JPH06148076A - 核酸の塩基配列決定方法、単一分子検出方法、その装置及び試料の作成方法 - Google Patents
核酸の塩基配列決定方法、単一分子検出方法、その装置及び試料の作成方法Info
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- JPH06148076A JPH06148076A JP4300134A JP30013492A JPH06148076A JP H06148076 A JPH06148076 A JP H06148076A JP 4300134 A JP4300134 A JP 4300134A JP 30013492 A JP30013492 A JP 30013492A JP H06148076 A JPH06148076 A JP H06148076A
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- G01N21/6402—Atomic fluorescence; Laser induced fluorescence
Abstract
(57)【要約】
【目的】 単一分子の検出を可能にする。
【構成】 蛍光性の分子を有する試料が付着した基板の
局所領域に励起光を照射する光源と、前記局所領域内の
前記蛍光性の分子からの蛍光強度を検出し、前記蛍光強
度の頻度を測定する蛍光検出手段とを有し、前記蛍光検
出手段は、前記励起光の前記基板への光路及び前記励起
光の前記基板からの反射光路以外の位置に配置される。
局所領域に励起光を照射する光源と、前記局所領域内の
前記蛍光性の分子からの蛍光強度を検出し、前記蛍光強
度の頻度を測定する蛍光検出手段とを有し、前記蛍光検
出手段は、前記励起光の前記基板への光路及び前記励起
光の前記基板からの反射光路以外の位置に配置される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は塩基の光学的識別装置に
関するもので、特に遺伝子を構成する塩基（ヌクレオチ
ド）の蛍光あるいは発光検出による識別に用いられる。
関するもので、特に遺伝子を構成する塩基（ヌクレオチ
ド）の蛍光あるいは発光検出による識別に用いられる。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子の組成物質であるＤＮＡ（デオキ
シリボ核酸、塩基を主成分とし、これに糖、リン酸が付
いている）は２重らせん状糸になっており、このらせん
状糸に遺伝情報が入っている。その遺伝情報はＤＮＡに
１つずつ暗号（塩基配列）のような形で入っており、生
物の細胞核の中に遺伝子がひも状に連なって群集してい
る。微生物のような下等生物であれば数千塩基対程度で
すむが、遺伝情報の多い高等生物には数億ないし２９億
の塩基対も存在する。
シリボ核酸、塩基を主成分とし、これに糖、リン酸が付
いている）は２重らせん状糸になっており、このらせん
状糸に遺伝情報が入っている。その遺伝情報はＤＮＡに
１つずつ暗号（塩基配列）のような形で入っており、生
物の細胞核の中に遺伝子がひも状に連なって群集してい
る。微生物のような下等生物であれば数千塩基対程度で
すむが、遺伝情報の多い高等生物には数億ないし２９億
の塩基対も存在する。
【０００３】遺伝子の主体であるＤＮＡの遺伝情報は、
核酸を構成するアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シト
シン（Ｃ）、チミン（Ｔ）の４種類の塩基（ヌクレオチ
ド）の配列いかんにより決まっている。したがって、こ
の配列を知ることが、今後の遺伝子工学、医学等を発展
させる上で、極めて重要になっている。
核酸を構成するアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シト
シン（Ｃ）、チミン（Ｔ）の４種類の塩基（ヌクレオチ
ド）の配列いかんにより決まっている。したがって、こ
の配列を知ることが、今後の遺伝子工学、医学等を発展
させる上で、極めて重要になっている。
【０００４】ところで、上記の塩基は、それぞれ個性的
な蛍光を生成することが知られており、特に低温（＜１
００Ｋ）で蛍光収率が大きくなる。これによって塩基を
分別することが原理的には可能である。蛍光を生成する
ためには、励起光を照射することが必要であり、この蛍
光の検出には光電子増倍管（ホトマル）のような高感度
の検出器を用いるとよい。単一蛍光分子を検出する装置
として、例えば文献「Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86 (198
9) 4087-91」のものが知られている。ここでは、図２０
に示すように微粒子を供給するフローセル６１に対し
て、流れの方向と直交する方向に光源からの励起光（レ
ーザビーム）が照射され、励起光の照射方向と流れ方向
の双方に直交する方向で、蛍光をホトマル６３により検
出している。
な蛍光を生成することが知られており、特に低温（＜１
００Ｋ）で蛍光収率が大きくなる。これによって塩基を
分別することが原理的には可能である。蛍光を生成する
ためには、励起光を照射することが必要であり、この蛍
光の検出には光電子増倍管（ホトマル）のような高感度
の検出器を用いるとよい。単一蛍光分子を検出する装置
として、例えば文献「Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86 (198
9) 4087-91」のものが知られている。ここでは、図２０
に示すように微粒子を供給するフローセル６１に対し
て、流れの方向と直交する方向に光源からの励起光（レ
ーザビーム）が照射され、励起光の照射方向と流れ方向
の双方に直交する方向で、蛍光をホトマル６３により検
出している。
【０００５】また、単一フラグメントの各塩基を固定可
能な蛍光染料で修飾する方法がある（特開平３−１００
９４５，United State patent 4,962,037 ）。この方法
では、同様の構成で、各塩基をそれぞれ特徴的な蛍光色
素でラベルした後、エキソヌクレアーゼＩＩＩによって
各塩基を切断して、蛍光スペクトルのちがいを利用する
ことより、塩基配列を決定している。
能な蛍光染料で修飾する方法がある（特開平３−１００
９４５，United State patent 4,962,037 ）。この方法
では、同様の構成で、各塩基をそれぞれ特徴的な蛍光色
素でラベルした後、エキソヌクレアーゼＩＩＩによって
各塩基を切断して、蛍光スペクトルのちがいを利用する
ことより、塩基配列を決定している。
【０００６】もうひとつの単一分子検出として有機単分
子（パラタ−フェニル）中の不純物法後続元素（ペンタ
セン）の超高分解能スペクトル分光によるアプローチが
ある（J.Chem.Phys.95(10),15 Nov.1991 7150-7163）。
この方法は、塩基の検出に適さないが、ペンタセンの蛍
光励起スペクトルを極低温下（４Ｋ）で測定し、不均一
広がりに埋もれた均一広がりのスペクトルを測定してそ
れを単一分子の蛍光スペクトルとしているものである。
子（パラタ−フェニル）中の不純物法後続元素（ペンタ
セン）の超高分解能スペクトル分光によるアプローチが
ある（J.Chem.Phys.95(10),15 Nov.1991 7150-7163）。
この方法は、塩基の検出に適さないが、ペンタセンの蛍
光励起スペクトルを極低温下（４Ｋ）で測定し、不均一
広がりに埋もれた均一広がりのスペクトルを測定してそ
れを単一分子の蛍光スペクトルとしているものである。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】フローにする利点は、
色素の劣化が抑えうることと色素循環系にフィルタを付
けることによってごみを取り除くことができる点にあ
る。しかし、励起光が照射されている領域を分子が通過
する時間（μｓｅｃ程度）だけしか蛍光の観察ができな
い。そのため、上記の従来装置では、遺伝子の有する塩
基からの蛍光を、正確かつ効率よく検出できない。１個
のＤＮＡの有する塩基はＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔの４種類のみで
あって、しかも極めて多数である反面、そのサイズは極
めて微小で、生成される蛍光も極めて微弱だからであ
る。励起光のビームを塩基が通過するほんの一瞬の蛍光
検出では、その種類が分別できないのである。
色素の劣化が抑えうることと色素循環系にフィルタを付
けることによってごみを取り除くことができる点にあ
る。しかし、励起光が照射されている領域を分子が通過
する時間（μｓｅｃ程度）だけしか蛍光の観察ができな
い。そのため、上記の従来装置では、遺伝子の有する塩
基からの蛍光を、正確かつ効率よく検出できない。１個
のＤＮＡの有する塩基はＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔの４種類のみで
あって、しかも極めて多数である反面、そのサイズは極
めて微小で、生成される蛍光も極めて微弱だからであ
る。励起光のビームを塩基が通過するほんの一瞬の蛍光
検出では、その種類が分別できないのである。
【０００８】もっとも、塩基の流れに対して、流れ方向
の広い範囲で励起光を照射すれば、蛍光の生成可能時間
を長くし、効率を高めることもできる。しかし、このよ
うにした場合には、次々と供給されてくる塩基を同時に
検出することになり、得られたデータの処理が難しくな
る。
の広い範囲で励起光を照射すれば、蛍光の生成可能時間
を長くし、効率を高めることもできる。しかし、このよ
うにした場合には、次々と供給されてくる塩基を同時に
検出することになり、得られたデータの処理が難しくな
る。
【０００９】そこで本発明は、核酸の単一フラグメント
を構成している塩基（Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ）の配列決定を最
終的な目標とする方法であって、遺伝子の有する塩基の
種類を正確かつ迅速に識別できる方法を提供することを
目的とする。また、この方法を実現するにあたって蛍光
検出あるいは発光検出にり、単一分子を検出するための
光学的識別装置を提供することを目的とする。
を構成している塩基（Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ）の配列決定を最
終的な目標とする方法であって、遺伝子の有する塩基の
種類を正確かつ迅速に識別できる方法を提供することを
目的とする。また、この方法を実現するにあたって蛍光
検出あるいは発光検出にり、単一分子を検出するための
光学的識別装置を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明の単一分子検出方
法は、蛍光性の分子の溶液を微小な液滴状態にして鏡面
度の高い基板の表面に付着させた後、自然乾燥をし、基
板の局所領域に励起光を照射して蛍光性の分子からの蛍
光強度を測定し、量子化された蛍光強度の出現頻度から
局所領域の中の蛍光性の分子が単一の分子の状態である
ことを検出する。
法は、蛍光性の分子の溶液を微小な液滴状態にして鏡面
度の高い基板の表面に付着させた後、自然乾燥をし、基
板の局所領域に励起光を照射して蛍光性の分子からの蛍
光強度を測定し、量子化された蛍光強度の出現頻度から
局所領域の中の蛍光性の分子が単一の分子の状態である
ことを検出する。
【００１１】蛍光性の分子は、蛋白に蛍光分子が結合し
たものであることを特徴としても良い。蛍光分子そのも
のでもよい。
たものであることを特徴としても良い。蛍光分子そのも
のでもよい。
【００１２】蛍光性の分子は、複数の蛍光分子を含むこ
とが可能であり、クロマトグラフィで特定数の蛍光分子
を結合したものを分離精製して溶液を調製することを特
徴としても良い。
とが可能であり、クロマトグラフィで特定数の蛍光分子
を結合したものを分離精製して溶液を調製することを特
徴としても良い。
【００１３】蛍光性の分子の溶液は、微小な液滴状態で
蛍光性の分子を平均１個程度になる濃度であることを特
徴としても良い。
蛍光性の分子を平均１個程度になる濃度であることを特
徴としても良い。
【００１４】蛍光性の分子の溶液を高純度の溶媒で希釈
することを特徴としても良い。
することを特徴としても良い。
【００１５】超音波にて蛍光性の分子を微小な液滴状態
にすることを特徴としても良い。
にすることを特徴としても良い。
【００１６】蛍光性の分子を霧状に気体に分散させて前
記基板に付着することを特徴としても良い。
記基板に付着することを特徴としても良い。
【００１７】基板は、シリコンウェハであることを特徴
としても良い。
としても良い。
【００１８】自然乾燥は室温若しくは室温以下で行うこ
とを特徴としても良い。
とを特徴としても良い。
【００１９】励起光は、レーザ光であることを特徴とし
ても良い。
ても良い。
【００２０】蛍光強度を測定する検出器を励起光の前記
基板への光路及び励起光の基板からの反射光路以外に配
置して蛍光強度を測定することを特徴としても良い。
基板への光路及び励起光の基板からの反射光路以外に配
置して蛍光強度を測定することを特徴としても良い。
【００２１】蛍光強度は、２次元のフォトカウンティン
グシステムによって検出し、画面上における蛍光強度の
頻度から、その画面において蛍光性の分子が単一の分子
の状態であることを検出することを特徴としても良い。
グシステムによって検出し、画面上における蛍光強度の
頻度から、その画面において蛍光性の分子が単一の分子
の状態であることを検出することを特徴としても良い。
【００２２】また、本発明の単一分子検出用試料の作成
方法蛍光性の分子を超音波にて霧状に気体に分散させて
鏡面度の高い基板に付着した後自然乾燥をすることを特
徴とする。本発明の単一分子検出用試料は、シリコンウ
ェハの表面上に蛍光性の分子を付着させたものである。
方法蛍光性の分子を超音波にて霧状に気体に分散させて
鏡面度の高い基板に付着した後自然乾燥をすることを特
徴とする。本発明の単一分子検出用試料は、シリコンウ
ェハの表面上に蛍光性の分子を付着させたものである。
【００２３】そして、本発明の単一分子検出装置は、蛍
光性の分子を有する試料が付着した基板の局所領域に励
起光を照射する光源と、局所領域内の蛍光性の分子から
の蛍光強度を検出し、前記蛍光強度の頻度を測定する蛍
光検出手段とを有し、蛍光検出手段は、励起光の基板へ
の光路及び励起光の基板からの反射光路以外の位置に配
置される。
光性の分子を有する試料が付着した基板の局所領域に励
起光を照射する光源と、局所領域内の蛍光性の分子から
の蛍光強度を検出し、前記蛍光強度の頻度を測定する蛍
光検出手段とを有し、蛍光検出手段は、励起光の基板へ
の光路及び励起光の基板からの反射光路以外の位置に配
置される。
【００２４】蛍光検出手段は、光学顕微鏡及び２次元の
光検出器を含むフォトカウンティングシステムで構成さ
れていることを特徴としても良い。
光検出器を含むフォトカウンティングシステムで構成さ
れていることを特徴としても良い。
【００２５】光学顕微鏡は、その倍率をかえることが可
能であることを特徴としても良い。
能であることを特徴としても良い。
【００２６】基板は、清澄な雰囲気に配置されることを
特徴としても良い。
特徴としても良い。
【００２７】光源は、レーザであることを特徴としても
良い。
良い。
【００２８】基板上の局所領域を相対的に移動させる手
段をさらに備えることを特徴としても良い。
段をさらに備えることを特徴としても良い。
【００２９】また、核酸の塩基配列決定方法は、核酸の
塩基を含む蛍光性分子の溶液を微小な液滴状態にして順
次鏡面度の高い基板の表面に付着させた後、自然乾燥を
し、基板の局所領域に励起光を照射して前記蛍光性分子
からの蛍光強度を測定し、量子化された蛍光強度の出現
頻度から局所領域の中の前記蛍光性分子が単一の分子の
状態であることを検出し、蛍光性分子にパルス状に励起
光を照射して蛍光性分子からの蛍光の波長分布及び寿命
から蛍光性分子に含まれる核酸の塩基を特定し、基板上
の局所領域を移動させて順次核酸の塩基配列を決定す
る。
塩基を含む蛍光性分子の溶液を微小な液滴状態にして順
次鏡面度の高い基板の表面に付着させた後、自然乾燥を
し、基板の局所領域に励起光を照射して前記蛍光性分子
からの蛍光強度を測定し、量子化された蛍光強度の出現
頻度から局所領域の中の前記蛍光性分子が単一の分子の
状態であることを検出し、蛍光性分子にパルス状に励起
光を照射して蛍光性分子からの蛍光の波長分布及び寿命
から蛍光性分子に含まれる核酸の塩基を特定し、基板上
の局所領域を移動させて順次核酸の塩基配列を決定す
る。
【００３０】基板をシリコンウェハとし、その周に沿っ
て蛍光性分子を付着することを特徴としても良い。
て蛍光性分子を付着することを特徴としても良い。
【００３１】蛍光性分子の溶液を超音波にて蛍光性の分
子を平均１個程度含む微小な液滴状態にして基板に蛍光
性分子を付着することを特徴としても良い。
子を平均１個程度含む微小な液滴状態にして基板に蛍光
性分子を付着することを特徴としても良い。
【００３２】蛍光強度、蛍光の波長及び寿命を測定する
検出器を励起光の基板への光路及び励起光の基板からの
反射光路以外に配置して蛍光強度、蛍光の波長分布及び
寿命を測定することを特徴としても良い。
検出器を励起光の基板への光路及び励起光の基板からの
反射光路以外に配置して蛍光強度、蛍光の波長分布及び
寿命を測定することを特徴としても良い。
【００３３】蛍光性分子は、塩基にモノクロナル抗体が
付着したものであることを特徴としても良い。
付着したものであることを特徴としても良い。
【００３４】蛍光性分子は、抗体の連鎖反応による分子
増倍過程にて形成されたものとしても良い。
増倍過程にて形成されたものとしても良い。
【００３５】本発明の核酸の塩基配列測定装置は、核酸
の塩基を含む蛍光性分子の溶液を付着した基板の局所領
域に励起光を照射する光源と、局所領域内の蛍光性分子
からの蛍光強度を検出し、蛍光強度の頻度から局所領域
の中の蛍光性分子が単一の分子の状態であることを検出
する第１の手段と、蛍光性分子にパルス状に励起光を照
射して蛍光性分子からの蛍光の波長及び寿命を検出する
第２の手段と、基板上の局所領域を移動させる第３の手
段とを有し、第１及び第２の手段は、励起光の基板への
光路及び励起光の基板からの反射光路以外の位置に配置
される。
の塩基を含む蛍光性分子の溶液を付着した基板の局所領
域に励起光を照射する光源と、局所領域内の蛍光性分子
からの蛍光強度を検出し、蛍光強度の頻度から局所領域
の中の蛍光性分子が単一の分子の状態であることを検出
する第１の手段と、蛍光性分子にパルス状に励起光を照
射して蛍光性分子からの蛍光の波長及び寿命を検出する
第２の手段と、基板上の局所領域を移動させる第３の手
段とを有し、第１及び第２の手段は、励起光の基板への
光路及び励起光の基板からの反射光路以外の位置に配置
される。
【００３６】第１及び第２の手段は、蛍光性分子からの
蛍光を集光する光学顕微鏡を共用し、この光学顕微鏡を
経た蛍光から検出するとしても良い。
蛍光を集光する光学顕微鏡を共用し、この光学顕微鏡を
経た蛍光から検出するとしても良い。
【００３７】蛍光性分子からの蛍光を集光しかつ反射す
る手段を基板と第２の手段との間にさらに有するとして
も良い。
る手段を基板と第２の手段との間にさらに有するとして
も良い。
【００３８】
【作用】本発明の単一分子検出方法及び装置では、背景
光が十分に抑えられ、蛍光が蛍光分子の個数を反映した
量子化された状態で観測され得る。ここで、溶液を微小
な液滴状態で付着することで、付着した部分での分子数
を１個程度にすることが可能であり、基板上に分子を散
在させることができる。また、自然乾燥することで、蛍
光性の分子の状態を良好に保ち得る。そして、基板の局
所領域への励起光の照射により、十分強い励起光を蛍光
性の分子に与えることができ、基板が表面度が高いこと
及び検出器の配置から検出器への背景光が非常に小さな
ものになる。
光が十分に抑えられ、蛍光が蛍光分子の個数を反映した
量子化された状態で観測され得る。ここで、溶液を微小
な液滴状態で付着することで、付着した部分での分子数
を１個程度にすることが可能であり、基板上に分子を散
在させることができる。また、自然乾燥することで、蛍
光性の分子の状態を良好に保ち得る。そして、基板の局
所領域への励起光の照射により、十分強い励起光を蛍光
性の分子に与えることができ、基板が表面度が高いこと
及び検出器の配置から検出器への背景光が非常に小さな
ものになる。
【００３９】本発明の核酸の塩基配列決定方法及び装置
では、基板上の塩基を含む蛍光性分子が単一の分子状態
であることを確認してから、蛍光の波長及び寿命を測定
する。そして塩基の種類を特定する。ここでも、同様
に、基板上の分子数の制御、分子の散在、蛍光性の分子
の状態、励起、背景光の抑制などについての利点があ
る。基板上の局所領域を移動させることで、順次基板上
の蛍光性分子について測定を行って塩基配列が決定され
る。
では、基板上の塩基を含む蛍光性分子が単一の分子状態
であることを確認してから、蛍光の波長及び寿命を測定
する。そして塩基の種類を特定する。ここでも、同様
に、基板上の分子数の制御、分子の散在、蛍光性の分子
の状態、励起、背景光の抑制などについての利点があ
る。基板上の局所領域を移動させることで、順次基板上
の蛍光性分子について測定を行って塩基配列が決定され
る。
【００４０】
【実施例】単一分子の位置の測定は、前述の従来技術で
ものべたように、いまだ未開拓で、現在研究が行われて
いる分野である。単一分子の位置の測定方法は本発明の
重要な部分であるので、まず、本願発明者の行った単一
分子の位置の測定方法及びそのための装置について説明
する。
ものべたように、いまだ未開拓で、現在研究が行われて
いる分野である。単一分子の位置の測定方法は本発明の
重要な部分であるので、まず、本願発明者の行った単一
分子の位置の測定方法及びそのための装置について説明
する。
【００４１】（単一分子の検出）図１は、本発明の単一
分子検出方法において使用する装置の構成例を示したも
のである。この装置は、試料の分子が表面に付着したシ
リコンウェハ（以下、基板とする）２０の表面に励起光
を照射する励起光源として励起光源３０と、励起光の照
射位置で塩基からの蛍光を検出する手段としてフォトン
カウンティングカメラシステム（カメラヘッド４０、顕
微鏡簡４１、対物レンズ４２、カメラコントローラ４
４、コンピュータ４５、モニタ４６、ＭＯディスクユニ
ット４７）とを備えている。基板２０は、クラス１００
０以下のクリーンブースに配置され、清澄な雰囲気にお
かれている。この装置は、核酸の塩基だけでなく、蛍光
を発するものであれば、蛋白を始めとして様々なものを
試料として用い得る。また、蛍光を発しないものであっ
ても、蛍光性物質と結合させて同様にして用い得る。
分子検出方法において使用する装置の構成例を示したも
のである。この装置は、試料の分子が表面に付着したシ
リコンウェハ（以下、基板とする）２０の表面に励起光
を照射する励起光源として励起光源３０と、励起光の照
射位置で塩基からの蛍光を検出する手段としてフォトン
カウンティングカメラシステム（カメラヘッド４０、顕
微鏡簡４１、対物レンズ４２、カメラコントローラ４
４、コンピュータ４５、モニタ４６、ＭＯディスクユニ
ット４７）とを備えている。基板２０は、クラス１００
０以下のクリーンブースに配置され、清澄な雰囲気にお
かれている。この装置は、核酸の塩基だけでなく、蛍光
を発するものであれば、蛋白を始めとして様々なものを
試料として用い得る。また、蛍光を発しないものであっ
ても、蛍光性物質と結合させて同様にして用い得る。
【００４２】励起光源３０は、位置が検出できれば良い
ので、励起光を基板２０の塩基の付着位置に連続的に強
い光、例えば、コヒーレントなレーザ光を照射するもの
が望ましい。そのため、ここでは、波長４８８ｎｍのア
ルゴンガスレーザ（Spetra-physics 2030 ）を較正済み
のパワーメータ（Spetra-physics 385）で７〜２０ｍＷ
の平均パワーに調節して使用する。そして、３０ないし
５０ｃｍの焦点距離のレンズで集光して照射している。
励起光源３０と基板２０の距離はレンズの焦点距離より
も小さくし、基板２０上に励起光が均一に照射されるよ
うにしている。また、励起光源３０は、励起光が図１１
のように斜め方向から入射するように配置されており、
基板２０での反射光ビームが斜め方向に反射するように
なっている。
ので、励起光を基板２０の塩基の付着位置に連続的に強
い光、例えば、コヒーレントなレーザ光を照射するもの
が望ましい。そのため、ここでは、波長４８８ｎｍのア
ルゴンガスレーザ（Spetra-physics 2030 ）を較正済み
のパワーメータ（Spetra-physics 385）で７〜２０ｍＷ
の平均パワーに調節して使用する。そして、３０ないし
５０ｃｍの焦点距離のレンズで集光して照射している。
励起光源３０と基板２０の距離はレンズの焦点距離より
も小さくし、基板２０上に励起光が均一に照射されるよ
うにしている。また、励起光源３０は、励起光が図１１
のように斜め方向から入射するように配置されており、
基板２０での反射光ビームが斜め方向に反射するように
なっている。
【００４３】フォトンカウンティングカメラシステム
は、基板２０の試料の位置を検出するもので、微弱な光
を検出できるものを用いる。ここでは、光学顕微鏡４
１，４２を装着した浜松ホトニクスのイメージング・画
像解析システム（ARGUS 50 VIM 3）で構成し、２次元的
に光子を計数して２次元的に微弱な光検出が可能になっ
ている。光学顕微鏡４１，４２は、基板２０の試料から
の蛍光を集めるためのもので、ここでは、４０倍（0.55
NA）或いは１００倍（0.75NA）の対物レンズ（NIKON ）
を有するもの用いて構成している。カメラヘッド４０に
は、５１２×５１２画素で高感度のもの（ VIM 3）が用
いられ、４０倍の対物レンズでの１画素の幅０．３μｍ
としている。基板２０からの蛍光がカメラヘッド４０で
画像信号に変換され、カメラコントローラ４４，パーソ
ナルコンピュータ４５，ＭＯディスクユニット４７，モ
ニタ４６で信号の蓄積（蛍光のフォトンカウンティン
グ），画像処理，記録の保存，画像の表示がなされる。
は、基板２０の試料の位置を検出するもので、微弱な光
を検出できるものを用いる。ここでは、光学顕微鏡４
１，４２を装着した浜松ホトニクスのイメージング・画
像解析システム（ARGUS 50 VIM 3）で構成し、２次元的
に光子を計数して２次元的に微弱な光検出が可能になっ
ている。光学顕微鏡４１，４２は、基板２０の試料から
の蛍光を集めるためのもので、ここでは、４０倍（0.55
NA）或いは１００倍（0.75NA）の対物レンズ（NIKON ）
を有するもの用いて構成している。カメラヘッド４０に
は、５１２×５１２画素で高感度のもの（ VIM 3）が用
いられ、４０倍の対物レンズでの１画素の幅０．３μｍ
としている。基板２０からの蛍光がカメラヘッド４０で
画像信号に変換され、カメラコントローラ４４，パーソ
ナルコンピュータ４５，ＭＯディスクユニット４７，モ
ニタ４６で信号の蓄積（蛍光のフォトンカウンティン
グ），画像処理，記録の保存，画像の表示がなされる。
【００４４】また、基板２０は、図示せぬ駆動装置によ
り位置及び回転が制御され、光学顕微鏡２０，カメラヘ
ッド４０の視野に入る基板２０上の位置が制御されるよ
うになっている（図１１）。
り位置及び回転が制御され、光学顕微鏡２０，カメラヘ
ッド４０の視野に入る基板２０上の位置が制御されるよ
うになっている（図１１）。
【００４５】なお、カメラヘッド４０の受光面と光学顕
微鏡２０との間４１には、試料特有の蛍光以外の光を遮
断するための波長選択手段を設け、励起光の散乱光の入
射がないようにすることも可能である。この場合、波長
選択手段４１は、波長選択フィルタ及びダイクロイック
ミラーで構成される。これとレーザビームの傾斜によっ
て、背景光となるっレーザ光及び基板２０表面での散乱
光の入射が抑えられる。
微鏡２０との間４１には、試料特有の蛍光以外の光を遮
断するための波長選択手段を設け、励起光の散乱光の入
射がないようにすることも可能である。この場合、波長
選択手段４１は、波長選択フィルタ及びダイクロイック
ミラーで構成される。これとレーザビームの傾斜によっ
て、背景光となるっレーザ光及び基板２０表面での散乱
光の入射が抑えられる。
【００４６】つぎに、この装置を用いた単一分子検出方
法を手順を追って説明する。
法を手順を追って説明する。
【００４７】まず、試料を所定の溶媒に溶解・希釈す
る。溶液を基板２０に試料溶液を霧状にして液滴２２を
付着し（図２）、清澄な雰囲気で自然乾燥して試料が付
着した基板２０を作成する。溶媒は高純度のものを使用
し、顕微鏡４１，４２の解像度程度の領域内に入る分子
が１個となるように希釈する（この点に付いては後
述）。自然乾燥によって、前述のものと比較して背景光
の原因の一つとなる溶媒のラマン散乱が溶液系に比べて
低減し、色素分子の劣化の原因となる溶媒と試料分子と
の反応が大幅に回避される。また、加熱や真空乾燥して
乾燥させれば、試料分子がなくなってしまう可能性が高
い。基板２０にシリコンウェハを使用するとそのダング
リングボンドにより試料分子が固定され、試料が解離し
にくいものになる。そのため、この基板は繰り返して使
用できる。
る。溶液を基板２０に試料溶液を霧状にして液滴２２を
付着し（図２）、清澄な雰囲気で自然乾燥して試料が付
着した基板２０を作成する。溶媒は高純度のものを使用
し、顕微鏡４１，４２の解像度程度の領域内に入る分子
が１個となるように希釈する（この点に付いては後
述）。自然乾燥によって、前述のものと比較して背景光
の原因の一つとなる溶媒のラマン散乱が溶液系に比べて
低減し、色素分子の劣化の原因となる溶媒と試料分子と
の反応が大幅に回避される。また、加熱や真空乾燥して
乾燥させれば、試料分子がなくなってしまう可能性が高
い。基板２０にシリコンウェハを使用するとそのダング
リングボンドにより試料分子が固定され、試料が解離し
にくいものになる。そのため、この基板は繰り返して使
用できる。
【００４８】図１の装置に基板２０をセットし、レーザ
光を照射しながら基板２０上の発光する領域を測定す
る。ここで、レーザ光は、斜め方向に入射・反射するの
で、顕微鏡２０の視野に入らず、背景光が非常に小さく
なっている。特に、基板２０がシリコンウェハのように
鏡面度が高いので、散乱光が小さくなり、さらに、基板
２０表面上には溶媒分子が存在しないので、ラマン散乱
が少なく、１分子からの蛍光を捕らえ得る程度に背景光
が小さくなっている。そして、フォトンカウンティング
カメラシステムでは、画面ごとに蛍光強度とその強度の
蛍光が現れる頻度が測定可能になっており、これらから
どこの位置に単一分子が存在するかが検出される。
光を照射しながら基板２０上の発光する領域を測定す
る。ここで、レーザ光は、斜め方向に入射・反射するの
で、顕微鏡２０の視野に入らず、背景光が非常に小さく
なっている。特に、基板２０がシリコンウェハのように
鏡面度が高いので、散乱光が小さくなり、さらに、基板
２０表面上には溶媒分子が存在しないので、ラマン散乱
が少なく、１分子からの蛍光を捕らえ得る程度に背景光
が小さくなっている。そして、フォトンカウンティング
カメラシステムでは、画面ごとに蛍光強度とその強度の
蛍光が現れる頻度が測定可能になっており、これらから
どこの位置に単一分子が存在するかが検出される。
【００４９】この単一分子の検出について実際の測定結
果をもとに詳述する。
果をもとに詳述する。
【００５０】基板２０において、レーザ光（ＴＥＭ00mo
de）の不均一性などに基づく光検出効率の位置依存性が
生じる場合があるので、それを予め測定しておく。基板
２０をおく位置にすりガラスをおいて、４８８ｎｍにお
けるレーザ光の散乱を観察する。５１２×５１２画素の
うち有効な部分にしるしをつけておく。有効な部分の明
暗の差は多くとも１０％程度である。
de）の不均一性などに基づく光検出効率の位置依存性が
生じる場合があるので、それを予め測定しておく。基板
２０をおく位置にすりガラスをおいて、４８８ｎｍにお
けるレーザ光の散乱を観察する。５１２×５１２画素の
うち有効な部分にしるしをつけておく。有効な部分の明
暗の差は多くとも１０％程度である。
【００５１】ここでは、単一分子の検出対象としての蛍
光物質には、蛍光性のｄ−ビオチン（d-Biotin，ＦＬ
Ｂ）とダイソジウムフルオレセイン（disodium fluores
cein，ＤＦＬ）を用いた。ＦＬＢ及びＤＦＬは水溶液中
で４９３ｎｍの吸収ピークと（ε＝85,000cm-1Ｍ-1 at
pH=8.4）、４９３ｎｍの発光ピーク（Φ〜0.9 at pH=8.
4 ）を持つ（Hitachi 557 ，Hitachi 850 での測定
値）。ストレプトアビジン（Streptavidin，ＳＡ）は４
量体蛋白（分子量４×１５，０００）であり、ＦＬＢに
対し高い親和性（解離定数ｋｄ＝１０-15 -1）を持つ。
ＦＬＢの一部（Ｂ）とＳＡは特異的な反応をし、ＦＬＢ
／Ｂを４分子結合し得る（アビジン−ビオチン複合体を
形成する）。この反応は、ＳＡと結合する染色分子の数
を制御するために利用し得る。ＦＬＢ／Ｂの混合比（モ
ル比）を制御することによってＳＡと結合するＦＬＢ分
子の数を１〜４にすることができる。これらを試料に用
いて単一分子の検出を行った。
光物質には、蛍光性のｄ−ビオチン（d-Biotin，ＦＬ
Ｂ）とダイソジウムフルオレセイン（disodium fluores
cein，ＤＦＬ）を用いた。ＦＬＢ及びＤＦＬは水溶液中
で４９３ｎｍの吸収ピークと（ε＝85,000cm-1Ｍ-1 at
pH=8.4）、４９３ｎｍの発光ピーク（Φ〜0.9 at pH=8.
4 ）を持つ（Hitachi 557 ，Hitachi 850 での測定
値）。ストレプトアビジン（Streptavidin，ＳＡ）は４
量体蛋白（分子量４×１５，０００）であり、ＦＬＢに
対し高い親和性（解離定数ｋｄ＝１０-15 -1）を持つ。
ＦＬＢの一部（Ｂ）とＳＡは特異的な反応をし、ＦＬＢ
／Ｂを４分子結合し得る（アビジン−ビオチン複合体を
形成する）。この反応は、ＳＡと結合する染色分子の数
を制御するために利用し得る。ＦＬＢ／Ｂの混合比（モ
ル比）を制御することによってＳＡと結合するＦＬＢ分
子の数を１〜４にすることができる。これらを試料に用
いて単一分子の検出を行った。
【００５２】まず、基板２０に試料溶液を霧状にして液
滴２２を付着し（図２）、自然乾燥して試料が付着した
基板２０を作成した。ここでは、超音波加湿器（Sharp
HV-A200 ) を用いて試料溶液を無数の微小の液滴２２状
態即ち霧状にし、自然乾燥は清澄な雰囲気で行った。自
然乾燥によって、前述のものと比較して背景光の原因の
一つとなる溶媒のラマン散乱が溶液系に比べて低減し、
色素分子の劣化の原因となる溶媒と試料分子との反応が
大幅に回避される。また、加熱や真空乾燥して乾燥させ
れば、試料分子がなくなってしまう可能性が高い。
滴２２を付着し（図２）、自然乾燥して試料が付着した
基板２０を作成した。ここでは、超音波加湿器（Sharp
HV-A200 ) を用いて試料溶液を無数の微小の液滴２２状
態即ち霧状にし、自然乾燥は清澄な雰囲気で行った。自
然乾燥によって、前述のものと比較して背景光の原因の
一つとなる溶媒のラマン散乱が溶液系に比べて低減し、
色素分子の劣化の原因となる溶媒と試料分子との反応が
大幅に回避される。また、加熱や真空乾燥して乾燥させ
れば、試料分子がなくなってしまう可能性が高い。
【００５３】上記の試料は、超純水（Mili−Ｑ water，
Milipore）を用いて薄める。ナノモル／ｌオーダの濃度
にすることができ、後述するように１個の液滴に含まれ
る色素の個数は概算できる。水溶液のウェハ（基板２
０）への噴霧、自然乾燥を幾つかの試料について繰り返
し、２９６Ｋで測定を行った。ウェハに噴霧する溶液を
つぎのようにして調製した。
Milipore）を用いて薄める。ナノモル／ｌオーダの濃度
にすることができ、後述するように１個の液滴に含まれ
る色素の個数は概算できる。水溶液のウェハ（基板２
０）への噴霧、自然乾燥を幾つかの試料について繰り返
し、２９６Ｋで測定を行った。ウェハに噴霧する溶液を
つぎのようにして調製した。
【００５４】ＳＡを燐酸塩１０ｍＭとＮａＣｌ０．１５
Ｍとの混合水溶液（ｐＨ７．５）にＳＡ（Vector Labor
atory ）を溶かし（２ｍｇ／ｍｌ）、同様の緩衝液（燐
酸塩，ＮａＣｌ）にＦＬＢとＢとを溶解させた。ここ
で、ＦＬＢとＢとのモル比を４：０，３：１，２：２，
１：３の４種類のものを調製した。ＦＬＢとＳＡが十分
に反応するためのモル比は２０：１とした。ＳＡ溶液１
００μｌに上記４種類のＦＬＢ／Ｂ溶液を混合した。そ
して上記緩衝液を加えて２００μｌに調製した。２７７
Ｋで４時間放置した後、十分に反応したＳＡと未反応若
しくは十分に反応していないものとを分離するために、
ＳＡ−ＦＬＢ／Ｂ混合溶液をゲルろ過カラムにかけた
（Superose 12,Pharmacia ，ビーズサイズ１０〜１１μ
ｍ、カラムサイズ１．２×３０ｃｍ，数１２）。展開液
（移動相）として１０ｍＭの炭酸アンモニウムまたは燐
酸塩（ＮａＣｌを含まないもの）の溶液を用いた。ＳＡ
／Ｂ化合物の寿命はおよそ２．９日なので、用意した試
料にて１両日中に測定を行った。
Ｍとの混合水溶液（ｐＨ７．５）にＳＡ（Vector Labor
atory ）を溶かし（２ｍｇ／ｍｌ）、同様の緩衝液（燐
酸塩，ＮａＣｌ）にＦＬＢとＢとを溶解させた。ここ
で、ＦＬＢとＢとのモル比を４：０，３：１，２：２，
１：３の４種類のものを調製した。ＦＬＢとＳＡが十分
に反応するためのモル比は２０：１とした。ＳＡ溶液１
００μｌに上記４種類のＦＬＢ／Ｂ溶液を混合した。そ
して上記緩衝液を加えて２００μｌに調製した。２７７
Ｋで４時間放置した後、十分に反応したＳＡと未反応若
しくは十分に反応していないものとを分離するために、
ＳＡ−ＦＬＢ／Ｂ混合溶液をゲルろ過カラムにかけた
（Superose 12,Pharmacia ，ビーズサイズ１０〜１１μ
ｍ、カラムサイズ１．２×３０ｃｍ，数１２）。展開液
（移動相）として１０ｍＭの炭酸アンモニウムまたは燐
酸塩（ＮａＣｌを含まないもの）の溶液を用いた。ＳＡ
／Ｂ化合物の寿命はおよそ２．９日なので、用意した試
料にて１両日中に測定を行った。
【００５５】ＤＦＬ（Exinton ）は、噴霧する液滴の大
きさを見積もるために用いる。２．３×１０-5ＭのＤＦ
Ｌ溶液をウェハ（基板２０）に霧状にして付着し、図１
の装置にセットした。そして、レーザ光を照射しながら
フォトンカウンティングカメラシステムで蛍光が生じる
領域の大きさ（ pixel2 ）を測定した。液滴の接触角度
を９０度と仮定して、その領域の大きさを半球状の液滴
２２ａの体積に変換した（図２）。ＤＦＬも単一分子検
出の試料に用いた。
きさを見積もるために用いる。２．３×１０-5ＭのＤＦ
Ｌ溶液をウェハ（基板２０）に霧状にして付着し、図１
の装置にセットした。そして、レーザ光を照射しながら
フォトンカウンティングカメラシステムで蛍光が生じる
領域の大きさ（ pixel2 ）を測定した。液滴の接触角度
を９０度と仮定して、その領域の大きさを半球状の液滴
２２ａの体積に変換した（図２）。ＤＦＬも単一分子検
出の試料に用いた。
【００５６】これらの試料を用いたのは生物学的応用と
光物理的な応用とを意図したからである。第１の試料
（ＳＡ，ＦＬＢ，Ｂ）については、ラベリングを施して
検出するイムノアッセイやＤＮＡ配列の測定への応用で
ある。第２の試料（ＤＦＬ）については光物理学的研究
への応用を念頭においたものである。
光物理的な応用とを意図したからである。第１の試料
（ＳＡ，ＦＬＢ，Ｂ）については、ラベリングを施して
検出するイムノアッセイやＤＮＡ配列の測定への応用で
ある。第２の試料（ＤＦＬ）については光物理学的研究
への応用を念頭においたものである。
【００５７】アビジン−ビオチン複合体形成の技術は、
ＳＡとＦＬＢ／Ｂの化学量論的な複雑な組成に基づく。
ＳＡ分子の４サイトに結合するＦＬＢの数は、４９３ｎ
ｍと２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ（４９３），Ａ（２
８０））の比を計算することで測定することができる。
４９３ｎｍにおける光吸収はＦＬＢのみによるものであ
り、２８０ｎｍにおける光吸収はＦＬＢ及びＢのみによ
るものである。Ｄ−ビオチン（D-biotin）は２００〜９
００ｎｍで光吸収はない。しかし、ベールの法則（Bee
r' law ）は、ＳＡの存在の下でＦＬＢでは満たされな
い（３〜１２μＭin １０ｍＭ tryethanolamine／ＨＣ
ｌ，ｐＨ＝８．４２）。
ＳＡとＦＬＢ／Ｂの化学量論的な複雑な組成に基づく。
ＳＡ分子の４サイトに結合するＦＬＢの数は、４９３ｎ
ｍと２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ（４９３），Ａ（２
８０））の比を計算することで測定することができる。
４９３ｎｍにおける光吸収はＦＬＢのみによるものであ
り、２８０ｎｍにおける光吸収はＦＬＢ及びＢのみによ
るものである。Ｄ−ビオチン（D-biotin）は２００〜９
００ｎｍで光吸収はない。しかし、ベールの法則（Bee
r' law ）は、ＳＡの存在の下でＦＬＢでは満たされな
い（３〜１２μＭin １０ｍＭ tryethanolamine／ＨＣ
ｌ，ｐＨ＝８．４２）。
【００５８】図３（ａ）は、ＳＡに混ぜたＦＬＢ／Ｂの
吸収スペクトルを示したものである。ＦＬＢ／ＢとＳＡ
の複合体においてこれらの比が丁度４：１の場合を示し
たもので、これらはまったくカラムクロマトグラフィー
を行なわないで測定されたものである。ベールの法則か
らはずれるのに加え４９３ｎｍの半値幅が図３（ｂ）に
示すようにＦＬＢの増加とともに増加している。一方、
図４（ａ），（ｂ）は、ＦＬＢのみの時にはベールの法
則に従い、図３（ａ），（ｂ）と同じ濃度の範囲では、
半値幅の拡大が起こらないことを示している。ＳＡと結
合するＦＬＢの数は、ＦＬＢの寄与を含んだＡ（４９
３）とＡ（２８０）の比を参照することで得られる。Ａ
（２８０）からＦＬＢの寄与を差し引くことは、ＳＡが
存在しないときのＦＬＢの吸収スペクトルはＳＡの存在
下のものと比較できないので、非現実的で非実際的であ
る。また、ＦＬＢ／Ｂの結合は、２８０ｎｍ近傍におい
てトリプトファン（tryptophan）のレッドシフト（低波
長側へのずれ）をもたらす。このことから、混合溶液に
おいてＦＬＢ／ＢがＳＡと完全に結合したと仮定して、
Ａ（４９３）とＡ（２８０）の比を図３から求めて、こ
れを用いてＦＬＢの数を見積ることができる。
吸収スペクトルを示したものである。ＦＬＢ／ＢとＳＡ
の複合体においてこれらの比が丁度４：１の場合を示し
たもので、これらはまったくカラムクロマトグラフィー
を行なわないで測定されたものである。ベールの法則か
らはずれるのに加え４９３ｎｍの半値幅が図３（ｂ）に
示すようにＦＬＢの増加とともに増加している。一方、
図４（ａ），（ｂ）は、ＦＬＢのみの時にはベールの法
則に従い、図３（ａ），（ｂ）と同じ濃度の範囲では、
半値幅の拡大が起こらないことを示している。ＳＡと結
合するＦＬＢの数は、ＦＬＢの寄与を含んだＡ（４９
３）とＡ（２８０）の比を参照することで得られる。Ａ
（２８０）からＦＬＢの寄与を差し引くことは、ＳＡが
存在しないときのＦＬＢの吸収スペクトルはＳＡの存在
下のものと比較できないので、非現実的で非実際的であ
る。また、ＦＬＢ／Ｂの結合は、２８０ｎｍ近傍におい
てトリプトファン（tryptophan）のレッドシフト（低波
長側へのずれ）をもたらす。このことから、混合溶液に
おいてＦＬＢ／ＢがＳＡと完全に結合したと仮定して、
Ａ（４９３）とＡ（２８０）の比を図３から求めて、こ
れを用いてＦＬＢの数を見積ることができる。
【００５９】ＳＡをＦＬＢ／Ｂと化学量論的な反応をさ
せるためには反応時間が重要なものになる。原因は不明
だが、１晩かそれ以上反応溶液を放置するとＳＡと結合
するＦＬＢ／Ｂの数が減少した。Ａ（４９３）とＡ（２
８０）の比は、クロマトグラフィのフラクション数（fr
action number ）に依存する。図５の黒丸印は、フラク
ションのうちＡ（４９３）とＡ（２８０）の比が最も大
きいものについて示したものであり、このフラクション
を用いた。４ＦＬＢ，３ＦＬＢ／Ｂ，２ＦＬＢ／２Ｂ，
ＦＬＢ／３Ｂの比においては、ＳＡとＦＬＢ／Ｂのモル
比を丁度１：４に混合した場合を標準値としたものとか
なり良い一致を示す。一方、３ＦＬＢ／Ｂの場合は、明
らかに外れたものになっていて、これは試料調整のたび
ごとに違ったものになっていた。クロマトグラフィの際
においてＳＡからＦＬＢ／Ｂが分離してしまうことに起
因するものと考えられる。
せるためには反応時間が重要なものになる。原因は不明
だが、１晩かそれ以上反応溶液を放置するとＳＡと結合
するＦＬＢ／Ｂの数が減少した。Ａ（４９３）とＡ（２
８０）の比は、クロマトグラフィのフラクション数（fr
action number ）に依存する。図５の黒丸印は、フラク
ションのうちＡ（４９３）とＡ（２８０）の比が最も大
きいものについて示したものであり、このフラクション
を用いた。４ＦＬＢ，３ＦＬＢ／Ｂ，２ＦＬＢ／２Ｂ，
ＦＬＢ／３Ｂの比においては、ＳＡとＦＬＢ／Ｂのモル
比を丁度１：４に混合した場合を標準値としたものとか
なり良い一致を示す。一方、３ＦＬＢ／Ｂの場合は、明
らかに外れたものになっていて、これは試料調整のたび
ごとに違ったものになっていた。クロマトグラフィの際
においてＳＡからＦＬＢ／Ｂが分離してしまうことに起
因するものと考えられる。
【００６０】水中での染料分子では特にベールの法則か
らはずれることが知られている。有機染料の過去の幾つ
かの研究によれば、濃度によって吸収スペクトルが著し
く変化することが分かっている。FosterとKonig は、蛍
光物質を含むいくつかの有機染料分子の水中の吸収スペ
クトルの変化から高い濃度（１０-3〜１０-1Ｍ）では２
量体を形成していることを報告している。また、Koizum
i とMatagaは、電解質ポリマーの存在の下での染料水溶
液の吸収スペクトルの変化について報告している。これ
らの研究から、スペクトルの変化はポリマーに与える染
料分子の凝集効果に起因すると考えられる。これらの過
去の研究と、ＳＡとＢの高い親和性による結合とをふま
えて、同様に、ＳＡに対するＦＬＢの局所的な凝集効果
が十分有り得るものであると考えられる。このことは、
ＳＡとＦＬＢの相互作用について分光学的証拠でもあ
る。例えば、ＦＬＢと親和性をもたないウシ血清アルブ
ミン（Bovine serum albmin ）では、ＦＬＢに何らスペ
クトルの変化をもたらさない。
らはずれることが知られている。有機染料の過去の幾つ
かの研究によれば、濃度によって吸収スペクトルが著し
く変化することが分かっている。FosterとKonig は、蛍
光物質を含むいくつかの有機染料分子の水中の吸収スペ
クトルの変化から高い濃度（１０-3〜１０-1Ｍ）では２
量体を形成していることを報告している。また、Koizum
i とMatagaは、電解質ポリマーの存在の下での染料水溶
液の吸収スペクトルの変化について報告している。これ
らの研究から、スペクトルの変化はポリマーに与える染
料分子の凝集効果に起因すると考えられる。これらの過
去の研究と、ＳＡとＢの高い親和性による結合とをふま
えて、同様に、ＳＡに対するＦＬＢの局所的な凝集効果
が十分有り得るものであると考えられる。このことは、
ＳＡとＦＬＢの相互作用について分光学的証拠でもあ
る。例えば、ＦＬＢと親和性をもたないウシ血清アルブ
ミン（Bovine serum albmin ）では、ＦＬＢに何らスペ
クトルの変化をもたらさない。
【００６１】つぎに、ＳＡに結合したＦＬＢの相対的な
蛍光量子生成率と蛍光スペクトルを測定した。吸収スペ
クトルの異常な振る舞いを考慮すれば、ＳＡとの結合の
際にＦＬＢの蛍光特性に何かが起こっているものと考え
られる。図６は、ＦＬＢのみのとき（１）、ＳＡと結合
したＦＬＢ／３Ｂのとき（２）、ＳＡと結合した２ＦＬ
Ｂ／２Ｂのとき（３）、ＳＡと結合した３ＦＬＢ／Ｂの
とき（４）、ＳＡと結合した４ＦＬＢのとき（４）につ
いて蛍光スペクトルを示したものである（ＳＡとの結合
はｐＨ８．４２，２９６Ｋで１０ｍＭのトリエタノール
アミン（triethanol）／ＨＣｌに溶解しておこなっ
た）。スペクトルの形状は同じであり、ピークもシフト
していないが、最初のＦＬＢがＳＡに結合した時強度が
顕著に減少しさらにＦＬＢが結合するにつれてかなり減
少した。（１）〜（５）から得られたＳＡによる相対的
な蛍光量子生成率を計算したものを図６（ｂ）に示す。
このＳＡのクエンチングによる蛍光は、ＳＡのアミノ酸
とＦＬＢとの間に、消光反応があることを示している。
ＦＬＢの数に依存したクエンチングによる蛍光のメカニ
ズムは、染料水溶液での自己クエンチング（self-quenc
hing，上述の過去の研究で報告されている）と同じもの
であるものと考えられる。この点に付いてさらなる研究
は今後に委ねられよう。
蛍光量子生成率と蛍光スペクトルを測定した。吸収スペ
クトルの異常な振る舞いを考慮すれば、ＳＡとの結合の
際にＦＬＢの蛍光特性に何かが起こっているものと考え
られる。図６は、ＦＬＢのみのとき（１）、ＳＡと結合
したＦＬＢ／３Ｂのとき（２）、ＳＡと結合した２ＦＬ
Ｂ／２Ｂのとき（３）、ＳＡと結合した３ＦＬＢ／Ｂの
とき（４）、ＳＡと結合した４ＦＬＢのとき（４）につ
いて蛍光スペクトルを示したものである（ＳＡとの結合
はｐＨ８．４２，２９６Ｋで１０ｍＭのトリエタノール
アミン（triethanol）／ＨＣｌに溶解しておこなっ
た）。スペクトルの形状は同じであり、ピークもシフト
していないが、最初のＦＬＢがＳＡに結合した時強度が
顕著に減少しさらにＦＬＢが結合するにつれてかなり減
少した。（１）〜（５）から得られたＳＡによる相対的
な蛍光量子生成率を計算したものを図６（ｂ）に示す。
このＳＡのクエンチングによる蛍光は、ＳＡのアミノ酸
とＦＬＢとの間に、消光反応があることを示している。
ＦＬＢの数に依存したクエンチングによる蛍光のメカニ
ズムは、染料水溶液での自己クエンチング（self-quenc
hing，上述の過去の研究で報告されている）と同じもの
であるものと考えられる。この点に付いてさらなる研究
は今後に委ねられよう。
【００６２】溶媒のないシリコンウェハ上でも溶液中の
相対的な蛍光量子生成率と等しいことは知られていない
のであるが、単一分子検出に適切な試料の選定を図６の
結果の下に行った。蛍光量子生成率と蛍光係数はＦＬＢ
の数とともに減少するので、モノマーのＦＬＢ／３Ｂに
ついてのみ単一分子検出の確認のため測定をし得る。こ
れらのことから単一分子検出にはモノマーを試料として
用いることとした。
相対的な蛍光量子生成率と等しいことは知られていない
のであるが、単一分子検出に適切な試料の選定を図６の
結果の下に行った。蛍光量子生成率と蛍光係数はＦＬＢ
の数とともに減少するので、モノマーのＦＬＢ／３Ｂに
ついてのみ単一分子検出の確認のため測定をし得る。こ
れらのことから単一分子検出にはモノマーを試料として
用いることとした。
【００６３】この単一分子検出では、液滴は染料分子の
数が少数となるようにしなければならない。液滴中で
は、染料分子の数はポワッソンに支配されるので、これ
を用いて液滴中の染料分子数を計算することができる。
染料溶液（ＤＦＬ）を高濃度にし、その液滴を超音波加
湿器でシリコンウェハに付着した。図７（ａ），
（ｂ），（ｃ）は、噴霧する時間を１０秒，７秒，３秒
にかえて液滴１つが基板上に占める領域がどの様に分布
するかを示したものである。領域の大きさ（in pixel2u
nit,1pixel=o.3μｍ）に対する頻度（frequency ）を示
す。ピークの位置は噴霧する時間が長くなるにつれ少し
移動するが、実際には分布の形及びピークの位置は噴霧
する時間とは独立している。最大のピークは、およそ３
０〜４０ pixel2 であるので、染料の濃度をナノモル／
ｌ程度にすると、液滴１つにはいる染料分子数は１．０
０〜１．５６になる。
数が少数となるようにしなければならない。液滴中で
は、染料分子の数はポワッソンに支配されるので、これ
を用いて液滴中の染料分子数を計算することができる。
染料溶液（ＤＦＬ）を高濃度にし、その液滴を超音波加
湿器でシリコンウェハに付着した。図７（ａ），
（ｂ），（ｃ）は、噴霧する時間を１０秒，７秒，３秒
にかえて液滴１つが基板上に占める領域がどの様に分布
するかを示したものである。領域の大きさ（in pixel2u
nit,1pixel=o.3μｍ）に対する頻度（frequency ）を示
す。ピークの位置は噴霧する時間が長くなるにつれ少し
移動するが、実際には分布の形及びピークの位置は噴霧
する時間とは独立している。最大のピークは、およそ３
０〜４０ pixel2 であるので、染料の濃度をナノモル／
ｌ程度にすると、液滴１つにはいる染料分子数は１．０
０〜１．５６になる。
【００６４】こうして分子数を非常に小さくして液滴を
基板２０（シリコンウェハ）に付着したのち、図１の装
置で１００以上の基板２０上の発光する領域を測定し
た。そして、蛍光強度（INTENSITY ）とその強度の蛍光
が現れる頻度（FREQUENCY ）とをプロットした（蛍光強
度については相対値を用いた）。
基板２０（シリコンウェハ）に付着したのち、図１の装
置で１００以上の基板２０上の発光する領域を測定し
た。そして、蛍光強度（INTENSITY ）とその強度の蛍光
が現れる頻度（FREQUENCY ）とをプロットした（蛍光強
度については相対値を用いた）。
【００６５】図８（ａ），（ｂ）は、ＳＡと結合したＦ
ＬＢ／３Ｂを用いた測定結果を示したものである（顕微
鏡は４０ｘ，０．５５ＮＡとした）。５００おきに幾つ
かのピークが現れ、これは蛍光が量子化され、この測定
が、単一分子領域で蛍光を捕らえていることを反映して
いる。横軸の５００よりも小さいものは、シリコンウェ
ハに付着した水や緩衝液中のダストによる４８８ｎｍの
光の散乱に起因するものであるが、図８（ｂ）の横軸の
５００において明瞭にピーク値の最小値が現れている。
このピークは、ＦＬＢ／３Ｂと結合したＳＡの単一分子
から生じたものと考えられる。図８（ａ）と（ｂ）とで
は、それらのカラムクロマトグラフィでの緩衝液が違っ
たものになっている。図８（ａ）ではリン酸塩（ｐＨ＝
７．５）のみを用い、図８（ｂ）では炭酸アンモニウム
を加えている（ｐＨ＝７．５）。炭酸アンモニウムの揮
発性によって基板表面に検出した緩衝液の塩による光学
的なノイズが抑えられているものと考えられる。
ＬＢ／３Ｂを用いた測定結果を示したものである（顕微
鏡は４０ｘ，０．５５ＮＡとした）。５００おきに幾つ
かのピークが現れ、これは蛍光が量子化され、この測定
が、単一分子領域で蛍光を捕らえていることを反映して
いる。横軸の５００よりも小さいものは、シリコンウェ
ハに付着した水や緩衝液中のダストによる４８８ｎｍの
光の散乱に起因するものであるが、図８（ｂ）の横軸の
５００において明瞭にピーク値の最小値が現れている。
このピークは、ＦＬＢ／３Ｂと結合したＳＡの単一分子
から生じたものと考えられる。図８（ａ）と（ｂ）とで
は、それらのカラムクロマトグラフィでの緩衝液が違っ
たものになっている。図８（ａ）ではリン酸塩（ｐＨ＝
７．５）のみを用い、図８（ｂ）では炭酸アンモニウム
を加えている（ｐＨ＝７．５）。炭酸アンモニウムの揮
発性によって基板表面に検出した緩衝液の塩による光学
的なノイズが抑えられているものと考えられる。
【００６６】図９は、ＤＦＬのみを使用した場合の結果
を示したものである（顕微鏡は１００ｘ，０．５５ＮＡ
とした）。この場合においても、１０，０００おきに幾
つかのピークが現れ、蛍光が量子化されている。シリコ
ンウェハへの水だけを噴霧するという実験によって、
８，０００以下における蛍光強度の異常は水の中のダス
トによることが分かる。強度１０，０００の蛍光は、Ｄ
ＦＬの単一分子から生じたものと結論できる。
を示したものである（顕微鏡は１００ｘ，０．５５ＮＡ
とした）。この場合においても、１０，０００おきに幾
つかのピークが現れ、蛍光が量子化されている。シリコ
ンウェハへの水だけを噴霧するという実験によって、
８，０００以下における蛍光強度の異常は水の中のダス
トによることが分かる。強度１０，０００の蛍光は、Ｄ
ＦＬの単一分子から生じたものと結論できる。
【００６７】図８と図９において蛍光のフォトンカウン
ティングの絶対強度の違いは、顕微鏡の対物レンズ，検
出器の感度のレギュレーション，シリコンウェハ表面へ
のレーザ強度，ＦＬＢ／３Ｂと結合したＳＡと何も結合
していないＤＦＬと蛍光量子生成率といった実験条件の
違いによるものである。
ティングの絶対強度の違いは、顕微鏡の対物レンズ，検
出器の感度のレギュレーション，シリコンウェハ表面へ
のレーザ強度，ＦＬＢ／３Ｂと結合したＳＡと何も結合
していないＤＦＬと蛍光量子生成率といった実験条件の
違いによるものである。
【００６８】量子化された蛍光強度は、図７（ａ）に示
された液滴の大きさの分布から計算できる。液的中の分
子数はポワッソンの式で示される（式１）。
された液滴の大きさの分布から計算できる。液的中の分
子数はポワッソンの式で示される（式１）。
【００６９】
【数１】
【００７０】ここで、Ｗ（Ｎ）は液滴が含む分子数の期
待値、μは液滴中の分子数の平均値をしめす。噴霧する
際、液滴の大きさにバラツキがあるので、液滴大きさの
分布の重みを加味してつぎのポワッソンの式で示され
る。
待値、μは液滴中の分子数の平均値をしめす。噴霧する
際、液滴の大きさにバラツキがあるので、液滴大きさの
分布の重みを加味してつぎのポワッソンの式で示され
る。
【００７１】
【数２】
【００７２】
【数３】
【００７３】ここで、ｆ（μ）は規格化された重み係数
であり、図７の液滴の大きさの分布から計算される。図
１０は、Ｗ（Ｎ）の計算結果をＤＦＬについての測定結
果（斜線）と共に示したものである（ここでは、Ｎ＝１
の頻度を規格化してある）。これらは良い一致を示して
おり、単一分子の検出がなされていることを如実に示し
ている。
であり、図７の液滴の大きさの分布から計算される。図
１０は、Ｗ（Ｎ）の計算結果をＤＦＬについての測定結
果（斜線）と共に示したものである（ここでは、Ｎ＝１
の頻度を規格化してある）。これらは良い一致を示して
おり、単一分子の検出がなされていることを如実に示し
ている。
【００７４】このようにして、蛋白に結合する染料分子
と、希釈した染料分子との２種類の試料について単分子
の検出を行うことに成功した。後者のほうは分子間の相
互作用がなく、単分子の検出に向いている。実際の応用
場面では、蛍光クエンチングをもつ分子間の相互作用が
ある場合が多く、前者はその典型的なもののひとつであ
る。
と、希釈した染料分子との２種類の試料について単分子
の検出を行うことに成功した。後者のほうは分子間の相
互作用がなく、単分子の検出に向いている。実際の応用
場面では、蛍光クエンチングをもつ分子間の相互作用が
ある場合が多く、前者はその典型的なもののひとつであ
る。
【００７５】従来は、背景光が大きく単一分子からの蛍
光はそれに埋もれて検出することが不可能であった。し
かし、この単一分子の検出では、これを可能にし、大き
なブレークスルーで、様々な分析に応用され得る。イム
ノアッセイ，クロマトグラフィ，ＤＮＡ解析の自動化に
大きな進歩をもたらすものと思われ、超高速の蛍光分析
を可能にし得るものと考えられる。
光はそれに埋もれて検出することが不可能であった。し
かし、この単一分子の検出では、これを可能にし、大き
なブレークスルーで、様々な分析に応用され得る。イム
ノアッセイ，クロマトグラフィ，ＤＮＡ解析の自動化に
大きな進歩をもたらすものと思われ、超高速の蛍光分析
を可能にし得るものと考えられる。
【００７６】このように、室温で固体基板表面に試料を
付着すること、２次元フォトンカウンティング法を用い
て単一分子の存在及び位置を検出していることで単一分
子の検出を可能にしている。単一分子の存在及び位置
は、従来通りの光学顕微鏡を用い、その解像度の限界で
の蛍光スポットから検出している。蛍光スポットは、顕
微鏡視野内に散在し、蛍光スポットに存在する分子の個
数については、単一分子の検出の際非常に重要な要素で
あり、蛍光スポットからの蛍光強度の大きさを左右する
ことになる。上記方法で分子１個程度が蛍光スポットに
存在するようにし、単一分子の検出を可能にしている。
付着すること、２次元フォトンカウンティング法を用い
て単一分子の存在及び位置を検出していることで単一分
子の検出を可能にしている。単一分子の存在及び位置
は、従来通りの光学顕微鏡を用い、その解像度の限界で
の蛍光スポットから検出している。蛍光スポットは、顕
微鏡視野内に散在し、蛍光スポットに存在する分子の個
数については、単一分子の検出の際非常に重要な要素で
あり、蛍光スポットからの蛍光強度の大きさを左右する
ことになる。上記方法で分子１個程度が蛍光スポットに
存在するようにし、単一分子の検出を可能にしている。
【００７７】従来のウエット系、溶媒に測定対象の分子
を溶解させるものでは、溶媒（水など）のラマン散乱が
バックグラウンドノイズとなり、測定を非常に難しいも
のにしていたが、本発明の方法では、適切な基板の選択
により良好に単一分子の検出を可能にしている。また、
基板上に超音波（超音波加湿器など）をもちいるのは、
非常に簡便で有用なものである。緩衝液に由来する塩
は、測定対象の分子とともに基板上に存在する場合があ
り、これがバックグラウンドノイズのレベルを決めてし
まうことがある。試料調整の際、試料の種類によっては
必ずしも緩衝液を必要とするわけではないが、その選択
には注意を要する。
を溶解させるものでは、溶媒（水など）のラマン散乱が
バックグラウンドノイズとなり、測定を非常に難しいも
のにしていたが、本発明の方法では、適切な基板の選択
により良好に単一分子の検出を可能にしている。また、
基板上に超音波（超音波加湿器など）をもちいるのは、
非常に簡便で有用なものである。緩衝液に由来する塩
は、測定対象の分子とともに基板上に存在する場合があ
り、これがバックグラウンドノイズのレベルを決めてし
まうことがある。試料調整の際、試料の種類によっては
必ずしも緩衝液を必要とするわけではないが、その選択
には注意を要する。
【００７８】さらに、基板には測定対象の分子が良好に
付着しており、他の測定においても使用することが可能
である。例えば、ＳＴＭ，ＡＴＭは空間分解能の優れた
顕微鏡であり、これらの測定にも用い得ることができ
る。ＳＴＭ，ＡＴＭで単一分子の存在を確認し、分子種
類の識別は蛍光で行う、というようにしても良い（本発
明の検出法は、蛍光で行うので分子種類の識別もできる
ことはいうまでもない）。ＤＮＡの塩基配列の一つの決
定法にもなり得る。即ち、エキソニュークリアーゼを用
いて末端からＤＮＡの塩基を切断し、１個１個の塩基を
識別して行くのである。この場合、切断された順序で決
まる所定の位置に塩基を配置しておく。
付着しており、他の測定においても使用することが可能
である。例えば、ＳＴＭ，ＡＴＭは空間分解能の優れた
顕微鏡であり、これらの測定にも用い得ることができ
る。ＳＴＭ，ＡＴＭで単一分子の存在を確認し、分子種
類の識別は蛍光で行う、というようにしても良い（本発
明の検出法は、蛍光で行うので分子種類の識別もできる
ことはいうまでもない）。ＤＮＡの塩基配列の一つの決
定法にもなり得る。即ち、エキソニュークリアーゼを用
いて末端からＤＮＡの塩基を切断し、１個１個の塩基を
識別して行くのである。この場合、切断された順序で決
まる所定の位置に塩基を配置しておく。
【００７９】（核酸の塩基配列の測定）図１２は、本発
明の核酸の塩基配列決定方法において使用する装置の構
成例を示したものである。この装置は、基板２０の表面
上の微小な領域に励起光を照射する励起光源３０と、励
起光の照射位置で塩基からの蛍光を検出する手段として
フォトンカウンティングカメラシステム（４２〜４７）
とを備えている。基板２０は、鏡面度の非常に高いも
の、例えば、シリコンウェハを用い、前述の方法で塩基
の分子を表面に付着しておく。また、クラス１０００以
下のクリーンブースに配置され、清澄な雰囲気または真
空中におかれている。
明の核酸の塩基配列決定方法において使用する装置の構
成例を示したものである。この装置は、基板２０の表面
上の微小な領域に励起光を照射する励起光源３０と、励
起光の照射位置で塩基からの蛍光を検出する手段として
フォトンカウンティングカメラシステム（４２〜４７）
とを備えている。基板２０は、鏡面度の非常に高いも
の、例えば、シリコンウェハを用い、前述の方法で塩基
の分子を表面に付着しておく。また、クラス１０００以
下のクリーンブースに配置され、清澄な雰囲気または真
空中におかれている。
【００８０】励起光源３０は、励起光を基板２０の塩基
の付着位置に強く照射するもの、例えば、コヒーレント
なレーザ光が望ましいため、レーザ光源を用いる。その
波長が３０μｍ以下であればパルスレーザを用いること
ができる。励起光（レーザ光）を３０乃至５０ｃｍの焦
点距離のレンズ３２で集光して照射する。励起光源３０
と基板２０の距離はレンズの焦点距離よりも小さくし、
基板２０上に励起光が均一に照射されるようにする。ま
た、励起光源３０は、励起光が図２のように斜め方向か
ら入射するように配置し、基板２０での反射光ビームが
斜め方向に反射するようにする。
の付着位置に強く照射するもの、例えば、コヒーレント
なレーザ光が望ましいため、レーザ光源を用いる。その
波長が３０μｍ以下であればパルスレーザを用いること
ができる。励起光（レーザ光）を３０乃至５０ｃｍの焦
点距離のレンズ３２で集光して照射する。励起光源３０
と基板２０の距離はレンズの焦点距離よりも小さくし、
基板２０上に励起光が均一に照射されるようにする。ま
た、励起光源３０は、励起光が図２のように斜め方向か
ら入射するように配置し、基板２０での反射光ビームが
斜め方向に反射するようにする。
【００８１】フォトンカウンティングカメラシステム
は、基板２０の塩基の位置を検出するもので、微弱な光
を検出できるものを用いる。ここでは、光学顕微鏡２０
を装着した浜松ホトニクスのイメージング・画像解析シ
ステム（ARGUS 50 VIM 3）で構成し、２次元的に光子を
計数して２次元的な光検出が可能なものにし、分子の位
置が特定しうるようにする。光学顕微鏡２０は、基板２
０の塩基からの蛍光を集めるためのもので、高倍率にし
て構成している。カメラヘッド４０には、イメージング
・画像解析システムがつながれており、これによって信
号の蓄積（蛍光のフォトンカウンティング），画像処
理，記録の保存，画像の表示がなされて塩基の分子の存
在が検出されうる。
は、基板２０の塩基の位置を検出するもので、微弱な光
を検出できるものを用いる。ここでは、光学顕微鏡２０
を装着した浜松ホトニクスのイメージング・画像解析シ
ステム（ARGUS 50 VIM 3）で構成し、２次元的に光子を
計数して２次元的な光検出が可能なものにし、分子の位
置が特定しうるようにする。光学顕微鏡２０は、基板２
０の塩基からの蛍光を集めるためのもので、高倍率にし
て構成している。カメラヘッド４０には、イメージング
・画像解析システムがつながれており、これによって信
号の蓄積（蛍光のフォトンカウンティング），画像処
理，記録の保存，画像の表示がなされて塩基の分子の存
在が検出されうる。
【００８２】ハーフミラー５６は、基板２０上の塩基か
らの蛍光を分岐するものであり、ポリクロメータ５２へ
の光量を多く分岐するものにする。ポリクロメータ５２
は蛍光のスペクトルを測定し、蛍光寿命測定装置は、蛍
光の寿命を測定するもので光電子増倍管（ホトマル）な
どで構成される。これらによって塩基の種類が特定され
る。ハーフミラー５６に代えて、これらとカメラヘッド
４０とを光学的または機械的に切り替えるようにしても
良い。
らの蛍光を分岐するものであり、ポリクロメータ５２へ
の光量を多く分岐するものにする。ポリクロメータ５２
は蛍光のスペクトルを測定し、蛍光寿命測定装置は、蛍
光の寿命を測定するもので光電子増倍管（ホトマル）な
どで構成される。これらによって塩基の種類が特定され
る。ハーフミラー５６に代えて、これらとカメラヘッド
４０とを光学的または機械的に切り替えるようにしても
良い。
【００８３】また、基板２０は、図示せぬ駆動装置によ
り位置及び回転が制御され、光学顕微鏡２０，カメラヘ
ッド４０の視野に入る基板２０上の位置が制御されるよ
うになっている（図１１と同様）。矢印Ａ方向に一定速
度で走行するようになっている。基板２０上の励起光が
照射される領域近傍は、冷却手段３４で冷却されるよう
にする。冷却手段としては、クライオスタットの冷却端
３４ａを基板２０の裏側に導くようにするもの（図１３
（ａ）、例えば銅ブロック）、冷却端３４ａとの間に熱
伝導度の高いボール３４ｂを埋め込む（図１３
（ｂ））、冷却ガス３４ｄをパイプ３４ｃで導き吹き付
けるもの（図１３（ｃ）、例えばヘリウムなど）があ
る。核酸塩基そのものは低温になるほど自家蛍光が増大
するので、冷却する温度は低いほうが望ましい。また、
冷却によって色素の劣化を抑えることが可能になる。
り位置及び回転が制御され、光学顕微鏡２０，カメラヘ
ッド４０の視野に入る基板２０上の位置が制御されるよ
うになっている（図１１と同様）。矢印Ａ方向に一定速
度で走行するようになっている。基板２０上の励起光が
照射される領域近傍は、冷却手段３４で冷却されるよう
にする。冷却手段としては、クライオスタットの冷却端
３４ａを基板２０の裏側に導くようにするもの（図１３
（ａ）、例えば銅ブロック）、冷却端３４ａとの間に熱
伝導度の高いボール３４ｂを埋め込む（図１３
（ｂ））、冷却ガス３４ｄをパイプ３４ｃで導き吹き付
けるもの（図１３（ｃ）、例えばヘリウムなど）があ
る。核酸塩基そのものは低温になるほど自家蛍光が増大
するので、冷却する温度は低いほうが望ましい。また、
冷却によって色素の劣化を抑えることが可能になる。
【００８４】つぎに、この装置を用いた塩基配列決定方
法を手順を追って説明する。
法を手順を追って説明する。
【００８５】まず、図１５に示すようにフローセル１０
を用いて核酸（例えば、ＤＮＡ）から分離した塩基を含
む液滴２２を基板２０に滴下し、塩基が付着した基板２
０を作成する（図１４）。
を用いて核酸（例えば、ＤＮＡ）から分離した塩基を含
む液滴２２を基板２０に滴下し、塩基が付着した基板２
０を作成する（図１４）。
【００８６】フローセル１０は、本体１１に２個の超音
波トラップ１２を挟んで構成される。図１５に示すよう
に、各々の超音波トラップ１２はピエゾ素子１３を有
し、配線１４を介してピエゾ駆動回路に接続されてい
る。このフローセル１０のフロー通路１５にＤＮＡを分
離した塩基を含んだ液体を流し、ピエゾ素子１３によっ
て定在波を作ることにより、図のように液体は分離して
滴下される。一方、基板２０は、図示せぬ駆動機構によ
り、一定速度で回転すると共に液体の滴下する位置が中
心に移動するようにする（図１６）。滴下された塩基は
矢印Ａ方向（図１５）に走行する基板２０に略一定間隔
で付着し、光学顕微鏡２０の視野内に１個の液滴が入る
ようにする。
波トラップ１２を挟んで構成される。図１５に示すよう
に、各々の超音波トラップ１２はピエゾ素子１３を有
し、配線１４を介してピエゾ駆動回路に接続されてい
る。このフローセル１０のフロー通路１５にＤＮＡを分
離した塩基を含んだ液体を流し、ピエゾ素子１３によっ
て定在波を作ることにより、図のように液体は分離して
滴下される。一方、基板２０は、図示せぬ駆動機構によ
り、一定速度で回転すると共に液体の滴下する位置が中
心に移動するようにする（図１６）。滴下された塩基は
矢印Ａ方向（図１５）に走行する基板２０に略一定間隔
で付着し、光学顕微鏡２０の視野内に１個の液滴が入る
ようにする。
【００８７】核酸の分離は、前述の文献にあるように、
酵素エキソヌクレアーゼIII を含む溶液を使って単一フ
ラグメントの端から順次切断して行う。約３７℃の良好
な状態に保つことにより、上記酵素で約１００個／ｓの
速度で切断することが可能であり、約３００個／ｓの速
度で微粒子状の液滴をフローセル１０から滴下させる。
また、フローセル１０により滴下させる微粒子は、約３
０μｍ程度の直径になるように径及び定在波の周波数を
調整し、１つの液滴には、ポワッソンの式を考慮してお
よそ１分子が入るようにしておく。こうして、図１４に
示すような螺旋状に１塩基が順に付着した基板２０が作
成される。
酵素エキソヌクレアーゼIII を含む溶液を使って単一フ
ラグメントの端から順次切断して行う。約３７℃の良好
な状態に保つことにより、上記酵素で約１００個／ｓの
速度で切断することが可能であり、約３００個／ｓの速
度で微粒子状の液滴をフローセル１０から滴下させる。
また、フローセル１０により滴下させる微粒子は、約３
０μｍ程度の直径になるように径及び定在波の周波数を
調整し、１つの液滴には、ポワッソンの式を考慮してお
よそ１分子が入るようにしておく。こうして、図１４に
示すような螺旋状に１塩基が順に付着した基板２０が作
成される。
【００８８】つぎに、基板を自然乾燥させ溶媒を取り除
く。基板は、自然乾燥では取り除くことのできない溶媒
分子と塩基とが付着したものになる。溶媒分子をあえて
取り除こうとすると（加熱、真空乾燥）、試料分子（塩
基の分子）も基板上からなくなる可能性は高いので、溶
媒分子を付着したままにしている。自然乾燥は、溶媒か
らのラマン散乱の低減及び色素の劣化の抑制に有効であ
る。ここで、冷却しながら乾燥させても良い。また、基
板がシリコンであると良好なものになるのは、ダングリ
ングボンドがアクティブで結合するからであると考えら
れる。
く。基板は、自然乾燥では取り除くことのできない溶媒
分子と塩基とが付着したものになる。溶媒分子をあえて
取り除こうとすると（加熱、真空乾燥）、試料分子（塩
基の分子）も基板上からなくなる可能性は高いので、溶
媒分子を付着したままにしている。自然乾燥は、溶媒か
らのラマン散乱の低減及び色素の劣化の抑制に有効であ
る。ここで、冷却しながら乾燥させても良い。また、基
板がシリコンであると良好なものになるのは、ダングリ
ングボンドがアクティブで結合するからであると考えら
れる。
【００８９】こうして塩基を付着した基板を上記図１２
の装置にセットし、試料分子のうち最初のものを付着し
た位置近傍に顕微鏡４２の視野を合わせる。まず、レー
ザ光を照射しながら試料分子からの蛍光フォトンカウン
ティングカメラシステムで検出して基板上の試料分子の
うち最初のものを観測し顕微鏡４２の視野にあることを
確認する。また、分子が１個であることを確認する。分
子が１個でない場合、顕微鏡の視野を動かしまたは倍率
を変えて１個にする。励起光源３０からパルスレーザ光
をその試料分子に照射して励起し、ポリクロメータ５２
および蛍光寿命測定装置５３で蛍光波長及び蛍光寿命を
測定する。これらの視野内に入ってくるのは１分子から
の蛍光になっている。
の装置にセットし、試料分子のうち最初のものを付着し
た位置近傍に顕微鏡４２の視野を合わせる。まず、レー
ザ光を照射しながら試料分子からの蛍光フォトンカウン
ティングカメラシステムで検出して基板上の試料分子の
うち最初のものを観測し顕微鏡４２の視野にあることを
確認する。また、分子が１個であることを確認する。分
子が１個でない場合、顕微鏡の視野を動かしまたは倍率
を変えて１個にする。励起光源３０からパルスレーザ光
をその試料分子に照射して励起し、ポリクロメータ５２
および蛍光寿命測定装置５３で蛍光波長及び蛍光寿命を
測定する。これらの視野内に入ってくるのは１分子から
の蛍光になっている。
【００９０】ここで、溶媒分子が溶液中に比べて少ない
ため、ラマン散乱が著しく少なく、背景光が小さくなっ
ている。また、励起光源３０からレーザ光は顕微鏡４２
の視野に入らないようになっており、基板に鏡面度の高
いもの（シリコンウェハ）を用いているため、背景光が
非常に少なくなる。特に、反射の場合は透過の場合より
も小さなものになる。そのため、試料分子からの蛍光は
非常に微弱なのであるが、背景光に隠れずに測定するこ
とが可能になっている。また、励起光が反射して蛍光検
出器４０に入射する確率はほとんどなくなるので、たと
えポリクロメータ５２のカットオフ特性が完全でなくと
も、雑音成分となることはない。
ため、ラマン散乱が著しく少なく、背景光が小さくなっ
ている。また、励起光源３０からレーザ光は顕微鏡４２
の視野に入らないようになっており、基板に鏡面度の高
いもの（シリコンウェハ）を用いているため、背景光が
非常に少なくなる。特に、反射の場合は透過の場合より
も小さなものになる。そのため、試料分子からの蛍光は
非常に微弱なのであるが、背景光に隠れずに測定するこ
とが可能になっている。また、励起光が反射して蛍光検
出器４０に入射する確率はほとんどなくなるので、たと
えポリクロメータ５２のカットオフ特性が完全でなくと
も、雑音成分となることはない。
【００９１】蛍光波長及び蛍光寿命からこの差異により
塩基を前述のＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃに識別でき、顕微鏡４２の
視野にある塩基が、塩基Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれである
かが特定される。なお、蛍光検出は検出期間を長くする
必要上、オフラインで行なってもよい。そして、レーザ
光の照射領域即ち顕微鏡４２の視野をつぎに付着した試
料分子近傍に移動させる。同様にして塩基の種類を特定
し、つぎの試料の観測を行う。これを順次繰り返して核
酸の塩基配列の測定がなされる。
塩基を前述のＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃに識別でき、顕微鏡４２の
視野にある塩基が、塩基Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれである
かが特定される。なお、蛍光検出は検出期間を長くする
必要上、オフラインで行なってもよい。そして、レーザ
光の照射領域即ち顕微鏡４２の視野をつぎに付着した試
料分子近傍に移動させる。同様にして塩基の種類を特定
し、つぎの試料の観測を行う。これを順次繰り返して核
酸の塩基配列の測定がなされる。
【００９２】測定対象の塩基の分子を基板に付着させ、
分子の位置情報を得ながら塩基の種類を特定してゆくも
のであるので、繰り返して測定し直すことができるだけ
でなく、核酸の記録媒体として用いることもできる。
分子の位置情報を得ながら塩基の種類を特定してゆくも
のであるので、繰り返して測定し直すことができるだけ
でなく、核酸の記録媒体として用いることもできる。
【００９３】上記実施例においては、種々の変形が可能
である。
である。
【００９４】例えば、基板２０は、シリコンウェハが最
も望ましいが、平面度・鏡面度が同程度に高ければ、他
の半導体や絶縁体、場合によっては金属をも用い得る。
但し、アルミニウムや金は蒸着膜として用いられるが、
酸化しやすい、傷付きやすい、という欠点がある。酸化
シリコンなどをコーティングした金属基板も、鏡面度が
高ければ、基板として用い得る。
も望ましいが、平面度・鏡面度が同程度に高ければ、他
の半導体や絶縁体、場合によっては金属をも用い得る。
但し、アルミニウムや金は蒸着膜として用いられるが、
酸化しやすい、傷付きやすい、という欠点がある。酸化
シリコンなどをコーティングした金属基板も、鏡面度が
高ければ、基板として用い得る。
【００９５】顕微鏡４２、ポリクロメータ５２および蛍
光寿命測定装置５３の配置を図１７に示すようにしても
良い。この場合、反射鏡２５で試料分子からの蛍光をポ
リクロメータ５２および蛍光寿命測定装置５３に反射す
るようにすることで良好な波長及び蛍光寿命測定ができ
るようなる。
光寿命測定装置５３の配置を図１７に示すようにしても
良い。この場合、反射鏡２５で試料分子からの蛍光をポ
リクロメータ５２および蛍光寿命測定装置５３に反射す
るようにすることで良好な波長及び蛍光寿命測定ができ
るようなる。
【００９６】さらに、カメラヘッド４０は複数個として
もよい。１回の検出で失敗したときには、検出を改めて
行なってもよい。なぜなら、塩基はいったん基板２０に
付着されると、その位置は後に変ることがないので、繰
り返して発光あるいは蛍光検出することが可能になる。
もよい。１回の検出で失敗したときには、検出を改めて
行なってもよい。なぜなら、塩基はいったん基板２０に
付着されると、その位置は後に変ることがないので、繰
り返して発光あるいは蛍光検出することが可能になる。
【００９７】また、塩基Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃと結びついて発
光する試薬があり、これらを用いて抗体コーティングを
施し塩基の検出を増大させることも考えられる。
光する試薬があり、これらを用いて抗体コーティングを
施し塩基の検出を増大させることも考えられる。
【００９８】均一の分子からなる抗体であるモノクロナ
ル抗Ａ、抗Ｔ、抗Ｇ、抗Ｃは、塩基Ａ〜塩基Ｃと特異的
に結び付く性質を持っている。これらのモノクロナル抗
Ａ〜抗Ｃを基板２０にコーティングする（図１８
（ａ））。そして、フローセル１０により核酸の塩基を
滴下させると、塩基Ａ〜Ｃは対応する抗Ａ〜Ｃのいずれ
かと結合する。発光型の抗Ａ〜抗Ｃは、それぞれ図１８
（ｂ）のように発光性の酵素を有しており、かつ塩基Ａ
〜塩基Ｃと特異的に結び付く性質を持っている。発光型
の抗Ａ〜抗Ｃを滴下し、余分な発光型の抗Ａ〜Ｃを洗浄
して除去する。図１８（ｃ）に示すように、基板２０に
付着したモノクロナル抗Ａには塩基Ａが特異的に結びつ
き、さらに発光型の抗Ａが特異的に結びつく。また、図
１８（ｄ）のように、基板２０に付着したモノクロナル
抗Ｔには塩基Ｔ、塩基Ｔには発光型の抗Ｔが結びつく。
このため、各々の酵素の発光波長などを変えておくこと
で、発光検出による識別が可能になる。
ル抗Ａ、抗Ｔ、抗Ｇ、抗Ｃは、塩基Ａ〜塩基Ｃと特異的
に結び付く性質を持っている。これらのモノクロナル抗
Ａ〜抗Ｃを基板２０にコーティングする（図１８
（ａ））。そして、フローセル１０により核酸の塩基を
滴下させると、塩基Ａ〜Ｃは対応する抗Ａ〜Ｃのいずれ
かと結合する。発光型の抗Ａ〜抗Ｃは、それぞれ図１８
（ｂ）のように発光性の酵素を有しており、かつ塩基Ａ
〜塩基Ｃと特異的に結び付く性質を持っている。発光型
の抗Ａ〜抗Ｃを滴下し、余分な発光型の抗Ａ〜Ｃを洗浄
して除去する。図１８（ｃ）に示すように、基板２０に
付着したモノクロナル抗Ａには塩基Ａが特異的に結びつ
き、さらに発光型の抗Ａが特異的に結びつく。また、図
１８（ｄ）のように、基板２０に付着したモノクロナル
抗Ｔには塩基Ｔ、塩基Ｔには発光型の抗Ｔが結びつく。
このため、各々の酵素の発光波長などを変えておくこと
で、発光検出による識別が可能になる。
【００９９】さらに、発光検出を容易にするため、図１
９のような分子増倍過程を利用してもよい。すなわち、
図１９の右上に丸印の１〜３で示す３種の抗体を用意
し、これを基板２０に供給する。これにより、抗体の連
鎖反応が生じ、重合反応を用いた分子増倍が実現でき
る。なお、抗原結合部位を認識するための抗体には、抗
イディオタイプ抗体と呼ばれるものがある。これによれ
ば、連鎖した分だけ酵素が多くなるので、発光量を増大
できる。なお、これらの供給および洗浄についてオンラ
イン・オフラインで行なってもよい。
９のような分子増倍過程を利用してもよい。すなわち、
図１９の右上に丸印の１〜３で示す３種の抗体を用意
し、これを基板２０に供給する。これにより、抗体の連
鎖反応が生じ、重合反応を用いた分子増倍が実現でき
る。なお、抗原結合部位を認識するための抗体には、抗
イディオタイプ抗体と呼ばれるものがある。これによれ
ば、連鎖した分だけ酵素が多くなるので、発光量を増大
できる。なお、これらの供給および洗浄についてオンラ
イン・オフラインで行なってもよい。
【０１００】
【発明の効果】以上、詳細に説明した通り、本発明の単
一分子検出方法及び装置によれば、背景光が十分に抑え
られ、直接の測定対象たる蛍光性の分子１個からの蛍光
を検出することができる。そのため、蛍光が量子化され
た状態で観測され得るので、単一の分子状態を検出する
ことができる。
一分子検出方法及び装置によれば、背景光が十分に抑え
られ、直接の測定対象たる蛍光性の分子１個からの蛍光
を検出することができる。そのため、蛍光が量子化され
た状態で観測され得るので、単一の分子状態を検出する
ことができる。
【０１０１】また、本発明の核酸の塩基配列決定方法及
び装置によれば、基板上の塩基を含む蛍光性の分子が単
一の分子状態であることを確認してから、蛍光の波長及
び寿命を測定するので、その分子に含まれる核酸の塩基
を適確に特定することができ、順次塩基を特定して行く
ことで高速に塩基配列を決定できる。
び装置によれば、基板上の塩基を含む蛍光性の分子が単
一の分子状態であることを確認してから、蛍光の波長及
び寿命を測定するので、その分子に含まれる核酸の塩基
を適確に特定することができ、順次塩基を特定して行く
ことで高速に塩基配列を決定できる。
【図１】本発明の単一分子測定装置の構成例を示した
図。
図。
【図２】シリコンウェハ上の染料分子の溶液の液滴のイ
ラスト図である。半球の体積は、液滴が半球状で接触角
９０度をなしているものとし、揮発後の蛍光を発する領
域（ｓ＝πｒ2 ）が半球状の液滴の赤道面であるとして
いる（ｖ＝２πｒ3 ／３）。
ラスト図である。半球の体積は、液滴が半球状で接触角
９０度をなしているものとし、揮発後の蛍光を発する領
域（ｓ＝πｒ2 ）が半球状の液滴の赤道面であるとして
いる（ｖ＝２πｒ3 ／３）。
【図３】（ａ）は、２９６Ｋで１０ｍＭのトリエタノー
ルアミン（triethanol）／ＨＣｌに溶解したＦＬＢ／Ｂ
とＳＡとの混合物の吸収スペクトルを示した図。ＦＬＢ
／ＢとＳＡのモル比は４：１である。Ｄ−ビオチン（D-
biotin）この領域では光吸収はない。２８０ｎｍ近傍の
光吸収は主にＳＡ中のトリプトファン（tryptophan）に
よる。（ｂ）の黒のプロットは、ＦＬＢ濃度の増加にと
もないＡ（２８０）が直線的には増加しないことを示
す。（ｂ）の白のプロットは、ＦＬＢ濃度の増加にとも
ない４９３ｎｍのピークの半値幅が広がることを示す。
ルアミン（triethanol）／ＨＣｌに溶解したＦＬＢ／Ｂ
とＳＡとの混合物の吸収スペクトルを示した図。ＦＬＢ
／ＢとＳＡのモル比は４：１である。Ｄ−ビオチン（D-
biotin）この領域では光吸収はない。２８０ｎｍ近傍の
光吸収は主にＳＡ中のトリプトファン（tryptophan）に
よる。（ｂ）の黒のプロットは、ＦＬＢ濃度の増加にと
もないＡ（２８０）が直線的には増加しないことを示
す。（ｂ）の白のプロットは、ＦＬＢ濃度の増加にとも
ない４９３ｎｍのピークの半値幅が広がることを示す。
【図４】（ａ）は、ｐＨ８．４２，２９６Ｋで１０ｍＭ
のトリエタノールアミン（triethanol）／ＨＣｌに溶解
したＦＬＢの吸収スペクトルを示した図。ＦＬＢ／Ｂと
ＳＡのモル比は４：１である。（ｂ）は、（ａ）におい
てのスペクトルの変化からＦＬＢの濃度（黒のプロッ
ト）とＡ（４９３）との間に線形関係があることを示
す。（ｂ）の白のプロットは、この場合、ＦＬＢ濃度に
４９３ｎｍでの半値幅は依存しないことを示す。
のトリエタノールアミン（triethanol）／ＨＣｌに溶解
したＦＬＢの吸収スペクトルを示した図。ＦＬＢ／Ｂと
ＳＡのモル比は４：１である。（ｂ）は、（ａ）におい
てのスペクトルの変化からＦＬＢの濃度（黒のプロッ
ト）とＡ（４９３）との間に線形関係があることを示
す。（ｂ）の白のプロットは、この場合、ＦＬＢ濃度に
４９３ｎｍでの半値幅は依存しないことを示す。
【図５】ＳＡと結合したＦＬＢ／Ｂが４９３ｎｍでの吸
収Ａ（４９３）と２８０ｎｍでの吸収Ａ（２８０）とか
ら計算し得ることを示す図。Ａ（４９３）にはＦＬＢの
みが寄与するＡ（２８０）はＳＡとＦＬＢの寄与を含
む。Ａ（４９３）／Ａ（２８０）の評価はＳＡとＦＬＢ
／Ｂの比を様々なのものにしておこなった。黒のプロッ
トは、クロマトグラフィからのＦＬＢ／Ｂ−ＳＡ混合物
を用いたもの、白三角のプロットは、ＳＡとＦＬＢ／Ｂ
の混合比を丁度１：４にしたものを示している。後者を
ＳＡと結合したＦＬＢの数を決めるための標準値とし
た。
収Ａ（４９３）と２８０ｎｍでの吸収Ａ（２８０）とか
ら計算し得ることを示す図。Ａ（４９３）にはＦＬＢの
みが寄与するＡ（２８０）はＳＡとＦＬＢの寄与を含
む。Ａ（４９３）／Ａ（２８０）の評価はＳＡとＦＬＢ
／Ｂの比を様々なのものにしておこなった。黒のプロッ
トは、クロマトグラフィからのＦＬＢ／Ｂ−ＳＡ混合物
を用いたもの、白三角のプロットは、ＳＡとＦＬＢ／Ｂ
の混合比を丁度１：４にしたものを示している。後者を
ＳＡと結合したＦＬＢの数を決めるための標準値とし
た。
【図６】（ａ）は、ＦＬＢのみのとき（１）、ＳＡと結
合したＦＬＢ／３Ｂのとき（２）、ＳＡと結合した２Ｆ
ＬＢ／２Ｂのとき（３）、ＳＡと結合した３ＦＬＢ／Ｂ
のとき（４）、ＳＡと結合した４ＦＬＢのとき（４）に
ついて蛍光スペクトルを示した図。ＳＡとの結合はｐＨ
８．４２，２９６Ｋで１０ｍＭのトリエタノールアミン
（triethanol）／ＨＣｌに溶解しておこなった。（ｂ）
は、（ａ）の（１）〜（５）から得られたＳＡによる相
対的な蛍光量子生成率の変化を示した図。ＳＡとＦＬＢ
自身による蛍光のクエンチングが明らかに観察された。
合したＦＬＢ／３Ｂのとき（２）、ＳＡと結合した２Ｆ
ＬＢ／２Ｂのとき（３）、ＳＡと結合した３ＦＬＢ／Ｂ
のとき（４）、ＳＡと結合した４ＦＬＢのとき（４）に
ついて蛍光スペクトルを示した図。ＳＡとの結合はｐＨ
８．４２，２９６Ｋで１０ｍＭのトリエタノールアミン
（triethanol）／ＨＣｌに溶解しておこなった。（ｂ）
は、（ａ）の（１）〜（５）から得られたＳＡによる相
対的な蛍光量子生成率の変化を示した図。ＳＡとＦＬＢ
自身による蛍光のクエンチングが明らかに観察された。
【図７】噴霧する時間を１０秒，７秒，３秒にかえて液
滴１つが基板上に占める領域がどの様に分布するかを示
した図。
滴１つが基板上に占める領域がどの様に分布するかを示
した図。
【図８】ＳＡと結合したＦＬＢ／３Ｂの蛍光強度分布を
示した図。
示した図。
【図９】ＤＦＬのみを使用した場合の蛍光強度分布を示
した図。
した図。
【図１０】Ｗ（Ｎ）の計算結果をＤＦＬについての結果
と共に示した図。
と共に示した図。
【図１１】レーザ光が照射される様子を示した図。
【図１２】本発明の核酸の塩基配列測定装置の構成例を
示した図。
示した図。
【図１３】冷却手段の構成例を示した図。
【図１４】塩基が付着した基板２０を示した図。
【図１５】フローセル１０の詳細な構成図である。
【図１６】基板２０に塩基を付着させるようすを示した
図。
図。
【図１７】本発明の核酸の塩基配列測定装置のほかの構
成例を示した図。
成例を示した図。
【図１８】発光検出の原理を示す模式図である（変形
例）。
例）。
【図１９】分子増倍過程の原理を示す模式図である。
【図２０】従来装置の斜視図である。
１０…フローセル、２０…基板、３０…レーザ光源、４
０…カメラヘッド、４２…顕微鏡カメラヘッド、５２…
ポリクロメータ、５４…蛍光寿命測定装置。
０…カメラヘッド、４２…顕微鏡カメラヘッド、５２…
ポリクロメータ、５４…蛍光寿命測定装置。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｐ 7055−2Ｊ // Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ 7823−4Ｂ
Claims (29)
- 【請求項１】 蛍光性の分子の溶液を微小な液滴状態に
して鏡面度の高い基板の表面に付着させた後、自然乾燥
をし、 前記基板の局所領域に励起光を照射して前記蛍光性の分
子からの量子化された蛍光強度を測定し、 前記蛍光強度の出現頻度から前記局所領域の中の前記蛍
光性の分子が単一の分子の状態であることを検出する単
一分子検出方法。 - 【請求項２】 前記蛍光性の分子は、蛋白に蛍光分子が
結合したものあるいは蛍光分子そのものであることを特
徴とする請求項１記載の単一分子検出方法。 - 【請求項３】 前記蛍光性の分子は、複数の蛍光分子を
含むことが可能であり、 クロマトグラフィで特定数の蛍光分子を結合したものを
分離精製して前記溶液を調製することを特徴とする請求
項１記載の単一分子検出方法。 - 【請求項４】 前記蛍光性の分子の溶液は、微小な液滴
状態で前記蛍光性の分子を１個程度含む濃度であること
を特徴とする請求項１記載の単一分子検出方法。 - 【請求項５】 前記蛍光性の分子の溶液を高純度の溶媒
で希釈することを特徴とする請求項１記載の単一分子検
出方法。 - 【請求項６】 超音波にて前記蛍光性の分子を微小な液
滴状態にすることを特徴とする請求項１記載の単一分子
検出方法。 - 【請求項７】 前記蛍光性の分子を霧状に気体に分散さ
せて前記基板に付着することを特徴とする請求項１記載
の単一分子検出方法。 - 【請求項８】 前記基板は、シリコンウェハであること
を特徴とする請求項１記載の単一分子検出方法。 - 【請求項９】 前記自然乾燥は室温若しくは室温以下で
行うことを特徴とする請求項１記載の単一分子検出方
法。 - 【請求項１０】 前記励起光は、レーザ光であることを
特徴とする請求項１記載の単一分子検出方法。 - 【請求項１１】 前記蛍光強度を測定する検出器を前記
励起光の前記基板への光路及び前記励起光の前記基板か
らの反射光路以外に配置して前記蛍光強度を測定するこ
とを特徴とする請求項１記載の単一分子検出方法。 - 【請求項１２】 前記蛍光強度は、２次元のフォトカウ
ンティングシステムによって検出し、画面上における前
記蛍光強度の頻度分布から、その画面において前記蛍光
性の分子が単一の分子の状態であることを検出すること
を特徴とする請求項１記載の単一分子検出方法。 - 【請求項１３】 蛍光性の分子を超音波にて霧状に気体
に分散させて鏡面度の高い基板に付着した後自然乾燥を
することを特徴とする単一分子検出用試料の作成方法。 - 【請求項１４】 シリコンウェハの表面上に蛍光性の分
子を付着してなる単一分子検出用試料。 - 【請求項１５】 蛍光性の分子を有する試料が付着した
基板の局所領域に励起光を照射する光源と、 前記局所領域内の前記蛍光性の分子からの蛍光強度を検
出し、前記蛍光強度の頻度を測定する蛍光検出手段とを
有し、 前記蛍光検出手段は、前記励起光の前記基板への光路及
び前記励起光の前記基板からの反射光路以外の位置に配
置された単一分子検出装置。 - 【請求項１６】 前記蛍光検出手段は、光学顕微鏡及び
２次元の光検出器を含むフォトカウンティングシステム
で構成されていることを特徴とする請求項１５記載の単
一分子検出装置。 - 【請求項１７】 前記光学顕微鏡は、その倍率をかえる
ことが可能であることを特徴とする請求項１６記載の単
一分子検出装置。 - 【請求項１８】 前記基板は、清澄な雰囲気に配置され
ることを特徴とする請求項１５記載の単一分子検出装
置。 - 【請求項１９】 前記光源は、レーザであることを特徴
とする請求項１５記載の単一分子検出装置。 - 【請求項２０】 前記基板上の前記局所領域を相対的に
移動させる手段をさらに備えることを特徴とする請求項
１５記載の単一分子検出装置。 - 【請求項２１】 核酸の塩基を含む蛍光性分子の溶液を
微小な液滴状態にして順次鏡面度の高い基板の表面に付
着させた後、自然乾燥をし、 前記基板の局所領域に励起光を照射して前記蛍光性分子
からの蛍光強度を測定し、前記量子化された蛍光強度の
出現頻度から前記局所領域の中の前記蛍光性分子が単一
の分子の状態であることを検出し、 前記蛍光性分子にパルス状に励起光を照射して前記蛍光
性分子からの蛍光の波長分布及び寿命から前記蛍光性分
子に含まれる核酸の塩基を特定して、 前記基板上の局所領域を移動させて順次核酸の塩基配列
を決定する核酸の塩基配列決定方法。 - 【請求項２２】 前記基板をシリコンウェハとし、その
周に沿って前記蛍光性分子を付着することを特徴とする
請求項２１記載の核酸の塩基配列決定方法。 - 【請求項２３】 前記蛍光性分子の溶液を超音波にて前
記蛍光性の分子を１個程度含む微小な液滴状態にして前
記基板に前記蛍光性分子を付着することを特徴とする請
求項２１記載の核酸の塩基配列決定方法。 - 【請求項２４】 前記蛍光強度、前記蛍光の波長及び寿
命を測定する検出器を前記励起光の前記基板への光路及
び前記励起光の前記基板からの反射光路以外に配置して
前記蛍光強度、前記蛍光の波長分布及び寿命を測定する
ことを特徴とする請求項２１記載の核酸の塩基配列決定
方法。 - 【請求項２５】 前記蛍光性分子は、前記塩基にモノク
ロナル抗体が付着したものであることを特徴とする請求
項２１記載の核酸の塩基配列決定方法。 - 【請求項２６】 前記蛍光性分子は、抗体の連鎖反応に
よる分子増倍過程にて形成されたものである請求項２１
記載の核酸の塩基配列決定方法。 - 【請求項２７】 核酸の塩基を含む蛍光性分子の溶液を
付着した基板の局所領域に励起光を照射する光源と、 前記局所領域内の前記蛍光性分子からの蛍光強度を検出
し、前記蛍光強度の頻度から前記局所領域の中の前記蛍
光性分子が単一の分子の状態であることを検出する第１
の手段と、 前記蛍光性分子にパルス状に励起光を照射して前記蛍光
性分子からの蛍光の波長及び寿命を検出する第２の手段
と、 前記基板上の前記局所領域を移動させる第３の手段とを
有し、 前記第１及び第２の手段は、前記励起光の前記基板への
光路及び前記励起光の前記基板からの反射光路以外の位
置に配置された核酸の塩基配列測定装置。 - 【請求項２８】 前記第１及び第２の手段は、前記蛍光
性分子からの蛍光を集光する光学顕微鏡を共用し、この
光学顕微鏡を経た前記蛍光から検出する請求項２７記載
の核酸の塩基配列測定装置。 - 【請求項２９】 前記蛍光性分子からの蛍光を集光しか
つ反射する手段を前記基板と前記第２の手段都の間にさ
らに有する請求項２７記載の核酸の塩基配列測定装置。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4300134A JP2575270B2 (ja) | 1992-11-10 | 1992-11-10 | 核酸の塩基配列決定方法、単一分子検出方法、その装置及び試料の作成方法 |
| US08/149,840 US5528046A (en) | 1992-11-10 | 1993-11-10 | Method and device for determining the location and number of fluorescent molecules |
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