CN109313198B - 用于结合测定的背景阻断剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于时间分辨荧光分析结合测定的背景阻断概念。更具体地，本发明涉及结合测定和试剂盒，该结合测定和试剂盒包括在镧系元素螯合物标记的分析物特异性生物分子中以及如背景阻断剂中使用相同或类似的螯合配体。

Description

用于结合测定的背景阻断剂
技术领域
本发明涉及在时间分辨荧光分析结合测定中的背景阻断概念。更具体地，本发明涉及结合测定，特别是生物亲和性测定，其涉及在时间分辨荧光分析中利用非特异性背景发光阻断的镧系元素螯合物，此类非特异性阻断剂的用途，以及用于结合测定的试剂盒。
背景技术
采用长寿命发射发光镧系元素螯合物的时间分辨荧光分析(TRF)已被应用于多种特异性结合测定，例如免疫测定法、DNA杂交测定法、受体-结合测定法、酶测定法、配体结合测定法、生物成像(诸如免疫细胞化学测定法和免疫组织化学测定法)、以及基于细胞的测定法，从而测量极低浓度的所关注分析物。
当设计具有多个疏水性芳族发色团的螯合物和配体时，公知的挑战在于获得提供较高水溶性的分子结构，并且同时对目标测定中存在的任何可能生物过程及其它物质呈惰性。良好的水溶性在荧光螯合物用于生物分子标记、遗传工程化分子、以及半合成或合成分子时是必需的。
近来，已示出具有三个独立的发色部分(诸如各种螯合物或配体结构设计中组合的经取代的4-苯基乙炔基吡啶)的镧系元素螯合物的发光强度有所改善。
WO 2013/026790公开了具有镧系元素(诸如铕)的发光镧系元素螯合物，以及对应的发光镧系元素螯合配体。该专利申请还公开了：包含缀合于发光镧系元素螯合物的生物特异性结合反应物(诸如抗体)的可检测分子，以及实施生物特异性结合测定的方法，此类可检测分子在利用特定发光的时间分辨荧光测定的基于特异性生物亲和性的结合测定中的用途，以及缀合有发光镧系元素螯合物的固体载体材料。
WO 2013/092992公开了具有三个束缚于无环芯的4-(苯乙炔基)吡啶发色基团的发光镧系元素螯合物。在一些实施方案中，一个发色基团包含反应性基团，并且另两个发色基团在邻位和/或对位包含两个或三个-OCH2CO2H基团。
WO 2013/011236公开了具有三个束缚于三氮杂大环芯的4-(苯乙炔基)吡啶发色基团的发光镧系元素螯合物。在苯环对位，4-(苯乙炔基)吡啶发色基团被给电子基团取代。
WO 2014/147288公开了可用作标记试剂的三氮杂环壬烷基镧系元素螯合络合物。所公开的螯合物具有三个4-(苯乙炔基)吡啶发色基团，一个发色基团包含反应性基团；另两个发色基团具有(i)苯环上间位和对位的两个羧基(-CO2H)取代基，或者(ii)苯环上间位的两个-OCH2CO2H基团。
WO 2014/162105涉及发光镧系元素络合物，该络合物具有由引入2,6-吡啶-二-羧基基团的三个配体形成或者由具有1,4,7-三氮杂环壬烷结构的大环形成的螯合剂。
WO 2016/066641涉及一种具有环绕发射镧系元素芯的取代的4-(苯乙炔基)吡啶发色团的氮杂大环镧系元素螯合物设计。带有镧系离子的发色团具有高摩尔吸光系数和高发光值。该专利申请该公开了由其制备螯合物的配体，以及连接于生物特异性反应物的螯合物和它们在各种测定中的用途。
已知，加入发色团降低配体和螯合物在水中的溶解度，增加生物特异性结合反应物聚集体在标记过程中的形成，并改善被标记分子的非特异性结合特性。聚集体将产生纯化问题，并降低被标记物质的产率。此外，被标记分子改善的非特异性结合特性将增强生物特异性测定法的背景发光，因此降低测定法灵敏度。同时，当测定中的特定信号强度增强时，背景信号及其它干扰因素的下降是难以实现的任务。另外的干扰因素包括测定中的样品基质及其它组分，其可各自对测定性能有负面效应(
Figure BDA0001887259050000021
I.,Photoluminescenceimmunoassays.In:Johnstone,A.P.,Turner,M.W.编辑,Immunochemistry 1:a practicalapproach.IRL Press Oxford,1997,193-214)。
在免疫测定法中，不希望的非特异性结合由以下项之间的相互作用产生：1)报告抗体与蛋白质，2)报告抗体与固相，3)用于在实际测定之前稳定化和储存生物分子的干燥试剂，以及4)测定中所用的报告抗体与样品基质中的化合物以及其它试剂。导致非特异性结合的吸引力是离子-离子相互作用、氢键合和范德瓦尔斯吸引力(即具有永久相反偶极子的两个分子所致的吸引力、偶极分子在其它分子中诱导偶极子，以及非极性分子之间的吸引力)。
非特异性结合通常通过阻断留下的结合位点而最小化(Jianwen,He.,PracticalGuide to ELISA development.In:Wild,D.编辑，The Immunoassay Handbook,Theory andapplications of ligand binding,ELISA and related techniques.Elsevier Oxford,2013,381-394)。蛋白质和表面活性剂(洗涤剂)是两类主要的阻断剂(Steinitz,M.,Quantification of the blocking effect of Tween 20 and bovine serum albumin inELISA microwells.Anal.Biochem.2000,282:232-238)。常用的封闭蛋白包括例如牛血清白蛋白、酪蛋白、脱脂奶粉、鱼明胶和全血清(Vogt,R.F.,Philips,D.L.等人，Quantitativedifferences among various proteins as blocking agents for ELISA microtiterplates.J.Immunol.Methods 1987,101:43-50)。表面活性剂可为非离子(诸如Tween 20)、阴离子(诸如十二烷基苯磺酸钠)、阳离子(诸如十六烷基三甲基溴化铵)以及两性离子(诸如CHAPS水合物)。
聚合物阻断剂(诸如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚丙烯马来酸和聚乙二醇)以及无机离子(诸如SO4 2-、HPO4 2-、Mg2+、Ca2+、Li+、Na+、H+、OH-和PO4 3-)也是公知的阻断剂(WO 2012/161288，用于减小非特异性结合的免疫测定方法和试剂)。
本领域期望开发出在使用镧系元素标记的报告子的TRF结合测定(诸如生物亲和性测定)中减少非特异性结合现象诸如背景及其它干扰因素的新型改善的阻断试剂。
发明内容
本发明的目的在于提供用于以下的改善的背景阻断剂：分析物特异性结合测定法，尤其是生物亲和性结合测定法，诸如免疫测定法(均相免疫测定法和非均相免疫测定法二者)、核酸杂交测定法、受体结合测定法、酶测定法、配体结合测定法、免疫细胞化学测定法、免疫组织化学测定法，以及利用特异性发光的荧光测定或时间分辨荧光(TRF)测定的基于细胞的测定法。可通过使用本发明的阻断剂来获得改善的测定灵敏度。
具体地，本发明提供了防止荧光标记的分析物特异性组分在用于测定的固体载体表面上非特异性结合的背景阻断剂。
该目的在于使可以(如果需要)共价缀合于非特异性生物分子的包含几个发色部分(1-5个部分)的高度稳定且水溶性，优选非荧光螯合物在所考虑的测定中所用的表面上非特异性结合的趋势增大。同时，生物分子在缀合阻断剂时不应提高对测定中所用的实际标记的分子或分析物的结合。
现已令人惊奇地发现，在利用用于标记特异性生物分子(例如抗体)的螯合的荧光镧系元素离子(例如Eu3+)的TRF结合测定中，可通过使用与标记荧光镧系元素螯合物共享相同或类似发色螯合配体结构的阻断试剂来显著降低非特异性背景发光，不同之处在于阻断试剂具有不同的镧系元素配位离子或不含镧系元素配位离子。例如，在分析物特异性生物分子用荧光Eu3+离子螯合物标记的TRF结合测定中，合适的阻断试剂可基于相同或类似形式的螯合配体，但是其中荧光配位镧系元素离子Eu3+在螯合配体中被非荧光镧系元素离子Gd3 +取代。更令人惊奇的是关于荧光无环镧系元素螯合物，具有一个或多个类似发色部分但具有至少一个含有或不含螯合离子并任选地缀合于非特异性生物分子的环状螯合部分的阻断试剂可用于降低背景。另选地，可使用发射波长与用于标记特定生物分子的镧系元素离子不同的镧系元素离子。在另一个可选方案中，可将不含有镧系元素配位离子的螯合配体用作阻断试剂。也可使用不同螯合的镧系元素离子的组合(或者不含离子)，例如以用作内参。通过用类似或相同镧系元素螯合物标记不同的分析物特异性结合组分，可在应用本发明阻断试剂的相同测定中检测不同的分析物，其中各个不同的分析物特异性结合组分用其自身各个镧系元素离子标记，其中不同的镧系元素离子可独立于其它离子进行检测。阻断试剂应当具有较高的非特异性结合特性，以防止标记的特定生物分子的非特异性结合。一种增强阻断剂的非特异性结合特性的方式在于：连接非特异性生物分子，例如非特异性蛋白质、无义IgG、与螯合配体类似的生物分子；连接半抗原，诸如生物素；连接有机分子(疏水基团)或连接聚合物。
迄今为止并未公开的构思是：在结合测定诸如基于生物亲和性的结合测定中，使用结构上类似于结合分析物特异性组分例如生物分子的镧系元素标记物的化合物和/或缀合物，以减少非特异性结合现象，诸如背景及其它干扰因素。
总体而言，可通过利用以下项有效地应用本发明的背景阻断原理：单个螯合物和配体，缀合于合适的结合组分尤其是生物分子如抗体的螯合物和配体，缀合于聚合物的配体，缀合于有机分子的配体以及缀合于半抗原如生物素的配体，并因此固定到链霉抗生物素蛋白涂覆的表面的配体，或涂覆有检测生物特异性分子或其它蛋白质的表面。
在第一方面，本发明涉及用于检测样品中一种或多种特定分析物的结合测定，包括：
-提供一种第一分析物特异性结合组分，或者对不同分析物有特异性的一组不同的第一分析物特异性结合组分，其被固定到涂覆或未涂覆的固体载体，
-添加：1)一种标记有发光镧系元素螯合物的第二分析物特异性结合组分，或者对标记有包含不同镧系元素离子的发光镧系元素螯合物的所述不同分析物有特异性的一组不同的第二分析物特异性结合组分；2)非特异性试剂，其包含或为镧系元素螯合物或螯合配体，该试剂对所述分析物并对所述第一和第二分析物特异性结合组分是非特异性的；以及3)所述样品；以及
-通过时间分辨荧光分析(TRF)检测特定分析物。
可在添加所述标记的分析物特异性结合组分之前、同时或之后添加非特异性试剂。根据测定，这可通过在例如温育缓冲液、样品、或洗涤流体中添加标记的分析物特异性结合组分来进行。
在第二方面，本发明涉及用于在结合测定中检测样品中一种或多种特定分析物的试剂盒，所述试剂盒包含：1)一种第一分析物特异性结合组分，或者对不同分析物有特异性的一组不同的第一分析物特异性结合组分，其被固定到涂覆或未涂覆的固体载体；2)一种标记有镧系元素螯合物的第二分析物特异性结合组分，或者对标记有包含不同镧系元素离子的发光镧系元素螯合物的所述不同分析物有特异性的一组不同的第二分析物特异性结合组分，以及3)非特异性试剂，其对所述分析物并对所述第一和第二分析物特异性结合组分是非特异性的，并且为或者包含镧系元素螯合物或螯合配体。
在一个优选的实施方案中，所述第一和第二分析物特异性结合组分中的至少一者是生物分子。更优选地，第一和第二分析物特异性结合组分两者均为生物分子。
将第一分析物特异性结合组分或一组不同的分析物特异性结合组分直接固定到涂覆或未涂覆的固体载体上，或者经由一对结合配体固定到涂覆或未涂覆的固体载体上。
在第一和第二方面的一个优选的实施方案中，结合测定和试剂盒用于检测样品中的一种特定分析物，并且包含：固定到涂覆或未涂覆的固体载体上的第一分析物特异性结合组分；标记有发光镧系元素螯合物的第二分析物特异性结合组分；以及所述非特异性试剂。
在第三方面，本发明涉及背景阻断试剂在通过时间分辨荧光分析(TRF)检测样品中一种或多种特定分析物的结合测定中的用途，包括：第一分析物特异性结合组分或一组不同的第一分析物特异性结合组分，其被固定到涂覆或未涂覆的固体载体上；以及标记有镧系元素螯合物的第二分析物特异性结合组分，或者对标记有包含不同镧系元素离子的发光镧系元素螯合物的所述不同的分析物有特异性的一组不同的第二分析物特异性结合组分，其中背景阻断试剂是非特异性试剂，其对所述分析物并对所述第一和第二分析物特异性结合组分是非特异性的，并且为或者包含镧系元素螯合物或螯合配体。
在一个优选的实施方案中，螯合配体是或者包含于非特异性试剂中，类似于用于标记分析物的发光镧系元素螯合物中所含的螯合配体。用于标记不同分析物的发光镧系元素螯合物包含不同的镧系元素，并且可为相同或不同的螯合配体。在另一个优选的实施方案中，螯合配体是或者包含于非特异性试剂中，与用于标记分析物的发光镧系元素螯合物中所含的螯合配体相同。
在本发明的所有方面中，非特异性试剂选自：
i)标记有镧系元素螯合物的生物分子，其中所述生物分子对所述分析物并对所述第一和第二分析物特异性结合组分是非特异性的，并且镧系元素离子不同于所述镧系元素螯合物标记的特异性结合组分中的镧系元素离子，
ii)标记有螯合配体的生物分子，其中所述生物分子对所述分析物并对所述第一和第二分析物特异性结合组分是非特异性的，并且不存在镧系元素离子，
iii)不含生物分子的镧系元素螯合物，其中镧系元素离子不同于所述镧系元素螯合物标记的特异性结合组分中的镧系元素离子，或者
iv)不含生物分子且不含镧系元素离子的螯合配体。
在一个实施方案中，第二分析物特异性结合组分被一种标记有发光镧系元素螯合物的分析物或一组不同的标记的分析物替代，每种分析物标记有包含不同镧系元素离子的不同发光镧系元素螯合物，并且其中所述非特异性试剂选自：
v)标记有第二镧系元素螯合物的分析物类似物，其中所述分析物类似物不被所述第一分析物特异性结合组分识别，并且所述镧系元素离子不同于所述发光镧系元素螯合物标记的分析物中的所述镧系元素离子，
vi)螯合配体标记的分析物类似物，其中所述分析物类似物不被所述第一分析物特异性结合组分识别，并且不存在镧系元素离子，
vii)不包含分析物类似物的第二镧系元素螯合物，并且所述镧系元素离子不同于所述镧系元素螯合物标记的分析物中的所述镧系元素离子，或者
viii)不包含分析物类似物且不包含镧系元素离子的螯合配体。
在另一个实施方案中，用于非特异性试剂的生物分子不同于待检测或甚至完全不相关的分析物。在另一个实施方案中，生物分子是分析物类似物，例如衍生物、融合体、或突变体等等。然而，要求当第二分析物特异性结合组分被替代时，可用于非特异性试剂的生物分子不被标记有发光镧系元素螯合物的第一和第二分析物特异性结合组分或分析物识别。
在本发明的一个优选的实施方案中，用作或用于非特异性试剂的螯合配体具有与用于标记第二分析物特异性结合组分的螯合配体相同或类似的结构；并甚至更优选地，用于或用作非特异性试剂的螯合配体与用于标记所述第二分析物特异性结合组分的螯合配体相同。第二分析物特异性结合组分不存在，或者在非特异性试剂中被非特异性结合组分，特别是生物分子(诸如无义抗体或其它蛋白质)替代。非特异性试剂中螯合的镧系元素离子不同于用来标记第二分析物特异性结合组分的镧系元素离子。螯合配体也可用作或者用于非特异性试剂而无需任何配位离子。在最优选的实施方案中，非特异性试剂不缀合于生物分子并且无需任何配位离子。此外，非特异性试剂优选地具有至少一个环状螯合部分。
附图
图1示出方案1。
图2示出方案2。
图3示出方案3。
图4示出方案4。
图5示出方案5。
图6示出方案6。
图7示出方案7。
图8示出方案8。
图9示出不同的背景阻断剂的相对背景信号。
具体实施方式
本发明涉及包含镧系元素螯合物或螯合配体的背景阻断试剂，以用于时间分辨荧光分析(TRF)结合测定，诸如生物亲和性测定。
本发明利用如下发现：通过在阻断剂中使用与用于螯合用来在测定中标记特异性结合组分例如生物分子(例如抗体)的荧光镧系元素离子的相同或类似的螯合配体结构，可显著地降低TRF结合测定中的背景发光。螯合配体可原样使用或作为包含合适的配位镧系元素离子的螯合物使用。本发明因此提供背景阻断试剂，其防止荧光标记的分析物特异性结合组分使用时在分析支持物表面非特异性结合。
术语“样品”在本发明上下文中意指生物样本(诸如血液、血清、血浆、尿液、口腔液、粪便、脑脊液、羊水、沟液、组织液、组织匀浆、汗液、精液、乳汁、伤口流体、腹水等)、得自环境研究的样品(废水、土壤样品、沥出物)、得自工业过程的样品(生产溶液、产物)以及化合物文库(筛选可能包含有机化合物、天然产物、生物提取物、天然、合成以及重组蛋白质和肽、核苷酸等的文库)。
术语“生物分子”在本发明上下文中意指天然或合成生物化合物，优选地选自多克隆或单克隆抗体，其可为经遗传或化学修饰的抗原、蛋白质、肽、糖蛋白、糖、低聚糖、多糖、核苷酸序列，诸如DNA、RNA或PNA探针、半抗原、凝集素、酶、受体、核酸配体、模制塑料印记(分子印记)等等。
术语“分析物”在本发明的上下文中意指样品中被检测的分子，尤其是特别关注的生物分子。所关注的分析物的示例为抗体、抗原、酶、激素、蛋白质和糖蛋白，诸如膜受体和膜标记物、DNA和RNA核苷酸序列等等。
术语“分析物特异性结合组分”在本发明的上下文中意指特异性结合所述分析物的结合分子或配体，尤其是生物分子。术语“第一分析物特异性结合组分”是指被固定到固体载体上的分析物特异性结合组分。术语“第二分析物特异性结合组分”是指标记有镧系元素螯合物的分析物特异性结合组分。
术语“非特异性组分”意指所述组分不被分析物、固定的第一分析物特异性结合生物分子或标记的第二分析物特异性结合组分识别。
术语“分析物类似物”在本发明的上下文中意指生物分子的衍生物、融合体、或突变体等等。
在本发明的第一方面，使用类似于标记试剂的阻断剂的新原理可用于检测样品中一种或多种特定分析物的结合测定，该结合测定包括：
a)提供被固定到涂覆或未涂覆的固体载体上的一种第一分析物特异性结合组分，或者一组不同的第一分析物特异性结合组分；
b)向所述固体载体添加：
1)一种标记有发光镧系元素螯合物的第二分析物特异性结合组分，或者对所述不同分析物有特异性的一组不同的第二分析物特异性结合组分，每种结合组分标记有包含不同镧系元素离子的不同发光镧系元素螯合物；
2)非特异性试剂，其对所述分析物并对所述第一和第二分析物特异性结合组分是非特异性的，并且选自：
i)标记有镧系元素螯合物的生物分子，其中所述生物分子对所述分析物并对所述第一和第二分析物特异性结合组分是非特异性的，并且所述镧系元素离子不同于所述镧系元素螯合物标记的分析物特异性结合组分中的所述镧系元素离子，
ii)标记有螯合配体的生物分子，其中所述生物分子对所述分析物并对所述第一和第二分析物特异性结合组分是非特异性的，并且不存在镧系元素离子，
iii)不包含生物分子的镧系元素螯合物，其中所述镧系元素离子不同于所述镧系元素螯合物标记的分析物特异性结合组分中的所述镧系元素离子，或者
iv)不包含生物分子且不包含镧系元素离子的螯合配体，
3)所述样品；并且
c)通过时间分辨荧光分析(TRF)对特定分析物进行检测。
可在添加所述标记的分析物特异性结合组分之前、同时或之后添加非特异性试剂。根据测定，这可通过在例如温育缓冲液、样品、或洗涤流体中添加标记的分析物特异性结合组分来进行。
在一个优选的实施方案，用来标记分析物特异性结合组分且用于非特异性试剂的螯合配体具有相同或类似的结构。更优选地，用来标记分析物特异性结合组分且用于非特异性试剂的螯合配体具有相同的结构。然而，分析物特异性结合组分在非特异性试剂中被非特异性生物分子诸如无义抗体或另一种蛋白质替代，或者在非特异性试剂中完全不存在。非特异性试剂中螯合的镧系元素离子不同于用来标记分析物特异性结合组分的镧系元素离子。当不同标记的分析物特异性结合组分用于在相同的测定中检测不同的特定分析物时，螯合配体可以相同或不同，但是优选的是它们相同。对于各个不同的标记的分析物特异性结合组分，镧系元素离子是不同的。在采用或不采用非特异性生物分子的情况下，螯合配体也可用作例如非特异性试剂而无需任何配位离子。在最优选的实施方案中，非特异性试剂不缀合于生物分子并且不含配位离子。此外，优选的是非特异性试剂具有至少一个环状螯合部分。
根据本发明测定的一个实施方案，将非特异性试剂添加至一种或多种分析物-特异性生物分子固定于其上以用于捕获特定分析物的固体载体；然后添加标记有发光镧系元素螯合物的分析物特异性结合组分，或者对不同分析物有特异性的一组不同的分析物特异性结合组分，每种结合组分标记有包含不同镧系元素离子的不同发光镧系元素螯合物。在添加样品之后，将固体载体温育并进行洗涤。在另一个实施方案中，在添加样品同时、之前或之后，将非特异性试剂和标记的分析物特异性结合组分添加至固体载体。在另一个实施方案中，在添加非特异性试剂、样品之后，将标记的分析物特异性组分添加至固体载体并洗涤。
根据本发明测定的另一个实施方案，第二分析物特异性结合组分被一种标记有发光镧系元素螯合物的分析物或一组不同的标记的分析物替代，每种分析物标记有包含不同镧系元素离子的不同发光镧系元素螯合物，并且其中所述非特异性试剂选自：
v)标记有第二镧系元素螯合物的分析物类似物，其中所述分析物类似物不被所述第一分析物特异性结合组分识别，并且所述镧系元素离子不同于所述发光镧系元素螯合物标记的分析物中的所述镧系元素离子，
vi)螯合配体标记的分析物类似物，其中所述分析物类似物不被所述第一分析物特异性结合组分识别，并且不存在镧系元素离子，
vii)不包含分析物类似物的第二镧系元素螯合物，并且所述镧系元素离子不同于所述镧系元素螯合物标记的分析物中的所述镧系元素离子，或者
viii)不包含分析物类似物且不包含镧系元素离子的螯合配体。
该测定可包括适用于所选择特定结合测定的另一些步骤，诸如一个或多个额外洗涤步骤、一种或多种温育步骤、一个或多个热循环步骤、一个或多个干燥步骤等，这些附加步骤对本领域技术人员是已知和普通的。
在本发明的第二方面，使用类似于标记试剂的阻断剂的新原理可用于在结合测定中检测一种或多种特定分析物的试剂盒，该试剂盒包含：
a)被固定到涂覆或未涂覆的固体载体上的一种第一分析物特异性结合组分，或者对不同特定分析物有特异性的一组不同的第一分析物特异性结合组分；
b)一种标记有镧系元素螯合物的第二分析物特异性结合组分，或者对所述不同分析物有特异性的一组不同的第二分析物特异性结合组分，每种组分标记有包含不同镧系元素离子的不同发光镧系元素螯合物；以及
c)非特异性试剂，其对所述分析物并对所述第一和第二分析物特异性结合组分是非特异性的，并且选自：
i)标记有镧系元素螯合物的生物分子，其中所述生物分子对所述分析物并对所述第一和第二分析物特异性结合组分是非特异性的，并且所述镧系元素离子不同于所述镧系元素螯合物标记的特异性结合组分中的所述镧系元素离子，
ii)标记有螯合配体的生物分子，其中所述生物分子对所述分析物并对所述第一和第二分析物特异性结合组分是非特异性的，并且不存在镧系元素离子，
iii)不包含生物分子的镧系元素螯合物，其中所述镧系元素离子不同于所述镧系元素螯合物标记的特异性结合组分中的所述镧系元素离子，或者
iv)不包含生物分子且不包含镧系元素离子的螯合配体。
试剂盒适用于根据本发明的第一方面的测定。试剂盒中所包含的螯合物/螯合配体被选择用于根据本发明的第一方面的测定。
在本发明的第一和第二方面的一个实施方案中，将第一分析物特异性结合组分直接固定到固体载体上。在另一个实施方案中，第一分析物特异性结合组分经由特异性结合对例如生物素-链霉抗生物素蛋白、生物素-亲和素或本领域中已知的其它合适的对被固定到固体载体上，其中对中的一个成员结合至所述第一分析物特异性结合组分并且另一个成员固定到固体载体上。如果例如出于空间原因而被期望，也可在固定中应用接头。
在第三方面，本发明涉及背景阻断剂在通过时间分辨荧光分析(TRF)检测一种或多种特定分析物的结合测定中的用途，所述测定包括：被固定到固体载体上的一种第一分析物特异性结合组分，或者一组不同的第一分析物特异性结合组分；以及一种标记有镧系元素螯合物的第二分析物特异性结合组分，或者对所述不同特定分析物有特异性的一组不同的第二分析物特异性结合组分，每种结合组分标记有包含不同镧系元素离子的不同发光镧系元素螯合物，其中所述背景阻断剂为非特异性试剂，其对所述分析物以及所述第一和第二分析物特异性结合组分是非特异性的，并且选自：
i)标记有镧系元素螯合物的生物分子，其中所述生物分子对所述分析物并对所述第一和第二分析物特异性结合组分是非特异性的，并且所述镧系元素离子不同于所述镧系元素螯合物标记的特异性结合组分中的所述镧系元素离子，
ii)标记有螯合配体的生物分子，其中所述生物分子对所述分析物并对所述第一和第二分析物特异性结合组分是非特异性的，并且不存在镧系元素离子，
iii)不包含生物分子的镧系元素螯合物，其中所述镧系元素离子不同于所述镧系元素螯合物标记的特异性结合组分中的所述镧系元素离子，或者
iv)不包含生物分子且不包含镧系元素离子的螯合配体。
在第四方面，本发明涉及背景阻断剂在制备用于通过时间分辨荧光分析(TRF)检测一种或多种特定分析物的结合测定的试剂盒中的用途，所述测定包括：被固定到固体载体上的一种第一分析物特异性结合组分，或者一组不同的第一分析物特异性结合组分；以及一种标记有镧系元素螯合物的第一分析物特异性结合组分，或者对所述不同特定分析物有特异性的一组不同的第一分析物特异性结合组分，每种结合组分标记有包含不同镧系元素离子的不同发光镧系元素螯合物，其中所述背景阻断剂为非特异性试剂，其对所述分析物以及所述第一和第二分析物特异性结合组分是非特异性的，并且选自：
i)标记有镧系元素螯合物的生物分子，其中所述生物分子对所述分析物并对所述第一和第二分析物特异性结合组分是非特异性的，并且所述镧系元素离子不同于所述镧系元素螯合物标记的特异性结合组分中的所述镧系元素离子，
ii)标记有螯合配体的生物分子，其中所述生物分子对所述分析物并对所述第一和第二分析物特异性结合组分是非特异性的，并且不存在镧系元素离子，
iii)不包含生物分子的镧系元素螯合物，其中所述镧系元素离子不同于所述镧系元素螯合物标记的特异性结合组分中的所述镧系元素离子，或者
iv)不包含生物分子且不包含镧系元素离子的螯合配体。
更具体地，用于本发明的螯合物配体包括具有七个至十个镧系元素(Ln)的配位杂原子(如果所述镧系元素存在)的式(I)的吡啶部分：
Figure BDA0001887259050000141
m是1至5的正整数，并且如果所述镧系元素离子存在，虚线表示吡啶氮与镧系元素离子之间的配位键。
式I的包含1-5个吡啶部分的所述螯合物或螯合配体包含1-5个相同或不同的基团G，所述基团G选自i)缀合基团，ii)单键，以及iii)氢。
G被吸电子和/或供电子基团取代。吸电子基团可为但不限于-NO2、-CN、-SO3H、-COOH、-CHO、-COR5、-CF3、-N+(CH3)3和卤素(即-F、-Cl、-Br和-I)。G优选地被供电子基团取代，所述供电子基团可为但不限于-C1-6烷基或-X-(R4)1-2，其中X为氧原子、硫原子、氮原子、或-N(R5)CO-，其中R5为氢或-C1-6烷基，并且R4选自氢、-C1-6烷基、-(CH2)1-6OH、-(CH2)1-6OC1-6烷基、-(CH2)1-6CO2H、-(CH2)1-6CONR6R7、-(CH2)1-6CO(哌嗪-1,4-二基)(CH2)1-6COOH、-(CH2)1- 6SO3H、-(CH2)1-6NH2、-(CH2)1-6N(CH3)2、-(CH2)1-6N+-(CH3)-(CH2)1-6SO3 -、-(CH2)1-6NH(CH2)1- 6COOH、-(CH2)1-6N(CH3)(CH2)1-6COOH和聚乙二醇，其中R6和R7各自独立地选自氢、C1-6烷基、-(CH2)1-6OH、-CH(CH2OH)2、以及-CH(CH2OH)3、-CH2[CH(OH)]1-6CH2OH。
缀合基团由一个、两个或三个部分组成，每个部分选自亚乙烯基(-CH＝CH-)、乙炔二基(-C≡C-)、羰基(-C(＝O)-)、以及(杂)芳族环或环系的二基团(-Het/Ar-)，例如亚苯基、二亚苯基、亚萘基、亚吡啶基、亚吡嗪基、亚嘧啶基、亚哒嗪基、亚呋喃基、亚噻吩基、亚吡咯基、亚咪唑基、亚吡唑基、亚噻唑基、亚异噻唑基、亚噁唑基、亚异噁唑基、亚呋咕基(fyrazanylene)、1,2,4-亚三唑-3,5-基，以及亚噁二唑基。
R3 n(其中n为1至5的正整数)各自独立地选自：i)在偶联至所述生物分子之后由反应性基团Z2与生物分子中对应的基团所形成的共价基团Z1，ii)疏水基团，iii)亲水基团，以及iv)氢。
反应性基团Z2有利于缀合至非特异性生物分子，或者有利于与其它试剂(例如二氨基己烷；参见实施例部分)或聚合物形成共价键。
反应性基团的示例是选自以下的那些：叠氮基(-N3)、炔基(-C≡CH)、亚烃基(-CH＝CH2)、氨基(-NH2)、氨基氧基(-O-NH2)、羧基(-COOH)、醛(-CHO)、巯基(-SH)、马来酰亚胺基基团或其活化衍生物，包括异氰酸酯基(-NCO)、异硫氰酸酯基(-NCS)、重氮(-N+≡N)、溴乙酰氨基、碘乙酰氨基、反应性酯、吡啶基-2-二硫基、以及6-取代的4-氯-1,3,5-三嗪-2-基氨基。
6-取代的4-氯-1,3,5-三嗪-2-基氨基中的取代基可选自氢、卤素、烷氧基、芳氧基、氨基、含有一至六个碳原子的烷基、取代的氨基或硫醚，并优选地选自氯、氟、乙氧基、2-甲氧基乙氧基、2-氰乙氧基、2,2,2-三氟乙氧基、硫代苯氧基或乙氧基羰基-硫代甲氧基。取代的氨基或硫醚是优选的单-或二取代的，各个取代基优选地独立选自含有一至六个
碳原子的烷基或烷氧基、苯基、羰基或羧基。
因而，在与非特异性生物分子或其它试剂(诸如1,6-二氨基己烷)或聚合物反应时，反应性基团Z2与所述非特异性生物分子或所述其它试剂或所述聚合物形成键，例如以下类型之一：硫脲(-NH-C(＝S)-NH-)、氨基乙酰胺(-NH-CO-CH2-NH-)、酰胺(-NH-CO-、-CO-NH-、-NCH3-CO-和-CO-NCH3-)、以及脂族硫醚(-S-)、二硫化物(-S-S-)、6-取代的-1,3,5-三嗪-2,4-二胺、
Figure BDA0001887259050000151
其中n＝1-6；以及三唑(例如由所谓的“点击”化学形成)。
疏水基团提高所述螯合物或螯合配体的非特异性结合特性，并且可选自诸如以下基团的1-6个组合：含有1-20个碳原子以及另外0至4个其它原子例如氧、硫和氮的烷基(诸如-(CH2)0-20CH3、-NH(CH2)1-20NH2、-NH(CH2)1-6O(CH2)1-6NH2、-NH[(CH2)2-6O]1-10(CH2)1-6NH2、-NH(CH2)1-6NH(CH2)1-6NH2)、芳基、联芳基(诸如苯基、联苯基、萘基)或具有1-20个氨基酸残基的低聚肽。
亲水基团的示例为单和低聚糖，诸如单糖和二糖；寡聚烷撑二醇(例如具有1-20个重复单元的那些)，诸如20寡聚乙二醇和寡聚丙二醇等。
在一个实施方案中，亲水基团选自单糖、二糖、-(CH2)1-6CH2OH、-CH(CH2OH)2、-C(CH2OH)3-(CH2)1-3-O-(CH2CH2O)0-5-H、-(CH2)1-3-O-(CH2CH2O)0-5-C1-4-烷基、-O-(CH2CH2O)1-6-H和-O-(CH2CH2O)1-6-C1-4-烷基，特别是单糖。
在本语境中，术语“单糖”旨在表示无环或环状形式的C5-C7碳水化合物。单糖的示例为C6碳水化合物，例如选自以下的那些：
Figure BDA0001887259050000161
在本语境中，术语“二糖”旨在表示优选地经由糖苷键连接在一起的两个单糖(参看以上)。
R1和R2表示i)如果所述镧系元素存在，在所述杂原子与镧系元素之间形成一个或多个配位键的附加螯合部分Ch，ii)所述吡啶部分与化合物的其它部分之间的键，或者iii)式(I)的各个吡啶部分之间的键。
优选地，R1或R2是与Ln3+离子形成配位键的螯合基团Ch，并且可为但不限于诸如-COO-、-PO3 2-、-PMeO2 -、-PPhO2 -、-CH2PO3 2-的基团。1-5个吡啶部分中的一个R1或R2可为-CONHR9或-CONR9R10，其中R9或R10为烷基基团或连接基团，所述连接基团包含共价偶联于生物分子的反应性基团或者偶联反应之后由所述反应性基团Z2和生物分子中的对应基团形成的共价基团Z1。
R1和R2各自表示发色部分与螯合物的其它部分例如发色部分与螯合部分之间的键。螯合部分包含直接或经由环状或无环的含N-和/或O-烃链而连接于发色部分的芳族单元的至少两个羧酸或磷酸基团、所述酸的酯、酰胺或盐。所述其它部分可包含含有基团R3的连接基团。
利用特异性发光的荧光测定或时间分辨荧光测定的基于特异性生物亲和性的结合测定包括免疫测定法(均相免疫测定法和非均相免疫测定法二者)、核酸杂交测定法、受体结合测定法、酶测定法、免疫细胞化学测定法、免疫组织化学测定法以及基于细胞的测定法。本发明的阻断试剂提供了一种用于获得改善的测定灵敏度的方式。
在本发明的一个实施方案中，阻断试剂中螯合的Ln3+为镧系元素离子或钇离子，并且镧系元素离子选自Gd3+、La3+、Lu3+、Pr3+、Nd3+、Ho3+、Er3+和Yb3+。
在本发明的另一个实施方案中，基团Ln3+在阻断试剂中不存在。
如果在阻断剂中使用螯合的镧系元素，其必须不同于在标记的分析物特异性结合组分或一组不同的标记的分析物特异性结合组分中所用的镧系元素。如果不同的分析物特异性结合组分用于相同的测定来检测不同的特定分析物，将它们用不同的螯合的镧系元素标记。
已令人惊奇地观察到，Gd3+螯合物通过使能量从Gd3+螯合物传递至位置最靠近的Eu3+螯合物来增大特定Eu3+发射信号。因此，在一个优选的实施方案中，Eu3+用于标记特定生物分子，并且Gd3+在阻断试剂中使用。阻断试剂可以或者不可包含缀合的非特异性生物分子。甚至更令人惊奇地，不含任何配位离子并且不缀合于非特异性生物分子的螯合配体使背景显著下降。因此，在最优选的实施方案中，非特异性试剂不缀合于所述非特异性生物分子并且不含任何配位离子，并且此外，非特异性试剂具有一个环状螯合部分。
具有可检测发射波长的镧系元素(诸如Eu3+、Tb3+、Sm3+、Dy3+、Nd3+、Er3+、Ho3+、Tm3+和Yb3+)可用于标记特定生物分子，并且可在阻断试剂中使用在标记的特定生物分子的发射波长处不具有发射谱带的任何其它镧系元素。此外，其它荧光镧系元素可用作内部测定或测量对照。例如，其它荧光镧系元素可缀合于生物素并固定至链霉抗生物素蛋白涂覆的表面。利用生物素缀合的其它荧光镧系元素和用于测量样品或液体对照中的分析物的荧光镧系元素的不同发射之间的已知关系，固定表面上其它荧光镧系元素的信号以及已知量分析物的信号，即在TRF-测量之后获得的两种不同发射信号可用于调节各种单独的仪器，以给出来自相同量样品或液体对照的相同信号水平。
在本发明的另一个实施方案，Ln3+是镧系元素离子或钇离子，并且镧系元素离子选自Gd3+、La3+、Lu3+、Pr3+、Nd3+、Ho3+、Er3+和Yb3+，并且一个R3基团是在偶联至所述生物分子之后由反应性基团Z2与非特异性生物分子中对应的基团所形成的共价基团Z1。
在本发明的另一个实施方案中，基团Ln3+不存在，并且一个R3基团是在偶联至所述生物分子之后由反应性基团Z2与非特异性生物分子中对应的基团所形成的共价基团Z1。
在优选的实施方案中，Eu3+螯合物用于标记分析物特异性化合物，并且Gd3+、La3+、Lu3+、Pr3+、Nd3+、Ho3+、Er3+、Yb3+或Y3+螯合物用作阻断剂，其中标记和阻断剂中的螯合配体相同或在结构上类似。在更优选的实施方案中，Eu3+螯合物用于标记特定生物分子，并且Gd3+螯合物用作阻断剂，其中标记和阻断剂中的螯合配体相同或在结构上类似。在最优选的实施方案中，Eu3+螯合物用于标记特定生物分子，并且螯合配体用作阻断剂，其中阻断剂相同或结构上类似，并且具有一个环状或无环螯合部分。
式(I)的吡啶部分的非限制性示例如下示出：
Figure BDA0001887259050000191
Figure BDA0001887259050000201
Figure BDA0001887259050000211
除基于吡啶的化合物之外，例如各种酚类(例如Bailey,M.P.等人Analyst 1984,109,1449；US 4,670,572；Kankare,J.等人，Anal.Chim.Acta 1992,266,205；WO 2000/048991和WO 2008/063721)、1,2-羟基吡啶酮(例如WO 2008/008797)化合物以及DTPAcarbosyril 124缀合物(Selvin,P.R.等人，J.Am.Chem.Soc.1994,16 6029)也可用于该目的。
下文示出了包含用于偶联分别用于根据本发明的TRF结合测定的特异性生物分子(Ln3+＝Eu3+)和非特异性生物分子(Ln3+＝Gd3+)的反应性基团的螯合物“对”的示例。
Figure BDA0001887259050000221
分析物特异性生物分子通常共价或非共价地固定于固体载体上。在一个实施方案中，分析物特异性生物分子直接固定于固体载体上。在另一个实施方案中，分析物特异性生物分子经由结合对诸如生物素-链霉抗生物素蛋白、生物素-亲和素等被固定，其中对中的一个成员结合至分析物特异性生物分子并且另一个固定于固体载体上。如果例如因空间原因而期望，也可在固定中应用接头。
测定固体载体为水不溶性颗粒和表面诸如聚苯乙烯表面、聚合物珠、玻璃珠、金颗粒、纳米颗粒、组织、组织片段、细胞等，其被选择成以最佳方式适于特异性结合测定。固体载体可选自纳米颗粒、微粒、玻片、板和固相合成树脂。此类固体载体对本领域技术人员是已知的，并且可容易地由本领域技术人员选择和使用。例如可提及到微量滴定板。不同的测定形式还可包含组分以准备所述测定。试剂盒也可包含根据本发明的合适测定中的内容使用说明。
可获得螯合配体并使用其来制备具有镧系元素配位离子的镧系元素螯合物，如上所讨论的现有技术中所述。螯合物和螯合配体也可缀合于分析物特异性结合组分或一组不同的分析物特异性结合组分或非特异性试剂，如现有技术所公开。例如，可通过使用过量的螯合物/配体，将用作阻断试剂的活化螯合物和活化螯合配体与无义IgG抗体偶联(如Lode,P.等人，载于Anal.Chem.,2003,75,3193-3201所述)。偶联反应在室温下过夜进行，并且例如在合适的凝胶过滤柱上从过量试剂分离产物，并使包含抗体的级分合并。缀合的螯合物/配体浓度可利用不同的特定波长处的UV吸收值来测量。各抗体偶联的螯合物/配体的量将通常在平均1至50之间，特别是2至40之间，更特别是5至30之间，诸如10至15之间变化。
将采用和不采用本发明阻断试剂的测定背景在肌钙蛋白I(TnI)夹心免疫测定法中进行比较，其中使用采用相当于Gd3+螯合物结构的Eu3+螯合物标记的示踪抗体。将示踪抗体和TnI标准溶液移取到用链霉抗生物素蛋白和针对TnI的生物素酰化捕获抗体以及被测试化合物涂布的经预涂布的测定孔中。将反应混合物温育，之后进行洗涤并在用荧光计测量之前干燥。观察到背景信号的显著降低。令人惊奇地，关于本专利申请中所述的不同阻断试剂，观察到特定信号的较高增大，甚至多至40％。
值得注意的是相比于测定中所用的发光螯合物，甚至当使用高浓度的较强螯合配体作为阻断试剂时，也获得了相当于使用Ln-基阻断试剂例如Gd3+-基阻断试剂的显著背景降低，并且其对所获得的特定信号没有负面效应。
总体而言，可通过利用以下项有效地应用本发明的背景阻断原理：单个螯合物和配体，缀合于抗体的螯合物和配体，缀合于聚合物的配体，缀合于有机分子(疏水基团)的配体以及缀合于半抗原如生物素的配体，并因此固定到链霉抗生物素蛋白涂覆的表面的配体。
实验部分
以下非限制性实例旨在进一步展示本发明。采用的结构和合成路线示出方案1-8中。方案8示出用于免疫测定测试中所需的抗体示踪剂标记的Eu3+螯合物(20和21)。
实施例
1H-NMR光谱采用Bruker AVANCE DRX 500MHz记录。四甲基硅烷用作内部参照。使用α-氰基-4-肉桂酸基质，用PerSeptive Biosystems Voyager DE-PRO MALDI-TOF仪器记录质谱。在Pharmacia Ultrospec 3300 pro上记录UV-Vis光谱。荧光测量用Perkin-ElmerWallac VictorTM板荧光计进行，并且免疫测定用Radiometer AQT 90Flex免疫测定分析仪进行。
HPLC纯化运行条件：反相HPLC(RP-18柱)。溶剂为A：三乙基醋酸铵缓冲液(TEAA)(20mM，pH7)，以及B：50％乙腈溶于三乙基醋酸铵缓冲液(20mM，pH7)。以5％溶剂B开始梯度洗脱，在30分钟内溶剂B的量线性增加到100％。
柱层析用填充有硅胶60(Merck)的柱进行。FC＝快速色谱法，RT＝室温。
实例1化合物2的合成(方案1，图1)
将化合物1(125mg，75μmοl；如WO 2013/026790所述合成)与含有0.5M KOH的EtOH(10ml)的混合物在室温下搅拌30min并添加H2O(5ml)。在室温下搅拌3h之后，使EtOH蒸发，将残余物在室温下搅拌20h，用6M HCI将pH调节至约6.5。在10min之内添加含GdCl2×6H2O(28mg，75μmol)的H2O(0.4ml)，并且采用固体NaHCO3使pH维持于5-7。在室温下搅拌过夜之后，用1M NaOH将pH调节至8.5，将沉淀离心并使上清液蒸发至干。将产物溶解于20mmolTEAA缓冲液(1ml)中并用半制备型HPLC进行纯化。收率：116mg(72％)。Rf(HPLC)＝15.7min。UVA/IS＝357nm。MALDI TOF-MS质量：计算值(M+2H+)1439.20；实测值为1439.21。
实施例2：化合物3的合成(方案1，图1)
用固体NaHCO3将化合物2(116mg，54μmol)水溶液(2ml)的pH调节至约7.0-7.5，并在5min之内添加至CSCl2(58μl，0.76mmol)和NaHCO3(72mg，0.86mmol)以及CHCl3(2ml)的混合物中。在室温下搅拌40min之后，用CHCl3(3×2ml)洗涤水相。将产物用丙酮(约40ml)沉淀，离心，用丙酮(2×10ml)洗涤并干燥。
实施例3：化合物5的合成(方案2，图2)
将化合物4(1.31g mg，0.80mmol；如WO 2016/066641所述合成)与含有0.5M KOH的EtOH(80ml)的混合物在室温下搅拌1h并添加H2O(40ml)。在室温下搅拌4小时之后，使EtOH蒸发，并将混合物在室温下搅拌过夜。用6M HCl将冰冷混合物的pH调节至约2.0-2.5，在冰浴中搅拌15min，离心，用冷H2O(2×10ml)和冷EtOH(2×10ml)洗涤并干燥。收率：1.02g(99％)。Rf(HPLC)＝17.4min。UVA/IS＝346nm。MALDI TOF-MS质量：计算值(M+1H+)1294.34；实测值为1294.38。
实施例4：化合物6的合成(方案2，图2)
该化合物6采用类似于实施例2所述的合成方法由化合物5合成。
实施例5：化合物7的合成(方案3，图3)
用1M NaOH将化合物5(15mg，12μmol)在H2O(5ml)中的悬浮液的pH调节至约6.5。在添加含柠檬酸(8mg，42μmol)的H2O(0.5ml)之后，用1M NaOH将pH调节至约6.5。在10分钟添加含GdCl2×6H2O(5mg，14μmol)的H2O(0.25ml)并且用1M NaOH将pH调节至约9.5。将混合物在95℃下搅拌4-6周(直至分析HPLC色谱图示出完全络合)。用1M HCl将pH调节至约7.0，使混合物蒸发至干，溶解于20mmol TEAA缓冲液(0.4ml)中并用半制备型HPLC进行纯化。Rf(HPLC)＝15min。UV＝350nm。MALDI TOF-MS质量：计算值(M+)1448.23；实测值为1448.52(产物相比于对应的Eu3+螯合物具有相同的保留时间；参见WO 2013/026790)。
实施例6：化合物8的合成(方案3，图3)
采用类似于实施例2所述的合成方法，由化合物7合成化合物8。
实施例7：化合物9-15的合成(方案4，图4)
将化合物6(59mg，40μmol)和相应胺(0.4mmol)在50mM Na2CO3缓冲液(1ml)中的混合物于室温下搅拌过夜。将产物用丙酮(40ml)沉淀，离心，用丙酮(2×10ml)洗涤并干燥。
表1：所获得的制备的化合物9-15的保留时间Rf(HPLC)。
化合物 胺 R<sub>f</sub>(HPLC)/min
9 R<sup>7</sup>＝CH<sub>2</sub>(CH<sub>2</sub>)<sub>5</sub>NH<sub>2</sub> 18.0
10 R<sup>7</sup>＝CH<sub>2</sub>(CH<sub>2</sub>)<sub>9</sub>NH<sub>2</sub> 22.3
11 R<sup>7</sup>＝CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>OCH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>OCH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>NH<sub>2</sub> 17.4
12 R<sup>7</sup>＝CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>O(CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>O)<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>NH<sub>2</sub> 18.1
13 R<sup>7</sup>＝CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>NHCH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>NH<sub>2</sub> 16.3
14 R<sup>7</sup>＝CH<sub>2</sub>(CH<sub>2</sub>)<sub>7</sub>NH<sub>2</sub> 19.8
15 R<sup>7</sup>＝CH<sub>2</sub>CH(OH)CH<sub>2</sub>NH<sub>2</sub> 16.2
实施例8：化合物16的合成(方案5，图5)
将化合物8(59mg，40μmol)添加至聚赖氨酸(13mg，2μmol)和50mM Na2CO3缓冲液(1ml)的混合物中。在反应过夜之后，添加1,6-二氨基己烷(46mg)并使混合物在室温下放置过夜进行反应。将产物用丙酮(40ml)沉淀，离心，用丙酮(2×10ml)洗涤并干燥。
实施例9：化合物17的合成(方案6，图6)
将化合物6(73mg，50μmol)和生物素-(PEG)4-NH2(23mg，50μmol)在50mM Na2CO3缓冲液(2ml)中的混合物于室温下搅拌过夜。在添加牛磺酸(13mg，0.1mmol)之后，将混合物在室温下搅拌过夜，并且蒸发至干。将产物溶解于20mmol TEAA缓冲液(1ml)中并用半制备型HPLC进行纯化。收率：10mg。Rf(HPLC)＝21.1min。MALDI TOF-MS质量：计算值(M+1H++Na++K+)1859.55；实测值为1859.61。
实施例10：化合物18和19的合成(方案7，图7)
这两种Gd络合物使用类似于实施例1和2中所述的合成方法，由对应的配体酯制备。酯使用WO 2013/026790和WO 2016/066641所述的方法和方案进行制备。
实施例11：使活化Gd螯合物3、8、19以及活化配体6与抗小鼠-IgG偶联
如von Lode,P.等人(Anal.Chem.,2003,75,3193-3201)所述，通过使用300倍过量的所用化合物3、6、8或19来实施抗小鼠-IgG的一般偶联反应。反应在室温下过夜进行。通过使用Tris-盐水-叠氮化物(50mM Tris，0.9％NaCI，pH 7.75)缓冲液作为洗脱液，在Superdex 200HR 10/30凝胶过滤柱(GE Healthcare)上从过量反应物分离出产物。使包含抗体的级分合并。螯合物(3，8，19)和配体(6)浓度分别使用350nm和330nm处的UV吸光度来测量。各抗体偶联的螯合物/配体的量在平均10至15之间变化。
实施例12：肌钙蛋白I免疫测定以及采用和不采用本发明阻断试剂的测定背景比 较
在夹心免疫测定法中评价心脏标记肌钙蛋白I的背景阻断。将示踪抗体用相当于Gd3+螯合物3的结构的Eu3+螯合物标记(参见WO2013/026790)。Tnl抗体的标记如von Lode,P.等人所述，使用300倍过量的Eu3+螯合物(20和21；(方案8，图8))进行。反应在室温下过夜进行。通过使用Tris-盐水-叠氮化物(Tris 50mM，NaCI 0.9％，pH 7.75)缓冲液作为洗脱液，在Superdex 200HR 10/30凝胶过滤柱(GE Healthcare)上从过量Eu3+螯合物分离出标记的抗体。使包含抗体的级分合并，并且针对Eu标准材料在VictorTM板荧光计上或者通过340nm处的UV吸光度来测量Eu浓度。
将经稀释的示踪抗体(10μl，5ng/μl)和Tnl标准溶液(40μl)移取到预涂布的测定孔(96孔板形式中的单个孔，这些孔涂布有链霉抗生物素蛋白和针对Tnl的生物素酰化捕获抗体(Innotrac Diagnostics Oy)，以及被测试的化合物(200ng/孔))中。在震荡下，将反应混合物在36℃下温育20min。将孔洗涤6次，并在VictorTM板荧光计上测量之前干燥。结果汇总于表2和图9中。在表2中，A和B标准均以最少6次平行测定进行测量。标准A表示空白，并且标准B表示中等范围的样品浓度。
表2：对阻断试剂的化合物3和8所测量的绝对信号和所计算的平均值、标准偏差和 CV。
Figure BDA0001887259050000271
*：值作为异常值被排除
从表2的结果中明显看出背景信号的显著减小(超过三倍减小)。令人惊奇地，另外观察到化合物3的特定信号增大。更令人惊奇地，关于本专利申请中所述的不同阻断试剂，观察到特定信号的较高增大，甚至多至40％。
化合物3和8利用几种不同的示踪抗体和测定概念来测试。两种化合物的平均性能与本专利申请中所述的其它阻断化合物的性能一起示于图9中。在图9中，参考值表示不采用附加背景阻断剂的标准测定的背景信号。化合物6、9和19的值通过与化合物8的信号比较来获得。化合物10-16的值通过与化合物6比较来获得。
值得注意的是相比于测定中所用的发光螯合物，甚至当使用高浓度的较强螯合配体作为阻断试剂时，其也对所获得的特定信号没有负面效应。
总体而言，可通过利用以下项有效地应用本发明的背景阻断原理：单个螯合物和配体，缀合于抗体的螯合物和配体，缀合于聚合物的配体，缀合于有机分子(疏水基团)的配体以及缀合于半抗原如生物素的配体，并因此固定到链霉抗生物素蛋白涂覆的表面的配体。

Claims (14)

1.一种用于检测样品中一种或多种特定分析物的结合测定，包括：
a)提供被固定到涂覆的或未涂覆的固体载体上的第一分析物特异性结合组分或者对不同特定分析物有特异性的一组不同的第一分析物特异性结合组分；
b)向所述固体载体添加：
1)标记有发光镧系元素螯合物的第二分析物特异性结合组分，或者对所述不同分析物有特异性的一组不同的第二分析物特异性结合组分，每种结合组分标记有包含不同镧系元素离子的不同发光镧系元素螯合物；
2)非特异性试剂，所述非特异性试剂对所述分析物并对所述第一和第二分析物特异性结合组分是非特异性的，并且选自：
i)标记有镧系元素螯合物的生物分子，其中所述生物分子对所述分析物并对所述第一和第二分析物特异性结合组分是非特异性的，并且所述镧系元素离子不同于所述镧系元素螯合物标记的特异性结合组分中的所述镧系元素离子，
ii)标记有螯合配体的生物分子，其中所述生物分子对所述分析物并对所述第一和第二分析物特异性结合组分是非特异性的，并且不存在镧系元素离子，
iii)不包含生物分子的镧系元素螯合物，并且所述镧系元素离子不同于所述镧系元素螯合物标记的特异性结合组分中的所述镧系元素离子，或者
iv)不包含生物分子且不包含镧系元素离子的螯合配体，
3)所述样品；以及
c)通过时间分辨荧光分析(TRF)对特定分析物进行检测，
其中所述非特异性试剂的所述螯合配体具有与用于标记所述分析物特异性结合组分的发光镧系元素螯合物的螯合配体相同或类似的结构，
其中式I的所述螯合物或螯合配体包含含有1-5个相同或不同基团G的1-5个吡啶部分，所述基团G选自i)缀合基团，ii)单键，以及iii)氢；
Figure FDA0003565381390000021
Ln3+为镧系元素离子或钇离子，并且镧系元素离子选自Gd3+、La3+、Lu3+、Pr3+、Nd3+、Ho3+、Er3+和Yb3+，或者Ln3+不存在；
m为1-5，并且如果镧系元素离子存在，虚线表示吡啶氮与镧系元素离子Ln3+之间的配位键；
R1和R2表示i)在螯合部分Ch的杂原子与所述镧系元素之间形成一个或多个配位键的附加螯合部分Ch，ii)所述吡啶部分与化合物的其它部分之间的键，或者iii)式I的各个吡啶部分之间的键；
其中n＝1-5的R3 n中的每个R3 n独立地选自：i)在与所述生物分子偶联之后，由反应性基团Z2和生物分子中的对应基团形成的共价基团Z1，ii)疏水基团，iii)亲水基团，以及iv)氢。
2.根据权利要求1所述的测定，其中所述第二分析物特异性结合组分的所述镧系元素离子选自Eu3+。
3.根据权利要求1所述的测定，其中所述第一和第二分析物特异性结合组分选自：任选为经遗传或化学修饰的多克隆或单克隆抗体、抗原、蛋白质、肽、糖蛋白、低聚糖、多糖、DNA探针、RNA探针、PNA探针、半抗原、凝集素、酶、受体和核酸配体。
4.背景阻断剂在通过时间分辨荧光分析(TRF)检测一种或多种特定分析物的结合测定中的用途，所述测定包括：被固定到固体载体上的第一分析物特异性结合组分或者一组不同的第一分析物特异性结合组分；以及标记有镧系元素螯合物的第二分析物特异性结合组分或者对所述不同特定分析物有特异性的一组不同的第二分析物特异性结合组分，每种结合组分标记有包含不同镧系元素离子的不同发光镧系元素螯合物，其中所述背景阻断剂为非特异性试剂，所述非特异性试剂对所述分析物以及所述第一和第二分析物特异性结合组分是非特异性的，并且选自：
i)标记有镧系元素螯合物的生物分子，其中所述生物分子对所述分析物并对所述第一和第二分析物特异性结合组分是非特异性的，并且所述镧系元素离子不同于所述镧系元素螯合物标记的特异性结合组分中的所述镧系元素离子，
ii)标记有螯合配体的生物分子，其中所述生物分子对所述分析物并对所述第一和第二分析物特异性结合组分是非特异性的，并且不存在镧系元素离子，
iii)不包含生物分子的镧系元素螯合物，并且所述镧系元素离子不同于所述镧系元素螯合物标记的特异性结合组分中的所述镧系元素离子，或者
iv)不包含生物分子且不包含镧系元素离子的螯合配体，
其中所述非特异性试剂的所述螯合配体具有与用于标记所述分析物特异性结合组分的发光镧系元素螯合物的螯合配体相同或类似的结构；
其中式I的所述螯合物或螯合配体包含含有1-5个相同或不同基团G的1-5个吡啶部分，所述基团G选自i)缀合基团，ii)单键，以及iii)氢；
Figure FDA0003565381390000031
Ln3+为镧系元素离子或钇离子，并且镧系元素离子选自Gd3+、La3+、Lu3+、Pr3+、Nd3+、Ho3+、Er3+和Yb3+，或者Ln3+不存在；
m为1-5，并且如果镧系元素离子存在，虚线表示吡啶氮与镧系元素离子Ln3+之间的配位键；
R1和R2表示i)在螯合部分Ch的杂原子与所述镧系元素之间形成一个或多个配位键的附加螯合部分Ch，ii)所述吡啶部分与化合物的其它部分之间的键，或者iii)式I的各个吡啶部分之间的键；
其中n＝1-5的R3 n中的每个R3 n独立地选自：i)在与所述生物分子偶联之后，由反应性基团Z2和生物分子中的对应基团形成的共价基团Z1，ii)疏水基团，iii)亲水基团，以及iv)氢。
5.根据权利要求4所述的背景阻断剂的用途，其中所述非特异性试剂的所述螯合配体与用于标记所述分析物特异性结合组分的发光镧系元素螯合物的螯合配体相同。
6.根据权利要求4-5中的一项所述的背景阻断剂的用途，其中所述第二分析物特异性结合组分的所述镧系元素离子选自Eu3+。
7.根据权利要求4-5中任一项所述的背景阻断剂的用途，其中所述第一和第二分析物特异性结合组分选自：任选为经遗传或化学修饰的多克隆或单克隆抗体、抗原、蛋白质、肽、糖蛋白、低聚糖、多糖、DNA探针、RNA探针、PNA探针、半抗原、凝集素、酶、受体和核酸配体。
8.根据权利要求4所述的背景阻断剂的用途，其中所述缀合基团由一个、两个或三个部分组成，每个部分选自亚乙烯基(-CH＝CH-)、乙炔二基(-C≡C-)、羰基(-C(＝O)-)、芳族环或环系的二基团(-Ar-)，以及杂芳族环或环系的二基团(-Het-)。
9.根据权利要求4或8中任一项所述的背景阻断剂的用途，其中G被一个或多个吸电子基团和/或一个或多个供电子基团取代，其中所述吸电子基团选自-NO2、-CN、-SO3H、-COOH、-CHO、-COR5、-CF3、-N+(CH3)3和卤素，并且所述供电子基团选自-C1-6烷基或-X-(R4)1-2，其中X为氧原子、硫原子、氮原子、或-N(R5)CO-，其中R5为氢或-C1-6烷基，并且R4选自氢、-C1-6烷基、-(CH2)1-6OH、-(CH2)1-6OC1-6烷基、-(CH2)1-6CO2H、-(CH2)1-6CONR6R7、-(CH2)1-6CO(哌嗪-1,4-二基)(CH2)1-6COOH、-(CH2)1-6SO3H、-(CH2)1-6NH2、-(CH2)1-6N(CH3)2、-(CH2)1-6N+-(CH3)-(CH2)1-6SO3 -、-(CH2)1-6NH(CH2)1-6COOH、-(CH2)1-6N(CH3)(CH2)1-6COOH和聚乙二醇，其中R6和R7各自独立地选自氢、C1-6烷基、-(CH2)1-6OH、-CH(CH2OH)2、以及-CH(CH2OH)3、-CH2[CH(OH)]1- 6CH2OH。
10.根据权利要求4或8中任一项所述的背景阻断剂的用途，其中R1或R2是与Ln3+离子形成配位键的螯合基团Ch，并且选自-COO-、-PO3 2-、-PMeO2 -、-PPhO2 -和-CH2PO3 2-。
11.根据权利要求4或8中任一项所述的背景阻断剂的用途，其中1-5个吡啶部分中的R1或R2为-CONHR9或-CONR9R10，其中R9或R10为烷基基团或连接基团，所述连接基团包含共价偶联于生物分子的反应性基团或者偶联反应之后由所述反应性基团Z2和生物分子中的对应基团形成的共价基团Z1。
12.根据权利要求4或8中任一项所述的背景阻断剂的用途，其中R1和R2各自表示发色部分与所述螯合物的其它部分之间的键。
13.根据权利要求4或8中任一项所述的背景阻断剂的用途，其中所述螯合部分包含直接地或经由环状或无环的含N-和/或O-烃链而连接于发色部分的芳族单元的至少两个羧酸或磷酸基团、所述酸的酯、酰胺或盐。
14.根据权利要求4或8中任一项所述的背景阻断剂的用途，其中所述其它部分能够包含含有所述基团R3的连接基团。
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