JPS61153568A

JPS61153568A - 免疫螢光分析のための螢光抗体

Info

Publication number: JPS61153568A
Application number: JP18498885A
Authority: JP
Inventors: アーウイン、ウイーダー; ケイス、オーウエン、ホジソン
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1975-06-30
Filing date: 1985-08-21
Publication date: 1986-07-12
Also published as: JPS6218868B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、パンクグラウンドすなわち競合螢光の影響を
低下させて感度を上昇させた免疫螢光分光分析法および
組成物に関する。

螢光分光分析においては、未知量の物質すなわち標的分
子を含有する試料をホルダー中に入れる。

この試料は液体溶液または例えば口紙のような基質上の
固体の形態であり得る。この試料を次いで既知のスペク
トル分布、特に狭いバンドの光の放射に露出させる。励
起放射の分布は標的分子の励起スペクトル内であり、そ
して好ましくは最大値に近いものである。照射以後の発
光スペクトルはより長い波長のものでありそしてこれは
標的分子に特徴的なものである。標的分子の量を指示す
るその強度が測定される。

現今の螢光分光分析方法に関する一つの問題は、それら
の感度が励起系および検出系中のノイズの故に、そして
第２には周囲の物質例えば基質物質、試料容器、空気中
の粒子、試料中の他の螢光物質、試薬その他からの競合
する螢光の故に、限定されるということである。

螢光抗体（ＦＡＢ）技術は１９４１年、クーンズ氏およ
びその共同研究者に端を発している。最初の概念は、後
に抗原結合させることのできる抗体に染料を結合させる
ことであった。その最初の形においては、それは第−義
的に、組織または細胞内でのある種の抗原の分布を可視
化させまたはこれをトレースするために使用されていた
。以前にマーカー°として使用されていた通常の非螢光
性染料と異なってこの螢光染料の使用は、その感度を１
０００倍も上昇させる結果となった。

その後、螢光染料を結合させる技術は改善されそしてよ
り安定な染料が合成された。１９５０年および１９５１
年に、クーンズ氏およびその共同研究者は螢光イソシア
ネートの合成およびそれを抗体と結合させるの改善され
た方法を開発した。

このことは、容易に使用可能な螢光顕微鏡の開発と相俟
って、ＦＡＢ技術を確立しそして医学におけるその拡大
された使用のための道をつくった。

１９５０年代の終わりに、３種の他の重要な安定な螢光
染料、すなわちローダミンＢ２００．１−ジメチルアミ
ノナフタレン５−スルホニルクロリド（ＤＡＮＢ）およ
び螢光インチオシアネート（ＦＩＴＣ）が開発された。

しかし今日まで最も一般にＦＡＢ研究で使用されている
染料はＦＩＴＯである。

非常に最近まで、ＦＡＢ技術は第−義的には螢光顕微鏡
を使用して試料上の抗原の位置を可視化させるためのト
レーサーとして使用されていた。

これらの使用は定量的なものではない。ＦＡＢの螢光は
、組織または細胞上における特定の抗原の存否またはそ
の分布を示すためのみに使用されていた。

現在、血液または他の体液中の特定抗原の定量的測定を
可能ならしめるような免疫学的方法の開発のために相当
な努力が費やされている。これらの抗原は天然に存在す
る物質例えば癌抗原、レニンまたはサイロキシンである
かまたは投与された薬物例えばジゴキシンまたはメトト
レキセートであり得る。

高い感度を要求する分析法に応用されて成功している一
つの免疫学的試験はラジオイムノアッセ−（ＲＩＡ）で
ある。ＲＩＡにおいては、アフセーされるべきタイプの
抗原を放射能でラベルし、アッセーされるべき抗原と利
用可能な抗体に対して競合せしめ、そして適当な処理の
後で放射能を測定し、そして存在する抗原量を演鐸する
。ＲＩＡはほとんどの微妙な分析に対して充分敏感であ
るけれども、それは放射性ラベルの故に不利な点を有し
ている。これらの不利点としては、放射能物質取り扱い
における余計な注意、放射性廃棄物の処分の問題および
放射性抗原の有限の保存期間（典型的には６０日）があ
げられる。

イムノアツヤ−法における放射能ラベル抗原の代わりに
ＦＡＢを使用することの可能性が、螢光法特にレーザー
励起を使用した場合の極端な感度の故に、当該分野の研
究者により考慮されている。

しかし、試料ホルダー、試薬、投与薬物および血清また
は尿中の有機物質のバックグラウンド螢光の存在が免疫
螢光分析に必要な高感度の実現を阻害している。

従来の免疫螢光分析および螢光スペクトル分析に固有の
これらの問題の多くは本発明者によって開発された方法
により解決される。本発明者等の見い出した標的物質の
螢光スペクトル分析用の改善法は、周囲の物質の崩壊寿
命に比べて比較的長い螢光崩壊寿命を有する螢光標識（
タグ）で標的物質の分子を標識する段階を包含する。次
いで、この標識を付された標的分子を、螢光標識の比較
的長い螢光検出時間に比べれば短いパルス持続時間を存
する放射の少なくとも１回のパルスで励起させる。次い
で有害な競合する螢光を生ぜしめる周囲の物質の螢光が
実質的に崩壊した後にのみ螢光検出系が開かれてその結
果標的分子単独の発光スペクトルが測定および／または
検出され得る。

螢光標識は新規のＦＡＢ群のものであり、これは希土類
キレートと結合された抗体よりなる。選ばれた抗体は測
定されるべき標的抗原に特異的なものであり、そして選
ばれた希土類キレートは適当な励起に際して室温でスペ
クトル的に幅の狭い長時間持続性の螢光を有するもので
ある。

添付図面において、第１図は本発明に使用する装置の平
面図であり、第２ａ図はレーザー励起パルスの強度を時
間に対してプロットしたものであり、第２ｂ図は周囲の
物質の螢光発光の強度を時間に対してプロットしたもの
であり、そして第２Ｃ図は本発明の方法による標識した
標的分子の発光の強度を時間に対してプロットしたもの
である。

本発明の方法においてはその量を測定すべき標的物質を
周囲の物質の螢光崩壊寿命に比べて比較的長い螢光崩壊
寿命を有する螢光標識で標識することが必要である。こ
の標的物質は、抗体固定により他物質から前辺って分離
されている・抗体固定による分離の一例は次のとおりで
ある。

標的物質に特異的な抗体のある量を固体マトリックス例
えばセルロースアセテート上に沈着させる。

選ばれた抗体に特異的な未知量の溶液状態標的分子をマ
トリックスに曝らしそして選ばれた抗体と反応させて基
質に固定状態ならしめる。Ｐｒｏｃ、　Ｓｏｃ。

Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ第１１巻第
３９４〜３９７頁（１９６３）中のエプパロネソト氏に
よるｒ　ＴｈｅＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ａｎｔｉｂｏ
ｄｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｓ　Ａｐｐｌｉｅｄ　ｔ。

Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ　　ａｎｄ　　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ａｎｔｉｇｅｎｓ　　１ｎＳｏ
ｌｕｔｉｏｎｓ　ｏｒ　Ａｎｔｉｓｅｒａ　Ｊの表題の
論文を参照されたい。

標的物質の分離が達成されたら、螢光標識すなわち標的
物質に親和性を有する螢光標識物質を使用して標的物質
を標識し、そして過剰の標識を洗い流す。

少な（とも２種のタイプの螢光標識を使用することがで
きる。各螢光標識は、競合するバンクグラウンド螢光に
比較して長い螢光期間ををするように選ばれる。例えば
、その崩壊寿命が競合バックグラウンド螢光の持続時間
の少なくとも１０倍である螢光標識が望ましい、以下に
論じられる例示的螢光標識のいずれかを各分離法に関し
て使用することができる。

第一の群の螢光標識は希土類有機錯塩よりなる。

これらは有機化合物に結合した希土類で構成されており
、その際得られる錯塩は所望の性質を有している。これ
ら所望の性質とは、便利な波長における効率のよい励起
、希土類への良好な励起の伝達、通常の温度における高
い量子効率、狭い発光スペクトルおよび非常に長い寿命
である。この錯塩はその励起を希土類に伝達すると信じ
られており、そして測定されるものは希土類の発光スペ
クトル強度（これは存在している希土類−有機錯塩量と
関係している）である。希土類−有機錯塩分子が一定の
比で標的分子に結合している場合には、この標的物質の
量は本明細書に開示されている方法および装置によって
推測することができる。

前記の望ましい性質を有することが見出されている代表
的希土類−有機錯塩は、ユーロピウムベンゾイルアセト
ネートおよびユーロピウムベンゾイルトリフルオロアセ
トネートである。前記化合物および他の類似化合物の螢
光はＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｈｙｓ
ｉｃｓ第１θ巻第２１４〜２１７頁（１９４２）にニス
・アイ・ワイスマン氏により論じられている。

１００ｎｓ（ナノ秒）以上の比較的長い崩壊寿命を有す
る他の螢光標識群はピレンブチレートによす代表される
。ピレンブチレートの製造および典型的螢光寿命は、ク
ツツブおよびウェーバ−両氏によりＪｏｕｒｎａｌ　ｏ
ｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　第
２４２巻第１３５３頁（１９６７）および同第２４４巻
第６３０９頁（１９６９）中に論じられている。

この螢光標識は生化学作用（特異的）によって標的分子
に結合させることができる。標的抗原に特異的な螢光抗
体は既知の比で抗原により捕集されるように選ばれ、そ
して過剰の螢光標識は洗い流される。抗原を螢光抗体で
標識する操作方法は。

エイ・カワムラ氏編ｒＰ１ｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ａｎｔ
ｉｂｏｄｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅｉｒ
　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　Ｊ　　（ユニバージティ
ー・パークプレス社、　１９６９年発行）中に記載され
ている。

ピレンブチレートを有する抗体複合体、すなわち螢光抗
体の製造はｒＴｈｅ　ＲｏｔａｔｉｏｎａＩ　Ｄｉｆｆ
ｕｓｉｏｎｏｆ　ＴｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎＪなる表
題のＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏ−１ｏｇｉｃａｌ　
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第２４４巻第６５４３〜６５４７頁
（１９６９）中のエイ・ダブりニー・ロウインチ氏等に
よる報文中に記載されている。

抗体に対する希土類キレートの結合のために選ばれる方
法は、数種の基準を満足するように選ばれる。キレート
リガンドすなわち希土類イオンを配位結合させる化学基
は、穏和な条件下に抗体に容易に結合して共有結合すな
わち不可逆性付加物（アダクト）を生成させるべきであ
る。このカンプリング法および抗体上のラベルの存在は
抗体特異性およびその反応性を有意な程度には低下させ
るべきでない。その螢光性のために選ばれた希土類キレ
ートは、希土類イオンの室温における良好な量子効率お
よびスペクトルの鋭い長時間接続螢光特性を示すタイプ
であるべきである。

はとんどのキレートリガンドに対しては、このことは希
土類の選択をユーロピウム＋３（以後本発明書において
はＥｕ（Ｉ［）と呼ばれる）およびテルビウム＋３　（
以後Ｔｂ（Ｉ［［）と呼ばれる）に限定する。その理由
はこれら希土類イオンが、ドナーをキレート作用するリ
ガンド分子の最低のトリプレット状態に比して低い方に
ある励起状態の好ましい位置を示すからである。このこ
とはこれら希土類イオンが螢光を発する機構すなわちリ
ガンドシングレット系中の紫外部エネルギーの吸収、そ
のエネルギーのりガンドトリプレソト系への伝達および
それに続（エネルギーの希土類イオン状態への伝達を増
強する。この過程は、Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃ。

５ｐｅｃｔ、第８巻第３１５〜３２７頁（１９６２）中
にアール・エフ・ワアンおよびジー・エイ・クロスビー
両氏により詳細に論じられている。

Ｂｕ（［１）およびＴｂ（ＤＩ）キレートは種々のリガ
ンドと結合させた場合、固体状態および溶液の両方にお
いて室温において最も強い螢光を示す。使用し得るこれ
らの種々のリガンドは、ｒＪ、　Ｃｈｅｎ。

Ｐｈｙｓ、第１０巻第２１４〜２１７頁（１９４２）　
Ｊ、ｒＪ、　Ｃｈｅ＋ｓ、　Ｐｈｙｓ、第３９巻第２７
２頁（１９６３）　ＪおよびｒＪ、　Ｏｐｔ、　Ｓｏｃ
、　Ａｍｅｒ、第５４巻第１２１１頁（１９６４）の各
報文中に一層完全に論じられている。

イムノアソセーのために抗体に結合させるのに適当な希
土類キレートの例は、Ｂｕ（Ｉ［））リス（ヘキサフル
オロアセチルアセトネート）　、Ｂｕ　（Ｉ［、）トリ
スまたはテトラキス（テノイルトリフルオロアセトネー
ト）、Ｅｕ（ＩＩＩ））リスまたはテトラキス（ベンゾ
イルトリフルオロアセトネート）およびＴｂ（Ｉ［［）
）リス（アセチルアセトネートである。

第一の例としては、Ｅｕ（Ｉ［［））リス（テノイルト
リフルオロアセトネート）が抗体またはその他の蛋白に
結合させるための螢光キレートとして選ばれる。

第１の段階は以下に式（１）として記したチオフェン環
の５位にアミノメチル基を有するテノイルトリフルオロ
アセトネートリガンドの合成である。

式（１）の化合物はβ−ジケトンの合成に対して確立さ
れている方法によって合成できる。この方法の第１段階
は、以下に示す化合物（４）たるブロックされた５−シ
アノ−２−アセチルチオフェンから化合物（５）の２−
アセチル−５−（アミノメチル）チオフェンの還元的合
成である。

容易に入手できる化合物（２）たる５−ヨード−２−ア
セチルチオフェンから出発しそして「日本化学雑誌第８４巻第１４１１頁
（１９６１）　Ｊ記載の方法を使用して次の化合物（３
）すなわち５−シアノ−２−アセチルチオフェンを生成させる。このブロックされた形態のものを次いで
標準的方法により生成させる０例えば「Ｊ。

Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、第７８巻第６３００
頁（１９５６）　Ｊを参照されたい、これは次の化合物
（４）を与える。次いでこの化合物（４）を、例えば「
Ｊ。

Ａ＋＋＋ｅｒ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、第７０巻第３７
３８頁（１９４８）　Ｊ記載のような方法によって還元
する。そして「脱ブロック」　〔例えば前記Ｊ、　Ａｍ
ｅｒ、　Ｃｈｅｓ、　Ｓｏｃ、第７８巻第６００頁（１
９５６）等を参照コして化合物（５）たる２−アセチル
−５−（アミノメチル）千オフエン ≧ を生成させる。次いで例えば「Ｊ、　Ａｍｅｒ、　Ｃｈ
ｅＩｌｌ。

Ｓｏｃ、第７２巻第２９４８頁（１９５０）　Ｊに記載
の標準的クライゼン縮合技術を使用してキレートリガン
ド（１）を合成する。このものは本明細書中では以後Ｔ
ＴＦＡ　−ＮＨｚと略記される。

１個の官能性ならしめたりガントアニオンＴＴＦＡ−Ｍ
Ｈｚおよび２個の未置換テノイルトリフルオロアセトネ
ートリガンドアニオン（それぞれＴＴＦＡと略記される
）を含有するＨｕ（ＩＩＩ）錯塩は便利には数種の方法
の一つによって製造することができる。

β−ケトエノールのアンモニウム塩と適当な希土類塩を
包含する一つの方法は、ジエー・ジー・スタイテス氏に
よるｒＪ、＾５ｃａｒ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、第７０
巻第３１４２頁（１９４８）　Ｊの幅大に示されている
。

この方法は化合物Ｅｕ　（ＩＩ）　　（ＴＴＦＡ）２　
（ＴＴＦＡ−Ｎｌｌｚ）を生ずる。

前記の螢光性Ｈｕ（［１）錯塩を抗体にカップリングさ
せるためには、ＴＴＦＡ　−ＭＨｚリガンド上のアミノ
をイソチオシアネートに変換させなくてはならない、こ
のことは錯塩の酸分解を生ぜしめ得る低ｐＨを避けた数
種の方法の一つによって達成することができる。このタ
イプの変換は、エイチ・エイ・スタッグおよびシー・ウ
ォルター両氏のｒＡｎｎ。

第６５７巻第９８頁（１９６２）および同第６５７巻第
１０４頁（１９６２）　Ｊまたはディー・ハドソン氏等
のｒＪ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、　　（Ｃ）　　１９７
０年第９３１頁」の技術によって行われる。

抗体への螢光性Ｅｕ（ＩＩＩ）の実際のカップリングは
、フルオレッセインイソチオシアネートを抗体に結合さ
せるためにすでに成功裡に使用されている数種の方法の
一つ例えば「Ａ鋼ｅｒ、　Ｊ、　Ｐａｔｈｏｌ、第１部
第３４巻第１０８１頁（１９５８）　Ｊに記載の方法ま
たはＰｒｏｃ、　Ｓｏｃ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ、　Ｍ
ｅｎ、第９８巻第８９８頁（１９５９）の方法に従う。

前記で合成されたこの独特のＦＡＢを特定の抗原に対す
る血清の直接的免疫螢光分析に使用するためには、先ず
血清を通常の方法で準備し、そしてその抗原を固定基質
に固定させ、その抗原に特異的なＦＡＢに露出させ且つ
これと結合させ、そして過剰のＦＡＢを分離し去る。

測定のために抗原−ＦＡＢ錯塩を単離するための種々の
方法を使用することができる。一つの好ましい方法は、
エフ・バロネット氏ｒＰｒｏｃ、　Ｓｏｃ。

Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ、第１１３巻第３９４頁（１９６３
）−Ｊに記載の「サンドインチ」技術である。この場合
には、非螢光性抗体流体をその上に有する固体基質を試
料に露出させそしてその試料中の実質的にすべての抗原
を抗体（これは所望の測定範囲に必要な量より過剰であ
る）と結合させる。次いでこの固体基質をＦＡＢ　（こ
のＦＡＢはその際基質上に固定された抗原に結合する）
を含有する溶液中に浸漬させそして基質を過剰のＦＡＢ
から除去する。測定は固体基質からの螢光についてなさ
れ得る。この方法は抗原が抗体結合に対して１個以上の
結合部位を有している場合すなわちより大なる分子の抗
原に対して操作可能である。

１分子当たりただ１個の抗体特異性結合部位しか有して
いない一層小さい分子に対しては、間接アッセー法を使
用することができる。アソセーされている抗原と同一の
抗原を固体基質に結合させることができる。この固体基
質は抗体特異性部位を露出された状態のままに残すよう
にして化学的に抗原と結合する。これを達成させるため
の化学的方法は、その抗原に対する抗体を産生させるた
めの動物中にコンジュゲートさせた抗原蛋白を注入する
前に大形蛋白に抗原を結合させるために使用される技術
と同様のものである。これらの操作では抗原を蛋白に化
学的に結合させ、他方抗原部位は動物免疫系に露出状態
で残されていてその結果適当な抗体が産生されることが
必要である。その−例は、ダブりニー・エイ・ベンジャ
ミン代著ｒｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　Ｂａ５ｉｓ　ｏｆ　
Ａｎｔｉｂｏｄｙ　５ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙＪ（プレス
マン・アンド・ゴールドバーブ社１９６８年発行）第９
〜１０頁に引用されている。抗原との化学的結合に対し
て適当な固体基質は例えばアソセーされるべき抗原上の
適当な基に合致するように官能化された側鎖を有するス
チレン重合体でありうる。そのようにして各抗原はその
抗原の分析に使用されるべき同一の抗原で被覆されたそ
の特別の固体基質を有することになる。

次いでこの固体基質を未知量の抗原を含有する溶液中に
浸漬させそしてその抗原に特異的なＦＡＢを加−える。

溶液中の抗原および固体基質上の抗原はＦＡＢに対して
競合し、そして固体基質と結合するＦＡＢ量は溶液中の
抗原量に逆比例する。

固体基質上のＦＡＢ量は以下に記載する螢光測定により
測定され、そして溶液中の抗原量が決定される。

螢光測定を行うことのできる試料製造のための多くの他
の方法が明らかに存在している。

本発明の組成物の利用にあっては、その量が測定される
べき標的抗原を周囲の物質の崩壊寿命に比して相対的に
長い螢光崩壊寿命を有するＦＡＢで標識することが必要
である。存在する標的物質量を演褌するためには、前記
のようにして標識が完了したならば、その標識された標
的分子からの螢光を測定することが必要である。

第１図について述べるに、標的分子は基質上に単離され
、標識されそして例えば支持体２１により支持されてい
る。標識された標的物質は既知の出カスベクトルを有す
る励起源２３により励起される０通常、出力は実質的に
単色光であるビーム２５の形であり、そしてこの具体例
においては、典型的にはレーザーからのパルス放射が使
用される。パルスの持続時間は、螢光標識の螢光寿命よ
りも少なくとも１０倍短いものである。本発明者等は、
パルス式窒素レーザー励起装置２７により励起された調
節可能な染料レーザーが非常に強い励起を生ぜしめるこ
とを発見した。あるいはまた３３７１Ａで作動するパル
ス式窒素レーザー単独が非常に強い励起を生ぜしめる。

どちらかのレーザーが好ましい。その理由はほとんどの
物質の励起スペクトル内の波長において高いピーク出力
および比較的短い持続パルスが得られるからである。

あるいはまた、その持続またはその崩壊時間が螢光標識
の螢光寿命よりも少なくとも１０倍短いことを条件とし
て簡単なパルス化ガス放電がらの口演されかつ集束され
た出力を使用することもできる。

ビーム２５は支持体２１上の標的分子に向けられる。別
の場合にはこの標的分子はバイアル中の溶液状態であり
得る。

基質２１からの発光は破線３１により示されている。こ
れはレンズ３３により集められ、そしてフィルター例え
ば干渉フィルター３５を通過しそして次いで検出器３７
（これは典型的には光電倍増管である）に向けられる。

干渉フィルター３５は螢光標識物質の発光放射の発光波
長に中心を有する透過波長バンドを有しており、そして
これは検出器３７の方向に散乱された光源２３からの励
起波長放射を口渡する。

常時「オン」である検出器３７は受光された螢光放射発
光に比例した電気信号を発生する。これは線形増幅器３
８により増幅される。これは次いで増幅された信号をゲ
ート回路３９に送る。このゲート回路は遅延回路からの
２個の信号によって開放（オン）および閉鎖（オフ）と
なる。これらの二つの信号は、光電管３４によって励起
パルスが検知された後、二つの固定された時間で発生さ
れる。光電管３４から得られる信号は、次いで遅延信号
を発生する回路３６のタイムシーケンスを開始する。

第１の信号のために遅延回路３６中で選ばれる遅延量は
好ましくはバックグラウンド螢光寿命の少なくとも５倍
となるように選ばれる。例えばバックグラウンドまたは
周囲の物質からの螢光の寿命が１０ナノ秒である場合に
は、選ばれる第一遅延は好ましくは５０ナノ秒である。

周囲の螢光の崩壊が指数崩壊モードによる場合には、５
倍崩壊寿命はそのバックグラウンドまたは周囲の螢光を
そのピーク値の約０．７％に低減させることになる。

ゲート回路３９は遅延回路３６から第二の遅延信号が到
着するまで開いている。これは好ましくは螢光標識の崩
壊寿命の２倍の時間例えばピレンブチレートに対しては
約２００ナノ秒であるべきである。

あるいはまた、バックグラウンド螢光信号が光電検出器
または増幅器を飽和させるに充分なだけ強い場合には、
光電検出器を通常「オフ」に保ち、そして遅延回路３６
の第１および第２の信号により規定される時間でそれを
オンそして再びオフにすることによって、この光電検出
系を開くことができる。

スイッチとして働くゲート回路３９による信号導入後、
増幅器３８からの線形増幅された信号は信号処理装置４
８に送られる。これは多数のパルスの結果を平均化させ
、そしてこの増幅信号を既知量の標的物質の発光を水性
する情報と相関させる。それによって信号処理装置４８
の出力は標的分子の量の指数となる。

第２ａ図においては、励起パルスのパルス振幅は縦座標
軸により示されており、そして時間は横軸として示され
ている。パルスの持続（強度半減点間の時間）は矢印に
より示されており、そして３ナノ秒である。螢光寿命（
持続ではない）が本明細書中で論じられている場合には
、その寿命とは螢光強度がその初期の値１／ｅ（ｅは自
然対数の底である）まで崩壊する時間として定義される
。

第２ｂ図は、第２ａ図と同一のゼロ出発時間を使用した
励起パルスに対する周囲螢光を示している０周囲螢光の
強度は縦座標として示されており、そして時間はプロッ
トで横軸として示されている。

周囲螢光すなわち空気中の粒子、試薬、ホルダー物質の
試料中の他の螢光物質その他を包含するすべての源から
のものを合併したものの寿命は約１０ナノ秒であり、そ
してこれは０に向かって崩壊する。

第２ｃ図においては、典型的螢光標識物質の強度が縦座
標としてプロットされており、そして時間は横軸として
示されている。寿命は、第２Ｃ図中の矢印により示され
ている様に１００ナノ秒である。第２ｃ図は、第２ａお
よび２ｂ図と共通のゼロ時間を共有しており、そしてそ
の時間ゲート回路は第２Ｃ図中の左側の破線の左側に示
されているように「オフ」に保たれている。その時間が
経過した後、ゲートを開路すなわちオンにし、そしてそ
のゲートは螢光標識の寿命の２倍すなわちピレンブチレ
ートに対しては約２００ナノ秒の間オンに保たれる。す
なわち、第１図のゲート回路３９がオンに保たれている
全時間は、第２ＣｖＩ！Ｊにおいては二つの破線の間の
時間、または時間ゼロ後の５０ナノ秒から２００ナノ秒
の間の時間である。次いでこの過程が繰り返される。

多くのサイクルの後、螢光はエレクトロニクス手段によ
り平均化され、相当抗原濃度に変換されそして表示され
る。

新規なＦＡＢ群の他の一つの適用においては、バックグ
ラウンド螢光が実質的に崩壊した後にのみ、ただしＦＡ
Ｂがまだ活性状態で崩壊している間に、画像変換管をオ
ンにすることによって、抗原の空間的分布の検出が増強
されることができる。

新規なＦＡＢ群は医学診断的使用に関して記載されてい
るけれども、少量の分子の検出が必要とされる他の応用
が可能である。

【図面の簡単な説明】

添付図面中、第１図は本発明に使用する装置の平面図で
あり、第２ａ図はレーザー励起パルスの強度を時間に対
してプロットしたものであり、第２ｂ図は周囲物質の螢
光発光の強度を時間に対してプロットしたものであり、
そして第２Ｃ図は本発明の方法による標識した標的分子
の発光の強度を時間に対してプロットしたものである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）抗原に特異的な抗体と、該抗体と結合した螢光希
土類キレートとよりなり、該螢光希土類キレートはキレ
ートリガンドが配位した希土類イオンよりなることを特
徴とする螢光抗体。
（２）希土類イオンがＥｕ（III）である第１項の螢光
抗体。
（３）希土類イオンがＴｂ（III）である第１項の螢光
抗体。
（４）キレートリガンドがテノイルトリフルオロアセト
ネートおよび前記抗体と結合のため化学的に修飾したテ
ノイルトリフルオロアセトネートである第２項の螢光抗
体。
（５）キレートリガンドがヘキサフルオロアセチルアセ
トネートおよび前記抗体と結合のため化学的に修飾した
ヘキサフルオロアセチルアセトネートである第２項の螢
光抗体。
（６）キレートリガンドがベンゾイルトリフルオロアセ
トネートおよび前記抗体と結合のため化学的に修飾した
ベンゾイルトリフルオロアセトネートである第２項の螢
光抗体。
（７）キレートリガンドがアセチルアセトネートおよび
前記抗体と結合のため化学的に修飾したアセチルアセト
ネートである第２項の螢光抗体。
（８）標的物質を螢光抗体で標識することと、標識した
標的物質を前記螢光抗体の螢光崩壊寿命に比較して短い
持続時間を有する放射のパルスで励起することと、周囲の物質の螢光は実質上崩壊したがしかし前記螢光抗
体の螢光は未だ活動的に崩壊しつつある間に螢光検出シ
ステムのゲートをオンにすることよりなる標的物質の螢
光検出方法において、前記螢光抗体として、前記標的物質に対し特異的な抗体と、該体と結合した螢
光希土類キレートとよりなり、該螢光希土類キレートは
キレートリガンドが配位した希土類イオンよりなり、該
希土類キレートはシャープな螢光放出を有しかつ競合す
る未標識の周囲物質の最長螢光崩壊寿命に比較して長い
螢光崩壊寿命を有している前記螢光抗体を使用すること
を特徴とする螢光検出方法。
（９）希土類イオンがＥｕ（III）である第８項の方法
。
（１０）希土類イオンがＴｂ（III）である第８項の方
法。
（１１）キレートリガンドがテノイルトリフルオロアセ
トネートおよび前記抗体と結合のため化学的に修飾した
テノイルトリフルオロアセトネートである第９項の方法
。
（１２）キレートリガンドがヘキサフルオロアセチルア
セトネートおよび前記抗体と結合のため化学的に修飾し
たヘキサフルオロアセチルアセトネートである第９項の
方法。
（１３）キレートリガンドがベンゾイルトリフルオロア
セトネートおよび前記抗体と結合のため化学的に修飾し
たベンゾイルトリフルオロアセトネートである第９項の
方法。
（１４）キレートリガンドがアセチルアセトネートおよ
び前記抗体と結合のため化学的に修飾したアセチルアセ
トネートである第９項の方法。