JP2002055050A

JP2002055050A - 蛍光画像検出方法並びにｄｎａ検査方法及びその装置

Info

Publication number: JP2002055050A
Application number: JP2000247896A
Authority: JP
Inventors: Yoshitada Oshida; 良忠押田; Satoshi Takahashi; 智高橋; Kenji Yasuda; 健二保田
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 2000-08-09
Filing date: 2000-08-09
Publication date: 2002-02-20
Anticipated expiration: 2020-08-09
Also published as: JP3729043B2

Abstract

(57)【要約】【課題】１スポットを走査するＤＮＡ検出では検査に時
間を要し、将来の集団検診等の多量サンプル処理が不可
能になる。また高分解の多量の絵素からなるサンプルを
高感度、高精度でかつ高速に検出することが従来困難で
あった。【解決手段】マルチスポット又はシート状の励起光ビー
ムをサンプルに同時照射し、励起光とサンプルを相対移
動し、マルチチャンネルのフォトンカウント可能なフォ
トマルで同時検出する。得られたデータから蛍光画像を
構成する。高速、高感度でかつ広いダイナミックレンジ
で検出するため、フォトンカウント検出とアナログ積分
検出を条件に応じて切り替える。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は励起光を照射するこ
とにより微弱な蛍光を発する対象を高感度高速に蛍光検
出する方法に関する。またこの蛍光検出方法を用いてＤ
ＮＡ検査する方法及び装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来励起光を照射して得られる微弱蛍光
を検出する方法として、１本のレーザビームを対象物に
絞り込み得られる蛍光を励起光から分離し高感度検出素
子で検出していた。また２次元的に検出するには照射励
起光ビームを試料面に対し相対的に走査し、検出してい
た。この際検出の信号対雑音比を大きくするため、対象
物と共役な関係にある位置に開口を設け共焦点検出して
いた。また２次元的に検出するために、スパイラル状に
微小円開口が開いたいわゆるニッポウディスクを用い
て、これに一様照射光を当て、円開口からの光を非対称
物上に結像し、反射光或いは蛍光をこの開口の透過光
として検出することにより２次元的に共焦点画像或いは
蛍光画像を検出する方法があった。

【０００３】またＤＮＡチップあるいはＤＮＡマイクロ
アレイを検査する方法として、上記の１スポットを用い
て蛍光検出し、この蛍光検出結果からＤＮＡを検査する
方法があった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上記の何れの方法も微
弱な蛍光を２次元的に検出しようとすると非常に長い時
間を要する。１ビームレーザ光を対象物に絞り込む方法
は１絵素ずつ時系列的に検出するため、蛍光が非常に微
弱な場合１絵素分の検出に時間を要し、２次元画像全体
を検出するにはかなりの時間を要する。微弱な蛍光を発
する対象を高速に検出するため、１ビームレーザの励起
光を強くしても、例えば６０００×６０００絵素を１分
で検出しようとすると１絵素当たりの検出時間は１〜２
μsec (マイクロ秒)となる。このような短い時間で検出
しようとすると、蛍光検出強度を広いダイナミックレン
ジ（例えば２¹⁶）で検出することが困難になる。また通
常の蛍光は励起光を受光してから１０^-9〜１０^-5sec遅
延して蛍光を発するので、１絵素当たりの蛍光検出時間
が１から２μsecでは十分な蛍光検出ができない。他方
ニッポウディスクを用いる方法は一様光中の微小開口の
比率分しか光が有効に用いられないため、微弱蛍光を検
出するのにかなりの時間を要する。

【０００５】本発明はこれら従来の課題を解決し、微弱
な蛍光を２次元の大きな解像本数を必要とする検出対象
物に対して、高速、高分解能にかつ高感度に検出する技
術を提供する。またこの技術を用いて、高感度高速にＤ
ＮＡを検査する技術を提供する。

【０００６】

【課題を解決するための手段】上記の課題の解決方法と
して本発明は以下の手段を用いている。

【０００７】蛍光特性を有する対象物体に多数Ｍの微小
なスポットからなるマルチスポット励起光を照射する。
この励起光により得られる各マルチスポットからの蛍光
を励起光から分離し、この対象物体から発する蛍光像を
フォトンカウント可能な複数の微弱光検出素子で検出す
る。このようにすれば非常に微弱な蛍光でも検出でき
る。各検出素子から得られるフォトン信号をそれぞれ個
別にフォトンカウントし、各検出素子で検出されたフォ
トンカウント数Ｎｐｍを個別に記憶する。さらにマルチ
スポット光と対象物体との位置を相対的に駆動系等によ
り変化させ、各検出器のフォトンカウント数を順次記憶
して行く。このようにして対象物体上の所望の範囲に亘
りフォトンカウント数データを記憶収集してゆけば、こ
の収集データから蛍光画像を構成することができる。

【０００８】また上記マルチスポット光の代わりにシー
ト状励起光を用いる。このシート状励起光を照射するこ
とにより得られる長細い形状を有する照射領域からの蛍
光を励起光から分離し、該対象物体から発する蛍光像を
フォトンカウント可能な複数の微弱光検出素子で検出す
る。各検出素子から得られるフォトン信号をそれぞれ個
別にフォトンカウントし、各検出素子で検出されたフォ
トンカウント数Ｎｐｍを個別に記憶する。シート状励起
光による細長い形状を有する照射領域と該対象物体との
位置を相対的に変化させ、各検出器のフォトンカウント
数を順次記憶して行く。このようにして対象物体上の所
望の範囲に亘りフォトンカウント数データを記憶収集し
てゆけば、この収集データから蛍光画像を構成すること
ができる。

【０００９】マルチスポット又はシート状励起光を照射
し同時にＭ絵素の蛍光を検出することにより従来の課題
で示した上記１分で６０００×６０００画素を検出する
には１絵素当たりＭ〜２Ｍμsecの時間をかけることが
可能になる。例えばＭ＝５０ならこの時間は５０〜１０
０μsecとなり、上記の蛍光発生遅延の問題を解決でき
る。またダイナミックレンジを確保し、かつ高感度の検
出が下記理由により可能になる。

【００１０】即ち、１絵素当たりの検出時間が１μsec
程度であると高感度検出を行うに必要なフォトンカウン
トの計数時間に足る検出時間が短くなり、ダイナミック
レンジの確保が困難になる。これは１フォトンを検出し
たときに発生するフォトンパルス信号のパルス幅が数十
ｎｓであるため、１μsecの時間内ではせいぜい数十パ
ルスの信号しか検出できないためである。またこのよう
な短い時間で蛍光強度をアナログ的に検出しようとして
も、検出回路の周波数特性から十分なダイナミックレン
ジを確保して検出することは困難である。

【００１１】上記の対象物として蛍光分子を付加したＤ
ＮＡ断片を対応するＤＮＡに結合させたサンプルを用い
て以下のようにして検査する。一例として検査対象がＤ
ＮＡチップの場合、先ず検査対象であるＤＮＡから前処
理により作成したＤＮＡ断片に所望の蛍光体を付加した
ターゲットを上記ＤＮＡチップにハイブリダイゼーショ
ンする。このハイブリダイゼーションされた被検査ＤＮ
Ａチップに、多数Ｍの微小なスポットからなるマルチス
ポット励起光を照射することにより得られる各マルチス
ポットからの蛍光を励起光から分離する。分離したＤＮ
Ａチップから発する蛍光の像をフォトンカウント可能な
複数の微弱光検出素子で検出する。各検出素子から得ら
れるフォトン信号をそれぞれ個別にフォトンカウント
し、各検出素子で検出されたフォトンカウント数Ｎｐｍ
を個別に記憶する。さらに上記マルチスポット光と該Ｄ
ＮＡチップとの位置を相対的に変化させて上記各検出器
のフォトンカウント数を順次記憶していく。このように
して上記ＤＮＡチップ上の所望の範囲に亘りフォトンカ
ウント数データを記憶収集し、この収集データから蛍光
画像を構成することによりＤＮＡを検査する。

【００１２】上記マルチスポット光に代えてシート状ビ
ームを用いても、上記蛍光検出でシート状ビームを用い
る蛍光検出で説明したのと同様にターゲットＤＮＡに付
加した蛍光を検出することにより、ＤＮＡ検査を行うこ
とができる。

【００１３】上記対象物体に照射されるマルチスポット
励起光又はシート状の励起光の最小絞り径となる位置に
ある物体面からの蛍光像の合焦点位置にマルチスポット
像またはシート状の細長い領域像のみを通過せしめるマ
ルチスポット開口または細長い開口を配置し、共焦点検
出する。このようにすることにより、信号対雑音比の大
きい共焦点画像が得られる。即ち、検出したいマルチス
ポット位置の蛍光、或いはシート状ビームの位置の蛍光
を、それ以外の光路中に存在する蛍光物質等の背景にあ
る蛍光雑音から影響を受けずに、低雑音で検出できる。
蛍光検出を行うサンプルが２次元平面内にあるときには
マルチスポットとサンプルをこの平面内で相対位置変化
させ共焦点検出を行えば、この平面外にある蛍光体によ
る雑音の影響を殆ど受けずに信号対雑音比の大きな蛍光
検出或いはＤＮＡ検査を行うことができる。

【００１４】上記マルチスポット光を用いる蛍光画像検
出で、マルチスポットと対象物の相対位置変化を対象物
体面内の２方向と対象物体面に垂直な方向の計３方向の
うち少なくとも１方向に行う。特に上記の共焦点検出の
場合、マルチスポットの最小絞り込み位置、或いはシー
トビームの最小絞り込み位置から対象物を光軸方向に相
対位置変化させることにより、得られる蛍光像強度の変
化から合焦点位置を求め、この位置での蛍光強度から表
面に凹凸のある対象に対して、正しい蛍光強度情報と、
表面凹凸情報、或いは蛍光を発している３次元的な位置
情報を得ることが可能になる。

【００１５】上記従来の１スポット励起光の場合におけ
る問題点で示したように、高速に蛍光画像を検出するた
めマルチスポット光の数は多いほど有利である。Ｍは１
０以上にするとこの時間内で検出できる最大のフォトン
カウント数は数百と大きくなり、高感度、広ダイナミッ
クレンジを実現する上で有効である。ＤＮＡ検査等では
更に高速化を行うためスポットの複数化の効果は大き
く。Ｍを５０以上にすると更に良い。即ちＭを５０以上
にすると例えば６０００×６０００絵素を１絵素当たり
数十μｓかけて検出し、全画素を１分以内で検出するこ
とが可能になる。

【００１６】上記マルチスポットは、複数の検出素子、
とりわけ１ないし２次元の直線上に配列した検出素子で
検出するため、また検出した複数の情報を対象物或いは
ＤＮＡチップの位置情報に対応させ蛍光画像として出力
するため１又は２次元の直線上に配列させる。

【００１７】上記マルチスポット励起光またはシート状
励起光と対象物の相対位置変化を行い１絵素分の移動を
おこなう周期をＴｄとする。このとき上記フォトンカウ
ント信号の単独フォトン検出時のパルス幅Δｔ０で割っ
た値、即ちＴｄ／Δｔ０に１以下０．１以上の所望の係
数αを掛けた値，即ちαＴｄ／Δｔ０を求める。この値
が上記フォトンカウント数Ｎｐｍに達していることを判
断基準にして、即ち、αＴｄ／Δｔ０≧Ｎｐｍの時上記
マルチスポット励起光またはシート状励起光の強度を変
化させる等の方法により、蛍光検出強度が小さくなるよ
うにしてフォトンカウントができるようにして検出を行
う。即ち１絵素を検出する時間をフォトンパルス時間幅
で割った値のα倍以上のフォトンカウントは精度の点で
不可能であるため、励起光を小さくしたり、或いは励起
光照射時間を短くし実効的に励起光強度を小さくした
り、或いは検出蛍光を小さくするため検出素子のゲイン
を小さくし、実効的にフォトンカウント可能なフォトン
カウント値にする。

【００１８】上記マルチスポット光またはシート状励起
光を２波長以上の多色光にする。このようにすることに
より蛍光検出の情報を多くし、蛍光検出機能、ＤＮＡ検
出機能を向上させる。

【００１９】また、上記フォトンパルス信号がハイレベ
ルにある時間を１絵素分の検出時間Ｔｄ以内の時間βＴ
ｄに亘り加算計測する。この値をＴｈ′とするとき、１
以下の所定のγに対し、Ｔｈ′≧γβＴｄの条件を満足
するか否かを判定する。仮にこの式を満たすとき、上記
検出素子の出力信号をアナログ的に積分する回路で積算
した結果を用いる。このようにすることにより強い蛍光
にたいしても検出できるようになる。即ち、フォトンカ
ウントが不可能な強い蛍光を検出しても、アナログ的に
積分することにより強い蛍光の検出が可能になる。しか
も、アナログ検出の時間をＴｄ以内にすれば、１絵素当
たりの検出時間を変えずに全絵素に亘り検出できる。こ
の結果、フォトンカウントを用いる微弱な蛍光からこの
積分回路によるるアナログ積分検出を用いる強い検出強
度までの広いダイナミックレンジに亘り高精度にかつ、
高速に検出することが可能になる。また上記αが１に相
当する検出法として、フォトンカウントとアナログ積分
検出を同時に並行して行い、得られた両結果を比較判断
して、何れかの検出結果を用いる。

【００２０】また、上記の励起光源としてレーザを用い
る。このレーザの共振器内にマルチスポット発生ホログ
ラム又はシートビーム発生ホログラムを配置し、レーザ
共振器内の強力なレーザ光でマルチスポットを発生させ
る。通常レーザの共振器内の光エネルギーは出射するビ
ームのエネルギーの１０倍以上になっている。通常のレ
ーザでは出射ウィンドウのミラーの反射率は約９０％に
し、残り約１０％を出射光として取り出している。この
出射ウィンドウの反射率を１００％にし、光を共振器内
に閉じこめ、この共振器内の光路にホログラムを配置す
ることにより、ホログラムの回折効率約１０％をマルチ
スポット光もしくはシート状ビームとして利用すること
ができる。この結果従来のレーザ出射光路中にホログラ
ムを配置する場合に比べ、１０倍近い強度のマルチスポ
ット光もしくはシート状ビームが得られ、高速高感度の
蛍光検出、並びにＤＮＡ検査を行うことが可能になる。

【００２１】

【発明の実施の形態】図１は本発明の実施形態図であ
る。レーザ光源２１１，２１２，２１３……は６３５ｎ
ｍの波長を有する半導体レーザから出射した拡散光を丸
い平行ビームにしたものである。各レーザ光源から出射
したＫ個の光ビームはピッチＰの間隔でマルチビームス
プリッタ２２に入射する。マルチビームスプリッタ２２
はピッチＰでＫ個並び、入射した各ビームを２分し、ピ
ッチＰ／２の２Ｋ個の平行に進むビームを形成する。こ
れらのビームは図示された座標のｙｚ軸に±４５度の方
向に長軸を有する楕円偏光又は直線偏光もしくは円偏光
になっている。

【００２２】２Ｋ個のビームはピッチＰ／２で配列し、
マルチレンズ２３１に入射する。マルチレンズ２３１は
プリズム２３２に貼り付けられている。マルチレンズを
透過したビームはプリズム２３２を通過し、プリズム２
３３との境界にあるマルチピンホールに入射する。

【００２３】プリズム２３２及び２３３はそれぞれ厚さ
がわずかに異なる台形のガラスを底辺同士で接着してお
りこの接着面が偏光ビームスプリット面になっている。
この結果プリズム２３２を通過したビームはピッチＰ／
４で４Ｋ個のピンホールを有するピンホールアレイ２３
４の各ピンホールにビームを収束させる。ピンホールア
レイはピンホール部以外に載る雑音となる迷光を除去
し、ＤＮＡチップに雑音の少ないマルチスポットを照射
する役割を持っている。

【００２４】上記のプリズム２３２を通過する際偏光ビ
ームスプリット面を通過する光はＰ偏光（ｚに直交する
直線偏光）、反射する光はＳ偏光（ｚ方向の直線偏光）
になっている。このためマルチスポットを通過した光の
半分はＰ偏光、残りの半分はＳ偏光になっている。

【００２５】ピンホールアレイの直後には１／２波長板
もしくは１／４波長板がある。１／２波長板は光学軸が
上記のＰおよびＳ偏光に対し２２．５度傾いている。ま
た１／４波長板の場合には４５度傾いている。ピンホー
ル通過後このような波長板を通過した上記ＰおよびＳ偏
光は１／２波長板の場合にはｚ軸に±４５度傾いた直線
偏光に、１／４波長板の場合には右および左回りの円偏
光になる。

【００２６】上記の波長板２３５を通過した光は前述の
台形貼り合わせプリズム２３３（但し台形プリズムの厚
さの差は前述の台形貼り合わせプリズム２３２の半分で
ある）に入射する。このプリズムの台形の底辺である貼
り合わせ面は偏光ビームスプリット面になっているた
め、上記のピンホールアレイおよび波長板を通過した４
Ｋ個の光は更に２倍に増え、ピッチがＰ／８で８Ｋ個に
なる。このためあたかも８Ｋ個の点光源（２次点光源）
がピンホールアレイ２３４の位置にあるようにプリズム
２３３から光が出射してくる。

【００２７】このようにしてできた８Ｋ個の２次点光源
からの光はレンズ２４、ミラー２５、光量調整器２６、
波長選択ビームスプリッタ３０、高ＮＡ対物レンズ３を
通過し、ＤＮＡチップ５の検出面５１にその８Ｋ個の点
光源像を結ぶ。なお光量調整器２６は検出面５１にある
蛍光体の量の多少に応じて蛍光検出の励起光の光量を調
整するためにある。即ち、蛍光体の濃度がＤＮＡチップ
或いは蛍光検出サンプル全体に亘り大きいときには駆動
源２６０を駆動し、例えば１０％のＮＤフィルタ２６２
が励起光光路に挿入されるようにする。しかしこのよう
な励起光全ビームの強度を代えることは検出のダイナミ
ックレンジを狭めることにもなるので、個々の励起光マ
ルチスポットの強度を、図示しない光変調器アレーで調
整することも可能である。

【００２８】また例えば２^Nのダイナミックレンジの検
出が必要な場合、ＮＤフィルタ２６１は１００％（ＮＤ
フィルタ無し）とし、２６２は１００×２^N/2％の透過
率にしておき、全画面をＮＤフィルタを交換して２画面
検出し、両画面を合成し２^Nのダイナミックレンジの蛍
光画像を検出することも可能である。このように２画面
を検出すれば２倍の時間を要するが、マルチスポットを
用いる本発明は従来の方法に比べ５倍以上の速度で検出
することができる。

【００２９】ＤＮＡチップの検出面に照射された８Ｋ個
の点光源像はプローブＤＮＡにハイブリダイゼーション
された先端に蛍光体を持つターゲットＤＮＡを照射し、
励起する。

【００３０】図２はＤＮＡチップ５のガラス５１上のタ
ーゲットＤＮＡがある領域５０の詳細とマルチスポット
の関係を表した図である。５０１はセルである。このセ
ルはｘｙ方向に一定ピッチで配列している。この各セル
にはその配列の番地毎に所望のＤＮＡ断片がガラスに付
着されており、プローブＤＮＡとも呼ばれている。この
プローブＤＮＡは通常各セル内では同じ塩基配列からな
るＤＮＡであり、異なるセルでは通常異なるＤＮＡがプ
ローブされている。このように用意されたＤＮＡチップ
に検査対象である生物の検体から収集し、精製、増幅し
た複数種のＤＮＡ断片の端に蛍光体を付着させたターゲ
ットＤＮＡサンプル液を流し、ハイブリダイゼーション
を起こさせる。即ち各セルのプローブＤＮＡの塩基配列
に対応するターゲットＤＮＡが結合、即ちハイブリダイ
ズする。図２のＤＮＡチップは以上のようにしてできて
いる。

【００３１】セル５０１に対し励起光であるマルチスポ
ット２００１，２００２，２００３，……、２０Ｍはセ
ルピッチの整数倍のピッチで並んでいる。図２の場合こ
の整数は２である。マルチスポットのビーム径はおよそ
Δ、マルチスポットのピッチはＮΔで、図２の場合Ｎ＝
１０で、１セル当たり５×５の絵素に分割して検出して
いる。このような分割を行うのはセル内に異物等が付着
すると、この異物で強い蛍光を発生し検出データに誤差
が生じるため、強い蛍光検出強度以上の絵素は異物によ
るものと判断し、その部分を除いてセル内の平均蛍光強
度を求めるためである。

【００３２】ＤＮＡチップを図２のＡのごとくｘ方向に
走査し、マルチスポットがセルの右端まで走査すると１
絵素Δ分ｙ方向に移動し、再びｘ方向に走査する。これ
を繰り返し、Ｎ絵素（図では１０絵素）走査し終わる
と、ＭＮΔ分ｙ方向に移動し、上記動作を繰り返し、全
セルを走査する。図３は上記の動作を表したものであ
る。横軸に時間を取り、上のグラフは縦軸にｙステージ
の移動量、下のグラフは縦軸にｘステージの移動量を示
したものである。ｘステージは時間ｔ_sで走査検出し、
時間ｔ_t−ｔ_sで元の位置に戻る。往路のみで検出を行っ
ている。ステージの精度が十分良好な場合には復路でも
検出が可能である。

【００３３】同時に検出されるＭ絵素分の蛍光検出は図
１に示すように励起光のマルチスポット照射で発生した
蛍光を対物レンズ３で受け、対物レンズを透過光した蛍
光は波長選択ビームスプリッタ３０で、蛍光波長の６７
０ｎｍ近傍の光を反射させる。ここで反射した蛍光は検
出系に導かれる。即ち、ミラーもしくは波長分離スプリ
ッタである３２，３４，３５及び３８と、結像レンズ３
３を通過し、マルチチャンネルフォトマル１０１及び１
０２上の受光開口に結像する。各受光開口には励起光の
マルチスポットの像とほぼ同程度の径であるピンホール
が開いている遮光板が設けられており、このピンホール
を通過する蛍光のみが検出され、共焦点検出が行われ
る。

【００３４】図４上のグラフは図３下のグラフの時間軸
を拡大したものである。１回の走査に要する時間ｔｓを
更に細かく見ている。図４下のグラフは図４上のグラフ
と横軸の時間軸は等しく、縦軸はフォトマル等の微弱光
検出器によるフォトンカウント時間のタイミングを示し
ている。このグラフの意味は信号レベルが１の時間フォ
トンカウントを行っており、０の時はフォトンカウント
を行わない。一区切りの１の間は１絵素分の信号検出に
なっている。０になり、次に１が始まると次の絵素を検
出することになる。ｘ方向の１走査の間にＬ_x個の絵素
があるため１絵素当たりの検出時間はｔ_s／Ｌ_x以下とな
る。１絵素毎に行うフォトンカウントの時間はＤＮＡチ
ップのセルの位置に対応している必要がある。従ってフ
ォトンカウントの開始の時間はｘステージの位置測定用
測長器の信号に基づいて信号を作る。

【００３５】１絵素のフォトンカウント終了時刻をステ
ージの位置測長器の情報に基づいて決定すると、ステー
ジが一様に動かないとき、フォトンカウント時間が絵素
毎にばらついてしまう。そのため、終了の時間は開始の
時間から一定の時間後になるようにする必要がある。こ
のため高周波（周波数νｒ）のパルス発生器のパルスを
計数し、フォトンカウントスタートから計数し、一定の
パルス数Ｎｒになったらフォトンカウントを終了するよ
うにする。即ちどの絵素についてもＮｒ／νｒ秒の時間
に亘りフォトンカウントを行う。図１の制御回路１は上
記の動作を制御する系であり、１２はＰＣ（パーソナル
コンピュータ）であり、ここで総ての動きのコントロー
ルを行っている。１３は上記のステージ４の制御、駆動
信号を発生し、またステージ４の位置情報を測長器から
取り込んでいる。

【００３６】以上のようにして６４絵素同時に、かつス
テージの走査により次々にｘ方向の絵素の蛍光を検出し
ていく。各絵素で得られフォトンカウント信号Ｓ_PMは図
５に示すようにして検出される。即ち、マルチチャンネ
ルフォトマルの１個のフォトマルに着目すると、微弱な
検出蛍光の場合、フォトマル信号は図５の上のグラフに
示すように低い頻度でパルス時間幅が約３０ｎｓ程度の
フォトン検出パルス信号が得られる。この信号の立ち上
がりから一定幅のパルス信号を発生させるか、或いはコ
ンパレータ回路により図５上グラフに示すように一定信
号レベルＩ_T以上の場合に図５下グラフの信号Ｓ_PCのよ
うに一定レベルの信号になるようにする。このようにし
て作られたパルス整形信号をカウンターで計数すること
により検出時間ｔｓ／Ｌｘ−Δｔ＝Ｎｒ／νｒ時間内の
検出フォトン数を求めることができる。

【００３７】図６は検出蛍光強度が大きい場合の例であ
る。フォトマル検出信号Ｓ_PMとコンパレータ後の信号Ｓ
_PCを示している。フォトンパルスが高頻度で検出される
ため一部分で２つ以上のパルスが重なって検出されてい
る。このためコンパレート後の信号の幅が広いものが現
れている。Ｓ_PC ^′は信号Ｓ_PCの時刻Ａと時刻Ｂの間の時
間を拡大した図である。検出信号が前後に重なって検出
されるとコンパレート後の信号はパルスの幅が広くな
る。この結果コンパレート後のパルス数を単純に数えた
のでは誤差が大きくなる。そこで図６の最下段のグラフ
に示すようにＳ_PC ^′をゲートにして、一定の高周波パル
ス信号を計数する。この計数信号Ｓ_PWCを用いればＳ_PC
信号のパルスを計数するより正確にフォトン数を求める
ことが可能になる。更にＳ_PWC信号の計数値を下に凸な
１価関数Ｆ（Ｓ_PWC）で補正することにより更に正確な
フォトン計数を行うことが可能である。

【００３８】しかしＤＮＡ検査で要求される更に広いダ
イナミックレンジを実現するには、上記の方法では不十
分である。即ちＤＮＡ検査では１絵素を検出する時間内
で数フォトンパルスから１０数万パルスまでのダイナミ
ックレンジが要求されている。ところがフォトン検出パ
ルスの幅は数十ｎｓであるため、総てのダイナミックレ
ンジをフォトンパルスカウントで行おうとすると、１絵
素当たりに要する時間は数十ｎｓ×１０数万＝数ｍsec
必要になる。

【００３９】マルチスポット励起光の数が６４として
も、絵素数が６０００×６０００あると、３０分近く検
出にかかることになる。

【００４０】図７はこの問題を解決する実施例である。
１０１のマルチチャンネルフォトマルの出力信号をアナ
ログスイッチ１Ａに入力する。ＰＣ１０によりアナログ
スイッチの初期状態はＢ即ちフォトンカウント回路１Ｂ
に接続されている。このことは蛍光検出を絵素毎に行う
とき、先ずフォトンカウントを行うことを意味する。図
８はフォトンカウント信号の経時変化を表しており
（ａ）及び（ｂ）は蛍光が非常に小さく、フォトンカウ
ント検出で蛍光強度を求める場合である。

【００４１】図８（ａ）はフォトマル検出したフォトン
パルス信号をコンパレータで２値化したパルス信号Ｓ_PC
である。（ｂ）は（ａ）のパルス信号のパルス数を計数
した計数信号ＮＳ_PCである。この計数信号ＮＳ_PCが計数
開始後α（ｔ_s／Ｌ_x）時間経った時点で決められた閾値
Ｎ₀を越えなければアナログスイッチはこのままの状態
でフォトンカウントを継続し、１絵素分の蛍光検出時間
ｔ_s／Ｌ_x−Δｔの間フォトンカウントを行う。この判断
を行う時点である計数開始後の時間α（ｔ_s／Ｌ_x）はα
として０．０１から０．３程度で良い。即ちこの時間の
間にフォトンカウントパルスが最大で１０前後以上入っ
て来る程度の時間以上であればよい。上記の最大でと言
う意味はこの時間内でパルス信号が最超密に発生した場
合である。

【００４２】図８（ｃ）〜（ｄ）は蛍光が大きくなりフ
ォトンカウントを行うと不都合を生じる場合である。即
ち２個以上のフォトンカウントパルスが同時或いは一部
重なってしまうような場合である。この場合コンパレー
タ後のパルス信号Ｓ_PCは図８（ｃ）の様に一部重なった
パルスは幅広くなる。図８（ｄ）は（ｃ）のパルス信号
の計数信号ＮＳ_PCである。ＮＳ_PCはα（ｔ_s／Ｌ_x）の時
点で閾値Ｎ₀を越えており、フォトンカウントによる蛍
光検出に適さないことが分かる。この時点で図７のアナ
ログスイッチをＣに接続し、回路１Ｃによりアナログ的
にフォトマル信号を積分する。このように各絵素毎にフ
ォトンカウントで検出するかアナログ積分で検出するか
を判断し、最適な方法をその都度選んで検出していく。

【００４３】なお図には示さないが、図８の（ｃ）より
更に蛍光が大きくなると（ｃ）のパルスが連なってしま
い、パルス計数値は数個又は０個になる。このときには
図６の（ｄ）のようにしてＳ_PCを一定周波数の矩形の高
周波パルスでカウントする信号Ｓｐｗｃの信号を用いれ
ば、このパルスカウント信号ＮＳ_PWCは図８（ｅ）のよ
うになる。このＮＳ_PWC信号を用いることにより、閾値
Ｎ１よりこの値が大きいことを判断し、アナログスイッ
チをＣに切り替えれば、更に強い蛍光検出の場合でも間
違えずにアナログ検出が可能になる。

【００４４】アナログ検出に切り替えられれば、回路１
Ｃにより切り替えられた時点をスタート時点として積分
を開始する。図９（ａ）に示すように着目絵素検出開始
時刻を起点（仮にこの時刻を時刻０とする）にして時刻
α（ｔ_s／Ｌ_x）から積分を開始し、フォトンカウントの
場合同様に時刻ｔ_s／Ｌ_x−Δｔまで積分を行い、この時
点で積分値を回路１ＣでＡＤ変換する。ＡＤ変換された
ディジタル情報１Ｃ０１は回路１００に送られる。蛍光
強度が弱い場合にはフォトンカウントを継続し、時刻０
から時刻ｔ_s／Ｌ_x−Δｔ間での間のフォトンカウント信
号が計数され、このディジタル情報１Ｂ０１も回路１０
０に送られる。マルチチャンネルのフォトマル１０１の
各チャンネルから上記のようにして回路１００に並列的
に転送されたフォトンカウントディジタル信号及びアナ
ログ積分ディジタル信号の結果をパソコンＰＣである１
１に転送する。各チャンネルでの検出がフォトンカウン
トかアナログ積分かは前記のように時刻α（ｔ_s／Ｌ_x）
の時点で分かっているので、ＰＣ１１で検出に適した方
を各くチャンネル毎に選択し採用する。即ち図７の１Ｃ
０１、１Ｃ０２……にはこの選択信号も同時に送られて
いる。

【００４５】なお上記の実施例ではフォトンカウントを
選択するかアナログ積分を選択するかを時刻α（ｔ_s／
Ｌ_x）で判断しているが、検出の初めから同時に両方式
で並列に検出しておき、（ｔ_s／Ｌ_x）−Δｔ後に選択を
行っても良い。

【００４６】アナログ積分検出を実行するときの、積分
信号の変化を図９（ａ）に示す。アナログ積分検出をス
タートする時刻α（ｔ_s／Ｌ_x）から時刻ｔ_s／Ｌ_x−Δｔ
の間で蛍光検出光の強度の大きさに比例した傾きで積分
値が大きくなり、時刻ｔ_s／Ｌ_x−Δｔにおける積分値が
サンプルホールドされ、ＡＤ変換される。こんのような
アナログ検出により２桁近いダイナミックレンジに亘る
信号強度変化を捕らえることが可能になる。

【００４７】更に強い蛍光検出の範囲に亘り検出を可能
にする方法を図９（ｂ）を用いて説明する。時刻ｔ_s／
Ｌ_x−Δｔに至る前に積分値が飽和しているので、この
時刻で検出することはできない。しかし、図６（ｄ）で
用いている高周波パルス信号Ｓ_hcを用いて積分をスター
トさせた時刻α（ｔ_s／Ｌ_x）から飽和する時刻ｔ_Fまで
の時間（ｔ_F−α（ｔ_s／Ｌ_x））を計数すれば飽和値Ｉ_F
が予め分かっているので、この検出強度Ｉが次式で求ま
るＩ＝Ｉ_F・（（１−α）ｔ_s／Ｌ_x−Δｔ）／（ｔ_F−α
（ｔ_s／Ｌ_x)）このように積分開始から飽和時間までを計測することに
より更に１桁近くダイナミックレンジを広げることが可
能になる。

【００４８】このような飽和の時刻を計数するには図７
に示すアナログ積分回路に以下の機能を追加すればよ
い。即ち、１Ｃの積分回路の積分信号を第１の入力と
し、予め決めておいた飽和値に相当する信号レベルを第
２の入力としてコンパレータ回路に入力することによ
り、その信号出力の結果の変化から計数終了とすること
により可能である。

【００４９】以上説明したようにマルチチャンネルフォ
トマル１０１及び１０２で検出される蛍光は６４チャン
ネル並列に検出され１００で並列に入力された信号を時
系列的な信号に変換しＰＣ１１に転送する。図１のｘス
テージを走査し、図２に示すようにｙ方向に並ぶ６４絵
素を同時に、かつｘ方向は順次検出していく。図１のｘ
ｙステージ４にはそれぞれ図示されていない光学的な測
長器が付いており、ｘ及びｙステージの移動量が測定さ
れる。ＤＮＡチップの蛍光検出絵素の寸法Δｘ及びΔｙ
は例えばそれぞれ２μｍであるとする。各絵素の測定の
開始はｘステージの測長器が２μｍ移動を計測する時点
から始まる。

【００５０】本発明のマルチスポット蛍光検出或いはマ
ルチスポットＤＮＡ検査の具体的な実施例を以下に説明
する。ｘ方向は走査の動作、ｙ方向はｘの１走査毎に１
絵素分シフトする動作、更にｘは１０走査毎にｙ方向に
大きくシフトし、これを繰り返すことにより、２次元的
に検出或いは検査を行う。

【００５１】ｘ方向の走査で計測開始のステージ位置測
長信号を検出すると、先ずフォトンカウントの計数を開
始する。ｘ方向の検出絵素数Ｌ_xが６４００、絵素ピッ
チが２μｍとし、この２μｍを走査する時間ｔ_sを６０
μsecとする。フォトマルが１フォトンを受光し、発生
するパルスの幅は３０ｎsec程度であるので１絵素をス
ポットが通過する時間６０μsecのうち４０μsecの間フ
ォトンカウントを行う場合、数百〜千のフォトンをフォ
トンカウント法で計数することが可能になる。これ以上
の強度の信号に対してはパルス信号が繋がってしまうた
めアナログ積分検出を行う。このアナログ検出のダイナ
ミックレンジはおよそ百程度ある。従ってフォトンカウ
ントとアナログ積分を上記の方法で切り替えて併用すれ
ばおよそ１万のダイナミックレンジが得られる。

【００５２】更に図９の（ｂ）で説明したアナログ積分
が飽和する時間から検出強度を求める方法を併用すると
更に１桁ダイナミックレンジを拡げることが可能にな
る。この結果およそ２の１６乗、即ち６５５３６の広い
ダイナミックレンジに亘り、即ち４０μsecで数フォト
ンの微弱な検出光から１０万フォトンに達する強い検出
光まで短時間で検出可能になる。

【００５３】以上説明した蛍光強度がフォトンカウント
の領域、アナログ積分の領域、及びアナログ積分飽和時
間検出領域と３つの領域からなる時、それぞれの境界は
スムーズに繋がるようにするため、事前に境界領域に相
当する強度の検出光を用いてキャリブレーションを行
う。

【００５４】上記図７の実施例ではフォトンカウントと
アナログ積分を時間分割して検出しているが、常時両方
を行い、蛍光検出の強度に応じて採用する信号を選択す
ることも可能である。

【００５５】上記の検出方式の切り替えは蛍光検出に限
られたものではなく、一般に１絵素当たりの検出時間Ｔ
ｐが短く限られている場合に有効である。即ちＴｐとフ
ォトン検出パルス時間幅Δｔの比Ｎｒが要求される検出
のダイナミックレンジＮｄに比べ小さいとき、即ちＴｐ／Δｔ＝Ｎｒ＜Ｎｄの時微弱なフォトンカウント領域からフォトンカウント
では計数不可能な強い光まで広い範囲で検出が可能にな
る。

【００５６】６０μsec／１絵素のスピードでｘ方向に
６０００絵素分走査し、この際ｙ方向に１０絵素とばし
で同時に６４絵素検出しているため、３６０ｍsecかけ
て１走査が終了した時点で３８４０００絵素が上記の広
いダイナミックレンジで検出されている。１走査が終了
するとｙ方向にステージを１絵素即ち２μｍ動かし隣の
絵素ラインを同様にして検出する。この動作を１０回繰
り返し、６４０×６０００絵素の検出を行う。ステージ
の戻りに要する加減速の時間を加えても、４から５秒で
上記の絵素数の検出が終わる。

【００５７】次にｙ方向に６４０絵素分２μｍ×６４０
＝１．２８ｍｍと大きく移動し、上記の動作を繰り返
す。この大きな移動を１０回繰り返せば６４００×６０
００絵素が約４０〜５０秒で検出されることになる。即
ち２μｍの解像度で６０００×６０００絵素の像をダイ
ナミックレンジが２の１６乗で、最小検出強度が数フォ
トンの蛍光検出や微弱光検出が１分以内で実現する。

【００５８】上記の実施例では１絵素当たりに要求され
る検出時間が短い場合であるが、１桁以上大きく、かつ
同じように２の１６乗のダイナミックレンジが必要な場
合には図９の（ｂ）に示す飽和時間を検出する方法は必
要でなくなる。またフォトマルのフォトン検出パルスの
幅が更に短くできればフォトンカウントのみ、或いはフ
ォトンカウントとアナログ積分検出の組み合わせで検出
できる。

【００５９】ＤＮＡ検査特にＤＮＡチップを用いるＤＮ
Ａ検査を集団検診等の多数のサンプルを扱う用途に適用
しようとすると高感度、高分解能、広ダイナミックレン
ジでかつ高速の検査装置を実現することが重要になる。
上記の実施例で説明したマルチスポットもしくはシート
状ビームを用いて、同時に複数の絵素を蛍光検出し、励
起光とサンプルの相対位置を走査により変化させ次々と
蛍光検出していくことによりこれが可能になった。

【００６０】６０００×６０００の絵素を６４（Ｍ＝６
４）絵素同時に検出することにより、（３００マイクロ
秒／絵素）以下の時間で検出することで、即ち平均絵素
検出時間が（３００マイクロ秒／Ｍ）以下で検出するこ
とができるようになり、一サンプル当たり３分以下で検
出が可能になった。従来上記の絵素数の蛍光像を検出す
るのに１０分以上要していたので高速検査の需要に応え
うる。更にフォトンカウントとアナログ積分を併用する
ことにより５０マイクロ秒／絵素の時間で検出可能にな
るり、１分以下で検出可能になる。

【００６１】更に、上記のマルチスポットを用いる蛍光
検出でサンプル上のマルチスポット径を小さくすること
により、多数のＭの直径が３μｍより小さく０．３μｍ
より大きい微小なスポットからなるマルチスポット励起
光、又は絞り込み幅が３μｍより小さく０．３μｍより
大きいシート状の励起光を照射する。これにより得られ
る各マルチスポットまたはシート状の照射位置からの蛍
光を励起光から分離し、該サンプルから発する蛍光像を
複数の微弱光検出素子で検出する。各検出素子から得ら
れる信号を個別に記憶し、上記マルチスポット光または
シート状励起光とサンプルとの位置を相対的に変化さ
せ、上記信号を順次記憶して行く、このようにすればサ
ンプル上の所望の範囲に亘り信号が記憶収集でき、収集
データから蛍光画像を構成することによりＤＮＡを検査
することが可能になる。このような方法を用いると、検
出像の分解能が高くなる。この高い分解能を用いれば例
えばサンプルとして所望のターゲットＤＮＡに蛍光を付
加しておき、細胞中の１本鎖ＤＮＡのうち対応するＤＮ
Ａにハイブリダイズさせることにより細胞中の目標とす
るＤＮＡを蛍光像として検出することができ、細胞のＤ
ＮＡ検査が可能になる。

【００６２】図１０は本発明の蛍光検出の実施例図であ
り、特にＤＮＡ検査に有効な蛍光検出の実施例である。
図２と同一番号は同一物を表す。図２で示された１０絵
素おきに照射するマルチスポット光に代え、シート状の
励起光２０００を用いている。励起光の照射で得られる
蛍光は図１の光学系同様にして励起光から分離して１次
元のフォトマルアレイ、或いは超高感度１次元センサで
検出される。シート状のビームでの励起は例えば隣り合
う１次元方向の５０絵素に亘り同時に行われ、１次元の
高感度センサで同時に検出される。ｙ方向に長いシート
状のビームに直交するｘ方向例えば５００画素分にスキ
ャンすることにより、５０×５００絵素分の蛍光像が得
られる。次にｙ方向に５０絵素分移動し、上記の１走査
を行う。これを１０回繰り返せば、最終的には５００×
５００絵素の蛍光画像が得られる。本実施例では孤立し
た、或いは隔たって分離したスポット光を照射する前記
の実施例に比べ若干背景ノイズが大きくなるが、２次元
平面的に大きく照射する場合に比べ、ノイズが小さい蛍
光検出を行うことが可能である。フォトマル又は超高感
度１次元センサから得られる信号は微弱光であるのでフ
ォトンカウント検出を行う。

【００６３】図１１は蛍光検出、或いは蛍光検出を用い
るＤＮＡ検査のマルチスポット励起光発生方法を示す実
施例である。レーザ２７はレーザ媒体が封入されたレー
ザチューブ２７１の両端はブリュースタ角の窓があり、
ここから出たレーザ光は両端にある１００％反射ミラー
２７２及び２７３で折り返される。この共振器ミラーの
間を往復するレーザ光は通常レーザの共振器内の光エネ
ルギーから出射窓を脱げて共振器が外に取り出されるビ
ームのエネルギーの１０倍以上になっている。この共振
機内にマルチスポット又はシートビーム発生ホログラム
板２７０を挿入すると、ホログラム２７０１はマルチス
ポット、またはシート状ビームが発生するように予め作
られているため、図に示すようにレンズ２７４を介して
マルチスポット２７０２が再生される。なおホログラム
に照射したレーザ光は約１０％の回折効率でマルチスポ
ット像を形成する。残りの光は０次光としてそのまま透
過し、共振器内を往復する。このマルチスポットは図１
で説明したマスク状の円開口アレー透過直後のマルチス
ポット光と全く同一のスポットであるため、レンズ２４
を用いて図１の構成により検査対象にマルチスポットを
照射することが可能になる。この結果従来のレーザ出射
光路中にホログラムを配置する場合に比べ、１０倍近い
強度のマルチスポット光もしくはシート状ビームが得ら
れ、高速高感度の蛍光検出、並びにＤＮＡ検査を行うこ
とが可能になる。

【００６４】上記の実施例では励起光として１つの波長
の場合について説明したが、本発明は励起光として２波
長、或いは３波長以上を励起光として用いる場合にも効
果を発揮する。この場合には、従来複数波長で検出しよ
うとすると非常に長い時間を要してしまうが、本発明の
マルチスポット光を用いてフォトンカウント検出を行え
ば高感度、高速に検出することができる。

【００６５】

【発明の効果】以上説明したように本発明により、１絵
素から数カウントのフォトンパルスが得られるような微
弱な蛍光検出物体、とりわけＤＮＡ検査で用いられるＤ
ＮＡマイクロアレイを高速に高分解能、高感度で検出す
ることが可能になった。またアナログ積分検出をも可能
にし、非常に広いダイナミックレンジを有する検出が可
能になった。即ち、例えば６０００×６０００絵素の蛍
光画像を２¹⁶のダイナミックレンジで１分の検出時間で
検出することも可能になった。この結果ＤＮＡチップな
どの検査対象を１分程度の検査時間で検出することが可
能になり、広く行われている集団検診で採取される大量
の検体サンプルを短時間でかつ正確に検査することが可
能になる。

【００６６】また本発明はＤＮＡ検査にのみ適用される
わけではなく、蛍光検出顕微法に広く使われる。従来長
い時間を要していた観察や、検査の時間を大幅に短縮す
る。即ち数フォトンしか検出されない微弱光まで短時間
で検出できるようになった。また微弱光から強い検出光
まで広い範囲に亘り短時間で高精度に検出できるように
なった。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明によるＤＮＡチップの検査装置の概略構
成を示す斜視図である。

【図２】本発明によるＤＮＡチップのセルと励起光の関
係を表すセルの平面図である。

【図３】本発明によるＤＮＡチップのｘｙ方向の走査を
説明する図である。

【図４】本発明によるＤＮＡチップのｘ方向の走査とフ
ォトン検出の関係を示す図である。

【図５】微弱光のフォトンカウント信号を示す図であ
る。

【図６】強い検出光の場合のフォトンパルス信号を示す
図である。

【図７】本発明による広いダイナミックレンジを検出す
る回路構成を示すブロック図である。

【図８】本発明による弱い検出光と強い検出光の判定方
法を示す図である。

【図９】本発明による更に強い検出光を検出する方法を
示す図である。

【図１０】本発明によるシート状の励起光を用いた場合
を示すＤＮＡチップのセルの平面図である。

【図１１】本発明によるマルチスポットをレーザ共振器
内のホログラムで形成する例を示す光学系の一部の斜視
図である。

【符号の説明】１…制御回路１Ａ…アナログスイッチ１Ｂ…フ
ォトンカウント回路２１１，２１２，２１３…レーザ光源２２…マルチ
ビームスプリッタ２３１…マルチレンズ２３２…プリズム３…対
物レンズ４…ｘｙステージ５…サンプル３
３…レンズ３６，３７…干渉フィルタ１０１，
１０２…マルチアノードフォトマル

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 31/22 １２１Ｐ４Ｂ０２９Ｇ０１Ｎ 31/22 １２１ 33/53 Ｍ４Ｂ０６３ 33/53 33/566 33/566 33/58 Ａ 33/58 37/00 １０２ 37/00 １０２ 35/00 Ｚ // Ｇ０１Ｎ 35/00 35/02 Ｆ 35/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ (72)発明者保田健二茨城県ひたちなか市市毛882番地株式会社日立製作所計測器グループ内Ｆターム(参考） 2G042 AA01 BD12 BD20 DA08 FA11 FB05 FC01 HA07 2G043 AA03 BA16 CA03 DA02 EA01 FA02 FA06 GA07 GB19 HA01 HA07 HA09 HA15 JA02 JA03 KA02 KA05 KA07 KA09 LA02 NA14 2G045 AA35 DA12 DA13 DA14 FA11 FB02 FB07 FB12 GB10 GC15 HA09 HA14 JA07 2G058 AA09 CC09 GA02 4B024 AA20 CA01 CA04 HA19 4B029 AA07 AA23 FA12 4B063 QA01 QQ42 QR32 QR55 QR58 QS32 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】蛍光特性を有する対象物体に多数Ｍの微小
なスポットからなるマルチスポット励起光を照射するこ
とにより得られる各マルチスポットからの蛍光を励起光
から分離し、該対象物体から発する蛍光像をフォトンカ
ウント可能な複数の微弱光検出素子で検出し、各検出素
子から得られるフォトン信号をそれぞれ個別にフォトン
カウントし、各検出素子で検出されたフォトンカウント
数Ｎｐｍを個別に記憶し、上記マルチスポット光と該対
象物体との位置を相対的に変化せしめて上記各検出器の
フォトンカウント数を順次記憶して行き、上記対象物体
上の所望の範囲に亘りフォトンカウント数データを記憶
収集し、当該収集データから蛍光画像を構成する蛍光画
像検出方法。
【請求項２】蛍光特性を有する対象物体にシート状の励
起光を照射することにより得られる長細い形状を有する
照射領域からの蛍光を励起光から分離し、該対象物体か
ら発する蛍光像をフォトンカウント可能な複数の微弱光
検出素子で検出し、各検出素子から得られるフォトン信
号をそれぞれ個別にフォトンカウントし、各検出素子で
検出されたフォトンカウント数Ｎｐｍを個別に記憶し、
上記シート状励起光による細長い形状を有する照射領域
と該対象物体との位置を相対的に変化せしめて上記各検
出器のフォトンカウント数を順次記憶して行き、上記対
象物体上の所望の範囲に亘りフォトンカウント数データ
を記憶収集し、当該収集データから蛍光画像を構成する
蛍光画像検出方法。
【請求項３】上記対象物体に照射されるマルチスポット
励起光又はシート状の励起光の最小絞り径となる位置に
ある物体面からの蛍光像の合焦点位置にマルチスポット
像またはシート状の細長い領域像のみを通過せしめるマ
ルチスポット開口または細長い開口を配置し、共焦点検
出することを特徴とする請求項１または２に記載の蛍光
画像検出方法。
【請求項４】上記マルチスポットまたはシート状の励起
光と対象物の相対位置変化は対象物面内方向と対象物体
面に垂直な方向の計３方向の内少なくとも１方向とする
ことにより、２次元又は３次元の蛍光画像を検出するこ
とを特徴とする請求項１または２に記載の蛍光画像検出
方法。
【請求項５】上記マルチスポット励起光またはシート状
励起光と対象物の相対位置変化を行い、１絵素分の移動
をおこなう周期Ｔｄを上記フォトンカウント信号の単独
フォトン検出時のパルス幅Δｔ０で割った値に１以下の
所望の係数αを掛けた値以上に上記フォトンカウント数
Ｎｐｍが達していることを判断基準にして、上記マルチ
スポット励起光またはシート状励起光の強度を変化せし
めるか、蛍光検出強度が小さくなるようにすることを特
徴とする請求項１または２に記載の蛍光画像検出方法。
【請求項６】上記マルチスポット光またはシート状励起
光は２波長以上の多色光であることを特徴とする請求項
１または２に記載の蛍光画像検出方法。
【請求項７】上記フォトンパルス信号がハイレベルにあ
る時間を上記相対的な位置変化に伴う１絵素分の検出時
間Ｔｄ以内の時間βＴｄに亘り加算計測した値Ｔｈ′が
１以下の所定のγに対し、Ｔｈ′≧γβＴｄの条件を満
たすとき、上記検出素子の出力信号をアナログ的に積分
する回路で積算した信号を用いることにより強い蛍光信
号に対しても検出可能にする請求項１または２に記載の
蛍光画像検出方法。
【請求項８】蛍光分子が付加されたＤＮＡ断片を対応す
るＤＮＡに結合させたサンプルに励起光を照射し、蛍光
を検出するＤＮＡ検査方法において、上記サンプルに多
数Ｍの微小なスポットからなるマルチスポット励起光を
照射することにより得られる各マルチスポットからの蛍
光を励起光から分離し、該サンプルから発する蛍光像を
フォトンカウント可能な複数の微弱光検出素子で検出
し、各検出素子から得られるフォトン信号をそれぞれ個
別にフォトンカウントし、各検出素子で検出されたフォ
トンカウント数Ｎｐｍを個別に記憶し、上記マルチスポ
ット光と該サンプルとの位置を相対的に変化せしめて上
記各検出器のフォトンカウント数を順次記憶して行き、
上記サンプル上の所望の範囲に亘りフォトンカウント数
データを記憶収集し、当該収集データから蛍光画像を構
成し、ＤＮＡ検査することを特徴とするＤＮＡ検査方
法。
【請求項９】蛍光分子が付加されたＤＮＡ断片を対応す
るＤＮＡに結合させたサンプルに励起光を照射し、蛍光
を検出するＤＮＡ検査方法において、上記サンプルにシ
ート状の励起光を照射することにより得られる長細い形
状を有する照射領域からの蛍光を励起光から分離し、該
サンプルから発する蛍光像をフォトンカウント可能な複
数の微弱光検出素子で検出し、各検出素子から得られる
フォトン信号をそれぞれ個別にフォトンカウントし、各
検出素子で検出されたフォトンカウント数Ｎｐｍを個別
に記憶し、上記シート状励起光による細長い形状を有す
る照射領域と該サンプルとの位置を相対的に変化せしめ
て上記各検出器のフォトンカウント数を順次記憶して行
き、上記サンプル上の所望の範囲に亘りフォトンカウン
ト数データを記憶収集し、当該収集データから蛍光画像
を構成し、ＤＮＡ検査することを特徴とするＤＮＡ検査
方法。
【請求項１０】上記サンプルはＤＮＡチップであること
を特徴とする請求項８または９に記載のＤＮＡ検査方
法。
【請求項１１】上記ＤＮＡサンプルに照射されるマルチ
スポット励起光又はシート状の励起光の最小絞り径とな
る位置にある物体面からの蛍光像の合焦点位置にマルチ
スポット又はシート状の励起光像のみを通過せしめるマ
ルチスポット開口または細長い開口を配置し、共焦点検
出することを特徴とする請求項８または９に記載のＤＮ
Ａ検査方法。
【請求項１２】上記Ｍは１０以上であることを特徴とす
る請求項８記載のＤＮＡ検査方法。
【請求項１３】上記Ｍは５０以上であることを特徴とす
る請求項１２記載のＤＮＡ検査方法。
【請求項１４】上記マルチスポットは１又は２次元の直
線上に配列していることを特徴とする請求項８記載のＤ
ＮＡ検査方法。
【請求項１５】上記マルチスポット光またはシート状励
起光とＤＮＡサンプルとの１絵素分の相対位置変化を行
う周期Ｔｄを上記フォトンカウント信号の単独フォトン
検出時のパルス幅Δｔ０で割った値に１以下の所望の係
数αを掛けた値以上に上記フォトンカウント数Ｎｐｍが
達していることを判断基準にして、上記マルチスポット
励起光またはシート状励起光の強度を変化せしめるか、
蛍光検出強度が小さくなるようにすることを特徴とする
請求項８または９に項記載のＤＮＡ検査方法。
【請求項１６】上記マルチスポット光またはシート状励
起光は２波長以上の多色光であることを特徴とする請求
項８または９に記載のＤＮＡ検査方法。
【請求項１７】上記フォトンパルス信号がハイレベルに
ある時間を１絵素分の検出時間Ｔｄ以内の時間βＴｄに
亘り加算計測した値Ｔｈ′が１以下の所定のγに対し、
Ｔｈ′≧γβＴｄの条件を満たすとき、上記検出素子の
出力信号をアナログ的に積分する回路で積算した信号を
用いることにより強い蛍光信号に対しても検出可能にす
る請求項８または９に記載のＤＮＡ検査方法。
【請求項１８】蛍光分子が付加されたＤＮＡ断片を対応
するＤＮＡに結合させたサンプルに励起光を照射し、蛍
光を検出するＤＮＡ検査方法において、多数Ｍの微小な
スポットからなるマルチスポット励起光又はシート状の
励起光を照射することにより得られる各マルチスポット
またはシート状の照射位置からの蛍光を励起光から分離
し、該サンプルから発する蛍光像を複数Ｍの微弱光検出
素子で平均絵素検出時間が（３００マイクロ秒／Ｍ）以
下で検出し、各検出素子から得られる信号を個別に記憶
し、上記マルチスポット光またはシート状励起光と該サ
ンプルとの位置を相対的に変化せしめて上記信号を順次
記憶して行き、上記サンプル上の所望の範囲に亘り上記
信号を記憶収集し、当該収集データから蛍光画像を構成
し、ＤＮＡを検査することを特徴とするＤＮＡ検査方
法。
【請求項１９】蛍光分子を付加したＤＮＡ断片を対応す
るＤＮＡに結合させたサンプルに励起光を照射し、蛍光
を検出するＤＮＡ検査方法において、多数Ｍの直径が又
は絞り込み幅が３μｍより小さく０．３μｍより大きい
微小なスポットからなるマルチスポット励起光、３μｍ
より小さく０．３μｍより大きい幅を有するシート状の
励起光を照射することにより得られる各マルチスポット
またはシート状の照射位置からの蛍光を励起光から分離
し、該サンプルから発する蛍光像を複数の微弱光検出素
子で検出し、各検出素子から得られる信号を個別に記憶
し、上記マルチスポット光またはシート状励起光と該サ
ンプルとの位置を相対的に変化せしめて上記信号を順次
記憶して行き、上記サンプル上の所望の範囲に亘り上記
信号を記憶収集し、当該収集データから蛍光画像を構成
することによりＤＮＡを検査することを特徴とするＤＮ
Ａ検査方法。
【請求項２０】励起光源と、蛍光分子が付加されたＤＮ
Ａ断片を対応するＤＮＡに結合させたサンプルを保持す
る機構と、該光源から出射する光を径がｄで複数Ｍのマ
ルチスポット励起光として該サンプル上に同時に発生さ
せるマルチスポット励起光発生光学系と、当該マルチス
ポット励起光を該サンプル上のＤＮＡ断片に付加した蛍
光物体に同時に上記寸法ｄで照射せしめる対物レンズ
と、得られる蛍光を当該対物レンズを介して蛍光検出光
路に導くビームスプリッタと、上記マルチスポット励起
光により発生した各マルチスポット光からの蛍光を分離
して検出する蛍光検出手段と、当該蛍光検出手段で得ら
れた各マルチスポット光からの蛍光のフォトンパルス信
号を個別にフォトンカウントする回路からなるフォトン
カウント手段と、該サンプルの所望の領域に亘りマルチ
スポット光を照射し蛍光検出するように上記マルチスポ
ット光の位置とサンプルの位置を相対的に変化せしめる
駆動手段と、当該駆動手段並びにフォトンカウント手段
により検出されたサンプルの所望領域のフォトンカウン
ト情報とフォトンカウント位置情報を保存する手段と、
該フォトンカウント情報とフォトンカウント位置情報か
ら被検査サンプルのＤＮＡ情報を求める手段とからなる
ＤＮＡ検査装置。
【請求項２１】励起光源と、蛍光分子が付加されたＤＮ
Ａ断片を対応するＤＮＡに結合させたサンプルを保持す
る機構と、該光源から出射する光を長径Ｄ、短径ｄのシ
ート状の励起光を該サンプル上に発生せしめるシート状
励起光発生光学系と、当該シート状励起光をサンプル上
のＤＮＡ断片に付加した蛍光物体に短径が上記寸法ｄに
なるように照射せしめる対物レンズと、得られる蛍光を
当該対物レンズを介して蛍光検出光路に導くビームスプ
リッタと、上記シート状の励起光により発生したシート
状の光からの蛍光を分離して検出する蛍光検出手段と、
当該蛍光検出手段で得られたシート状の光からの蛍光の
フォトンパルス信号を個別にフォトンカウントする回路
からなるフォトンカウント手段と、該サンプルの所望の
領域に亘りシート状の光を照射し蛍光検出するように上
記シート状の光の位置とサンプルの位置を相対的に変化
せしめる駆動手段と、当該駆動手段並びにフォトンカウ
ント手段により検出されたサンプルの所望領域のフォト
ンカウント情報とフォトンカウント位置情報を保存する
手段と、該フォトンカウント情報とフォトンカウント位
置情報から被検査サンプルのＤＮＡ情報を求める手段と
からなるＤＮＡ検査装置。
【請求項２２】上記ＤＮＡチップに照射されるマルチス
ポット励起光またはシート状励起光の最小絞り径ｄとな
る位置にある物体面からの上記対物レンズによる蛍光像
の合焦点位置にマルチスポット像又はシート像のみを通
過せしめるマルチスポット開口を配置し、共焦点検出す
ることを特徴とする請求項２０または２１に記載のＤＮ
Ａ検査装置。
【請求項２３】上記Ｍは１０以上であることを特徴とす
る請求項２０記載のＤＮＡ検査装置。
【請求項２４】上記Ｍは５０以上であることを特徴とす
る請求項２０記載のＤＮＡ検査装置。
【請求項２５】上記マルチスポット光またはシート状励
起光とＤＮＡチップの相対位置変化を行う周期Ｔｄを上
記フォトンカウント信号の単独フォトン検出時のパルス
幅Δｔ０で割った値に１以下の所望の係数αを掛けた値
以上に上記フォトンカウント数Ｎｐｍが達していること
を判断基準にして、上記マルチスポット励起光の強度を
変化せしめる手段を具備したことを特徴とする請求項２
０または２１に記載のＤＮＡ検査装置。
【請求項２６】上記マルチスポット光またはシート状励
起光を２波長以上の多色光とする、上記励起光源、上記
マルチスポット発生光学系又はシート状励起光発生光学
系、上記蛍光検出手段、並びに上記フォトンカウント手
段とからなることを特徴とする請求項２０または２１に
記載のＤＮＡ検査装置。
【請求項２７】上記フォトンパルス信号がハイレベルに
ある時間を１絵素分の検出時間Ｔｄ以内の時間βＴｄに
亘り加算計測した値Ｔｈ′が１以下の所定のγに対し、
Ｔｈ′≧γβＴｄの条件を満たすか否かを判断する手段
と、上記検出素子の出力信号をアナログ的に積分する回
路で積算する手段と、上記フォトンカウント手段により
得られた結果と、当該アナログ的積分回路手段で得られ
た結果とを用いて当該絵素の蛍光検出結果を決定する手
段を具備した請求項２０または２１に記載のＤＮＡ検査
装置。
【請求項２８】レーザからなる励起光源と、蛍光分子が
付加されたＤＮＡ断片を対応するＤＮＡに結合させたサ
ンプルを保持する機構と、当該レーザの共振器内にマル
チスポット発生ホログラム又はシートビーム発生ホログ
ラムを配置し、レーザ共振器内の強力なレーザ光でマル
チスポットまたはシートビームを発生させるマルチスポ
ットまたはシートビーム励起光発生光学系と、当該励起
光を該サンプル上のＤＮＡ断片に付加した蛍光物体に照
射せしめる対物レンズと、得られる蛍光を当該対物レン
ズを介して蛍光検出光路に導くビームスプリッタと、上
記励起光により発生した蛍光を励起光から分離して検出
する蛍光検出手段と、該サンプルの所望の領域に亘り励
起光を照射し蛍光検出するように上記励起光の位置とサ
ンプルの位置を相対的に変化せしめる駆動手段と、当該
駆動手段並びに蛍光検出手段により検出されたサンプル
の所望領域の蛍光検出情報と蛍光検出位置情報を保存す
る手段と、該蛍光検出情報と蛍光検出位置情報から被検
査サンプルのＤＮＡ情報を求める手段からなるＤＮＡ検
査装置。