JPS6218868B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、バツクグラウンドすなわち競合螢光
の影響を低下させて感度を上昇させた免疫螢光分
光分析法および組成物に関する。

螢光分光分析においては、未知量の物質すなわ
ち標的分子を含有する試料をホルダー中に入れ
る。この試料は液体溶液または例えばロ紙のよう
な基質上の固体の形態であり得る。この試料を次
いで既知のスペクトル分布、特に狭いバンドの光
の放射に露出させる。励起放射の分布は標的分子
の励起スペクトル内であり、そして好ましくは最
大値に近いものである。照射以後の発光スペクト
ルはより長い波長のものでありそしてこれは標的
分子に特徴的なものである。標的分子の量を指示
するその強度が測定される。

現今の螢光分光分析方法に関する一つの問題
は、それらの感度が励起系および検出系中のノイ
ズの故に、そして第２には周囲の物質例えば基質
物質、試料容器、空気中の粒子、試料中の他の螢
光物質、試薬その他からの競合する螢光の故に、
限定されるということである。

螢光抗体（FAB）技術は1941年、クーンズ氏
およびその共同研究者に端を発している。最初の
概念は、後に抗体結合させることのできる抗体に
染料を結合させることであつた。その最初の形に
おいては、それは第一義的に、組織または細胞内
でのある種の抗体の分布を可視化させまたはこれ
をトレースするために使用されていた。以前にマ
ーカーとして使用されていた通常の非螢光性染料
と異なつてこの螢光染料の使用は、その感度を
1000倍も上昇させる結果となつた。

その後、螢光染料を結合させる技術は改善され
そしてより安定な染料が合成された。1950年およ
び1951年に、クーンズ氏およびその共同研究者は
螢光イソシアネートの合成およびそれを抗体と結
合させるの改善された方法を開発した。

このことは、容易に使用可能な螢光顕微鏡の開
発と相俟つて、FAB技術を確立しそして医学に
おけるその拡大された使用のための道をつくつ
た。

1650年代の終わりに、３種の他の重要な安定な
螢光染料、すなわちローダミンB200、１−ジメ
チルアミノナフタレン５−スルホニルクロリド
（DANB）および螢光イソチオシアネート
（FITC）が開発された。しかし今日まで最も一
般にFAB研究で使用されている染料はFITCであ
る。

非常に最近まで、FAB技述は第一義的には螢
光顕微鏡を使用して試料上の抗原の位置を可視化
させるためのトレーサーとして使用されていた。
これらの使用は定量的なものではない。FABの
螢光は、組織または細胞上における特定の抗原の
存否またはその分布を示すためのみに使用されて
いた。

現在、血液または他の体液中の特定抗原の定量
的測定を可能ならしめるような免疫学的方法の開
発のために相当な努力が費やされている。これら
の抗原は天然に存在する物者例えば癌抗原、レニ
ンまたはサイロキシンであるかまたは投与された
薬物例えばジゴキシンまたはメトトレキセートで
あり得る。

高い感度を要求する分析法に応用されて成功し
ている一つの免疫学的試験はラジオイムノアツセ
ー（RIA）である。RIAにおいては、アツセーさ
れるべきタイプの抗原を放射能でラベルし、アツ
セーされるべき抗原と利用可能な抗体に対して競
合せしめ、そして適当な処理の後で放射能を測定
し、そして存在する抗原量を演縲する。RIAはほ
とんどの微妙な分析に対して充分敏感であるけれ
ども、それは放射性ラベルの故に不利な点を有し
ている。これらの不利点としては、放射能物質取
り扱いにおける余計な注意、放射性廃棄物の処分
の問題および放射性抗原の有限の保存期間（典型
的には60日）があげられる。

イムノアツセー法における放射能ラベル抗原の
代わりにFABを使用することの可能性が、螢光
法特にレーザー励起を使用した場合の極端な感度
の故に、当該分野の研究者により考慮されてい
る。しかし、試料ホルダー、試薬、投与薬物およ
び血清または尿中の有機物質のバツクグラウンド
螢光の存在が免疫螢光分析に必要な高感度の実現
を阻害している。

従来の免疫螢光分析および螢光スペクトル分析
に固有のこれらの問題の多くは本発明者によつて
開発された方法により解決される。本発明者等の
見い出した標的物質の螢光スペクトル分析用の改
善法は、周囲の物質の崩壊寿命に比べて比較的長
い螢光崩壊寿命を有する螢光標識（タグ）で標的
物質の分子を標識する段階を包含する。次いで、
この標識を付された標的分子を、螢光標識の比較
的長い螢光検出時間に比べれば短いパルス持続時
間を有する放射の少なくとも１回のパルスで励起
させる。次いで有害な競合する螢光を生ぜしめる
周囲の物質の螢光が実質的に崩壊した後にのみ螢
光検出系が開かれてその結果標的分子単独の発光
スペクトルが測定および／または検出され得る。

螢光標識は新規のFAB群のものであり、これ
は希土類キレートと結合された抗体よりなる。選
ばれた抗体は測定されるべき標的抗原に特異的な
ものであり、そして選ばれた希土類キレートは適
当な励起に際して室温でスペクトル的に幅の狭い
長時間持続性の螢光を有するものである。

添付図面において、第１図は本発明に使用する
装置の平面図であり、第２ａ図はレーザー励起パ
ルスの強度を時間に対してプロツトしたものであ
り、第２ｂ図は周囲の物質の螢光発光の強度を時
間に対してプロツトしたものであり、そして第２
ｃ図は本発明の方法による標識した標的分子の発
光の強度を時間に対してプロツトしたものであ
る。

本発明の方法においてはその量を測定すべき標
的物質を周囲の物質の螢光崩壊寿命に比べて比較
的長い螢光崩壊寿命を有する螢光標識で標識する
ことが必要である。この標的物質は、抗体固定に
より他物質から前以つて分離されている。

抗体固定による分離の一例は次のとおりであ
る。標的物質に特異的な抗体のある量を固体マト
リツクス例えばセルロースアセテート上に沈着さ
せる。選ばれた抗体に特異的な未知量の溶液状態
標的分子をマトリツクスに曝らしそして選ばれた
抗体と反応させて基質に固定状態ならしめる。
Proc.Soc.Experimental Biology第11巻第394〜
397頁（1963）中のエプパロネツト氏による
「The Fluorescent Antibody Techniqus
Applied to Titration and Identification of
Antigens in Solutions or Antisera」の表題の
論文を参照されたい。

標的物質の分離が達成されたら、螢光標識すな
わち標的物質に親和性を有する螢光標識物質を使
用して標的物質を標識し、そして過剰の標識を洗
い流す。

少なくとも２種のタイプの螢光標識を使用する
ことができる。各螢光標識は、競合するバツクグ
ラウンド螢光に比較して長い螢光期間を有するよ
うに選ばれる。例えば、その崩壊寿命が競合バツ
クグラウンド螢光の持続時間の少なくとも10倍で
ある螢光標識が望ましい。以下に論じられる例示
的螢光標識のいずれかを各分離法に関して使用す
ることができる。

第一の群の螢光標識は希土類有機錯塩よりな
る。これらは有機化合物に結合した希土類で構成
されており、その際得られる錯塩は所望の性質を
有している。これら所望の性質とは、便利な波長
における効率のよい励起、希土類への良好な励起
の伝達、通常の温度における高い量子効率、狭い
発光スペクトルおよび非常に長い寿命である。こ
の錯塩はその励起を希土類に伝達すると信じられ
ており、そして測定されるものは希土類の発光ス
ペクトル強度（これは存在している希土類−有機
錯塩量と関係している）である。希土類−有機錯
塩分子が一定の比で標的分子に結合している場合
には、この標的物質の量は本明細書に開示されて
いる方法および装置によつて推測することができ
る。

前記の望ましい性質を有することが見出されて
いる代表的希土類−有機錯塩は、ユーロビウムベ
ンゾイルアセトネートおよびユーロビウムベンゾ
イルトリフルオロアセトネートである。前記化合
物および他の類似化合物の螢光はJournal of
Chemical Physics第10巻第214〜217頁（1942）
にエス・アイ・ワイスマン氏により論じられてい
る。

100ns（ナノ秒）以上の比較的長い崩壊寿命を
有する他の螢光標識群はピレンブチレートにより
代表される。ピンチブチレートの製造および典型
的螢光寿命は、クノツプおよびウエーバー両氏に
よりJournal of Biological Chemistry第242巻第
1353頁（1967）および同第244巻第6309頁
（1969）中に論じられている。

この螢光標識は生化学作用（特異的）によつて
標的分子に結合させることができる。標的抗原に
特異的な螢光抗体は既知の比で抗原により捕集さ
れるように選ばれ、そして過剰の螢光標識は洗い
流される。抗原を螢光抗体で標識する操作方法は
エイ・カワムラ氏編「Fluorescent Antibody
Techniques and Their Applications」（ユニバ
ーシテイー・バークプレス社、1969年発行）中に
記載されている。

ピレンブチレートを有する抗体複合体、すなわ
ち螢光抗体の製造は「The Rotational Diffusion
of Thyroglobulin」なる表題のJournal of
Biological Chemistry第244巻第6543〜6547頁
（1969）中のエイ・ダブリユー・ロウイツチ氏等
による報文中に記載されている。

抗体に対する希土類キレートの結合のために選
ばれる方法は、数種の基準を満足するように選ば
れる。キレートリガンドすなわち希土類イオンを
配位結合させる化学基は、穏和な条件下に抗体に
容易に結合して共有結合すなわち不可逆性付加物
（アダクト）を生成させるべきである。このカツ
プリング法および抗体上のラベルの存在は抗体特
異性およびその反応性を有意な程度には低下させ
るべきでない。その螢光性のために選ばれた希土
類キレートは、希土類イオンの室温における良好
な量子効率およびスペクトルの鋭い長時間接続螢
光特性を示すタイプであるべきである。

このため１個の希土類イオンに対し複数のキレ
ートリガンドが配位され、該キレートリガンドの
少なくとも一つは化学的修飾により抗体と共有結
合により結合し得る官能基、例えばイソチオシア
ネート基を持つていなければならない。

ほとんどのキレートリガンドに対しては、この
ことは希土類の選択をユーロビウム＋３（以後本
発明書においてはEu（）と呼ばれる）および
テルビウム＋３（以後Tb（）と呼ばれる）に
限定する。その理由はこれら希土類イオンが、ド
ナーをキレート作用するリガンド分子の最低のト
リプレツト状態に比して低い方にある励起状態の
好ましい位置を示すからである。このことはこれ
ら希土類イオンが螢光を発する機構すなわちリガ
ンドシングレツト系中の紫外部エネルギーの吸
収、そのエネルギーのリガンドトリプレツト系へ
の伝達およびそれに続くエネルギーの希土類イオ
ン状態への伝達を増強する。この過程は、J.
Molec.Spect.第８巻第315〜327頁（1962）中にア
ール・エフ・ワアンおよびジー・エイ・クロスビ
ー両氏により詳細に論じられている。

Eu（）およびTb（）キレートは種々のリ
ガンドと結合させた場合、固体状態および溶液の
両方において室温において最も強い螢光を示す。
使用し得るこれらの種々のリガンドは、「J.
Chem.Phys.第10巻第214〜217頁（1942）」、「J.
Chem.Phys.第39巻第272頁（1963）」および「J.
Opt.Soc.Amer.第54巻第1211頁（1964）の各報文
中に一層完全に論じられている。

イムノアツセーのために抗体に結合させるのに
適当な希土類キレートの例は、Eu（）トリス
（ヘキサフルオロアセチルアセトネート）、Eu
（）トリスまたはテトラキス（テノイルトリフ
ルオロアセトネート）、Eu（）トリスまたはテ
トラキス（ベンゾイルトリフルオロアセトネー
ト）およびTb（）トリス（アセチルアセトネ
ートである。

第一の例としては、Eu（）トリス（テノイ
ルトリフルオロアセトネート）が抗体またはその
他の蛋白に結合させるための螢光キレートとして
選ばれる。

第１の段階は以下に式(1)として記したチオフエ
ン環の５位にアミノメチル基を有するテノイルト
リフルオロアセトネートリガンドの合成である。

式(1)の化合物はβ−ジケトンの合成に対して確
立されている方法によつて合成できる。この方法
の第１段階は、以下に示す化合物(4)たるブロツク
された５−シアノ−２−アセチルチオフエンから
化合物(5)の２−アセチル−５−（アミノメチル）
チオフエンの還元的合成である。

容易に入手できる化合物(2)たる５−ヨード−２
−アセチルチオフエン から出発しそして「日本化学雑誌第84巻第1411頁
（1961）」記載の方法を使用して次の化合物(3)すな
わち５−シアノ−２−アセチルチオフエン を生成させる。このブロツクされた形態のものを
次いで標準的方法により生成させる。例えば「J.
Amer.Chem.Soc.第78巻第6300頁（1956）」を参
照されたい。これは次の化合物(4) を与える。次いでこの化合物(4)を、例えば「J.
Amer.Chem.Soc.第70巻第3738頁（1948）」記載
のような方法によつて還元する。そして「脱ブロ
ツク」〔例えば前記J.Amer.Chem.Soc.第78巻第
600頁（1956）等を参照〕して化合物(5)たる２−
アセチル−５−（アミノメチル）チオフエン を生成させる。次いで例えば「J.Amer.Chem.
Soc.第72巻第2948頁（1950）」に記載の標準的ク
ライゼン縮合技術を使用してキレートリガンド(1)
を合成する。このものは本明細書中では以後
TTFA−NH₂と略記される。

１個の官能性ならしめたリガンドアニオン
TTFA−NH₂および２個の未置換テノイルトリフ
ルオロアセトネートリガンドアニオン（それぞれ
TTFAと略記される）を含有するEu（）錯塩
は便利には数種の方法の一つによつて製造するこ
とができる。β−ケトエノールのアンモニウム塩
と適当な希土類塩を包含する一つの方法は、ジエ
ー・ジー・スタイテス氏による「J.Amer.Chem.
Soc.第70巻第3142頁（1948）」の報文に示されて
いる。この方法は化合物Eu（）（TTFA）₂
（TTFA−NH₂）を生ずる。

前記の螢光性Eu（）錯塩を抗体にカツプリ
ングさせるためには、TTFA−NH₂リガンド上の
アミノをイソチオシアネートに変換させなくては
ならない。このことは錯塩の酸分解を生ぜしめ得
る低PHを避けた数種の方法の一つによつて達成す
ることができる。このタイプの変換は、エイチ・
エイ・スタツグおよびシー・ウオルター両氏の
「Ann.第657巻第98頁（1962）および同第657巻第
104頁（1962）」またはデイー・ハドソン氏等の
「J.Chem.Soc.(C)1970年第931頁」の技術によつて
行われる。

抗体への螢光性Eu（）の実際のカツプリン
グは、フルオレツセインイソチオシアネートを抗
体に結合させるためにすでに成功裡に使用されて
いる数種の方法の一つ例えば「Amer.J.Pathol.第
１部第34巻第1081頁（1958）」に記載の方法また
はProc.Sof.Exp.Biol.Men.第98巻第898頁
（1959）の方法に従う。

前記で合成されたこの独特のFABを特定の抗
原に対する血清の直接的免疫螢光分析に使用する
ためには、先ず血清を通常の方法で準備し、そし
てその抗原を固定基質に固定させ、この抗原に特
異的なFABに露出させ且つこれと結合させ、そ
して過剰のFABを分離し去る。

測定のために抗原−FAB錯塩を単離するため
の種々の方法を使用することができる。一つの好
ましい方法は、エフ・バロネツト氏「Proc.Soc.
Exp.Biol.第113巻第394頁（1963）」に記載の「サ
ンドイツチ」技術である。この場合には、非螢光
性抗体流体をその上に有する固体基質を試料に露
出させそしてその試料中の実質的にすべての抗原
を抗体（これは所望の測定範囲に必要な量より過
剰である）と結合させる。次いでこの固体基質を
FAB（このFABはその際基質上に固定された抗
原に結合する）を含有する溶液中に浸漬させそし
て基質を過剰のFABから除去する。測定は固体
基質からの螢光についてなされ得る。この方法は
抗原が抗体結合に対して１個以上の結合部位を有
している場合すなわちより大なる分子の抗原に対
して操作可能である。

１分子当たりただ１個の抗体特異性結合部位し
か有していない一層小さい分子に対しては、間接
アツセー法を使用することができる。アツセーさ
れている抗原と同一の抗原を固体基質に結合させ
ることができる。この固体基質は抗体特異性部位
を露出された状態のままに残すようにして化学的
に抗原と結合する。これを達成させるための化学
的方法は、その抗原に対する抗体を産生させるた
めの動物中にコンジユゲートさせた抗原蛋白を注
入する前に大形蛋白に抗原を結合させるために使
用される技術と同様のものである。これらの操作
では抗原を蛋白に化学的に結合させ、他方抗原部
位は動物免疫系に露出状態で残されていてその結
果適当な抗体が産出されることが必要である。そ
の一例は、ダブリユー・エイ・ベンジヤミン氏著
「Structural Basis of Antibody Specificity」
（プレスマン・アンド・ゴールドバーグ社1968年
発行）第９〜10頁に引用されている。抗原との化
学的結合に対して適当な固体基質は例えばアツセ
ーされるべき抗原上の適当な基に合致するように
官能化された側鎖を有するスチレン重合体であり
うる。そのようにして各抗原はその抗原の分析に
使用されるべき同一の抗原で被覆されたその特別
の固体基質を有することになる。

次いでこの固体基質を未知量の抗原を含有する
溶液中に浸漬させそしてその抗原に特異的な
FABを加える。溶液中の抗原および固体基質上
の抗原はFABに対して競合し、そして固体基質
と結合するFAB量は溶液中の抗原量に逆比例す
る。固体基質上のFAB量は以下に記載する螢光
測定により測定され、そして溶液中の抗原量が決
定される。

螢光測定を行うことのできる試料製造のための
多くの他の方法が明らかに存在している。

本発明の組成物の利用にあつては、その量が測
定されるべき標的抗原を周囲の物質の崩壊寿命に
比して相対的に長い螢光崩壊寿命を有するFAB
で標識することが必要である。存在する標的物質
量を演繹するためには、前記のようにして標識が
完了したならば、その標識された標的分子からの
螢光を測定することが必要である。

第１図について述べるに、標的分子は基質上に
単離され、標識されそして例えば支持体２１によ
り支持されている。標識された標的物質は既知の
出力スペクトルを有する励起源２３により励起さ
れる。通常、出力は実質的に単色光であるビーム
２５の形であり、そしてこの具体例においては、
典型的にはレーザーからのパルス放射が使用され
る。パルスの持続時間は、螢光標識の螢光寿命よ
りも少なくとも10倍短いものである。本発明者等
は、パルス式窒素レーザー励起装置２７により励
起された調節可能な染料レーザーが非常に強い励
起を生ぜしめることを発見した。あるいはまた
3371Åで作動するパルス式窒素レーザー単独が非
常に強い励起を生ぜしめる。どちらかのレーザー
が好ましい。その理由はほとんどの物質の励起ス
ペクトル内の波長において高いピーク出力でおよ
び比較的短い持続パルスが得られるからである。

あるいはまた、その持続またはその崩壊時間が
螢光標識の螢光寿命よりも少なくとも10倍短いこ
とを条件として簡単なパルス化ガス放電からのロ
波されかつ集束された出力を使用することもでき
る。

ビーム２５は支持体２１上の標的分子に向けら
れる。別の場合にはこの標的分子はバイアル中の
溶液状態であり得る。

基質２１からの発光は破線３１により示されて
いる。これはレンズ３３により集められ、そして
フイルター例えば干渉フイルター３５を通過しそ
して次いで検出器３７（これは典型的には光電倍
増管である）に向けられる。干渉フイルター３５
は螢光標識物質の発光放射の発光波長に中心を有
する透過波長バンドを有しており、そしてこれは
検出器３７の方向に散乱された光源２３からの励
起波長放射をロ波する。

常時「オン」である検出器３７は受光された螢
光放射発光に比例した電気信号を発生する。これ
は線形増幅器３８により増幅される。これは次い
で増幅された信号をゲート回路３９に送る。この
ゲート回路は遅延回路からの２個の信号によつて
開放（オン）および閉鎖（オフ）となる。これら
の二つの信号は、光電管３４によつて励起パルス
が検知された後、二つの固定された時間で発生さ
れる。光電管３４から得られる信号は、次いで遅
延信号を発生する回路３６のタイムシーケンスを
開始する。

第１の信号のために遅延回路３６中で選ばれる
遅延量は好ましくはバツクグラウンド螢光寿命の
少なくとも５倍となるように選ばれる。例えばバ
ツクグラウンドまたは周囲の物質からの螢光の寿
命が10ナノ秒である場合には、選ばれる第一遅延
は好ましくは50ナノ秒である。周囲の螢光の崩壊
が指数崩壊モードによる場合には、５倍崩壊寿命
はそのバツクグラウンドまたは周囲の螢光をその
ピーク値の約0.7％に低減させることになる。

ゲート回路３９は遅延回路３６から第二の遅延
信号が到着するまで開いている。これは好ましく
は螢光標識の崩壊寿命の２倍の時間例えばピレン
ブチレートに対しては約200ナノ秒であるべきで
ある。

あるいはまた、バツクグラウンド螢光信号が光
電検出器または増幅器を飽和させるに充分なだけ
強い場合には、光電検出器を通常「オフ」に保
ち、そして遅延回路３６の第１および第２の信号
により規定される時間でそれをオンそして再びオ
フにすることによつて、この光電検出系を開くこ
とができる。

スイツチとして働くゲート回路３９による信号
導入後、増幅器３８からの線形増幅された信号は
信号処理装置４８に送られる。これは多数のパル
スの結果を平均化させ、そしてこの増幅信号を既
知量の標的物質の発光を示性する情報と相関させ
る。それによつて信号処理装置４８の出力は標的
分子の量の指数となる。

第２ａ図においては、励起パルスのパルス振幅
は縦座標軸により示されており、そして時間は横
軸として示されている。パルスの持続（強度半減
点間の時間）は矢印により示されており、そして
３ナノ秒である。螢光寿命（持続ではない）が本
明細書中で論じられている場合には、その寿命と
は螢光強度がその初期の値１／ｅ（ｅは自然対数
の底である）まで崩壊する時間として定義され
る。

第２ｂ図は、第２ａ図と同一のゼロ出発時間を
使用した励起パルスに対する周囲螢光を示してい
る。周囲螢光の強度は縦座標として示されてお
り、そして時間はプロツトで横軸として示されて
いる。周囲螢光すなわち空気中の粒子、試薬、ホ
ルダー物質の試料中の他の螢光物質その他を包含
するすべての源からのものを合併したものの寿命
は約10ナノ秒であり、そしてこれは０に向かつて
崩壊する。

第２ｃ図においては、典型的螢光標識物質の強
度が縦座標としてプロツトされており、そして時
間は横軸として示されている。寿命は、第２ｃ図
中の矢印により示されている様に100ナノ秒であ
る。第２ｃ図は、第２ａおよび２ｂ図と共通のゼ
ロ時間を共有しており、そしてその時間ゲート回
路は第２ｃ図中の左側の破線の左側に示されてい
るように「オフ」に保たれている。その時間が経
過した後、ゲートを開路すなわちオンにし、そし
てそのゲートは螢光標識の寿命の２倍すなわちピ
レンブチレートに対しては約200ナノ秒の間オン
に保たれる。すなわち、第１図のゲート回路３９
がオンに保たれている全時間は、第２ｃ図におい
ては二つの破線の間の時間、または時間ゼロ後の
50ナノ秒から200ナノ秒の間の時間である。次い
でこの過程が繰り返される。

多くのサイクルの後、螢光はエレクトロニクス
手段により平均化され、相当抗原濃度に変換され
そして表示される。

新規なFAB群の他の一つの適用においては、
バツクグラウンド螢光が実質的に崩壊した後にの
み、ただしFABがまだ活性状態で崩壊している
間に、画像変換管をオンにすることによつて、抗
原の空間的分布の検出が増強されることができ
る。

新規なFAB群は医学診断的使用に関して記載
されているけれども、少量の分子の検出が必要と
される他の応用が可能である。

【図面の簡単な説明】

添付図面中、第１図は本発明に使用する装置の
平面図であり、第２ａ図はレーザー励起パルスの
強度を時間に対してプロツトしたものであり、第
２ｂ図は周囲物質の螢光発光の強度を時間に対し
てプロツトしたものであり、そして第２ｃ図は本
発明の方法による標識した標的分子の発光の強度
を時間に対してプロツトしたものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 抗原に特異的な抗体と、該抗体と結合した螢
   光希土類キレートとよりなり、該螢光希土類キレ
   ートは１個の希土類イオンに対し複数のキレート
   リガンドが配位しており、該螢光希土類キレート
   はシヤープな螢光放出を有しかつ競合する未標識
   の周囲物質の最長螢光崩壊寿命に比較して長い螢
   光崩壊寿命を有することを特徴とする螢光抗体。 ２ 希土類イオンがEu（）である第１項の螢
   光抗体。 ３ 希土類イオンがTb（）である第１項の螢
   光抗体。 ４ 複数のキレートリガンドがテノイルトリフル
   オロアセトネートおよび前記抗体と結合のため化
   学的に修飾したテノイルトリフルオロアセトネー
   トである第２項の螢光抗体。 ５ 複数のキレートリガンドがヘキサフルオロア
   セチルアセトネートおよび前記抗体と結合のため
   化学的に修飾したヘキサフルオロアセチルアセト
   ネートである第２項の螢光抗体。 ６ 複数のキレートリガンドがベンゾイルトリフ
   ルオロアセトネートおよび前記抗体と結合のため
   化学的に修飾したベンゾイルトリフルオロアセト
   ネートである第２項の螢光抗体。 ７ 複数のキレートリガンドがアセチルアセトネ
   ートおよび前記抗体と結合のため化学的に修飾し
   たアセチルアセトネートである第２項の螢光抗
   体。 ８ 標的物質を螢光抗体で標識することと、 標識した標的物質を前記螢光抗体の螢光崩壊寿
   命に比較して短い持続時間を有する放射のパルス
   で励起することと、 周囲の物質の螢光は実質上崩壊したがしかし前
   記螢光抗体の螢光は未だ活動的に崩壊しつつある
   間に螢光検出システムのゲートをオンにすること
   よりなる標的物質の螢光検出方法において、前記
   螢光抗体として、 前記標的物質に対し特異的な抗体と、該抗体と
   結合した螢光希土類キレートとよりなり、該螢光
   希土類キレートは１個の希土類イオンに対し複数
   のキレートリガンドが配位しており、該螢光希土
   類キレートはシヤーブな螢光放出を有しかつ競合
   する未標識の周囲物質の最長螢光崩壊寿命に比較
   して長い螢光崩壊寿命を有している前記螢光抗体
   を使用することを特徴とする螢光検出方法。 ９ 希土類イオンがEu（）である第８項方
   法。 １０ 希土類イオンがTb（）である第８項方
   法。 １１ 複数のキレートリガンドがテノイルトリフ
   ルオロアセトネートおよび前記抗体と結合のため
   化学的に修飾したテノイルトリフルオロアセトネ
   ートである第９項の方法。 １２ 複数のキレートリガンドがヘキサフルオロ
   アセチルアセトネートおよび前記抗体と結合のた
   め化学的に修飾したヘキサフルオロアセチルアセ
   トネートである第９項の方法。 １３ 複数のキレートリガンドがベンゾイルトリ
   フルオロアセトネートおよび前記抗体と結合のた
   め化学的に修飾したベンゾイルトリフルオロアセ
   トネートである第９項の方法。 １４ 複数のキレートリガンドがアセチルアセト
   ネートおよび前記抗体と結合のため化学的に修飾
   したアセチルアセトネートである第９項の方法。