8M-AE的2种吖啶酯缀合物显示与NSP-DMAE-HEG可比较的发射动力学。因此，如在这2种情况下观察到的，在吖啶环中的两性离子引入对于发射动力学也是无害的。还观察到来自3种含两性离子的化合物ZC6M-AE、ZC8M-AE和NSP-DMAE-Z的抗TSHMab和抗HBsAgMab缀合物的总光输出与NSP-DMAE-HEG是类似和可比较的。
如最初通过Law等人对于DMAE描述的，吖啶酯的增强稳定性是这些化合物的另一个重要特征，其促进其在商业、自动化、免疫分析仪中的效用。“稳定性”意指当化合物或缀合物贮存于一般在6-9的pH范围中(这在生理学pH内)的水溶液中时，如通过RLUs的丧失测量的最低限度丧失的化学发光活性。从机械学观点来看，酚酯的水解是化学发光吖啶酯通过其变得非化学发光的主要途径。稳定缀合物确保关于吖啶酯试剂的长保存期限，并且也确保测定性能经过给定时间段不极大地改变。本发明的抗TSH抗体的多种吖啶酯缀合物的稳定性(下文进一步描述)在表2中列出。缀合物的水溶液贮存于对于商业自动化仪器例如CentaurTM一般的4℃或贮存于37℃在pH7.7的水性缓冲液中。在其中吖啶酯水解预期加速的37℃的更严苛贮存条件允许多种吖啶酯的相对稳定性的公平比较。对于所有缀合物，使用光度计定期记录作为RLUs的光。在起始时间点也称为第1天测量的RLUs指定100％的值。在4周后来自每种缀合物的残留RLUs在表2中列出。关于这些测量的其他细节可以在实施例19中发现。
表2.
根据表2，本发明的多种含两性离子吖啶酯缀合物的化学发光稳定性与NSP-DMAE-HEG和HQYAE的那些是可比较的。在37℃，在4周后，这2种吖啶酯的缀合物分别保留其75％和58％的化学发光活性。其他含两性离子吖啶酯的所有缀合物显示可比较的稳定性，范围为对于ZC6-AE缀合物的52％到对于NSP-2Z-DMAE缀合物的94％。在4℃，在4周后，所有吖啶酯缀合物显示化学发光活性的最低限度丧失。
本发明的含两性离子的吖啶化合物在用于测定或定量分析物的测定中作为标记是有用的。在此类测定中一般测量的分析物通常是具有某些临床关联性的物质，并且可以跨越从大型大分子例如蛋白质、核酸、病毒、细菌等到小分子例如乙醇、维生素、类固醇、激素、治疗性药物等的广泛范围的分子。‘夹心’免疫测定一般涉及使用2种结合分子例如抗体检测大分子、也称为大分子分析物。一种抗体固定或连接至固相，例如颗粒、珠、膜、微量滴定板或任何其他固相表面。用于结合分子例如抗体连接至固相的方法是本领域众所周知的。例如，通过使用交联分子例如戊二醛，抗体可以共价连接至在其表面上含有胺的颗粒。连接还可以是非共价的，并且可以涉及结合分子与固相例如聚苯乙烯珠和微量滴定板的表面的简单吸附。第二种抗体通常与化学发光或荧光分子(通常称为标记)共价连接。结合分子例如抗体及其他结合蛋白的标记也是本领域众所周知的，并且通常称为缀合反应，并且标记的抗体通常称为缀合物。一般地，在标记上的胺反应性部分与在抗体上的胺反应，以形成酰胺连接。在抗体和标记之间的其他连接例如硫醚、酯、氨基甲酸酯等也是众所周知的。在测定中，2种抗体与大分子分析物的不同区域结合。大分子分析物可以是例如蛋白质、核酸、寡糖、抗体、抗体片段、细胞、病毒、受体或合成聚合物。结合分子可以是抗体、抗体片段、核酸、肽、结合蛋白或合成结合聚合物。例如，叶酸结合蛋白(“FBP”)结合分析物叶酸。可以结合多种分析物的合成结合分子也已由Mossbach等人Biotechnology第14卷，第163-170页(1995)公开。
当具有固定抗体和标记抗体的固相与含有分析物的样品混合时，结合复合物在分析物和2种抗体之间形成。由于固相的牵涉，这种类型的测定通常称为异源测定。随后可以测量与结合复合物相关的化学发光或荧光信号，并且可以推断分析物的存在或不存在。通常，在信号生成前，分离结合复合物与结合反应组分的其余部分，例如过量的标记抗体。例如，如果结合复合物与磁珠相关，那么磁体可以用于分离来自总体溶液的与珠结合的结合复合物。通过使用一系列标准，即已知浓度的分析物，使用2种抗体可以生成‘剂量应答’曲线。因此，剂量应答曲线关联一定量的测量信号与分析物的特定浓度。在夹心测定中，随着分析物的浓度增加，信号的量也增加。随后通过比较通过含有大分子分析物的未知样品生成的信号与剂量应答曲线，可以计算在未知样品中分析物的浓度。
以相似脉络(inasimilarvein)，2种结合组分还可以是与核酸分析物的不同区域结合或杂交的核酸。随后可以以相似方式推导核酸分析物的浓度。
用于小分子分析物例如类固醇、维生素、激素、治疗性药物或小肽的另一类免疫测定采用通常称为竞争性测定的测定形式。一般地，在竞争性测定中，通过共价交联2种分子，由目的分析物和化学发光或荧光标记制成缀合物。小分子分析物可以像这样使用，或其结构可以在与标记缀合前改变。具有改变结构的分析物称为类似物。通常必须使用分析物的结构类似物，以允许用于交联标记与分析物的化学作用。有时，分析物的结构类似物用于减弱或增强其与结合分子例如抗体的结合。此类技术是本领域众所周知的。针对目的分析物的抗体或结合蛋白通常直接或通过次级结合相互作用例如生物素-抗生物素蛋白系统固定在固相上。
通过允许含分析物的样品和分析物标记缀合物竞争有限量的固相固定的结合分子，可以在竞争性测定中推导在样品中分析物的浓度。随着在样品中分析物的浓度增加，在固相上通过结合分子捕获的分析物标记缀合物的量降低。通过采用一系列‘标准’，即已知浓度的分析物，可以构建剂量应答曲线，其中来自在固相上通过结合分子捕获的分析物标记缀合物的信号与分析物的浓度负相关。一旦剂量应答曲线已以这种方式衍生，通过比较得自未知样品的信号与剂量应答曲线中的信号，就可以推导未知样品中相同分析物的浓度。
用于小分子分析物的另一种形式的竞争性测定涉及固相的使用，所述固相固定有目的分析物或分析物类似物和对于分析物特异性的抗体或结合蛋白，其与化学发光或荧光标记缀合。在这种形式中，通过与固相上的分析物或分析物类似物的结合相互作用，在固相上捕获抗体标记缀合物。样品中存在于的目的分析物随后与抗体标记缀合物“竞争性”结合，并且因此抑制或替换抗体标记缀合物与固相的相互作用。以这种方式，由固相上捕获的抗体标记缀合物生成的信号量与样品中分析物的量关联。
用于与这些方法结合使用的试剂也由本发明提供，并且一般包含与分析物、分析物类似物或关于分析物的结合配偶体结合的化学发光吖啶化合物，所述吖啶化合物包含(i)连接至吖啶核的氮原子的烃基团，所述烃基团任选由至多20个杂原子取代，和(ii)与取代的烃部分(任选由至多20个杂原子取代)连接的吖啶核的C9位置上的羧基或磺酰胺基团，其中所述吖啶化合物包含连接至吖啶核的C2位置、吖啶核的C7位置、与羧基或磺酰胺基团连接的烃基团、或连接至吖啶核的氮原子的烃基团的至少一个两性离子官能团；其中与不包含所述两性离子官能团的在其他方面等同的吖啶化合物比较，所述吖啶化合物显示出与固相减少的非特异性结合。
依照前述，根据本发明的一个实施方案，用于检测或定量大分子分析物的测定包含下述步骤：
(a)提供包含下述的缀合物：(i)对于分析物特异性的结合分子；和(ii)本发明的含两性离子的吖啶酯或磺酰胺化合物中的任何；
(b)提供具有在其上固定了对于所述分析物特异性的第二种结合分子的固体载体；
(c)混合缀合物、固相和怀疑含有分析物的样品以形成结合复合物；
(d)分离在固体载体上捕获的结合复合物；
(e)通过加入化学发光触发试剂，触发来自步骤(d)的结合复合物的化学发光；
(f)用光度计测量光发射的量；和
(g)通过比较由反应混合物发射的光量与标准剂量应答曲线，检测分析物的存在或计算分析物的浓度，所述标准剂量应答曲线使发射的光量与分析物的已知浓度联系。
在另一个实施方案中，提供了用于检测或定量小分子分析物的测定，其包含下述步骤：
(a)提供分析物与本发明的含两性离子的吖啶酯或磺酰胺化合物中的任何的缀合物；
(b)提供固定有对于分析物特异性的结合分子的固体载体；
(c)混合缀合物、固体载体和怀疑含有分析物的样品以形成结合复合物；
(d)分离在固体载体上捕获的结合复合物；
(e)通过加入化学发光触发试剂，触发来自步骤(d)的结合复合物的化学发光；
(f)用光度计测量光量；和
(g)通过比较由反应混合物发射的光量与标准剂量应答曲线，检测分析物的存在或计算分析物的浓度，所述标准剂量应答曲线使发射的光量与分析物的已知浓度联系。
在可替代测定形式中，本发明的含两性离子的吖啶化合物对于在测定中检测小分子分析物也是有用的，其包含下述步骤：
a)提供固定有分析物或分析物类似物的固体载体；
b)提供对于分析物特异性的结合分子与本发明的含两性离子的吖啶酯或磺酰胺化合物的缀合物；
c)混合固相、缀合物和怀疑含有分析物的样品以形成结合复合物；
d)分离在固体载体上捕获的结合复合物；
e)通过加入化学发光触发试剂，触发(d)的结合复合物的化学发光；
f)用光度计测量光量；和
g)通过比较由反应混合物发射的光量与标准剂量应答曲线，检测分析物的存在或计算分析物的浓度，所述标准剂量应答曲线使发射的光量与分析物的已知浓度联系。
化学发光触发试剂可以是过氧化氢或过氧化物盐。
大分子分析物可以是蛋白质、核酸、寡糖、抗体、抗体片段、细胞、病毒、合成聚合物等。
小分子分析物可以是类固醇、维生素、激素、治疗性药物、小肽等。
在测定中的结合分子可以是抗体、抗体片段、结合蛋白、核酸、肽、受体或合成结合分子。
实施例1
ZC3-AE-NHS，化合物1d的合成
a)化合物1a
在氮气氛下，用偶氮二甲酸二异丙酯(0.188mL，4当量)处理2，7-二羟基吖啶甲酯(0.1g，0.24毫摩尔)(美国专利号7,309,615)、3-二甲氨基丙醇(0.112mL，4当量)和三苯基膦(0.252g，4当量)的无水四氢呋喃(10mL)溶液。将反应在室温搅拌16小时。使用乙酸乙酯作为洗脱剂在二氧化硅上的TLC分析显示没有原料，并且使用75％乙酸乙酯、24％甲醇和1％三乙胺，观察到极性产物(Rf～0.15)。随后将溶剂在减压下去除，并且将残渣在1NHCl(25mL)和乙酸乙酯(25mL)之间分配。将含有产物的水层用乙酸乙酯再萃取2次(2×25mL)。随后用2.5％氢氧化钠水溶液逐滴处理酸性水层，直至形成鲜黄色悬液。将这种悬液用乙酸乙酯萃取(3×25mL)。随后使用Phenomenex，C184.6mm×25cm柱和以1.0mL/分钟流速的10→60％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的40分钟梯度和在260nm的UV检测，通过HPLC分析小部分的这种溶液。观察到在Rt＝25分钟洗脱的产物并且是主要组分。将乙酸乙酯溶液在无水硫酸镁上干燥，过滤且在减压下浓缩，以获得粘性黄色固体。产量＝126mg(89％)；观察到MALDI-TOFMS588.3。
b)化合物1c
将化合物1a(0.126g，0.215毫摩尔)、蒸馏的1，3-丙烷磺内酯(0.785g，30当量)和2，6-二叔丁基吡啶(0.470mL，10当量)在离子液体[BMIM][PF6](1-2mL)中的混合物在150℃在氮气氛下加热24小时。随后将反应冷却至室温。抽取小部分(1-2uL)的反应混合物，用甲醇(0.1mL)稀释并且使用上文在节段(a)中描述的梯度通过分析型HPLC分析。观察到在Rt＝18分钟洗脱的主要产物，其通过MALDI-TOFMS分析(观察到953.5)对应于三烷基化吖啶酯产物1b。将粗反应混合物在乙酸乙酯(30mL)和水(30mL)之间分配。将含有产物的水层用乙酸乙酯再萃取3次(3×30mL)。将水层在减压下浓缩，以提供粗吖啶酯1b。将这种材料溶解于1NHCl(15mL)中，并且在氮下回流1.5小时，并且随后冷却至室温。反应混合物的HPLC分析指出甲酯的彻底水解，其中产物1c在Rt＝16分钟洗脱。将反应混合物浓缩至～10mL，并且使用YMC，C1830×300mm柱和以20mL/分钟的溶剂流速在节段(a)中描述的相同梯度和在260nm的UV检测，通过制备型HPLC纯化产物。合并含有产物的HPLC级分，并且在减压下浓缩。产量＝116mg(总共57％)；观察到MALDI-TOFMS941.2。
c)化合物1d
用二异丙基乙胺(7uL，1.5当量)和TSTU(19mg，2当量)处理吖啶羧酸1c(30mg，32微摩尔)的DMF(3mL)和水(0.3mL)的部分溶液。将反应在室温剧烈搅拌。在24小时后，使用在节段(a)中所述的梯度，反应混合物的HPLC分析显示在Rt＝17.5分钟洗脱的产物(～20％转化)。随后将反应用水(2.7mL)稀释，这给出澄清溶液，并且随后用另外的二异丙基乙胺(10uL，2当量)和TSTU(50mg，5当量)处理。将反应在室温搅拌0.5小时，并且随后通过HPLC进行分析，这指出～40％转化。随后使用在节段(b)中所述的梯度和柱，通过制备型HPLC纯化产物。将含有产物的HPLC级分在-80℃冷冻，并且冻干至干燥，以提供鲜黄色粉末。产量＝11mg(33％)；观察到MALDI-TOFMS1037.4。
下述反应描述了ZC3-AE-NHS，化合物1d的合成。
实施例2
ZC6-AE-NHS，化合物2d的合成
a)化合物2a
用偶氮二甲酸二异丙酯(0.06mL，5当量)处理2，7-二羟基吖啶甲酯(30mg，72微摩尔)、6-二甲氨基-1-己醇(42mg，4当量)和三苯基膦(75mg，4当量)的无水四氢呋喃(5mL)溶液。将反应在氮气氛下在室温搅拌16小时。使用70％乙酸乙酯、28％甲醇、2％三乙胺在二氧化硅上的TLC分析显示至极性产物的彻底转化。使用Phenomenex，C184.6mm×25cm柱和以1.0mL/分钟流速的10→70％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，执行反应混合物的HPLC分析。观察到在Rt＝25分钟洗脱的产物并且是主要组分。如实施例1，节段(a)中所述分离产物。产量＝36mg(75％)。
b)化合物2c
将化合物2a(36mg，54微摩尔)、蒸馏的1，3-丙烷磺内酯(0.2g，30当量)和2，6-二叔丁基吡啶(0.120mL，10当量)在离子液体[BMIM][PF6](1g)中的混合物在150℃在氮气氛下加热24小时。随后将反应冷却至室温，并且在乙酸乙酯(30mL)和水(50mL)之间分配。将含有产物的水层分离，并且用乙酸乙酯(2×30mL)洗涤2次。使用节段(a)中所述梯度的水溶液的HPLC分析指出至在Rt＝19分钟洗脱的三烷基化产物的＞80％转化，其中～20％二烷基化产物在Rt＝24分钟洗脱。将含有粗吖啶酯产物2b的水层在减压下浓缩。将残渣溶解于1NHCl(10mL)中，并且在氮气氛下回流2小时。随后将反应混合物冷却至室温，并且通过HPLC进行分析，这指出至在Rt＝17分钟洗脱的吖啶羧酸的彻底转化。使用YMC，C1830×300mm柱和以20mL/分钟的溶剂流速在节段(a)中描述的相同梯度和在260nm的UV检测，通过制备型HPLC纯化产物。合并含有产物的HPLC级分，并且在减压下浓缩，以给出化合物2c。产量＝39.4mg(总共71％)；观察到MALDI-TOFMS1025.1。
c)化合物2d
用二异丙基乙胺(0.033mL，5当量)和TSTU(57mg，5当量)处理化合物2c(39mg，38微摩尔)的15％水/DMF(4mL)溶液。将反应在室温搅拌15分钟，并且如节段(a)中所述通过HPLC进行分析。观察到在Rt＝18.4分钟洗脱的完全转化至NHS酯产物2d。使用YMC，C1830×300mm柱和以20mL/分钟的溶剂流速在节段(a)中描述的相同梯度和在260nm的UV检测，通过制备型HPLC纯化产物。合并含有产物的HPLC级分，在-80℃冷冻，并且冻干至干燥，以给出产物2d。产量＝28mg(66％)；观察到MALDI-TOFMS1120.8。
下述反应描述了ZC6-AE-NHS，化合物2d的合成。
实施例3
ZC8-AE-NHS，化合物3d的合成
a)化合物3a
用偶氮二甲酸二异丙酯(0.06mL，5当量)处理2，7-二羟基吖啶甲酯(30mg，72微摩尔)、8-二甲氨基-1-辛醇(50mg，4当量)和三苯基膦(75mg，4当量)的无水四氢呋喃(5mL)溶液。使用Phenomenex，C184.6mm×25cm柱和以1.0mL/分钟流速的10→100％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，执行小部分的反应混合物的HPLC分析。观察到在Rt＝22.5分钟洗脱的产物并且是主要组分。如实施例1，节段(a)中所述分离产物3a。产量＝58mg(定量)，观察到MALDI-TOFMS728.6。
b)化合物3c
将化合物3a(58mg，80微摩尔)、蒸馏的1，3-丙烷磺内酯(0.291g，30当量)和2，6-二叔丁基吡啶(0.175mL，10当量)在离子液体[BMIM][PF6](1g)中的混合物在150℃在氮气氛下加热24小时。随后将反应冷却至室温，并且在乙酸乙酯(30mL)和水(30mL)之间分配。将含有产物的水层分离，并且用乙酸乙酯(2×30mL)洗涤2次。使用节段(a)中所述梯度的水溶液的HPLC分析指出在Rt＝1.5分钟洗脱的吖啶酯产物3b(观察到MALDI-TOFMS1094)。将水层在减压下浓缩，并且将回收的褐色油在氮下在1NHCl(10mL)中回流。在2小时后，将反应冷却至室温，并且通过HPLC进行分析，这指出在Rt＝16分钟洗脱的产物。使用YMC，C1830×300mm柱和以20mL/分钟溶剂流速的10→70％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，通过制备型HPLC纯化产物。合并含有产物的HPLC级分，并且在减压下浓缩，以给出化合物3c。产量＝30mg(总共39％)；观察到MALDI-TOFMS1082.4。
c)化合物3d
用二异丙基乙胺(18.6uL，5当量)和TSTU(32mg，5当量)处理化合物3c(23mg，21.3微摩尔)的15％水/DMF(2mL)溶液。将反应在室温搅拌。在15分钟后，使用Phenomenex，C184.6mm×25cm柱和以1.0mL/分钟流速的10→60％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的40分钟梯度和在260nm的UV检测，执行小部分的反应混合物的HPLC分析。观察到在Rt＝29分钟洗脱的产物并且是主要组分。使用YMC，C1830×300mm柱和以20mL/分钟溶剂流速的10→70％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，通过制备型HPLC纯化产物。合并含有产物的HPLC级分，在-80℃冷冻，并且冻干至干燥，以给出产物3d。产量＝15mg(66％)；观察到MALDI-TOFMS1178.8。
下述反应描述了ZC8-AE-NHS，化合物3d的合成。
实施例4
ZC12-AE-NHS，化合物4e的合成
a)12-二甲氨基-1-十二醇，4a
用二甲胺的四氢呋喃(10mL)2.0M溶液处理12-溴-1-十二醇(1g，3.8毫摩尔)的无水四氢呋喃(10mL)溶液。将反应在室温搅拌3天。使用25％乙酸乙酯、75％己烷作为洗脱剂在二氧化硅上的TLC分析显示具有很少原料的极性产物的形成。将反应用乙酸乙酯(75mL)稀释，并且用无水碳酸氢钠和水洗涤2次。随后将乙酸乙酯溶液在无水硫酸镁上干燥，过滤且在减压下浓缩。产量＝1.2g(蜡)。在二氧化硅(25％甲醇，75％乙酸乙酯)上的TLC分析显示具有Rf～0.1的条纹(streaking)产物。这种产物4a无需纯化而使用。
b)化合物4b
用偶氮二甲酸二异丙酯(0.06mL，5当量)处理2，7-二羟基吖啶甲酯(30mg，72微摩尔)、12-二甲氨基-1-十二醇(66mg，4当量)和三苯基膦(75mg，4当量)的无水四氢呋喃(5mL)溶液。在2小时后，用另外4当量的三苯基膦和5当量的偶氮二甲酸二异丙酯处理反应。在30分钟后，使用Phenomenex，C184.6mm×25cm柱和以1.0mL/分钟流速的10→100％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，通过HPLC分析小部分。观察到在Rt＝30分钟洗脱的产物并且是主要组分。如实施例1，节段(a)中所述分离产物。产量＝57mg(95％)；观察到MALDI-TOFMS840.3。
c)化合物4d
将化合物4b(57mg，68微摩尔)、1，3-丙烷磺内酯(0.250g，30当量)和2，6-二叔丁基吡啶(0.15mL，10当量)在离子液体[BMIM][PF6](1mL)中的混合物在150℃在氮气氛下加热24小时。随后将反应冷却至室温，并且如实施例2，节段(b)中所述加工。使用节段(a)中所述梯度的粗反应混合物的HPLC分析指出在Rt＝24分钟洗脱的吖啶酯产物4c(观察到MALDI-TOFMS1206.2)。将粗产物在1NHCl(10mL)中回流4小时。随后将反应冷却至室温，并且通过HPLC进行分析，这指出至在Rt＝21分钟洗脱的产物4d的～70％转化。使用YMC，C1830×300mm柱和以20mL/分钟溶剂流速的10→100％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，通过制备型HPLC纯化产物。合并含有产物的HPLC级分，并且在减压下浓缩，以给出化合物4b。产量＝22mg(总共27％)；观察到MALDI-TOFMS1193.4。
d)化合物4e
用二异丙基乙胺(16uL，5当量)和TSTU(28mg，5当量)处理化合物4d(22mg，18.4微摩尔)的DMF(3.4mL)和水(0.6mL)溶液。将反应在室温搅拌。在15分钟后，使用Phenomenex，C184.6mm×25cm柱和以1.0mL/分钟流速的10→100％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，执行小部分的反应混合物的HPLC分析。观察到在Rt＝22分钟洗脱的产物并且是主要组分。使用YMC，C1830×300mm柱和以20mL/分钟溶剂流速的10→1000％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，通过制备型HPLC纯化产物。合并含有产物的HPLC级分，在-80℃冷冻，并且冻干至干燥，以给出产物4e。产量＝15.4mg(64％)；观察到MALDI-TOFMS1290.6。
下述反应描述了ZC12-AE-NHS，化合物4e的合成。
实施例5
ZC3M-AE-NHS，化合物5d的合成
a)化合物5a
用偶氮二甲酸二异丙酯(25uL，2当量)处理2-羟基吖啶甲酯(25mg，62.3微摩尔)(以与美国专利号7,309,615中的二羟基衍生物相似的方式合成)、3-二甲氨基-1-丙醇(15uL，2当量)和三苯基膦(33mg，2当量)的无水四氢呋喃(3mL)溶液。将反应在氮下在室温搅拌。在1小时后，使用1∶1乙酸乙酯/甲醇作为洗脱剂在二氧化硅上的TLC分析显示Rf～0.2的极性产物的彻底形成。使用Phenomenex，C184.6mm×25cm柱和以1.0mL/分钟流速的10→70％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，执行小部分的反应混合物的HPLC分析。观察到在Rt＝25.2分钟洗脱的产物并且是主要组分。将反应用乙酸乙酯(25mL)和1NHCl(25mL)稀释。分离具有产物的HCl层，并且用乙酸乙酯洗涤2次(2×25mL)。随后将HCl层在冰中冷却，并且用5％KOH水溶液处理直至形成悬液。将这种悬液用乙酸乙酯萃取(2×25mL)。将合并的乙酸乙酯萃取物用水(25mL)洗涤。随后将它在无水硫酸镁上干燥，过滤且在减压下浓缩，以提供化合物5a。产量＝24.5mg(82％)；观察到MALDI-TOFMS487.5。
b)化合物5c
将化合物5a(24.5mg，51.3微摩尔)、1，3-丙烷磺内酯(125mg，20当量)和2，6-二叔丁基吡啶(79uL，7当量)在离子液体[BMIM][PF6](0.5mL)中的混合物在150℃加热24小时。随后将反应冷却至室温，并且抽取小部分(1-2uL)，用甲醇稀释并且如节段(a)中所述通过HPLC分析。观察到在Rt＝18分钟洗脱的吖啶酯产物5b(＞80％转化；观察到MALDI-TOFMS731.04)。将反应在乙酸乙酯(25mL)和水(25mL)之间分配。将含有产物的水层分离，并且用乙酸乙酯(50mL)洗涤1次。随后将它在减压下浓缩。将残渣在10mL1NHCl中在氮下回流2小时，并且冷却至室温。反应混合物的HPLC分析指出在Rt＝15分钟洗脱的产物5c的彻底形成。使用YMC，C1830×300mm柱和以20mL/分钟溶剂流速的10→70％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，通过制备型HPLC纯化产物。合并含有产物的HPLC级分，并且在减压下浓缩，以给出化合物5c。产量＝32mg(总共89％)；观察到MAIDI-TOFMS717.1。
c)化合物5d
用二异丙基乙胺(39uL，5当量)和TSTU(67mg，5当量)处理化合物5c(32mg，44.6微摩尔)的DMF(3.4mL)和水(0.6mL)溶液。将反应在室温搅拌。在15分钟后，使用Phenomenex，C184.6mm×25cm柱和以1.0mL/分钟流速的10→70％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，执行小部分的反应混合物的HPLC分析。观察到在Rt＝17分钟洗脱的产物并且是主要组分。使用YMC，C1830×300mm柱和以20mL/分钟溶剂流速的10→70％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，通过制备型HPLC纯化产物。合并含有产物5d的HPLC级分，在-80℃冷冻，并且冻干至干燥。产量＝25mg(69％)；观察到MALDI-TOFMS814.1。
下述反应描述了ZC3M-AE-NHS，化合物5d的合成。
实施例6
ZC6M-AE-NHS，化合物6d的合成
a)化合物6a
用偶氮二甲酸二异丙酯(25uL，2当量)处理2-羟基吖啶甲酯(25mg，62.3微摩尔)、6-二甲氨基-1-己醇(18mg，2当量)和三苯基膦(33mg，2当量)的无水四氢呋喃(3mL)溶液。将反应在氮下在室温搅拌1小时，并且随后如节段(a)、实施例5中所述操作。使用Phenomenex，C184.6mm×25cm柱和以1.0mL/分钟流速的10→100％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，执行小部分的反应混合物的HPLC分析。观察到在Rt＝22分钟洗脱的产物并且是主要组分。产量＝33.5mg(定量)；观察到MALDI-TOFMS529.5。
b)化合物6c
将化合物6a(33.5mg，63.3微摩尔)、1，3-丙烷磺内酯(155mg，20当量)和2，6-二叔丁基吡啶(97uL，7当量)在离子液体[BMIM][PF6](0.5mL)中的混合物在150℃加热24小时。随后将反应冷却至室温，并且抽取小部分(1-2uL)，用甲醇稀释并且如节段(a)中所述通过HPLC分析。观察到在Rt＝16分钟洗脱的吖啶酯产物6b(＞80％转化；观察到MALDI-TOFMS773.5)。将反应混合物如节段(b)、实施例5中所述操作。将吖啶酯6b在10mL1NHCl中在氮下回流2小时，并且冷却至室温。反应混合物的HPLC分析指出在Rt＝14分钟洗脱的产物6c的彻底形成。使用YMC，C1830×300mm柱和以20mL/分钟溶剂流速的10→100％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，通过制备型HPLC纯化产物。合并含有产物的HPLC级分，并且在减压下浓缩，以给出化合物6c。产量＝26.8mg(总共56％)。
c)化合物6d
用二异丙基乙胺(31uL，5当量)和TSTU(53mg，5当量)处理化合物6c(26.9mg，35.3微摩尔)的DMF(3.4mL)和水(0.6mL)溶液。将反应在室温搅拌。在15分钟后，使用Phenomenex，C184.6mm×25cm柱和以1.0mL/分钟流速的10→100％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，执行小部分的反应混合物的HPLC分析。观察到在Rt＝15.4分钟洗脱的产物并且是主要组分。使用YMC，C1830×300mm柱和以20mL/分钟溶剂流速的10→100％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，通过制备型HPLC纯化产物。合并含有产物6d的HPLC级分，在-80℃冷冻，并且冻干至干燥。产量＝19.3mg(63％)；观察到MALDI-TOFMS856.2。
下述反应描述了ZC6M-AE-NHS，化合物6d的合成。
实施例7
ZC8M-AE-NHS，化合物7d的合成
a)化合物7a
用偶氮二甲酸二异丙酯(30uL，2当量)处理2-羟基吖啶甲酯(30mg，75微摩尔)、8-二甲氨基-1-辛醇(26mg，2当量)和三苯基膦(40mg，2当量)的无水四氢呋喃(5mL)溶液。将反应在氮下在室温搅拌1小时，并且随后如节段(a)、实施例5中所述操作。使用Phenomenex，C184.6mm×25cm柱和以1.0mL/分钟流速的10→100％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，执行小部分的反应混合物的HPLC分析。观察到在Rt＝24分钟洗脱的产物并且是主要组分。产量13mg(31％)；观察到MALDI-TOFMS557.1。
b)化合物7c
将化合物7a(13mg，23.3微摩尔)、1，3-丙烷磺内酯(57mg，20当量)和2，6-二叔丁基吡啶(36uL，7当量)在离子液体[BMIM][PF6](0.2mL)中的混合物在150℃加热24小时。随后将反应冷却至室温，并且抽取小部分(1-2uL)，用甲醇稀释并且如节段(a)中所述通过HPLC分析。观察到在Rt＝17.4分钟洗脱的吖啶酯产物7b(＞80％转化；观察到MALDI-TOFMS800.8)。将反应混合物如节段(b)、实施例5中所述操作。将吖啶酯7b在5mL1NHCl中在氮下回流2小时，并且冷却至室温。反应混合物的HPLC分析指出在Rt＝15.3分钟洗脱的产物7c的彻底形成。使用YMC，C1830×300mm柱和以20mL/分钟溶剂流速的10→100％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，通过制备型HPLC纯化产物。合并含有产物的HPLC级分，并且在减压下浓缩，以给出化合物7c。产量＝6.8mg(总共37％)；观察到MALDI-TOFMS787.8。
c)化合物7d
用二异丙基乙胺(7.5uL，5当量)和TSTU(13mg，5当量)处理化合物7c(6.8mg，8.6微摩尔)的DMF(1.7mL)和水(0.3mL)溶液。将反应在室温搅拌。在30分钟后，使用Phenomenex，C184.6mm×25cm柱和以1.0mL/分钟流速的10→100％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，执行小部分的反应混合物的HPLC分析。观察到在Rt＝16.5分钟洗脱的产物并且是主要组分。使用YMC，C1830×300mm柱和以20mL/分钟溶剂流速的10→100％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，通过制备型HPLC纯化产物。合并含有产物7d的HPLC级分，在-80℃冷冻，并且冻干至干燥。产量＝5mg(66％)；观察到MALDI-TOFMS885.0。
下述反应描述了ZC8M-AE-NHS，化合物7d的合成。
实施例8
AZC3-AE-NHS，化合物8d的合成
a)化合物8a
使用美国专利号7,319,041B2中所述的反应，由2-苄氧基-7-甲氧基吖啶-9羧酸和2，6-二甲基-4-羟基苯甲酸甲酯合成化合物2-羟基-7-甲氧基吖啶甲酯。用偶氮二甲酸二异丙酯(23uL，2当量)处理2-羟基-7-甲氧基吖啶甲酯(25mg，0.058毫摩尔)、3-二甲氨基-1-丙醇(13.6uL，2当量)和三苯基膦(30mg，2当量)的无水四氢呋喃(5mL)溶液。将反应在氮下在室温搅拌。在1小时后，将它如节段(a)、实施例5中所述操作。使用Phenomenex，C184.6mm×25cm柱和以1.0mL/分钟流速的10→100％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，执行小部分的反应混合物的HPLC分析。观察到在Rt＝20分钟洗脱的产物并且是主要组分。产量27mg(90％)；观察到MALDI-TOFMS517.9。
b)化合物8c
将化合物8a(27mg，52.2微摩尔)、1，3-丙烷磺内酯(128mg，20当量)和2，6-二叔丁基吡啶(80uL，7当量)在离子液体[BMIM][PF6](0.5mL)中的混合物在150℃加热24小时。随后将反应冷却至室温，并且抽取小部分(1-2uL)，用甲醇稀释并且如节段(a)中所述通过HPLC分析。观察到在Rt＝15.2分钟洗脱的吖啶酯产物8b。将反应混合物如节段(b)、实施例5中所述操作。将吖啶酯8b在10mL1NHCl中在氮下回流2小时，并且冷却至室温。反应混合物的HPLC分析指出在Rt＝13.5分钟洗脱的产物8c的彻底形成。使用YMC，C1830×300mm柱和以20mL/分钟溶剂流速的10→100％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，通过制备型HPLC纯化产物。合并含有产物的HPLC级分，并且在减压下浓缩，以给出化合物8c。产量＝22mg(总共56％)；观察到MALDI-TOFMS747.4。
c)化合物8d
用二异丙基乙胺(26uL，5当量)和TSTU(44mg，5当量)处理化合物8c(22mg，29.5微摩尔)的DMF(3.6mL)和水(0.4mL)溶液。将反应在室温搅拌。在30分钟后，使用Phenomenex，C184.6mm×25cm柱和以1.0mL/分钟流速的10→100％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，执行小部分的反应混合物的HPLC分析。观察到在Rt＝14.6分钟洗脱的产物并且是主要组分。使用YMC，C1830×300mm柱和以20mL/分钟溶剂流速的10→100％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，通过制备型HPLC纯化产物。合并含有产物8d的HPLC级分，在-80℃冷冻，并且冻干至干燥。产量＝17.6mg(70％)；观察到MALDI-TOFMS843.9.0。
下述反应描述了AZC3M-AE-NHS，化合物8d的合成。
实施例9
AZC6-AE-NHS，化合物9d的合成
a)化合物9a
用偶氮二甲酸二异丙酯(23uL，2当量)处理2-羟基-7-甲氧基吖啶甲酯(25mg，0.058毫摩尔)、6-二甲氨基-1-己醇(17mg，2当量)和三苯基膦(30mg，2当量)的无水四氢呋喃(3mL)溶液。将反应在氮下在室温搅拌。在2小时后，将它如节段(a)、实施例5中所述操作。使用Phenomenex，C184.6mm×25cm柱和以1.0mL/分钟流速的10→100％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，执行小部分的反应混合物的HPLC分析。观察到在Rt＝22.5分钟洗脱的产物并且是主要组分。产量20mg(63％)；观察到MALDI-TOFMS559.8。
b)化合物9c
将化合物9a(20mg，35.9微摩尔)、1，3-丙烷磺内酯(87mg，20当量)和2，6-二叔丁基吡啶(59uL，7当量)在离子液体[BMIM][PF6](0.5mL)中的混合物在150℃加热24小时。随后将反应冷却至室温，并且抽取小部分(1-2uL)，用甲醇稀释并且如节段(a)中所述通过HPLC分析。观察到在Rt＝15.7分钟洗脱的吖啶酯产物9b(观察到MALDI-TOFMS803.9)。将反应混合物如节段(b)、实施例5中所述操作。将吖啶酯9b在10mL1NHCl中在氮下回流2小时，并且冷却至室温。反应混合物的HPLC分析指出在Rt＝14.9分钟洗脱的产物9c的彻底形成。使用YMC，C1830×300mm柱和以20mL/分钟溶剂流速的10→100％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，通过制备型HPLC纯化产物。合并含有产物的HPLC级分，并且在减压下浓缩，以给出化合物9c。产量＝18.3mg(总共65％)；观察到MALDI-TOFMS790.4。
c)化合物9d
用二异丙基乙胺(20uL，5当量)和TSTU(35mg，5当量)处理化合物9c(18.3mg，23.2微摩尔)的DMF(3.6mL)和水(0.4mL)溶液。将反应在室温搅拌。在30分钟后，使用Phenomenex，C184.6mm×25cm柱和以1.0mL/分钟流速的10→100％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，执行小部分的反应混合物的HPLC分析。观察到在Rt＝16分钟洗脱的产物并且是主要组分。使用YMC，C1830×300mm柱和以20mL/分钟溶剂流速的10→100％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，通过制备型HPLC纯化产物。合并含有产物9d的HPLC级分，在-80℃冷冻，并且冻干至干燥。产量＝14mg(68％)；观察到MALDI-TOFMS887.6。
下述反应描述了AZC6M-AE-NHS，化合物9d的合成。
实施例10
NSP-2Z-DMAE-NHS，化合物10f的合成
a)化合物10a
用二甲胺(20mL)mL)的四氢呋喃2.0M溶液处理4-溴苄基溴化物(2g，8毫摩尔)的无水四氢呋喃(10mL)溶液。将反应在室温搅拌3天。随后将反应混合物用乙酸乙酯(75mL)稀释且用100mL碳酸氢钠饱和水溶液洗涤。将乙酸乙酯层分离且在无水硫酸镁上干燥。使用15％乙酸乙酯的己烷溶液在二氧化硅上的TLC分析显示没有原料和Rf＝0.1的极性产物形成。在减压下浓缩乙酸乙酯溶液，以提供淡黄色油。产量＝1.63g。
b)化合物10b
将靛红(1.12g，7.6毫摩尔)的无水DMF(20mL)溶液在冰浴中在氮下冷却，并且用氢化钠(0.366g，1.2当量，在矿物油中的60％分散体)处理。将反应在冰浴中搅拌30分钟，并且随后将化合物10a(1.63g，7.6毫摩尔)作为DMF(5mL)溶液连同碘化酮(2.9g，2当量)加入。将反应在140℃在氮下加热24小时。随后将它冷却至室温，用乙酸乙酯(30mL)稀释且过滤。使用10％甲醇的乙酸乙酯溶液作为洗脱剂在二氧化硅上的TLC显示Rf～0.1的极性产物。将滤液在减压下浓缩。将残渣悬浮于100mL10％KOH水溶液中，并且在氮下回流4小时。随后将反应混合物冷却至室温，并且用2NHCl酸化直至pH5。出现黄色沉淀物，其通过过滤收集且在真空下干燥。产量＝0.6g。这种化合物像这样用于接下来的反应。
c)化合物10c
在氮下用对甲苯磺酰氯(272mg，2当量)处理化合物10b(0.2g，0.714毫摩尔)的无水吡啶(15mL)悬液。在短暂搅拌5分钟后，加入2，6-二甲基-4-羟基苯甲酸甲酯(128mg，0.714毫摩尔)。将所得到的反应在室温搅拌3天。随后将溶剂在减压下去除，并且将残渣在乙酸乙酯(40mL)和1NHCl(50mL)之间分配。分离含有产物的HCl层，并且用乙酸乙酯洗涤2次(2×40mL)。随后将HCl溶液在冰浴中冷却，并且用5％KOH水溶液逐滴处理，直至析出黄色沉淀物(pH～8)。将这种悬液用乙酸乙酯萃取(2×50mL)。将合并的乙酸乙酯萃取物用水洗涤1次，并且在无水硫酸镁上干燥。随后将溶剂在减压下去除，并且使用乙酸乙酯作为洗脱剂，通过在二氧化硅上的快速层析纯化粗产物。产量＝95mg(30％)；观察到MALDI-TOFMS443.7。
d)化合物10e
将化合物10c(22mg，49.5微摩尔)、1，3-丙烷磺内酯(120mg，20当量)和2，6-二叔丁基吡啶(81.5uL，7.5当量)在离子液体[BMIM][PF6](0.5mL)中的混合物在150℃加热24小时。随后将反应冷却至室温，并且抽取小部分(1-2uL)，用甲醇稀释，并且使用Phenomenex，C184.6mm×25cm柱和以1.0mL/分钟流速的10→70％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，通过HPLC进行分析。观察到在Rt＝17.2分钟洗脱的产物10d(～40％转化)。将反应混合物如节段(b)、实施例5中所述操作。将吖啶酯10d在10mL1NHCl中在氮下回流2小时，并且冷却至室温。反应混合物的HPLC分析指出在Rt＝14.0分钟洗脱的产物10e的彻底形成。使用YMC，C1830×300mm柱和以20mL/分钟溶剂流速的10→70％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，通过制备型HPLC纯化产物。合并含有产物的HPLC级分，并且在减压下浓缩，以给出化合物10e。产量＝14.5mg(总共44％)；观察到MAIDI-TOFMS673.3。
c)化合物10f
用二异丙基乙胺(18.8uL，5当量)和TSTU(32mg，5当量)处理化合物10e(14.5mg，21.5微摩尔)的DMF(1.8mL)和水(0.2mL)溶液。将反应在室温搅拌。在15分钟后，使用Phenomenex，C184.6mm×25cm柱和以1.0mL/分钟流速的10→70％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，执行小部分的反应混合物的HPLC分析。观察到在Rt＝16.5分钟洗脱的产物并且是主要组分。使用YMC，C1830×300mm柱和以20mL/分钟溶剂流速的10→70％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，通过制备型HPLC纯化产物。合并含有产物10f的HPLC级分，在-80℃冷冻，并且冻干至干燥。产量＝14mg(85％)；观察到MALDI-TOFMS769.5。
下述反应描述了NSP-2Z-DMAE-NHS，化合物10f的合成。
实施例11
NSP-DMAE-Z-NHS，化合物11f的合成
a)化合物11a
用苄氧羰基琥珀酰亚胺(3.78g，2.2当量)处理N，N-双(3-氨丙基)甲胺(1g，6.9毫摩尔)的氯仿(40mL)溶液。将反应在室温搅拌16小时。使用15％甲醇的乙酸乙酯溶液，反应混合物在二氧化硅上的TLC分析显示在彻底反应中的极性产物形成。将反应混合物用氯仿(40mL)稀释且用碳酸氢钠饱和水溶液洗涤。随后将它在无水硫酸镁上干燥，过滤且在减压下浓缩，以提供粘稠油，其在贮存后固化为蜡状固体。产量＝3.2g；观察到MALDI-TOFMS414.4。
b)化合物11b
用1，3-丙烷磺内酯(0.71g，2当量)处理化合物11a(1.2g，2.9毫摩尔)的无水DMF(15mL)溶液。将反应在145℃在氮下加热1小时。使用Phenomenex，C184.6mm×25cm柱和以1.0mL/分钟流速的10→70％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，执行小部分的反应混合物的HPLC分析。观察到在Rt＝19.6分钟洗脱的产物(～80％转化)，其中原料在Rt＝21.6分钟洗脱。将反应混合物在减压下浓缩，并且将回收的油溶解于甲醇(20mL)中。使用40％甲醇、60％乙酸乙酯在二氧化硅上的TLC分析指出产物(Rf～0.2)与原料(Rf～0.3)的彻底分离。将上述反应以相同规模重复，并且使用40％甲醇、60％乙酸乙酯作为洗脱剂，通过快速层析纯化合并的反应混合物。产量＝1.55g(60％)；白色泡沫；观察到MALDI-TOFMS536.4。
c)化合物11c
将化合物11b(0.8g，1.49毫摩尔)在15mL33％HBr/AcOH中在室温搅拌24小时。随后加入乙醚(100mL)并且析出白色、颗粒状固体。允许产物沉降且滗析乙醚。将这个过程用乙醚重复2次(2×50mL)。最后，将产物在真空下干燥。将回收的粘稠油溶解于5-6mL水中，在-80℃冷冻，并且冻干至干燥，以提供玻璃状固体。产量＝0.766g(定量)；观察到MALDI-TOFMS268.2。使用25％氨水、75％甲醇和茚三酮用于显现，在二氧化硅上的TLC分析显示Rf～0.2的单个斑点。
d)化合物11d
用二异丙基乙胺(16uL，1.5当量)和TSTU(22mg，1.2当量)处理NSP-DMAE(30mg，61微摩尔，美国专利号6,664,043B2)的DMF(3mL)溶液。将反应在室温搅拌。在15分钟后，使用Phenomenex，C184.6mm×25cm柱和以1.0mL/分钟流速的10→70％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，执行小部分的反应混合物的HPLC分析。观察到在Rt＝20分钟洗脱的产物并且是主要组分。将NHS酯的这种DMF溶液的一半(1.5mL)逐滴加入化合物11c(50mg，0.187毫摩尔，游离胺形式)溶解于DMF(1mL)和0.15M碳酸氢钠(1mL)的溶液中。将反应在室温搅拌。在3小时后，HPLC分析显示至在12.4分钟洗脱的产物11d的彻底转化。使用10→40％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的40分钟梯度，产物在Rt＝19.2分钟洗脱。
使用YMC，C1830×300mm柱和以20mL/分钟溶剂流速的10→40％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的40分钟梯度和在260nm的UV检测，通过制备型HPLC纯化产物。合并含有产物11d的HPLC级分，并且在减压下浓缩。产量＝19mg(83％)；观察到MALDI-TOFMS743.2。
e)化合物11f
用二异丙基乙胺(53uL，5当量)和戊二酸酐(35mg，5当量)处理化合物11d(45mg，60.6微摩尔)的甲醇(3.6mL)和水(0.4mL)溶液。将反应在室温搅拌。在15分钟后，使用Phenomenex，C184.6mm×25cm柱和以1.0mL/分钟流速的10→70％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，执行小部分的反应混合物的HPLC分析。观察到在Rt＝14分钟洗脱的产物11e并且是主要组分。随后将溶剂在减压下去除。将残渣溶解于DMF(3.6mL)和水(0.4mL)中。用二异丙基乙胺(106uL，10当量)和TSTU(182mg，10当量)处理这种溶液。将反应在室温搅拌。在10分钟后，HPLC分析显示至在Rt＝15.3分钟洗脱的产物11f的完全转化。使用YMC，C1830×300mm柱和以20mL/分钟溶剂流速的10→40％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的40分钟梯度和在260nm的UV检测，通过制备型HPLC纯化产物。合并含有产物11f的HPLC级分，在-80℃冷冻，并且冻干至干燥。产量＝28.7mg(50％)；观察到MALDI-TOFMS955.2。
下述反应描述了NSP-DMAE-Z-NHS，化合物11f的合成。
实施例12
NSP-2，7-DMG-DMAE-Z-NHS，化合物12h的合成
a)1，3-二甲氧基甘油，化合物12a
用氢氧化钾丸剂(25g，0.446mol)处理无水甲醇(100mL)，并且将悬液在室温搅拌直至所有碱已溶解。随后将这种溶液在冰浴中冷却，并且逐滴加入表氯醇(0.223mol，20.6g)。在添加完成后，将反应加温至室温，并且在油浴中在75-80℃在氮下加热16小时。随后将反应冷却至室温且过滤。将滤液在减压下浓缩。将回收的油溶解于乙酸乙酯(150mL)中，并且再次过滤，并且随后在减压下浓缩。回收无色油(21.5g)，其通过真空蒸馏纯化，以提供12.9g(50％)1，3-二甲氧基甘油，化合物12a。
b)化合物12b
用对甲苯磺酰氯(2.38g，1.5当量)和4-二甲氨基吡啶(0.253g，0.25当量)处理1，3-二甲氧基甘油，化合物12a(1g，8.3毫摩尔)的无水吡啶(20mL)溶液。将反应在室温在氮下搅拌3天。随后将溶剂在减压下去除，并且将残渣在乙酸乙酯(100mL)和1NHCl(50mL)之间分配。分离乙酸乙酯层，并且用1nHCl洗涤1次(50mL)，随后为碳酸氢钠水溶液(3×50mL)洗涤。随后将它在无水硫酸镁上干燥，过滤且在减压下浓缩。使用20％乙酸乙酯的己烷溶液作为洗脱剂，通过在二氧化硅上的快速层析纯化粗产物(2.5g)。产量＝1.79g(65％)。
c)化合物12c
将2，7-二羟基吖啶甲酯(0.1g，0.24毫摩尔)、化合物12b(0.4g，1.45毫摩尔)和碳酸铯(0.2g，2.5当量)的无水DMF(6mL)溶液在油浴中在90-100℃在氮下加热。在5小时后，将反应冷却至室温。使用Phenomenex，C184.6mm×25cm柱和以1.0mL/分钟流速的10→100％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，执行小部分的反应混合物的HPLC分析。观察到在Rt＝26.5分钟洗脱的产物并且是主要组分。随后将溶剂在减压下去除，并且将残渣在乙酸乙酯(50mL)和水(50mL)之间分配。分离乙酸乙酯层，并且用水洗涤2次(2×50mL)。随后将它在无水硫酸镁上干燥，过滤且在减压下浓缩。使用1∶1乙酸乙酯/己烷，通过在二氧化硅上的制备型TLC纯化粗产物(0.37g)。产量＝58mg(40％)；观察到MALDI-TOFMS623.1。
d)化合物12e
将化合物12c(58mg，93.25微摩尔)、蒸馏的1，3-丙烷磺内酯(1.14g，100当量)和碳酸氢钠(78mg，10当量)的混合物在140-150℃加热。在2小时后，将反应冷却至室温。使用Phenomenex，C184.6mm×25cm柱和以1.0mL/分钟流速的10→100％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，执行小部分的反应混合物的HPLC分析。观察到在Rt＝20分钟洗脱的产物12d并且是主要组分。将反应混合物用20mL1∶1乙酸乙酯/己烷处理，并且将混合物短暂超声处理以分散胶质。允许产物沉降，并且通过滗析去除溶剂。将粗产物在真空下干燥，并且随后悬浮于10mL1NHCl中，并且在氮下回流3小时。随后将它冷却至室温，并且通过HPLC分析，这指出甲酯的完全水解与在Rt＝17.0分钟洗脱的产物12e。使用YMC，C1830×300mm柱和以20mL/分钟的溶剂流速的10→100％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的40分钟梯度和在260nm的UV检测，通过制备型HPLC纯化产物。合并含有产物12e的HPLC级分，并且在减压下浓缩。产量＝56mg(82％)；观察到MALDI-TOFMS730.9。
e)化合物12f
用二异丙基乙胺(20uL，1.5当量)和TSTU(27mg，1.2当量)处理化合物12e(55mg，75.3微摩尔)的DMF(3mL)溶液。将反应在室温搅拌。在10分钟后，使用Phenomenex，C184.6mm×25cm柱和以1.0mL/分钟流速的10→100％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，执行小部分的反应混合物的HPLC分析。观察到在Rt＝18分钟洗脱的NHS酯并且是主要组分。随后将NHS酯的DMF溶液逐滴加入化合物11c(168mg，0.376毫摩尔，2HBr盐)溶解于水(1.68mL)和0.5M碳酸氢钠(1.68mL)的溶液中。将反应在室温搅拌。在30分钟后，HPLC分析显示至在12.4分钟洗脱的产物12e的彻底转化。
使用YMC，C1830×300mm柱和以20mL/分钟溶剂流速的10→100％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的40分钟梯度和在260nm的UV检测，通过制备型HPLC纯化产物。合并含有产物12f的HPLC级分，并且在减压下浓缩。产量＝63.8mg(86％)；观察到MALDI-TOF979.1MS。
f)化合物12h
用二异丙基乙胺(57uL，5当量)和戊二酸酐(74mg，5当量)处理化合物12f(63.8mg，65.2微摩尔)的甲醇(4.0mL)溶液。将反应在室温搅拌。在15分钟后，使用Phenomenex，C184.6mm×25cm柱和以1.0mL/分钟流速的10→100％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，执行小部分的反应混合物的HPLC分析。观察到在Rt＝13.5分钟洗脱的产物12g并且是主要组分。随后将溶剂在减压下去除。将残渣溶解于DMF(5.4mL)和水(0.6mL)中。用二异丙基乙胺(114uL，10当量)和TSTU(200mg，10当量)处理这种溶液。将反应在室温搅拌。在15分钟后，HPLC分析显示至在Rt＝14.3分钟洗脱的产物12h的完全转化。使用YMC，C1830×300mm柱和以20mL/分钟溶剂流速的10→70％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的40分钟梯度和在260nm的UV检测，通过制备型HPLC纯化产物。合并含有产物12h的HPLC级分，在-80℃冷冻，并且冻干至干燥。产量＝49.3mg(63％)；观察到MALDI-TOFMS1188.9。
下述反应描述了NSP-2，7-DMG-DMAE-Z-NHS，化合物12h的合成。
实施例13
NSP-DMAE-Z2-NHS，化合物13e的合成
a)化合物13a
将2-氯乙烷磺酰氯(0.126mL，1.2毫摩尔)的无水乙醚(5mL)溶液在冰盐浴中在氮气氛下冷却至-5℃，并且用一份2，6-卢剔啶(0.14mL，1.2毫摩尔)处理。将反应在-5℃搅拌30分钟，随后加温至室温。随后将反应通过玻璃棉过滤到11a(0.325g，0.79毫摩尔)溶解于乙酸(5mL)的搅拌溶液内。在4-5小时后，将溶剂在减压下去除。将残渣悬浮于甲苯(5mL)中，并且在减压下浓缩。将粗产物在水(50mL)和乙酸乙酯(50mL)之间分配。分离水层，并且用氯仿洗涤1次(50mL)。将水层用氢氧化铵调整至pH9，并且用乙酸乙酯(3×50mL)萃取。随后将水层在减压下浓缩，以提供白色固体。产量＝0.18g，(43％)；观察到MALDI-TOFMS522.8)。
使用PhenomenexPRODIGY，C1810mm×25cm柱和以4.0mL/分钟流速的10→70％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，执行小部分的产物的HPLC分析。观察到在Rt＝21分钟洗脱的彻底产物，不含原料。
b)化合物13b
将化合物13a(78mg，0.15毫摩尔)在5mL33％HBr/AcOH中在室温搅拌24小时。随后加入乙醚(75mL)并且析出白色、颗粒状固体。允许产物沉降且滗析乙醚。将这个过程用乙醚重复2次(2×50mL)。最后，将产物在真空下干燥。产量＝48mg(77％)。该材料像这样用于接下来的反应。
c)化合物13c
用二异丙基乙胺(7.4uL，1.5当量)和TSTU(10.3mg，1.2当量)处理NSP-DMAE(14mg，28.4微摩尔，美国专利号6,664,043B2)的DMF(1mL)溶液。将反应在室温搅拌。在30分钟后，使用Phenomenex，C184.6mm×25cm柱和以1.0mL/分钟流速的10→70％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，执行小部分的反应混合物的HPLC分析。观察到在Rt＝20分钟洗脱的产物并且是主要组分。将NHS酯的这种DMF溶液逐滴加入化合物13b(48mg，0.116毫摩尔，HBr盐)溶解于0.25M碳酸氢钠(3mL)的溶液中。将反应在室温搅拌。在30分钟后，HPLC分析显示至在12.4分钟洗脱的产物13c的彻底转化。
使用YMC，C1830×300mm柱和以20mL/分钟溶剂流速的10→60％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的40分钟梯度和在260nm的UV检测，通过制备型HPLC纯化产物。合并含有产物13c的HPLC级分，并且在减压下浓缩。产量＝19mg(90％)。
d)化合物13e
用二异丙基乙胺(22.8uL，5当量)和戊二酸酐(15mg，5当量)处理化合物13c(19mg，26.1微摩尔)的甲醇(3.6mL)和水(0.4mL)溶液。将反应在室温搅拌。在30分钟后，使用Phenomenex，C184.6mm×25cm柱和以1.0mL/分钟流速的10→70％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，执行小部分的反应混合物的HPLC分析。观察到在Rt＝14.6分钟洗脱的产物13d并且是主要组分(＞80％)。随后将溶剂在减压下去除。将残渣溶解于DMF(3.6mL)和水(0.4mL)中。用二异丙基乙胺(45.6uL，10当量)和TSTU(79mg，10当量)处理这种溶液。将反应在室温搅拌。在15分钟后，HPLC分析显示至在Rt＝15.7分钟洗脱的产物13e的完全转化。使用YMC，C1830×300mm柱和以20mL/分钟溶剂流速的10→60％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的40分钟梯度和在260nm的UV检测，通过制备型HPLC纯化产物。合并含有产物13e的HPLC级分，在-80℃冷冻，并且冻干至干燥。产量＝15mg(60％)。
下述反应描述了NSP-DMAE-Z2-NHS，化合物13e的合成。
实施例14
NSP-DMAE-ZCB-NHS，化合物14d的合成
a)化合物14a
用丙烯酸(1mL，1.45毫摩尔)处理11a(0.6g，1.45毫摩尔)溶解于MeCN(5mL)中的溶液。将反应在室温搅拌36小时。随后将溶剂在减压下去除，并且使用3∶2，MeOH∶EtOAc作为洗脱剂，通过在二氧化硅上的快速层析纯化粗产物。合并含有产物的级分，并且在减压下浓缩。产量＝0.432g，(61％)；观察到MALDI-TOFMS486.1)。
b)化合物14b
将化合物14a(0.43g，0.88毫摩尔)在10mL33％HBr/AcOH中在室温搅拌24小时。随后加入乙醚(100mL)并且析出白色、颗粒状固体。允许产物沉降且滗析乙醚。将这个过程用乙醚重复4次(4×50mL)。最后，将产物在真空下干燥。随后将它溶解于水(5mL)中，冷冻且冻干。产量＝0.35g(定量)；观察到MALDI-TOFMS218.3。
c)化合物14c
用二异丙基乙胺(11.3uL，1.5当量)和TSTU(18.3mg，1.2当量)处理NSP-DMAE(25mg，51.0微摩尔，美国专利号6,664,043B2)的DMF(2mL)溶液。将反应在室温搅拌。在30分钟后，将NHS酯的这种DMF溶液逐滴加入化合物14b(80mg，0.2毫摩尔，HBr盐)溶解于0.25M碳酸氢钠(0.8mL)的溶液中。将反应在室温搅拌。在30分钟后，使用Phenomenex，C184.6mm×25cm柱和以1.0mL/分钟流速的10→70％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，执行HPLC分析，显示至在Rt＝12.0分钟洗脱的产物14c的彻底转化。
使用YMC，C1830×300mm柱和以20mL/分钟溶剂流速的10→60％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的40分钟梯度和在260nm的UV检测，通过制备型HPLC纯化产物。合并含有产物14c的HPLC级分，并且在减压下浓缩。产量＝38mg(定量)；观察到MALDI-TOFMS692.9。
e)化合物14d
用二异丙基乙胺(8.6uL，2当量)处理化合物14c(20mg，29微摩尔)的DMF(1.0mL)和DMSO(2.0mL)溶液，逐滴加入戊二酸二琥珀酰亚胺酯(38mg，0.117毫摩尔)的DMF(1mL)搅拌溶液中。将反应在室温搅拌。在60分钟后，使用Phenomenex，C184.6mm×25cm柱和以1.0mL/分钟流速的10→70％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，执行小部分的反应混合物的HPLC分析。观察到在Rt＝15.0分钟洗脱的产物14d并且是主要组分(＞70％)。使用YMC，C1830×300mm柱和以20mL/分钟溶剂流速的10→60％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的40分钟梯度和在260nm的UV检测，通过制备型HPLC纯化产物。合并含有产物14d的HPLC级分，在-80℃冷冻，并且冻干至干燥。产量＝4mg(15％)；观察到MALDI-TOFMS905.5。
下述反应描述了NSP-DMAE-ZCB-NHS，化合物14d的合成。
实施例15
CN-NSP-DMAE-Z3-NHS，化合物15f的合成
a)化合物15a
将NSP-DMAE甲酯(0.223g，0.44毫摩尔)在亚硫酰氯(5mL)中的悬液在80℃在氮气氛下伴随剧烈搅拌加热。在1小时后，形成深色溶液，将其冷却至室温。加入己烷(50mL)，并且析出暗褐色、粘性固体。滗析己烷，并且将残渣用己烷(25mL)清洗1次，并且在真空下极其短暂地干燥。向这种粘性固体中加入N，N′-二甲基乙二胺(10mL，过量)的无水MeCN(10mL)溶液。形成暗褐色溶液，将其在室温搅拌。在15分钟后，使用Phenomenex，C184.6mm×25cm柱和以1.0mL/分钟流速的10→70％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的30分钟梯度和在260nm的UV检测，执行小部分的反应混合物的HPLC分析。观察到作为在Rt＝19分钟的宽峰洗脱的产物15a。将反应混合物在减压下浓缩，并且将残渣溶解于甲醇(5mL)中，用甲苯(15mL)稀释，在减压下浓缩，以提供粘性褐色泡沫。粗产量＝0.46g。使用甲醇作为洗脱剂，通过在二氧化硅上的快速层析纯化产物。产量＝0.22g，(87％)；观察到MALDI-TOFMS577.9。
b)化合物15b
将化合物15a(0.22g，0.38毫摩尔)、蒸馏的1，3-丙烷磺内酯(0.465g，10当量和2，6-二叔丁基吡啶(0.42mL，5当量)在[BMIM][PF6](3mL)中的混合物在155℃伴随剧烈搅拌加热16小时。随后将它冷却至室温，并且加入乙酸乙酯(100mL)。将产物沉淀出且通过过滤收集，并且用乙酸乙酯(25mL)和甲醇(20mL)清洗。随后将粗产物转移至具有50mL1∶1水/甲醇的RB烧瓶。使用Phenomenex，C184.6mm×25cm柱和以1.0mL/分钟流速的10→40％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的40分钟梯度和在260nm的UV检测，执行小部分的粗反应混合物的HPLC分析。观察到在Rt＝33分钟洗脱的产物(～90％转化)。水溶液在减压下蒸发给出0.35g褐色固体。观察到MALDI-TOFMS699.2。这种材料像这样用于接下来的反应。
c)化合物15c
将化合物15b(0.35g，粗制的)悬浮于1NHCl(20mL)中，并且在回流下在氮气氛下加热1.5小时。如节段(b)中所示的HPLC分析显示在Rt＝27分钟洗脱的产物。将反应冷却至室温。使用YMC，C1830×300mm柱和以20mL/分钟溶剂流速的10→60％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的40分钟梯度和在260nm的UV检测，通过制备型HPLC纯化产物15c。合并含有产物的HPLC级分，并且在减压下浓缩。产量＝14mg；观察到MALDI-TOFMS685.7。
d)化合物15d
用二异丙基乙胺(6uL，2当量)和TSTU(12.3mg，2当量)处理化合物15c(14mg，20微摩尔)的DMF(2mL)溶液。将反应在室温搅拌。在10分钟后，使用Phenomenex，C184.6mm×25cm柱和以1.0mL/分钟流速的10→40％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的40分钟梯度和在260nm的UV检测，执行小部分的反应混合物的HPLC分析。观察到至在22分钟洗脱的NHS酯的完全转化。将这种DMF溶液逐滴加入化合物11c(46mg，5当量，HBr盐)溶解于0.25M碳酸氢钠(1mL)的溶液中。得到的溶液在室温搅拌。在15分钟后，HPLC分析显示在Rt＝14分钟洗脱的主要产物。
使用YMC，C1830×300mm柱和以20mL/分钟溶剂流速的10→60％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的40分钟梯度和在260nm的UV检测，通过制备型HPLC纯化产物15d。合并含有产物的HPLC级分，并且在减压下浓缩。产量＝18mg(定量)；观察到MALDI-TOFMS935.8。
e)化合物15f
用二异丙基乙胺(26uL，5当量)和戊二酸酐(17mg，5当量)处理化合物15d(18mg，19.2微摩尔)的甲醇(1.8mL)和水(0.2mL)溶液。将反应在室温搅拌。在15分钟后，如节段(d)中所述的HPLC分析显示至在Rt＝16.2分钟洗脱的戊二酸酯衍生物15e的完全转化。将反应用甲苯(5mL)稀释并且在减压下浓缩。将残渣溶解于DMF(1.8mL)和水(0.2mL)中，并且用二异丙基乙胺(52uL，10当量)和TSTU(90mg，10当量)处理。将反应在室温搅拌。在30分钟后，HPLC分析显示在Rt＝19分钟洗脱的产物的完全转化。使用YMC，C1830×300mm柱和以20mL/分钟溶剂流速的10→60％B(A＝具有0.05％TFA的水，B＝具有0.05％TFA的MeCN)的40分钟梯度和在260nm的UV检测，通过制备型HPLC纯化产物15f。合并含有产物的HPLC级分，在-80℃冷冻，并且冻干至干燥。产量＝6.5mg(30％)；观察到MALDI-TOFMS1146.6。
下述反应描述了CN-NSP-DMAE-Z3-NHS，化合物15f的合成。
实施例16
关于用吖啶 酯标记抗TSHMab的一般程序
用0.1M碳酸钠pH9(250uL)稀释抗体的母液(5mg/mL，200uL，1.0mg，6.7纳摩尔)，以给出～2.0mg/mL溶液。向这种溶液中加入作为1∶1DMF/水溶液或DMSO溶液的10当量吖啶NHS酯。例如，使用NSP-DMAE-Z-NHS、11f，这使得作为吖啶酯的5mg/mL溶液(12.8uL)加入的64微克的添加成为可能。将标记溶液在4℃轻轻搅拌16小时，并且随后用去离子水稀释至4mL。随后将这些稀释溶液转移至4mLCentriconTM滤器(MW30,000截止)，并且在4000G离心以将体积减少至～0.2mL。将这个过程再重复3次。将过滤的缀合物最后稀释到250uL水的总体积内用于质谱分析和RLU测量。
在VoyagerDEMALDI-TOF质谱仪上记录质谱，并且未标记的抗体用作参考。将约2uL缀合物溶液与2uL芥子酸(sinnapinicacid)基质溶液(HP)混合，并且点在MALDI板上。在完全干燥后，记录质谱。根据关于未标记抗体和缀合物的质量值中的差异，可以测量AE掺入的程度。一般地，在这些标记条件下，将～5AE标记掺入抗体中。
实施例17
化学发光测量
在由0.1M磷酸钠、0.15M氯化钠、6mM叠氮化钠和1g/L牛血清白蛋白(BSA)组成的缓冲液中，将每种吖啶酯标记的抗体稀释至0.2纳摩尔的浓度。在标准条件下在BertholdTechnolgiesAutolumatLB953光度计上，关于10微升测试的每种吖啶酯抗体缀合物的化学发光动力学以0.1秒间隔整合共10秒，伴随试剂1(0.1M硝酸和0.5％过氧化氢)和试剂2(0.25M氢氧化钠和0.05％十六烷基三甲基氯化铵)各300微升的序贯添加。就光发射的相对比率以及总光输出比较测试的吖啶化合物的化学发光动力学。
实施例18
非特异性结合的测量
两性离子吖啶化合物作为在免疫测定中的标记进行测试，用于与在相同免疫测定中分开用作标记的对照吖啶化合物比较。SiemensHealthcareDiagnosticsACS：TSH3测定是由SiemensHealthcareDiagnostics制造的用于在ACS：上应用的一系列商业销售的免疫测定之一。TSH3测定是夹心免疫测定，其使用抗TSH抗体的化学发光吖啶化合物用于测量在样品中的分析物TSH(促甲状腺激素)。
TSH3测定具有2种抗体，其中之一是连接至吖啶化合物的小鼠抗体，该组合称为示踪剂，而另一种抗体连接至顺磁颗粒(PMP)，其中这种组合称为固相。在这个示例测定中，两性离子吖啶化合物以及对照吖啶化合物各自在分开部分中连接至相同抗体。在这个示例测定中，仅测量非特异性结合，其中吖啶酯缀合物或示踪剂在样品中不存在TSH分析物的情况下进行测试。在含有0.15MN-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)、0.15M氯化钠、7.7mM叠氮化钠、1.0mM乙二胺四乙酸(EDTA)、12mM叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TritonX-100)、5g/L牛血清白蛋白(BSA)、0.20g/L两性霉素B、0.48g/L硫酸庆大霉素、1g/L小鼠IgG、10mg/L绵羊IgG、5.0g/L小鼠血清、0.05g/L止泡剂B、pH7.7的缓冲液中，将示踪剂稀释至2.2nM的浓度。在这个示例测定中，测试具有吖啶化合物的3种固相：SiemensHealthcareDiagnosticsTSH3AssaySolidPhase，SiemensHealthcareDiagnosticsiPTH(完整甲状旁腺激素)AssaySolidPhase(DynalM280-链霉抗生物素蛋白结合的生物素化的多克隆山羊抗PTH抗体)和SiemensHealthcareDiagnosticsTnI(肌钙蛋白I)-ultraAssay(DynalM270-链霉抗生物素蛋白结合的生物素化的单克隆小鼠抗cTnI抗体)。
SiemensHealthcareDiagnosticsACS：是设计为执行用于不同分析物的一系列免疫测定的自动化机器人装置。将200μL每种不含有TSH分析物的血清样品分配到分开小杯内，起始用于SiemensHealthcareDiagnosticsACS：TSH3测定的自动化程序。小杯是光学透明或半透明的容器，用于混合示踪剂、样品和固相，并且在其中测量化学发光。样品不合有分析物TSH。ACS：随后将0.100mL2.2nM(0.22pmol)示踪剂和0.225mL0.3g/L(67μg)固相分配到含有样品的每个小杯内，从而使得相同量的示踪剂和固相用于所有测试的吖啶化合物。2种测定试剂中的第一种是溶液，其含有与吖啶化合物缀合的抗TSH抗体。2种两性离子吖啶化合物和对照吖啶化合物作为用于示踪剂的标记分开测试。使用吖啶化合物和TSH结合小鼠抗体，制备示踪剂且使用先前描述的程序纯化。每种示踪剂中吖啶化合物数目/抗体对于所有测试的吖啶化合物是大约相同的。因此，对于每种吖啶化合物测量的在非特异性结合中的任何差异可以与吖啶化合物的结构相关。将在每个小杯中示踪剂、样品和固相的混合物在37℃加热5.0分钟。从固相中去除未结合的示踪剂，其用固相与小杯中的混合物磁性分离，随后为从小杯中去除液体，和用水洗涤小杯中的固相，以去除除固相和与之结合的任何示踪剂外的一切。
用SiemensHealthcareDiagnosticsACS：试剂1和SiemensHealthcareDiagnosticsACS：试剂2各0.30mL的序贯添加起始来自在固相上的吖啶化合物的化学发光，伴随后续光发射。SiemensHealthcareDiagnosticsACS：试剂1是0.1M硝酸和0.5％过氧化氢。SiemensHealthcareDiagnosticsACS：试剂2是0.25M氢氧化钠和0.05％十六烷基三甲基氯化铵。在每个小杯中的化学发光随后作为相对光单位(RLUs)测量，其中每个小杯对应于单个测定样品。关于每种测试的吖啶化合物的非特异性结合作为RLUs单位的化学发光测量，其中RLUs的数目通过SiemensHealthcareDiagnosticsACS：测量。非特异性结合分数定义为非特异性结合化学发光与由0.22pmol示踪剂进入每个小杯内的总化学发光输入的比。非特异性结合分数的最小化使特异性信号的测量达到最大，从而改善更少数量分析物的测量且增强免疫测定性能。在这个示例测定中，两性离子吖啶化合物具有更低的非特异性结合分数，并且将因此预期增强免疫测定性能。
实施例19
吖啶 缀合物化学发光稳定性的测量
在含有0.15MN-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)、0.15M氯化钠、7.7mM叠氮化钠、1.0mM乙二胺四乙酸(EDTA)、12mM叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TritonX-100)、5g/L牛血清白蛋白(BSA)、0.20g/L两性霉素B、0.48g/L硫酸庆大霉素、1g/L小鼠IgG、10mg/L绵羊IgG、5.0g/L小鼠血清、0.05g/L止泡剂B、pH7.7的缓冲液中，将两性离子吖啶化合物和对照吖啶化合物NSP-DMAE-HEG和HQY-AE的缀合物稀释至0.1nM的浓度。随后将所有缀合物在密封聚乙烯瓶中在4或37℃贮存4周。定期取出贮存于4或37℃的10μLs每种示踪剂，用于在BertholdtALB953化学光度计上的化学发光测量，所述化学光度计使用与使用SiemensHealthcareDiagnosticsACS：试剂1和2的SiemensHealthcareDiagnosticsACS：相同的方法用于化学发光测量。化学发光随后作为百分率与在4或37℃贮存开始时对于每种示踪剂测定的发光比较。相对于对照吖啶化合物增强或等价的化学发光稳定性将是关于新吖啶化合物的希望特性，提供产物的更长或等价保存期限和更佳或等价的每天结果可重复性。

Claims (14)

1.一种化学发光吖啶化合物，其具有下述结构：
其中，
R1是C1-35烷基、烯基、炔基或芳烷基，其各自可以含有至多20个杂原子，或磺丙基或磺丁基，或R1是基团-Ra-Z；
R2和R3独立地选自(i)氢、(ii)供电子基团或(iii)基团-Z；
Y和Y’独立地选自R、-Ra-Z或-Ra-L；其中L是包含离去基团、亲电子基团或亲核基团的可衍生官能团，用于与分析物、分析物类似物或关于分析物的结合配偶体形成缀合物；
Z是具有下述形式的两性离子基团：
X在每次出现时独立地选自键、-CH2-、氧、硫、-NRN-、酰胺(-NRN(CO)-)、氨基甲酸根(-NRNC(O)O-)或脲基(-NRNC(O)NRN-)；
R’和R”在每次出现时独立地选自C1-35烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基，其各自含有至多20个杂原子；
Z1是基团-Ra-Z2，其中Z2选自羧酸根(-COO-)、磺酸根(-SO3 -)、硫酸根(-OSO3 -)、磷酸根(-OP(O)(OR)(O-))或氧离子(-O-)；或在其中Z2是氧离子(-O-)的情况下，Ra可以是不存在的；
n在每次出现时独立地选自1-12的整数；和
R在每次出现时独立地选自C1-35烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基，其各自含有至多20个杂原子；
RN在每次出现时独立地选自氢，C1-35烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基，其各自含有至多20个杂原子；和
Ra是选自C1-35烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基的二价基团，其各自任选含有至多20个杂原子；
条件是R1、R2、R3、Y和Y’中的至少一个包含所述两性离子基团Z。
2.根据权利要求1的化学发光吖啶化合物，其中L选自：
3.根据权利要求1的化学发光吖啶化合物，其中R’或R”包含基团-Ra-L。
4.根据权利要求1的化学发光吖啶化合物，其中R’或R”在每次出现时是基团-Ra-C(O)-CH2CH2CH2-C(O)-N-琥珀酰亚胺基、-Ra-N-马来酰亚胺基、-Ra-C(O)-CH2-Br或-Ra-C(O)-CH2-I。
5.根据权利要求1的化学发光吖啶化合物，其中R1选自甲基、磺丙基(-CH2CH2CH2-SO3 -)、磺丁基(-CH2CH2CH2CH2-SO3 -)或具有下述结构的基团：
6.根据权利要求1的化学发光吖啶化合物，其中R2和R3中的一个或两个是基团Z。
7.根据权利要求6的化学发光吖啶化合物，其中R2和R3中的一个或两个是下述基团：
其中n是1-12的整数，并且m是0-3的整数。
8.根据权利要求1的化学发光吖啶化合物，其具有下述结构：
其中Y包含基团-Ra-Z，其中Ra、R2、R3和Z如上文定义的。
9.根据权利要求1的化学发光吖啶化合物，其具有下述结构：
其中R*选自氢，C1-35烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基，其各自任选含有至多20个杂原子，或R*是基团-Ra-L，其中L是用于与分析物、分析物类似物或关于分析物的结合配偶体形成缀合物的离去基团；n’、m’和q’独立地是1-4的整数，并且R、RN、R1、R2、R3、R’和Z1如上文定义的。
10.根据权利要求1的化学发光吖啶化合物，其中，所述吖啶化合物与不包含所述两性离子官能团的在其他方面等同的吖啶化合物比较，显示出与固相减少的非特异性结合。
11.一种用于检测分析物的试剂，其包含与分析物、分析物类似物或关于分析物的结合配偶体结合的权利要求1所述的化学发光吖啶化合物，其中，所述吖啶化合物与不包含所述两性离子官能团的在其他方面等同的吖啶化合物比较，显示出与固相减少的非特异性结合。
12.一种用于检测或定量大分子分析物的测定，其包含：
(a)提供包含根据权利要求1的化学发光吖啶化合物的缀合物，所述化学发光吖啶化合物与对于分析物特异性的结合分子结合；
(b)提供具有在其上固定了对于所述分析物特异性的第二种结合分子的固体载体；
(c)混合缀合物、固相和怀疑含有分析物的样品以形成结合复合物；
(d)分离在固体载体上捕获的结合复合物；
(e)通过加入化学发光触发试剂，触发来自步骤(d)的结合复合物的化学发光；
(f)用光度计测量光发射的量；和
(g)通过比较由反应混合物发射的光量与标准剂量应答曲线，检测分析物的存在或计算分析物的浓度，所述标准剂量应答曲线使发射的光量与分析物的已知浓度联系。
13.提供了一种用于检测或定量小分子分析物的测定，其包含下述步骤：
(a)提供分析物与根据权利要求1的化学发光吖啶化合物的缀合物；
(b)提供固定有对于分析物特异性的结合分子的固体载体；
(c)混合缀合物、固体载体和怀疑含有分析物的样品以形成结合复合物；
(d)分离在固体载体上捕获的结合复合物；
(e)通过加入化学发光触发试剂，触发来自步骤(d)的结合复合物的化学发光；
(f)用光度计测量光量；和
(g)通过比较由反应混合物发射的光量与标准剂量应答曲线，检测分析物的存在或计算分析物的浓度，所述标准剂量应答曲线使发射的光量与分析物的已知浓度联系。
14.一种用于检测小分子分析物的测定，其包含：
a)提供固定有分析物或分析物类似物的固体载体；
b)提供对于分析物特异性的结合分子与根据权利要求1的化学发光吖啶化合物的缀合物；
c)混合固相、缀合物和怀疑含有分析物的样品以形成结合复合物；
d)分离在固体载体上捕获的结合复合物；
e)通过加入化学发光触发试剂，触发(d)的结合复合物的化学发光；
f)用光度计测量光量；和
g)通过比较由反应混合物发射的光量与标准剂量应答曲线，检测分析物的存在或计算分析物的浓度，所述标准剂量应答曲线使发射的光量与分析物的已知浓度联系。
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