JP3551860B2 - Ｄｎａ検査方法及びｄｎａ検査装置 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＤＮＡを蛍光検出により検査する装置に関する。特に多数の生体のＤＮＡを高速に検査するＤＮＡ検査方法及びその装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来のＤＮＡチップの検査では、ＤＮＡチップ上に励起光のスポットを１点照射し、この照射した励起光により発生する蛍光を共焦点検出することを、ＤＮＡチップと検出スポットとの相対位置を変化させてチップ上の照射位置を順次変化させることにより、チップ上の所望の場所を順次検出する方法により行っていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ＤＮＡの検査を、従来の血液検査のような生体検査に適用しようとすると、多数の生検体に対し、高速に行うことが不可欠になる。しかるに、従来の技術では、ＤＮＡチップの必要な検査分解能に対し、この分解能相当の励起光スポットを１点照射し、得られる蛍光を順次検出していると、検査時間が大幅にかかる。これは、この１点の検出当たりに必要な時間が無制限に短くできないことに関係している。即ち、励起光を照射したのち、蛍光が発生し終わるまでの時間ΔｔＬがおおよそ１０ｎ秒程度かかるためである。蛍光が終わるのを待たず次に検出点に移ってしまうと検出できなくなる。
【０００４】
また、上記の必要な検出分解能相当のスポット光サイズ中に、数個の蛍光分子があるような状態まで高感度に検出することが必要である。しかし、発生した蛍光が総て検出されるわけではない。即ち、検出光学系の光利用効率や光検出に用いられる光電子倍増管量子効率が、１００％ではない。更に、励起光が蛍光物体で吸収される効率や、吸収された励起光が蛍光に変わる確率が小さい。このため、ΔｔＬの少なくとも数十倍から数百倍の時間をかけて検出する必要があり、更にこの時間を長くするほど、フォトンカウントに近い微弱光に対する検出精度が高くなる。
【０００５】
また、このような高速性を実用レベルで達成するには、ＤＮＡチップに混入する各種タンパク質からなる異物の影響を除去或いは低減したり、蛍光体を付加したターゲットをハイブリダイゼーションした検査面に、検出系の焦点を常時合わせる必要がある。また、複数の蛍光に対して、高速に検査することが必要になる場合もある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するために、本発明では以下に示す様な手段を施している。
【０００７】
各セルの寸法Ｄ以下のスポット径ｄからなり複数Ｍの励起光を互いに異なる位置に蛍光減衰時間以上の時間Δｔに亘り対物レンズを用いて同時に照射し、得られる蛍光を蛍光検出光路に導き、ＤＮＡチップの照射スポットと共役な関係にある 結像面で検出し、蛍光の位置と強度から被検査ＤＮＡチップの検査を行う。このとき上記スポット径は上記セル寸法の整数Ｎに対しほぼ１／Ｎにする。更に上記照射スポット位置とＤＮＡチップの相対位置を順次ｊ回に亘り異ならしめ全検査対象位置ＬＮ２＝Ｍｊを検査する。またＮを２以上にしセルを複数の部分に分割し、１セル内にあるＮ２個のデータの内有意なデータのみを選択し、処理することにより正確な検査を行う。このようにすることにより、ＤＮＡチップの全検査対象サンプル点数ＬＮ２に対し、ＬＮ２／（６×１０５）秒以内の時間で蛍光検出する。
【０００８】
上記ＤＮＡチップへの複数ＭのＤＮＡチップへの照射スポットと共役な関係にある 結像面で照射スポット像とほぼ同程度の有効径を有するＭ個の受光開口を有し、当該受光開口外は遮光し、当該受光開口を透過した各々の光を検出することにより、照射スポット或いは照射スポット面以外からの雑音光を除去し信号対雑音比の高い検査を行っている。また上記照射スポット像とほぼ同程度の有効径を有するＭ個の受光開口は光ファイバ受光端であり、該ファイバの出射端より出射する光を検出することにより更に信号対雑音比の大きな検出を行っている。
【０００９】
上記ＤＮＡチップへの複数Ｍの照射スポットはスポット径ｄ、整数ｋに対しほぼｋｄの間隔を持って直線上に配列し、このスポットアレイを上記Δｔ時間照射後、ほぼｄだけアレイ方向に移動し、Δｔ時間照射する。この動作を順次ｋ回繰り返すことにより、アレイ方向にｋＭ個のスポット位置に亘り検査を行い、かつＤＮＡチップと検査装置を少なくともアレイと直角方向に、相対的に移動することによりＤＮＡチップの所望の２次元領域を検査する。また上記スポットアレイの移動は音響光偏向器を用いて行うことを特徴とする。
また整数ｋは２以上であることが望ましく、さらにｋは５以上であると信号耐対音比の上で更に有利である。
【００１０】
上記スポットアレイはマイクロレンズアレイで形成する。また上記スポットアレイはホログラムで形成することもできる。上記スポットアレイのアレイ方向の移動と同期させ、励起光により生じた蛍光が上記受光開口上のほぼ同一箇所に来るように蛍光検出光路内に蛍光検出偏向手段を設ける。この際上記蛍光検出偏向手段は圧電素子を用いた偏向手段を用いる。また上記蛍光検出偏向手段は励起光を透過させ、蛍光を反射させる波長選択ビームスプリッタで構成さすることにより効率よく検出できる。また励起光との分離を良くするため励起光路から分離された蛍光検出光路内に蛍光のみを透過し、励起光を遮光するフィルタを用いる。
【００１１】
上記Ｍ個のマルチ励起スポット光が上記対物レンズの瞳上でほぼ同一位置Ａを通過するようにし、ＤＮＡチップで正反射した当該励起光が対物レンズの瞳上の位置Ｂ’に達するように構成する。このようにして、対物レンズの瞳上にあるＢ′の位置、もしくは蛍光検出光路内にあり上記対物レンズの瞳と共役な面上のＢ’の像位置、に反射励起光を遮光する手段を施すことにより雑音成分となる励起光を蛍光検出信号から除去する。
【００１２】
また上記Ｍ個のマルチ励起スポット光が上記対物レンズの瞳上でほぼ同一位置Ａを通過し、ＤＮＡチップで正反射した当該励起光が対物レンズの瞳上の上記Ａとは異なる位置Ｂを通過するように構成する。このようにして対物レンズの瞳もしくは、蛍光検出光路内で対物レンズの瞳と共役な位置にＢを中心に所望の径の反射励起光を遮光する部材を配置する。このようにして雑音成分となる励起光を蛍光検出信号から除去する。
【００１３】
更に上記遮光する反射励起光を正反射励起光にし、ＤＮＡチップ内の異物から散乱した励起光が上記遮光手段又は遮光部材外から透過するようにして取り出し、取り出された散乱光を上記蛍光検出光路から分岐し、ＤＮＡチップの照射スポットと共役な位置で撮像して、検出する。検出した散乱光の像の撮像情報を用いて、上記蛍光検出手段で検出した蛍光情報を補正する。このようにすることによりＤＮＡチップ内に存在する異物からの散乱光の影響を排除して正確な検出が可能になる。
【００１４】
上記Ｍ個のマルチ励起スポット光をレーザ光源で形成する。このようにすることにより微小なスポットに強度の大きい励起照射が実現する。またＭ個のマルチ励起スポット光を複数の半導体レーザ光源により形成することにより、小さな実装体積でより大きな励起照射が実現する。この際上記複数の半導体レーザ光源より出射した光を光ファイバに導入し、Ｍ個の所望のピッチで整列した当該光ファイバの出射端から出射する構成にする。このようにすることにより所望のピッチ配列であるＭ個のマルチ励起スポット光を得ることが可能になる。
【００１５】
光信号蓄積型撮像手段として超高感度のＮｘ×Ｎｙ画素数からなる２次元撮像装置を用い、ｎｘ、ｎｙを整数とし、スポット径ｄの励起光をｘ方向にｎｘｄ、ｙ方向にｎｙｄのピッチでＮｘ×Ｎｙスポット同時に照射する。このようにして得られるＮｘ×Ｎｙからなる蛍光スポット像を超高感度２次元撮像装置で検出し、かつ検出装置とＤＮＡチップとの相対位置をピッチｄでｘｙ方向にｎｘ×ｎｙステップ移動する。このようにすることによりＤＮＡチップの所望の領域を検出することが可能になる。
【００１６】
また上記励起光は複数の異なる波長からなり、複数の蛍光体を付加した異なるターゲットを分離して検出する。更に上記複数の波長からなる励起光を同時に照射し、複数の蛍光体を付加した異なるターゲットを分離して同時に検出する。このようにすることにより多様な検出対象を高速に行うことが可能になる。
【００１７】
上記被検査ＤＮＡチップの所望の蛍光体を付加したターゲットをハイブリダイゼーションした検査面上に、上記励起スポット光の近傍に第２の光を斜め入射させ、該検査面で反射した光の位置を検出することにより焦点検出する。この検出情報に基づき検査面と上記対物レンズの相対距離を制御することにより焦点合わせを行うことが可能になる。また、上記第２の斜め入射させる光が対物レンズを通過するように構成することにより、簡単な構成で焦点検出、制御が可能になる。
【００１８】
上記第２の斜め入射させる光を検出面にたいしＳ偏光にする。このようにすることにより、蛍光検出面での反射率を高め、正しい焦点検出が可能になる。更に上記第２の斜め入射させる光は上記蛍光体を励起しない波長を用いる。このようにすることにより、蛍光検出信号に雑音を重畳させずに正確な検出が可能になる。
【００１９】
【発明の実施の形態】
図１は、本発明の実施形態を示す図である。１は蛍光検出のために、マルチスポット励起光形成し、ＤＮＡチップ２に照射するマルチスポット励起光照射系であり、３はマルチスポット励起光で発生した蛍光を検出する蛍光検出系である。１１は励起光光源と励起光のビーム成形光学系を含む励起光源である。Ｈｅ−Ｎｅレーザ光を焦点距離の異なる２個のシリンドリカルレンズで所望の縦横ビーム径比に成形し、ミラー１０００を経由しＡＯ偏向器に入射させる。ＡＯ偏向器には水晶振動子に印加する周波数ωの高周波電圧端子とこの周波数より低い振幅信号ωＶの入力端子がある。
【００２０】
制御回路４から送られる周波数ωの信号はω±ω０の範囲の周波数帯を持っている。周波数が変わるとＡＯ偏向器に入射する励起光の回折角が変わる。また制御回路４から振幅信号ωＶを入力すると回折効率が変わるので、回折光の強度を制御することができる。ＡＯ偏向器を通った回折光は０次光（図示せず）と分離され（０次光は遮光される）、焦点距離ｆ１とｆ２の２つのレンズ１３１と１３２からなるレンズ系１３により所望のビーム系でマイクロレンズアレー１４を照射する。ＡＯ偏光器の周波数を変化させると、マイクロレンズアレー１４に入射する励起光の位置は変わらずに角度が変化する。
【００２１】
図４はマイクロレンズアレー１４の拡大詳細図である。ガラスでできた微小マイクロレンズが１次元状に３２〜２５６個、多数並んでおり、ここに入射した光は、例えば実線で示す１０１０はマイクロレンズを透過し、各マイクロレンズ１４１，１４２……を透過し、焦点面Σ上の直線Ｌの上に微小スポット１１１，１１２……１１Ｍを結ぶ。ＡＯ偏向器の周波数を変えると図４の点線で示すようにマイクロレンズに入射する励起光の角度が変化し、直線Ｌ上の微小スポットの位置が１ｊ２１、１ｊ２２……１ｊ２Ｍの様に変化する。
【００２２】
マイクロレンズアレー１４の焦点面Σ上にできた微小スポットアレー１１１，１１２……１１Ｍは図１に示すようにレンズ１５と対物レンズ１６によりＤＮＡチップ２のハイブリダイゼーションされたターゲットに付加した蛍光体を照射し、励起する。このターゲットが付いているガラス面Σ１又はΣ２（詳しくは図３３参照）上で最小のビーム径となるように対物レンズ１６のフォーカスがなされる。
【００２３】
図２はＤＮＡチップ２の面構造の詳細を示したものである。縦横の細い線で示した正方形の最小単位２０１，２１１，２０２，２１２等は検出絵素を表す。図では５×５の絵素（太い線で示す）分がセル２０である。１つのセルには同一のＤＮＡ情報の断片が植えられている。従ってこのセルには同じＤＮＡ断片構造を持つターゲットがハイブリダイズされる。
【００２４】
このように１つのセルを複数の絵素で分割する理由は１つのセル内に異物であるタンパク質等が混入していたとき、このタンパク質に入射した励起光により、大きな強度の蛍光が発生するようなことが生じる。通常このような異物の寸法はせいぜい数μｍであるので、絵素寸法が数μｍであり、セルの寸法が例えば１０μｍならば、１０μｍのセル内の異物位置が後述するような方法で検出、分離できれば、異物部分以外の情報により蛍光の大きさを正確に求めることが可能になる。
【００２５】
図３はＤＮＡチップの側面図である。この絵ではハイブリダイズされているターゲットがガラス基板の上に裸で乗っている構造になっている。このような場合もあるし、後述するようにガラス基板の間に挟まれている場合もある。いずれにしてもターゲットのある面に微小励起光スポットが集光される。この集光径は図２で示した正方形最小単位である検出の絵素の寸法にほぼ等しい。
【００２６】
ＡＯ偏向器の初期の周波数では図１の実線で示す回折光が得られており、このときには図３に示すようにＤＮＡチップに１０１，１０２，１０３……の様に励起光スポットアレイがＤＮＡチップ上の絵素２０１，２０２，２０３……２０Ｍに照射され、後述するように各絵素の蛍光が検出される。この励起光の照射時間は蛍光減衰時間以上の時間Δｔ（数〜数百μｓ）で、本実施形態例では６０μｓである。
【００２７】
６０μｓ経過後、ＡＯ偏向器の周波数が変えられると励起光の回折角が変わり、図１および図４で示すように、マイクロレンズアレーには点線で示す１０ｊ２０の光が入射し、図３のＤＮＡチップには１１１，１１２，１１３……１１Ｍの様に励起光スポットアレイが照射され、２１１，２１２，２１３……２１Ｍの絵素の蛍光が検出される。このようにしてＭ個のマルチスポットが絵素ピッチずつずれて順次照射され、ｊ絵素分ずれるとｊＭ絵素分が総て検出されることになる。
【００２８】
次に蛍光検出の実施形態を図１で説明する。レンズ１５と対物レンズ１６の間にあるビームスプリッタ３０は波長分離ビームスプリッタである。本実施形態で用いている励起光源ＨＥ−Ｎｅレーザの波長は６３３ｎｍであり、チップ上のターゲットに付加されている蛍光体はＣｙ５である。検出する蛍光の波長は６７０ｎｍ近辺である。
【００２９】
波長分離ビームスプリッタ３０は６３３ｎｍでは４５度入射光をほぼ１００％透過し、６７０ｎｍの蛍光は４５度入射でほぼ１００％反射である。しかし６３３ｎｍもごくわずか反射する。このごくわずかの反射でも、蛍光が非常に微弱であるので問題となる。そこで図１の実施形態では６７０ｎｍに中心波長特性を持ち、反値幅が約１５ｎｍの干渉フィルタ３４を蛍光検出系３に挿入し、励起光の漏れをこの干渉フィルタで遮光している。なお３４は干渉フィルタに限定されるものではなく、ある波長以上は透過し、以下は遮光するいわゆる色フィルタを用いても良い。また色フィルタと干渉フィルタを組み合わせて用いても良い。以降の実施形態の説明では説明の簡潔のため干渉フィルタのみで説明する。
【００３０】
次にＡＯ偏向器を用いてマルチスポット励起光のＤＮＡチップ上の位置を変化させるときの、検出蛍光像の位置の変化と、固定の検出器で検出するために行う必要のある、前記位置変化の補正について説明する。図１の波長分離ビームスプリッタ３０はこの位置変化の補正も行っている。図５は図１の主要な部分を示しており図１と同一番号は同一物を表している。波長分離ビームスプリッタ３０は５〜１０ｋＨｚの高い共振周波数特性を持つピエゾ素子３０１で駆動され、ｙ軸を中心に微小回転する構造になっている。
【００３１】
図６、図７はこの微小回転の役割を示した図であり、図１と同一番号は同一物を表している。制御回路４からＡＯ偏向器１２に入力される偏向信号により、図６（Ｃ）のＤＮＡチップ２上のマルチ励起微小スポット１０１１、１０２１、………、１０Ｍ１のそれぞれの位置が１絵素ずつ１０１２、１０２２、………、１０Ｍ２と順次変化させていく。このとき図６（Ｄ）に示すように波長分離ビームスプリッタ３０が回転しないとすると、ＤＮＡチップと共役な位置にある蛍光検出面ΣＰＨ上のマルチ蛍光点１２１１、１２２１、………、１２Ｍ１はやはり１絵素ずつ１２１２，１２２２、………、１２Ｍ２へ変化する。
【００３２】
蛍光検出面上の蛍光スポット像１２１２は、図に示すように、蛍光検出用マイクロレンズアレー３２１により１２１２点が光ファイバ束３２２の１本のファイバ端に結像し、ファイバに入射する。１本の光ファイバは光が通る芯３２２１とそれを保護する部分３２２２から成り立っている。光が通る芯の径は、蛍光検出面ΣＰＨ上の（マルチ）蛍光点１２１１よりやや大きい。しかし、波長分離ビームスプリッタ３０が回転しないと、１２１１点がＡＯ偏向器の駆動により１２１２，１２１３，１２１４、………と移動し、ファイバ入射端からずれていき、検出できなくなってしまう。そこ高い共振周波数特性を持つピエゾ素子３０１で図７に示すように波長分離ビームスプリッタ３０を微小回転駆動する。
【００３３】
すなわち微小回転しない場合の図６では、蛍光微小スポット像１２１１が異なる場所１２１２，１２１３，１２１４に移動したのに対し、微小回転することにより、図７の点線の枠内に示すようにΣＰＨ上のほぼ同一位置にスポットがくる。
【００３４】
図８は、以上説明したＡＯ偏向器１２のＯＮ−ＯＦＦあるいは強度変調信号ＳＡ１２、同じくＡＯ偏向器の偏向信号ＳＢ１２、波長分離ビームスプリッタ３０を偏向駆動するピエゾ素子３０１の駆動信号Ｓ３０、ファイバ３２を介してｋ番目の１つのフォトマル３３で検出する蛍光検出信号Ｓ３３ｋ、この蛍光検出信号の絵素ごとの画像蓄積（積分）信号Ｓ′３３ｋ、およびこの画像蓄積の各絵素毎の最終結果（画像蓄積していき、励起スポット光が次の絵素の励起に移る前の時刻でＳ′３３ｋをサンプルホルドした値）Ｓ″３３ｋについて各信号の相対的な時間変化を表している。このグラフの実施例ではマルチスポット励起光をＡＯ偏向器により順次１絵素ずつずらして行き、このようにして１つのスポットを１０絵素まで順次ずらしている。
【００３５】
このずらす数は、各絵素の検出のＳＮを向上させるため２以上必要であり、大きいほどＳＮ向上を図る上で望ましいが、装置の構成部品上の制限等により自ずと上限がある。しかし５以上にすると隣接するスポット励起光による光路途中の異物照射に伴う散乱光、あるいは蛍光の影響等が大幅に少なくなる。
【００３６】
図８に示すようにＡＯ偏向器１２の周波数（超音波水晶振動子に与える超音波の周波数、すなわち偏光器の偏向角度）信号ＳＢ１２を順次ステップ的に変え、この間この変化に応じて波長分離ビームスプリッタ３０を偏向駆動するピエゾ素子３０１の駆動信号Ｓ３０、を線形に変化させる。ＡＯ偏向器１２が超音波の伝播による透明媒体の屈折率のごくわずかな変化により、光を回折させているのに対し、ピエゾ素子３０１はビームスプリッタ全体を駆動させるため、周波数応答性が異なるため早いＡＯ偏向器の信号ＳＢ１２はステップ、遅いピエゾ素子の駆動信号Ｓ３０は線形にしている。
【００３７】
図９はこの２つの信号により蛍光検出面ΣＰＨ上できる蛍光スポット像の位置を示した図である。この図の上から下への変化は時間ｔの経過を表している。左の２つのグラフはＳＢ１２、とＳ３０の変化であり、図８ではステップ数が１０であったが、この図ではステップ数が５である。図９のグラフの右側にある実線の丸○、３２１１′、３２２１′、３２３１′………は蛍光検出マルチスポット像が図６で説明したようにピエゾ素子による位置補正をおこなわない場合の像の位置ずれを示している。なお、図の右方向（横方向）はスポットアレイの配列方向ｘＡを表しており実線の丸○、３２１２′、３２２２′、３２３２′………は隣接する蛍光スポット像の位置ずれを示している。点線の丸○はピエゾ素子により位置補正を行った結果である。
【００３８】
すなわち、ＡＯ偏向器でステップ移動し、励起光が停止していても、ピエゾ素子は線形に偏向を駆動しているため励起光が停止している間に蛍光検出面ΣＰＨ上できる蛍光スポット像の位置は３２１１−、３２１１，３２１１＋とわずかではあるが動いてしまう（隣の蛍光スポット像の位置では３２１２−、３２１２，３２１２＋とわずかではあるが動いてしまう）。
【００３９】
励起光がＤＮＡチップ上の次の照射位置にステップ移動し停止している間には、蛍光スポット像の位置は、３２２１−、３２２１，３２２１＋とわずかではあるが動いてしまう（隣の蛍光スポット像の位置では３２２２−、３２２２，３２２２＋とわずかではあるが動いてしまう）。この蛍光スポット像のわずかな動きをカバーして検出するには図９の下の図１０に示すように蛍光検出受光面（あるいは受光面と共役な面）３２０にアレイ方向ｘＡに長い長円開口の配列３２０１，３２０２………３２０Ｍを設ける。上記のファイバでの検出の場合にはファイバの入射端面がこの長円を含めば良い。
【００４０】
図１１は、本発明の実施形態を示す図である。図１と同一番号は同一物もしくは同一機能を有するものを表す。本図では図１の全体装置のうちマルチスポット励起光発生に関わる部分のみを示している。それ以外の構成は基本的には図１と同じである。１４′はマルチスポット発生ホログラムである。
【００４１】
図１２は、このマルチスポット発生ホログラムの作成方法を示す図である。図１２に示すように、マルチスポット励起光の寸法に対応したホール径を有するピンホールアレイ１ｊ１１′、１ｊ１２′………１ｊ１Ｍ′開口を有するマスク１８にレーザ子を照射し、透過光をフーリェー変換レンズ１５でホログラム記録媒体上に集光する。この集光位置に参照光１０００を入射角φ＝φ０で若干斜めから重ねて照射し、上記の集光位置にフーリェ変換ホログラムを作る。
【００４２】
光の利用効率を向上するため、位相変調型の記録媒体を用いる。またフーリェ変換面上の中心位置での０次光（空間周波数が０の位置）の強度が桁違いに大きくなりなり、できたホログラムのＳＮ，回折効率等が悪くなるのを避けるため各開口には互いの位置に無関係なランダムな位相を付加しておく。
【００４３】
このようにして作られたホログラムを図１１のＤＮＡ検査装置のマルチスポット励起光発生系に用いる。
【００４４】
図１１のＡＯ偏向器１２に入射したレーザ光は、レンズ系１３を通った後、上記の方法で作られたホログラム１４′を入射角φ０照射する。ＡＯ偏向器の駆動周波数の中心（偏向角度の中心）ではホログラムに入射するレーザ光の入射角φはφ０となり、図１２の方法でホログラムを作成する時の参照光１０００のホログラム面に対する入射角度φ０に等しくなるようにしておく。このようにしてホログラムにレーザ光を照射すると、図１１に示すように１ｊ１１、１ｊ１２………１ｊ１Ｍに図１２のホログラム作製時のピンホールアレーと同一のスポットアレイを再生する。
【００４５】
次にＡＯ偏向器の周波数を変化させると、ホログラムへの入射角度がわずかに変わるので、マルチスポット再生光の角度もわずかに変わる。この結果、隣の絵素に相当する位置を励起照明することになる。ＡＯ偏向器を順次駆動していけばステップ的にＤＮＡチップを１絵素ピッチで順次位置を変えてマルチスポット励起照明することができる。
【００４６】
図１３は、本発明のＤＮＡ検査装置の実施形態を示す図である。図１と同一番号は同一物を表している。本実施形態では、図１の実施形態と異なり、同時に２次元的な検出を行っている。すなわち、励起照明光は２次元的に広い範囲を同時に照明可能な照明系レンズ１３′を通し、波長選択ビームスプリッタ３０′で反射し、２次元マルチレンズアレー１４′を照明する。１４′の２次元マイクロレンズアレイは、すでに図１〜４を用いて１次元のマイクロレンズアレイを説明したと同じ機能を有し、２次元的なアレイ配列のみが異なっている。従って図１４に示すようにマイクロレンズ１４１′の焦点位置に２次元微小スポット１４１０′を形成する。
【００４７】
本実施形態の場合には、この１４１０′の位置を中心にピンホール開口が明けられている。このようにピンホール開口のみを通過する光がＤＮＡチップを照射する。微小マルチスポット光のスポット１４１０′の径ｄとスポットの配列ピッチｐの比は２以上の整数で、５以上が望ましい。図１３に示すようにピンホール開口を透過した２次元マルチスポット光は高解像レンズ１６′によりＤＮＡチップを同時に励起照射する。励起照射される絵素２ｘ１１ｙ１１、２ｘ１２ｙ１１，２ｘ１１ｙ２１、２ｘ２１ｙ２１、……は４絵素とばして等ピッチ間隔である。
【００４８】
同時に励起照射された上記絵素から発生する蛍光は上記高解像レンズ１６′を通り、マイクロレンズアレイ下面の各ピンホール１４１０′を通過する。ピンポールを通過した光はマイクロレンズを通過することにより、各マイクロレンズ上面（凸面）の大きさに広がる。このマイクロレンズ上面の蛍光強度が波長選択ビームスプリッタ３０′と 結像レンズ３１′を介して画像蓄積型高感度２次元センサ３２′に 結像される。本図では干渉フィルタが描かれていないが、波長分離ビームスプリッタ３０′と２次元センサ３２′の間に干渉フィルタ、または蛍光より長い波長を透過する色フィルタを設置する。
【００４９】
図４及び図１４に示した１次元及び２次元のマイクロレンズアレイでは、各マイクロレンズの隣接するマイクロレンズの中間の領域に入射する光は散乱光になりノイズ光となる危険性がある。そこでこの中間の領域を酸化クロム等の材質からなる遮光部で覆うマスキングを行えば（図示せず）このようなノイズを除去することができる。
【００５０】
以上の実施形態、図１，５，７，及び１３に用いている波長分離ビームスプリッタ３０，３０′と干渉フィルタ３４の分光反射特性と分光透過特性をそれぞれ図１５及び図１６に示す。両方を用いることにより励起光の影響を少なくでき、正確な検出ができるようになる。図でλは励起光の波長であり、通常スポット照射の単位面積当たりの強度を大きくするためレーザ光を用いるため励起波長バンド幅は狭い。λＬは検出しようとする蛍光の中心波長である。
【００５１】
ハイブリダイゼーションしようとするＤＮＡ断片に付加される蛍光体には、何種類かの蛍光物質が用いられる。例えば、良く用いられるＣｙ５（Ｃｙａｎｉｎｅ５）では、蛍光体の吸収のピーク波長は６４９ｎｍ、蛍光のピーク波長は６７０ｎｍである。また、更に短波長側では、Ｃｙ３（Ｃｙａｎｉｎｅ３）では蛍光体の吸収のピーク波長は５５０ｎｍ、蛍光のピーク波長は５７０ｎｍである。吸収体の分光吸収特性はバンド幅を有するため、吸収のピーク波長と励起レーザ光の波長は必ずしも一致させる必要はなく、吸収ピーク波長に近いレーザ光が用いられる。
【００５２】
Ｃｙ５ではＨｅ−Ｎｅレーザの赤の光６３３ｎｍや波長６３５ｎｍの半導体レーザ光を、Ｃｙ３ではＨｅ−Ｎｅレーザの緑の光５４４ｎｍ等を用いる。蛍光のみを取り出す干渉フィルタ、及び波長分離ビームスプリッタは、蛍光のピーク波長に近く、励起光を分離しやすい波長を中心波長に選ぶ。
【００５３】
上述した蛍光検出に際し、励起光を完全に遮光することが特に蛍光が微弱な場合に非常に重要となる。
【００５４】
図１７は、このような励起光の遮光をより完全に行うための本発明の実施形態図である。即ち、上述の干渉フィルタや波長選択ビームスプリッタのみでは不十分な場合、或いは、蛍光検出光強度を大きくするため、干渉フィルタのバンド半値幅を大きくしようとする場合に実施する。図１７で図１と同一番号は同一物もしくは同一機能を有するものである。
【００５５】
マイクロレンズアレイやホログラムでΣｆ面上に形成されたマルチスポットアレイ１１１，……、１１Ｍは、レンズ１５及び対物レンズ１６によりＤＮＡチップ上に励起光として結像される。この際各マルチスポット光が対物レンズの入射瞳ＥＰ０の中心にほぼ半径ＲＮＡσ′の広がりで通過する。対物レンズの開口数をＮＡ，焦点距離をｆとすると励起光のＤＮＡチップ上のスポット径Ｄｓは次式で与えられる。
【００５６】
Ｄｓ＝２ｋ１ｆλ／ＲＮＡσ′ （但し ｋ１＝０．６）
ＤＮＡチップ検出の絵素分解能（絵素ピッチ）をｐとすると、この値はほぼＤｓに等しい。ｐを２μｍ，励起光波長λを６３３ｎｍとすると、ＲＮＡσ′／ｆは０．１９となる。ＲＮＡσ′／ｆは２μｍのスポットを照射するための照明のＮＡ（２μｍスポットを 結像するために必要な対物レンズの最低限のＮＡ）でこれをＮＡ′とすると、
ＮＡ′＝ｓｉｎ（ｔａｎ−１（ＲＮＡσ′／ｆ））≒ＲＮＡσ′／ｆ＝０．１９
となる。対物レンズ１６のＮＡは微弱な蛍光を検出するため０．７以上０．９以下である。
対物レンズの入射瞳を上記のスポット径で通過した各励起スポット光は、対物レンズによりＤＮＡチップ上に約２μｍの励起スポット光を照射する。この対物レンズは両テレセントリックであるため、ＤＮＡチップに垂直に入射した励起光はチップ表面で約４〜８％の励起光が正反射し、対物レンズに戻ってくる。この正反射光は波長分離ビームスプリッタにより、励起光は透過されるが、わずかに反射し蛍光検出系３に向かう。
【００５７】
蛍光検出系には干渉フィルタ３４があり、励起光は遮光されるが、完全な遮光が難しい。即ち、干渉フィルタのバンド幅を広くして蛍光をできるだけ多く検出しようとすると、励起光がわずかに漏れる。そこで蛍光スポット光を蛍光検出面（或いはそれと共役な面）に結像検出するレンズ系３１′を図のようにレンズ系３１１と３１２で構成し、対物レンズの瞳が３１１と３１２の間の位置に結像するようにする。この瞳と共役な位置に空間フィルタ３５を配置する。空間フィルタ３５は図１８に示すような構造を持っている。
【００５８】
レンズ径３１１による対物レンズ瞳面の空間フィルタ３５への 結像倍率を１倍とする。空間フィルタは、遮光部３５３の光軸中心から対物レンズの瞳半径と等しいＲＮＡの半径を有する開口の中心部に、半径ＲＮＡσの円形の遮光部３５１を有する。ＤＮＡチップで正反射したマルチスポット励起光はこの空間フィルタ上でビーム径ＲＮＡσ′になっている。従ってＲＮＡσ＞ＲＮＡσ′であれば正反射光はこの遮光部３５１で遮光される。
【００５９】
一方マルチスポット励起光で励起され発生する蛍光は、ほぼ無指向で対物レンズに入射し、この空間フィルタに入射してくる。遮光部３５１により、蛍光も遮光されるが、遮光される蛍光の空間フィルタ入射蛍光に対する比率は（ＮＡ′／ＮＡ）２となり、上記値を入れると７（ＮＡ＝０．７の時）〜４（ＮＡ＝０．９の時）％になり、このロスは無視できる程度である。
【００６０】
このように、検出すべき蛍光の光量を落とさずに不必要な励起光を大幅に低減しすることができる。空間フィルタを透過した蛍光検出光は、レンズ３４と干渉フィルタ３４を通り、検出面であるファイバの入射端にＤＮＡチップのスポット像を結像し、蛍光検出される。
【００６１】
図１９は、本発明の実施形態を表す図である。励起光を蛍光検出光路に導かないようにする方法を示す。図１と同一番号は同一物を表す。励起光路と蛍光検出光路を分岐するビームスプリッタは本実施形態では偏光ビームスプリッタ３０″を用いている。即ち励起光をこの偏向ビームスプリッタのスプリット面にたいしＰ偏光で照射する。ＤＮＡチップ表面で反射し戻ってくる励起光はＰ偏光を保っているので、偏光ビームスプリッタを通過し、蛍光検出光路には入らない。他方発生する蛍光の偏光は励起光とはずれているので偏光ビームスプリッタ３０″でＳ偏光は反射し蛍光検出光路に導かれる。このようにすれば励起光の蛍光検出光路への入射を防ぐことができる。
【００６２】
図２０は、本発明の実施形態を示す図であり、蛍光検出を光ファイバとマルチチャンネル光電子倍増管を用いて行うものである。図１，５，７，１７，及び１９に示した実施形態における蛍光マルチスポット像の検出具体内容を示している。マルチスポット数がＭ以上の数からなるファイバ系３２の入射端は図２１に示すようにＭ個の１次元配列したマルチレンズアレイ３２１である。
【００６３】
図７で説明したように、蛍光マルチスポット像は、各マイクロレンズによりファイバの光を伝搬する芯（コア）に入射される。マルチチャンネル光電子倍増管３３が図２０に示すように２次元の受光開口配列の場合には、ファイバの出射端が２次元配列になるようにする。各出射端から出てきた蛍光は、図２０の実施形態の場合には 結像レンズ３２４により、ファイバ出射端３２３が光電子倍増管３３の各受光開口３３１に対応して結像するようにする。
【００６４】
図２１の実施形態の場合には、ファイバの出射端に２次元レンズアレイ３２４１が対応して設置されており、各ファイバから出射した蛍光は各レンズを通り、直接マルチチャンネル光電子倍増管の２次元受光開口（光電面）３３１１に集光するようにしている。図２０，２１に示した実施形態では、２次元のマルチチャンネル光電子倍増管であったが、１次元のマルチチャンネル光電子倍増管でも、出射端を１次元配列にすることにより、同じ方法で実現できる。
【００６５】
図２２は、本発明の実施形態を示す図である。本実施形態では、励起光として複数の波長を用いている。光源系１１Ａ、１１Ｂ、及び１１Ｃは、異なる波長λＡ，λＢ，及びλＣの励起光源からの光を成形し、ファイバ束に入射させ、出射端にマルチレンズアレイを配列し、出射後のほぼ集光する位置にピンホールアレイを設けている。ピンホールアレイを出射した励起光は、波長分離ビームスプリッタ３０Ａ，３０Ｂ、３０Ｃを通るように構成されている。図２２に示されているように、１１Ａが蛍光検出の励起光に選ばれている時には、λＡの励起光がレンズ１５を通過して、偏向ミラー３００で反射され、対物レンズ１６を通り、ＤＮＡチップ２をマルチスポット励起照射する。各スポットから発生する蛍光は、対物レンズ１６、偏向ミラー３００、レンズ１５（３１）を通り、波長選択ビームスプリッタ３０Ａで反射し、干渉フィルタ３４Ａを通り、図２０及び２１で説明したような方法で各スポットの蛍光をマルチチャンネル光電子倍増管検出する。
【００６６】
検出する蛍光が異なるタイプの場合には、制御装置４′から図示していない駆動機構により実線矢印の方向に光源系全体を移動し、異なる波長λＢ，及びλＣのいずれかを選択し、この波長で蛍光検出を行う。１つのＤＮＡチップに複数の蛍光を用いている場合には、光源系を順次移動させて、次々に異なる励起光で検出していく。
【００６７】
図２６は、上記の複数の蛍光を用いる場合の異なる実施形態である。図２２と異なり、複数の励起光を同時に照射し、検査時間の短縮を図ったものである。図２６では複数の波長λＡ′，λＢ′，及びλＣ′が例えば赤、緑、青の３色の光源系１１Ａ′、１１Ｂ′、及び１１Ｃ′から出射した光は波長選択合成ミラー５１，５２により、１つの光路に効率よく合成される。即ち波長選択合成ミラー５１は青を透過し、緑を反射する。また波長選択合成ミラー５２は赤を透過し、緑と青を反射する。
【００６８】
合成された３色は、ビームスプリッタ３０′を透過し、レンズ１５、偏向ミラー３００、対物レンズ１６を通過し、ＤＮＡチップ上に３色同時にスポット励起照明する。各波長でそれぞれの蛍光体が励起され、それぞれの蛍光色で発光するが、概ね、励起光よりわずかに長い波長の蛍光であるので、これら３波長の光で励起された３波長の蛍光を、波長分離ビームスプリッタ５３，５４で波長分離することができる。即ち波長分離ビームスプリッタ５３は青の蛍光を反射し、緑と赤を透過し、波長分離ビームスプリッタ５４は緑を反射し、赤を透過する。
【００６９】
このように各３色に分離された光路に、それそれの蛍光のみを純度高く透過させる干渉フィルタ３４Ｃ、３４Ｂ、及び３４Ａを配置し、各蛍光の微小スポット像を上述の方法によりファイバを介して、マルチチャンネル光電子倍増管３３Ｃ′、３３Ｂ′、及び３３Ａ′で同時に検出する。
【００７０】
図２２及び図２６の実施形態では、励起マルチスポット光のアレイ方向の走査を偏向ミラー３００で行う。偏向ミラーはピエゾ駆動方式もしくはガルバノミラータイプのものを用いる。この場合、図１で説明した実施形態とは異なり、マルチスポットはステップ移動ではなく、連続（線形）走査になる。ＤＮＡチップ上でのマルチスポットは走査になるが、検出光路にも同じ（同一の）偏向ミラーが使われているため、蛍光検出のファイバー端には動かないマルチスポットが結像している。このため偏向ミラーの偏向角に基づき画素番地が決定されることになる。
【００７１】
このような画素番地と偏向角の関係に基づき、マルチチャンネル光電子倍増管から並列的に得られる複数の蛍光検出信号は制御回路４′（図２２）や４″（図２６）により整理され、保存される。勿論このようなデータ処理には予め計測、検出の条件を入力しておく必要があり、これら入力情報は端末４１′から入力されるか、或いは上位のコンピュータ４０からこれら情報が入力され、必要に応じて、計測・検査結果のデータがコンピュータに送られる。
【００７２】
図２６の実施形態で、複数の波長の異なる励起光を同時に照射する例を説明したが、例えば、複数の励起光とそれぞれの狙っている蛍光の波長帯が重複しているような場合には、重複するものについては光源に近いところにある図示しないシャッタを用いたり、光源そのもののＯＮ−ＯＦＦにより、時間をずらして蛍光検出することによりこのような問題を回避する。
【００７３】
図２３は、励起光源に複数のほぼ同一波長の半導体レーザ１１１Ａ２，１１１Ａ２……を用いた実施形態である。半導体レーザは容積が小さく比較的高出力で、安価であるため、図に示すように多数の半導体レーザを用いて、マルチスポット光源を作ることにより、強いマルチスポット励起光をＤＮＡチップに照射することが可能になり、高速検出が実現する。各半導体レーザから出射した光をレンズ１１２Ａ１、１１２Ａ２……によりファイバ１２０Ａ１，１２０Ａ２……の入射端に取り込む。
【００７４】
出射端から出射するレーザ光を図２４に示すようにマイクロレンズアレイを介してピンホール配列１１１，１１２……に集光させ、この透過光をマルチスポット励起光として用いる。
【００７５】
励起光として半導体レーザを用いることができない場合には、半導体レーザ励起の高出力固体レーザや、高出力ガスレーザを用いる。このようなレーザ光源では出射ビームを図２５に示すような方法で分割して用いると、ほぼ等しい強度で、ほぼ等しいビーム形状を有するマルチスポット励起光を形成することが可能になる。
【００７６】
即ち、レーザ光源１１１Ａ′から出射したビームをマルチ分割ビームスプリッタ１１１０Ａ′，１１２０Ａ′……で分割する。分割する数をｋとすると、分割の初段から２段、３段……ｋ段目までのビームスプリットの反射率をｒ１，ｒ２，…ｒｊ…ｒｋとする。ｒｋは１であること、各ビームスプリット光は強度が等しいので、１≦ｊ≦ｋの任意のｊに対し、
ｒｊ＝１／（ｋ−ｊ＋１）
を満たすようにすればよい。即ち１１１０Ａ′ではｋが４、即ち４分割であるので、ｒ１は１／４、ｒ２は１／３、ｒ３は１／２、ｒ４は１となる。同様に１１２０Ａ′は３分割であるのでｒ１は１／３、ｒ２は１／２、ｒ３は１となる。 このように等しいビーム強度で、等しいビーム形状のレーザ光がレンズアレイ１１２Ａ１′に入射し、ファイバの芯に入射する。
【００７７】
図２３の実施形態では、複数の半導体レーザをマルチビームスポット発生の光源として用いているが、半導体レーザ以外のガスレーザや第２高調波によるレーザなどを複数用いてマルチスポット励起光を形成することも、入手できるレーザ光のパワーが不足する場合には必要になる。このような場合には図２５に示す系を複数用いて、この複数の系から取り出されるファイバ出射端を１次元上或いは２次元上に配列することにより、励起強度の大きいマルチスポット光を得ることができる。
【００７８】
上記の複数の励起光を用いる場合、励起波長によっては半導体レーザ、ガスレーザ及び半導体励起の第２高調波を用いる固体レーザ等各種タイプの異なるレーザを用いる必要が生じる。このような場合に上記の図２３や図２５の方法でマルチスポット励起光を形成すればよい。
【００７９】
図２７は本発明の実施形態を示す図であり、励起マルチスポット光がＤＮＡチップに混入した異物からの蛍光や散乱光、或いは検出光学系の異物からの散乱光の影響を除去し、精度の高い蛍光検出を実現するものである。１１′は励起光源でファイバを介してピンホール開口アレイ１４′を透過して励起マルチスポット光を作る。マルチスポット光はレンズ１５と対物レンズ１６によりＤＮＡチップ上に結像する。対物レンズの入射瞳の位置には空間フィルタ１６１がある。
【００８０】
励起マルチスポット光はこの瞳の中心からずれた１６３の位置を通過するように設定されている。即ち各マルチスポット光は図２９、図３０に示すように対物レンズの光軸から外れた部分を通り，図３０に斜め斜線で示すＩｉの光束となって、ＤＮＡチップ２に斜め方向θｉの入射角で照射する。この照射収束光の収束角θＩは、先にスポット径とＮＡ′の関係を説明したように、ｓｉｎ（ＮＡ′）＝θＩ／２となる。
【００８１】
また、ＤＮＡチップで正反射した励起光は、対物レンズを通過し、瞳１６１上で１６３とはレンズ光軸を対称の中心として対称な位置（図の１６２に相当する位置）を通る。
【００８２】
そこで、図２８に示すように、ここに正反射光を遮光する部材１６２を形成しておけば、励起正反射光はこの１６２で遮光される。このように瞳の中心から外れた位置を励起光の主光線の光路にし、この主光線の入射角θｉに対し、θｉ＞θＩ／２の条件を満たすようにすれば、励起光を瞳上で遮ることなく、励起正反射光を瞳上で遮光することができる。本実施形態は図１７の実施形態で説明した励起光による雑音除去の効果を有することは云うまでもない。
【００８３】
この効果に加え、図２７の実施形態では、ＤＮＡチップ上或いは中に混入している異物の影響を、以下の様にして取る。即ち、ＤＮＡサンプル作成時に混入した各種蛋白質等の異物があると、これに励起光が照射すると、このような異物の寸法が数μｍと小さいため、励起光が散乱する。また上記の有機物の様な異物の場合には異物から強い蛍光が発せられ、検出すべきＤＮＡに付加している蛍光体より強い蛍光となる。
【００８４】
図３０に示すように、散乱励起光は点で塗った対物レンズのＮＡで決まる領域Ｌ＋Ｓを透過し、対物レンズを通過後、空間フィルタの遮光部１６３以外の部分を通り、蛍光検出系に漏れてくる。この漏れを波長分離ビームスプリッタ６１で励起光だけ取り出し、像検出する。波長分離ビームスプリッタは蛍光を透過し、励起光を反射する。波長分離ビームスプリッタの挿入位置は図２９では波長分離ビームスプリッタ３０″の後ろの光路にあるが、前に置いても良い。このようにすることにより、異物で散乱した励起光が蛍光の画像がマルチチャンネル光電子倍増管等の検出器３３′で撮られるのと同様に、励起光散乱像Ｓ１００が検出器６２により画像として検出される。
【００８５】
図３１は、このように検出された蛍光像信号ＤＬと励起光像信号ＤＳを、各絵素毎の信号レベルで表している。即ち１，２，……、２５は検出絵素番地を表し、（１）、（２）、（３）、（４）、（５）は同じＤＮＡ配列が付いているセルの番地である。即ち例えば１，２，３，４，５番地の絵素は（１）のセルに属する。実際にはセル内の絵素は２次元であり、例えば５×５絵素あるが、図を用いた説明を分かりやすくするため１次元にしている。異物がある絵素にかかっていればその絵素の散乱励起光は閾値ＤＳＴを越える。
【００８６】
図３１で、励起光像信号ＤＳは絵素番地９，１０，１１及び１６，１７，１８，１９，２０で閾値ＤＳＴを越えている。従って、蛍光像検出信号ＤＬの該当する番地の情報は異物の影響を強く受けているため、この番地の情報を除去して各セルの蛍光の平均値を求める。すなわち、セル番号（２）については絵素９，１０番地の情報は用いないで残りの６，７，８番地の情報のみを用いて平均値を算出する。同様にセル（３）については１３，１４，１５のみの情報を用いて平均値を求める。セル（４）は総ての絵素が異物で散乱しているためこのセルは無効とする。このようにして図３１の下のグラフに示すようにセル内の平均強度を求めることにより、異物の影響を大幅に低減し、正確な蛍光検出ができるようになった。
【００８７】
なお、図２７から３０を用いて説明した異物の影響を除去する実施形態の光学系では、励起光が対物レンズを通ってＤＮＡチップを照明する光学系になっているが、対物レンズを通らずに対物レンズとＤＮＡチップの間から斜めに照射し、散乱光を検出する構成でも良い。この場合には、正反射光が対物レンズに入射しないため、空間フィルタ（１６１に相当する）が不要になる。
【００８８】
図３２は、本発明の実施形態を示す図である。１は既に詳細な実施形態を説明したマルチスポット励起光照射系であり、３は同じく詳細を説明したマルチスポット励起光で発生した蛍光を検出する蛍光検出系である。ＤＮＡチップ２の上にハイブリダイゼイションされているＤＮＡに付いている蛍光に数μｍの微小スポット励起光を対物レンズ１６により照射するには、スポットサイズが一定に保たれるよう対物レンズと蛍光面を焦点深度内の一定の間隔に常時維持していなければならない。このため剛性上対物レンズ１６と構造的に一体になった焦点検出系７を用いる。焦点検出系７は斜めビームスポット照射系７１とスポット位置検出系７２から構成されている。斜めビームスポット照射系７１はＤＮＡチップ上の蛍光面に斜めから微小スポットを照射する。
【００８９】
図３３はＤＮＡチップの断面構造の１例である。この実施形態図において蛍光面はΣ２面である。即ちガラス等の平坦な基板２３上に蛍光面Σ２があり、この面とガラス基板２１上の面Σ１の間には蛍光が付加された被検査ＤＮＡを含んだ液体を流し、ハイブリダイゼションさせるための間隙２２がある。ＤＮＡ検査の段階ではこの間隙に液体を満たしておく。しかし場合によってはこの間隙を空にしておくこともある。また蛍光面をΣ１にし、基板２３は不透明な材質や光を吸収する材料にしておくこともある。
【００９０】
斜めスポット照射系７１から蛍光面で収束するように斜めから照射される光ビームｆ０は上部基板２１の上面Σ３と下面Σ１、及び下部基板２３の上面Σ２と下面Σ４の４面で正反射する。斜め照射ビームｆ０の主光線ｆ０Ｍが正反射した光線ｌ３，ｌ１，ｌ２，ｌ４は、 結像レンズ７２１によりポジションセンサ７２２の受光面に等しい面上のＰ３，Ｐ１，Ｐ２，及びＰ４の位置にそれそれ像を結ぶ。蛍光面の位置は予め決まっているので、各面Σ３、Σ１、Σ２とΣ４がある程度離れていれば、検出したい面（この実施形態図ではΣ２）のスポット像位置のみを受光し、それ以外のスポット像は受光開口外となるように受光ポジションセンサ７２２の寸法と、レンズ７２１の 結像倍率を決めておけば、所望の検出面のみの高さ検出ができる。
【００９１】
即ち、この実施形態では、Σ２面からの正反射光のみをポジションセンサで捕らえ、ポジションセンサ上のスポット位置即ちΣ２面の高さ位置を検出することができる。制御回路４により、この検出情報に基づき対物レンズ、及び対物レンズと一体になった焦点検出系７を、駆動装置７３により上下に微動することにより常時合焦点状態で蛍光検出することが可能になる。
【００９２】
図３３の斜め入射フォーカス検出光の入射角がブリュースター角に近いと、Ｐ偏向で入射させると表面での反射が非常に小さくなり、検出困難になる。従ってＳ偏向を用いる。Ｓ偏向にするとどのような入射角でもＰ偏向に比べ表面での反射率が高くなり有利である。
【００９３】
図３４は本発明の実施形態図であり、対物レンズ１６を通して焦点検出するものである。ファイバ７４で図示しない近赤外半導体レーザ光源から導かれてきたレーザ光はファイバ出射後ビームスプリッタ７６を通りレンズ７７、波長分離ビームスプリッタ３００″、対物レンズ１６を通り、ＤＮＡチップ２の蛍光面に斜めから集光照射する。この照射光の入射角度θは対物レンズの開口ＮＡに相当する（ｓｉｎθ＝ＮＡ≒０．８よりやや小さい入射角）大きさである。正反射した光は再び対物レンズを通り、ポジションセンサ７３′上にチップ上の集光点に対応した位置に結像する。このようにすれば、図３３の実施形態同様にして、チップの蛍光面のフォーカス位置を検出できる。本実施形態のように焦点検出に用いる光として、検出蛍光より波長の長い光を用いれば蛍光体を励起することなく、即ち、検出雑音を発生することなく、正確に焦点検出できる。
【００９４】
なお図３４の波長分離ビームスプリッタ３００″は近赤外光を透過し、蛍光検出に用いる励起光及び蛍光は反射する。１次元励起光照射光学系１で形成された１次元励起光スポットアレイがレンズ１５、波長選択ビームスプリッタ３００″及び対物レンズ１６を介してＤＮＡチップ２の蛍光面に照射される。発生した蛍光は蛍光検出光学系３により検出される。励起光スポットアレイ照射位置のアレイ方向の移動は波長選択ビームスプリッタを微回転することにより行う。
【００９５】
以上、実施形態の各例を用いて説明したＤＮＡチップの蛍光検出をＤＮＡチップの全セルに亘り行う方法を、以下に図３５から４０を用いて説明する。
【００９６】
図３５はＤＮＡチップの全体の構造を表している。２０４はＤＮＡチップを実装している全体ケースである。ＤＮＡチップはこのケースにある窓２００の内側のガラス基板であり、ケース２０４に固定されている。窓内側の領域２０２に蛍光物体を添付したＤＮＡ断片がハイブリダイゼションされている。この２０２の領域の外で窓２００の内側に、位置決め用のアライメントマーク２０１が描画されている。
【００９７】
図２で説明したＮ×Ｎ（図５では５×５）の絵素（太い線で示す）分が同一のＤＮＡ情報の断片が植えられている（プロービングされている）セル２０と、このアライメントマーク２０１の相対的な位置が１０分の数μｍの精度で設計、製作されている。
【００９８】
ＤＮＡチップを検査装置に搭載し、既にその実施形態を説明したＤＮＡ検査装置内に実装している（図示せず）アライメント検出光学系で少なくとも２つのアライメントマーク２０１の位置をマーク位置検出２次元ＣＣＤ等でＣＣＤ上の位置として検出する。またこのマーク検出を行ったときのＤＮＡチップの位置は、例えば図３２に示すように、ＤＮＡチップが搭載されているチャックに設置されているｘ及びｙ方向の位置検出用測長器８１及び８２で検出する。
【００９９】
上記のＣＣＤ検出光学系の光軸と、前述の各種蛍光検出光学系における検出光軸との間隔は一定であるので、この間隔と、上記ＣＣＤのアライメントマーク検出位置と、測長器の検出位置から、ＤＮＡチップの各セルを更に細かくセル内を分割した絵素を正しい位置で検出することが可能になる。この際、２つ以上のアライメントマークの位置検出でＤＮＡチップが回転していることが分かったなら、図示しない回転機構でこの回転を補正する。なお、この回転補正後の正しい位置検出は必要に応じて行う。またこの回転の補正を行わなくても回転量が小さければこの回転量を上記方法で検出し、この回転検出量に基づきｘｙ座標を補正していっても良い。また上記のマルチスポット光の方を光学系の微小回転により補正して検出することも可能である。
【０１００】
以上説明したように、ＤＮＡチップ上のセル内の絵素を正確な位置決め精度で検出することが、アライメントマーク検出と、ＤＮＡチャックの測長によりできるので、以下に示す方法でチップ内の全絵素を順次光速に隈無く蛍光検出することができる。図３５の２ＡはＭ個のマルチスポットアレイ励起光を照射し、スポットアレイ方向にＮ絵素分順次走査し、元の操作位置に戻るという動作を繰り返すと共に、チャックをｙ方向に走査することにより、チャックの１走査で検出される領域を表す。即ち、図３６に示すようＤＮＡチップ上の絵素２Ａ１０１，２Ａ１０２，……，２Ａ１０Ｍが先ず同時に励起照明され、次に前述の方法により１絵素ピッチΔＰ分マルチスポットが移動し、これを順次続ける。
【０１０１】
このようにしてＮ（ｋ）絵素分移動すれば、合計ＭＮ（ｋ）絵素分、即ちＮＭΔＰの幅に亘り、１次元アレイ状に検出される。Ｎ（ｋ）絵素分の走査が終われば、マルチスポットアレイを初めの位置に戻す。この間ＤＮＡチップは図３９のｙｓｔの時間ｔ０からｔ１の間のようにｙ方向に１絵素分移動しているので、上記の動作をｙ方向の絵素数分時間ｔ０からｔ１の間繰り返せば、領域２Ａの全絵素に亘る蛍光検出が終了する。
【０１０２】
上記の動作を図１の実施形態のＤＮＡ検査装置で行う場合、ＡＯ偏光器によるマルチスポット励起光の駆動信号、或いはスポットの移動位置は図３８のＳｐｘに示すように変化する。更に詳細に見れば図８のＳＢ１２のようにステップ移動している。また波長選択ビームスプリッタの偏向信号も図３８のＳｐｘ同様に変化させる。時間ｔ０からｔ１までこのような変化を繰り返せば、領域２Ａの全域を検出できる。
【０１０３】
領域２Ａの下の端まで検出されると（時間ｔ１）図４０のｘｓｔに示すようにＤＮＡチップのチャックをｘ方向にＮＭΔＰだけステップ移動する。ステップ移動後、図３９の時間ｔ１後のｙｓｔに示すようにチャックをｙの逆方向に走査する。これと同時に図３８の時間ｔ１後のＳｐｘようにＡＯ偏光器１２及び波長選択偏向ビームスプリッタ３０の偏向信号を領域２Ａ検出時（時間ｔ０〜ｔ１）とは逆方向に走査する。このようにすれば図３７に示すように領域２Ｂを領域２Ａの検出に引き続き継続的に検出できる。以上の動作をＤＮＡチップのｙ方向について−方向と＋方向に交互に繰り返せばＤＮＡチップの２Ａから２Ｊまで全チップを高速に検出することができる。
【０１０４】
本実施形態でＤＮＡチップを総て検出するのに要する時間を説明する。チップ内のセル数Ｌ、各セルをＮ×Ｎ分割することにより、異物等の影響を回避することにする。このようにするとチップ内の全検出絵素数はＬＮ２になる。マルチスポット励起光の同時照射スポット数をＭとするとし、同時にマルチスポットで検出する時間をΔｔとすると、スポットの移動や、チャックのｘ方向の移動による時間が蛍光検出する時間に比べ短いとして無視すると、全蛍光検出時間Ｔは次式で与えられる。
【０１０５】
マルチスポットのスキャン数ｋに対し、波長分離ビームスプリッタ３０の応答時間ｔｐはｋΔｔ以上である必要がある。また光源のパワーはβＭ／Δｔ以上必要である。また励起マルチスポット光の間隔は５以上がＳＮの上で望ましい。
【０１０６】
蛍光検出に用いる光電子倍増管の量子効率は、蛍光波長が長い６７０ｎｍでは５〜１０％と低くなる。また、励起に用いるレーザ光の出力の限界もある。このような条件を考慮し、できるだけ高速に検出するには、例えばｋ（＝Ｎ）＝１０、Ｍ＝５０、Δｔ＝５０μｓとなり、セル数Ｌ＝１０００×１０００、セル内分割絵素数Ｎ＝５として、Ｔ＝２５ｓとなる。即ちＬＮ２／（６×１０５）秒以下の条件を満たす。ちなみに上記のＬとＮの値をこの条件に入れれば４２秒になり、蛍光検出以外のサンプルチップの装着脱、検査条件の入力、結果の出力を含めて１分以内に検出するという条件を満足する。
【０１０７】
１分で検出可能になれば、多くの検体を検査する場合効果を発揮する。例えば従来５分かかっていた検査が１分で済むため、前処理に少々時間がかかっても、検体数が百近くになると、前処理が通常多数の検体に対し平行してできるようにするため、５，６時間の時間短縮が図れる。
【０１０８】
本発明によりこのような高速・高精度の検出が可能になるのはマルチスポットを同時に励起光に用いているためであり、しかも各スポットの励起光による蛍光検出に際し他の励起スポット光の影響を極力受けないようにスポット間隔を開けて検出しているからである。
【０１０９】
【発明の効果】
以上説明した本発明により、ＤＮＡチップ上の多種、多数のＤＮＡプローブにハイブリダイゼーションされた被検査対象ＤＮＡを高速にかつ正確に蛍光検出することが可能になった。この結果、感染症の診断、遺伝子検査等を多数の検体に対し、高速・高精度に行うことが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施形態を表す図。
【図２】本発明の実施形態図で、マルチスポット照射を表す。
【図３】本発明の実施形態図で、マルチスポット照射の移動を表す。
【図４】本発明の実施形態図で、マイクロレンズアレイによるマルチスポット発生を表す。
【図５】本発明の実施形態図で、図１の実施形態を説明する図。
【図６】波長選択ビームスプリッタ固定時のスポット蛍光像の動きを説明する図。
【図７】波長選択ビームスプリッタ偏向時のスポット蛍光像の動きを説明する図
【図８】本発明の実施形態し、図１の各部品の動作、検出信号等を表す図。
【図９】図１の実施形態で、蛍光像検出面の像の動きを表す図。
【図１０】図１の実施形態で蛍光検出面の受光開口を表す図。
【図１１】本発明の実施形態図で、マルチスポットをホログラムで形成する図。
【図１２】上記のホログラムを作成する方法を示す図。
【図１３】本発明の実施形態を示す図。
【図１４】図１３の実施形態で用いる２次元マルチスポット発生用マイクロレンズアレ。
【図１５】本発明の実施形態で波長分離ビームスプリッタの特性を示す図。
【図１６】本発明の実施形態で干渉フィルタの特性を示す図。
【図１７】本発明の実施形態図で、励起光を空間フィルタで遮光する図。
【図１８】上記空間フィルタの図。
【図１９】本発明の実施形態図で、偏向を利用する励起光遮光法を示す図。
【図２０】本発明の実施形態図で、１次元スポットアレイを２次元マルチチャンネルフォトマルで検出する図。
【図２１】上記図２０の実施形態でファイバの入出射端とスポット像取り込みを示す図。
【図２２】本発明の実施形態図で、励起光を複数の波長にして検出する図。
【図２３】本発明の実施形態図で、複数の半導体レーザを励起光に用いる図。
【図２４】本発明の実施形態図で、ファイバの出射端からマルチスポット光を得る図。
【図２５】本発明の実施形態図で、１本のレーザビームからマルチスポットを得る図。
【図２６】本発明の実施形態図で、励起光を複数の波長にして同時に検出する図。
【図２７】本発明の実施形態図で、マルチスポット光を斜め照射し、正反射励起光を瞳上で遮光する図。
【図２８】上記図２７の瞳上の遮光部を示す図。
【図２９】本発明の実施形態図で、励起散乱光を検出し異物位置を求め、蛍光検出結果を補正する方法を示す図。
【図３０】上記図２９の対物レンズとＤＮＡチップの間の励起正反射光と散乱励起光を示す図。
【図３１】図２９の異物散乱光の検出信号による補正の方法を示す図。
【図３２】本発明の実施形態図で、フォーカス検出と、制御を示す図。
【図３３】図３２のフォーカス検出で、ＤＮＡチップの反射呼応を示す図。
【図３４】本発明の実施形態図で、対物レンズを通してフォーカス検出する図。
【図３５】本発明の実施形態で、ＤＮＡチップの全検査対象域を検出する方法を示す図。
【図３６】図３５の実施形態の拡大説明図
【図３７】図３５の実施形態の拡大説明図
【図３８】図３５の実施形態でマルチスポットの動きを示す図。
【図３９】図３５の実施形態でＤＮＡチップチャックのｘ方向の動きを示す図。
【図４０】図３５の実施形態でＤＮＡチップチャックのｙ方向の動きを示す図。
【符号の説明】
１・・・・励起光照射光学系、１０・・・・マルチスポット形成光学系、１１・・・・光源系、１２・・・・ＡＯ偏向器、１４・・・・マイクロレンズアレイ、１６・・・・対物レンズ、１４′・・・・マルチスポット発生ホログラム、２・・・・ＤＮＡチップ、２０・・・・セル、２０１，２０２，２１２・・・・蛍光検出絵素、３０・・・・波長選択ビームスプリッタ偏向器、３００・・・・ミラー偏向器、３２・・・・光ファイバ、３３・・・・光電子倍増管、４、４′・・・・制御回路、４１′・・・・入力端末、５１，５２，５３，５４・・・・波長選択ビームスプリッタ、７・・・・フォーカス検出系、７３・・・・は対物レンズとフォーカス系の微動機構、８０・・・・ＤＮＡチップチャック、８１，８２・・・・ＤＮＡチップチャック位置測長器、８３・・・・ＤＮＡチップチャック駆動機構である。
【発明の属する技術分野】
本発明はＤＮＡを蛍光検出により検査する装置に関する。特に多数の生体のＤＮＡを高速に検査するＤＮＡ検査方法及びその装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来のＤＮＡチップの検査では、ＤＮＡチップ上に励起光のスポットを１点照射し、この照射した励起光により発生する蛍光を共焦点検出することを、ＤＮＡチップと検出スポットとの相対位置を変化させてチップ上の照射位置を順次変化させることにより、チップ上の所望の場所を順次検出する方法により行っていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ＤＮＡの検査を、従来の血液検査のような生体検査に適用しようとすると、多数の生検体に対し、高速に行うことが不可欠になる。しかるに、従来の技術では、ＤＮＡチップの必要な検査分解能に対し、この分解能相当の励起光スポットを１点照射し、得られる蛍光を順次検出していると、検査時間が大幅にかかる。これは、この１点の検出当たりに必要な時間が無制限に短くできないことに関係している。即ち、励起光を照射したのち、蛍光が発生し終わるまでの時間ΔｔＬがおおよそ１０ｎ秒程度かかるためである。蛍光が終わるのを待たず次に検出点に移ってしまうと検出できなくなる。
【０００４】
また、上記の必要な検出分解能相当のスポット光サイズ中に、数個の蛍光分子があるような状態まで高感度に検出することが必要である。しかし、発生した蛍光が総て検出されるわけではない。即ち、検出光学系の光利用効率や光検出に用いられる光電子倍増管量子効率が、１００％ではない。更に、励起光が蛍光物体で吸収される効率や、吸収された励起光が蛍光に変わる確率が小さい。このため、ΔｔＬの少なくとも数十倍から数百倍の時間をかけて検出する必要があり、更にこの時間を長くするほど、フォトンカウントに近い微弱光に対する検出精度が高くなる。
【０００５】
また、このような高速性を実用レベルで達成するには、ＤＮＡチップに混入する各種タンパク質からなる異物の影響を除去或いは低減したり、蛍光体を付加したターゲットをハイブリダイゼーションした検査面に、検出系の焦点を常時合わせる必要がある。また、複数の蛍光に対して、高速に検査することが必要になる場合もある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するために、本発明では以下に示す様な手段を施している。
【０００７】
各セルの寸法Ｄ以下のスポット径ｄからなり複数Ｍの励起光を互いに異なる位置に蛍光減衰時間以上の時間Δｔに亘り対物レンズを用いて同時に照射し、得られる蛍光を蛍光検出光路に導き、ＤＮＡチップの照射スポットと共役な関係にある 結像面で検出し、蛍光の位置と強度から被検査ＤＮＡチップの検査を行う。このとき上記スポット径は上記セル寸法の整数Ｎに対しほぼ１／Ｎにする。更に上記照射スポット位置とＤＮＡチップの相対位置を順次ｊ回に亘り異ならしめ全検査対象位置ＬＮ２＝Ｍｊを検査する。またＮを２以上にしセルを複数の部分に分割し、１セル内にあるＮ２個のデータの内有意なデータのみを選択し、処理することにより正確な検査を行う。このようにすることにより、ＤＮＡチップの全検査対象サンプル点数ＬＮ２に対し、ＬＮ２／（６×１０５）秒以内の時間で蛍光検出する。
【０００８】
上記ＤＮＡチップへの複数ＭのＤＮＡチップへの照射スポットと共役な関係にある 結像面で照射スポット像とほぼ同程度の有効径を有するＭ個の受光開口を有し、当該受光開口外は遮光し、当該受光開口を透過した各々の光を検出することにより、照射スポット或いは照射スポット面以外からの雑音光を除去し信号対雑音比の高い検査を行っている。また上記照射スポット像とほぼ同程度の有効径を有するＭ個の受光開口は光ファイバ受光端であり、該ファイバの出射端より出射する光を検出することにより更に信号対雑音比の大きな検出を行っている。
【０００９】
上記ＤＮＡチップへの複数Ｍの照射スポットはスポット径ｄ、整数ｋに対しほぼｋｄの間隔を持って直線上に配列し、このスポットアレイを上記Δｔ時間照射後、ほぼｄだけアレイ方向に移動し、Δｔ時間照射する。この動作を順次ｋ回繰り返すことにより、アレイ方向にｋＭ個のスポット位置に亘り検査を行い、かつＤＮＡチップと検査装置を少なくともアレイと直角方向に、相対的に移動することによりＤＮＡチップの所望の２次元領域を検査する。また上記スポットアレイの移動は音響光偏向器を用いて行うことを特徴とする。
また整数ｋは２以上であることが望ましく、さらにｋは５以上であると信号耐対音比の上で更に有利である。
【００１０】
上記スポットアレイはマイクロレンズアレイで形成する。また上記スポットアレイはホログラムで形成することもできる。上記スポットアレイのアレイ方向の移動と同期させ、励起光により生じた蛍光が上記受光開口上のほぼ同一箇所に来るように蛍光検出光路内に蛍光検出偏向手段を設ける。この際上記蛍光検出偏向手段は圧電素子を用いた偏向手段を用いる。また上記蛍光検出偏向手段は励起光を透過させ、蛍光を反射させる波長選択ビームスプリッタで構成さすることにより効率よく検出できる。また励起光との分離を良くするため励起光路から分離された蛍光検出光路内に蛍光のみを透過し、励起光を遮光するフィルタを用いる。
【００１１】
上記Ｍ個のマルチ励起スポット光が上記対物レンズの瞳上でほぼ同一位置Ａを通過するようにし、ＤＮＡチップで正反射した当該励起光が対物レンズの瞳上の位置Ｂ’に達するように構成する。このようにして、対物レンズの瞳上にあるＢ′の位置、もしくは蛍光検出光路内にあり上記対物レンズの瞳と共役な面上のＢ’の像位置、に反射励起光を遮光する手段を施すことにより雑音成分となる励起光を蛍光検出信号から除去する。
【００１２】
また上記Ｍ個のマルチ励起スポット光が上記対物レンズの瞳上でほぼ同一位置Ａを通過し、ＤＮＡチップで正反射した当該励起光が対物レンズの瞳上の上記Ａとは異なる位置Ｂを通過するように構成する。このようにして対物レンズの瞳もしくは、蛍光検出光路内で対物レンズの瞳と共役な位置にＢを中心に所望の径の反射励起光を遮光する部材を配置する。このようにして雑音成分となる励起光を蛍光検出信号から除去する。
【００１３】
更に上記遮光する反射励起光を正反射励起光にし、ＤＮＡチップ内の異物から散乱した励起光が上記遮光手段又は遮光部材外から透過するようにして取り出し、取り出された散乱光を上記蛍光検出光路から分岐し、ＤＮＡチップの照射スポットと共役な位置で撮像して、検出する。検出した散乱光の像の撮像情報を用いて、上記蛍光検出手段で検出した蛍光情報を補正する。このようにすることによりＤＮＡチップ内に存在する異物からの散乱光の影響を排除して正確な検出が可能になる。
【００１４】
上記Ｍ個のマルチ励起スポット光をレーザ光源で形成する。このようにすることにより微小なスポットに強度の大きい励起照射が実現する。またＭ個のマルチ励起スポット光を複数の半導体レーザ光源により形成することにより、小さな実装体積でより大きな励起照射が実現する。この際上記複数の半導体レーザ光源より出射した光を光ファイバに導入し、Ｍ個の所望のピッチで整列した当該光ファイバの出射端から出射する構成にする。このようにすることにより所望のピッチ配列であるＭ個のマルチ励起スポット光を得ることが可能になる。
【００１５】
光信号蓄積型撮像手段として超高感度のＮｘ×Ｎｙ画素数からなる２次元撮像装置を用い、ｎｘ、ｎｙを整数とし、スポット径ｄの励起光をｘ方向にｎｘｄ、ｙ方向にｎｙｄのピッチでＮｘ×Ｎｙスポット同時に照射する。このようにして得られるＮｘ×Ｎｙからなる蛍光スポット像を超高感度２次元撮像装置で検出し、かつ検出装置とＤＮＡチップとの相対位置をピッチｄでｘｙ方向にｎｘ×ｎｙステップ移動する。このようにすることによりＤＮＡチップの所望の領域を検出することが可能になる。
【００１６】
また上記励起光は複数の異なる波長からなり、複数の蛍光体を付加した異なるターゲットを分離して検出する。更に上記複数の波長からなる励起光を同時に照射し、複数の蛍光体を付加した異なるターゲットを分離して同時に検出する。このようにすることにより多様な検出対象を高速に行うことが可能になる。
【００１７】
上記被検査ＤＮＡチップの所望の蛍光体を付加したターゲットをハイブリダイゼーションした検査面上に、上記励起スポット光の近傍に第２の光を斜め入射させ、該検査面で反射した光の位置を検出することにより焦点検出する。この検出情報に基づき検査面と上記対物レンズの相対距離を制御することにより焦点合わせを行うことが可能になる。また、上記第２の斜め入射させる光が対物レンズを通過するように構成することにより、簡単な構成で焦点検出、制御が可能になる。
【００１８】
上記第２の斜め入射させる光を検出面にたいしＳ偏光にする。このようにすることにより、蛍光検出面での反射率を高め、正しい焦点検出が可能になる。更に上記第２の斜め入射させる光は上記蛍光体を励起しない波長を用いる。このようにすることにより、蛍光検出信号に雑音を重畳させずに正確な検出が可能になる。
【００１９】
【発明の実施の形態】
図１は、本発明の実施形態を示す図である。１は蛍光検出のために、マルチスポット励起光形成し、ＤＮＡチップ２に照射するマルチスポット励起光照射系であり、３はマルチスポット励起光で発生した蛍光を検出する蛍光検出系である。１１は励起光光源と励起光のビーム成形光学系を含む励起光源である。Ｈｅ−Ｎｅレーザ光を焦点距離の異なる２個のシリンドリカルレンズで所望の縦横ビーム径比に成形し、ミラー１０００を経由しＡＯ偏向器に入射させる。ＡＯ偏向器には水晶振動子に印加する周波数ωの高周波電圧端子とこの周波数より低い振幅信号ωＶの入力端子がある。
【００２０】
制御回路４から送られる周波数ωの信号はω±ω０の範囲の周波数帯を持っている。周波数が変わるとＡＯ偏向器に入射する励起光の回折角が変わる。また制御回路４から振幅信号ωＶを入力すると回折効率が変わるので、回折光の強度を制御することができる。ＡＯ偏向器を通った回折光は０次光（図示せず）と分離され（０次光は遮光される）、焦点距離ｆ１とｆ２の２つのレンズ１３１と１３２からなるレンズ系１３により所望のビーム系でマイクロレンズアレー１４を照射する。ＡＯ偏光器の周波数を変化させると、マイクロレンズアレー１４に入射する励起光の位置は変わらずに角度が変化する。
【００２１】
図４はマイクロレンズアレー１４の拡大詳細図である。ガラスでできた微小マイクロレンズが１次元状に３２〜２５６個、多数並んでおり、ここに入射した光は、例えば実線で示す１０１０はマイクロレンズを透過し、各マイクロレンズ１４１，１４２……を透過し、焦点面Σ上の直線Ｌの上に微小スポット１１１，１１２……１１Ｍを結ぶ。ＡＯ偏向器の周波数を変えると図４の点線で示すようにマイクロレンズに入射する励起光の角度が変化し、直線Ｌ上の微小スポットの位置が１ｊ２１、１ｊ２２……１ｊ２Ｍの様に変化する。
【００２２】
マイクロレンズアレー１４の焦点面Σ上にできた微小スポットアレー１１１，１１２……１１Ｍは図１に示すようにレンズ１５と対物レンズ１６によりＤＮＡチップ２のハイブリダイゼーションされたターゲットに付加した蛍光体を照射し、励起する。このターゲットが付いているガラス面Σ１又はΣ２（詳しくは図３３参照）上で最小のビーム径となるように対物レンズ１６のフォーカスがなされる。
【００２３】
図２はＤＮＡチップ２の面構造の詳細を示したものである。縦横の細い線で示した正方形の最小単位２０１，２１１，２０２，２１２等は検出絵素を表す。図では５×５の絵素（太い線で示す）分がセル２０である。１つのセルには同一のＤＮＡ情報の断片が植えられている。従ってこのセルには同じＤＮＡ断片構造を持つターゲットがハイブリダイズされる。
【００２４】
このように１つのセルを複数の絵素で分割する理由は１つのセル内に異物であるタンパク質等が混入していたとき、このタンパク質に入射した励起光により、大きな強度の蛍光が発生するようなことが生じる。通常このような異物の寸法はせいぜい数μｍであるので、絵素寸法が数μｍであり、セルの寸法が例えば１０μｍならば、１０μｍのセル内の異物位置が後述するような方法で検出、分離できれば、異物部分以外の情報により蛍光の大きさを正確に求めることが可能になる。
【００２５】
図３はＤＮＡチップの側面図である。この絵ではハイブリダイズされているターゲットがガラス基板の上に裸で乗っている構造になっている。このような場合もあるし、後述するようにガラス基板の間に挟まれている場合もある。いずれにしてもターゲットのある面に微小励起光スポットが集光される。この集光径は図２で示した正方形最小単位である検出の絵素の寸法にほぼ等しい。
【００２６】
ＡＯ偏向器の初期の周波数では図１の実線で示す回折光が得られており、このときには図３に示すようにＤＮＡチップに１０１，１０２，１０３……の様に励起光スポットアレイがＤＮＡチップ上の絵素２０１，２０２，２０３……２０Ｍに照射され、後述するように各絵素の蛍光が検出される。この励起光の照射時間は蛍光減衰時間以上の時間Δｔ（数〜数百μｓ）で、本実施形態例では６０μｓである。
【００２７】
６０μｓ経過後、ＡＯ偏向器の周波数が変えられると励起光の回折角が変わり、図１および図４で示すように、マイクロレンズアレーには点線で示す１０ｊ２０の光が入射し、図３のＤＮＡチップには１１１，１１２，１１３……１１Ｍの様に励起光スポットアレイが照射され、２１１，２１２，２１３……２１Ｍの絵素の蛍光が検出される。このようにしてＭ個のマルチスポットが絵素ピッチずつずれて順次照射され、ｊ絵素分ずれるとｊＭ絵素分が総て検出されることになる。
【００２８】
次に蛍光検出の実施形態を図１で説明する。レンズ１５と対物レンズ１６の間にあるビームスプリッタ３０は波長分離ビームスプリッタである。本実施形態で用いている励起光源ＨＥ−Ｎｅレーザの波長は６３３ｎｍであり、チップ上のターゲットに付加されている蛍光体はＣｙ５である。検出する蛍光の波長は６７０ｎｍ近辺である。
【００２９】
波長分離ビームスプリッタ３０は６３３ｎｍでは４５度入射光をほぼ１００％透過し、６７０ｎｍの蛍光は４５度入射でほぼ１００％反射である。しかし６３３ｎｍもごくわずか反射する。このごくわずかの反射でも、蛍光が非常に微弱であるので問題となる。そこで図１の実施形態では６７０ｎｍに中心波長特性を持ち、反値幅が約１５ｎｍの干渉フィルタ３４を蛍光検出系３に挿入し、励起光の漏れをこの干渉フィルタで遮光している。なお３４は干渉フィルタに限定されるものではなく、ある波長以上は透過し、以下は遮光するいわゆる色フィルタを用いても良い。また色フィルタと干渉フィルタを組み合わせて用いても良い。以降の実施形態の説明では説明の簡潔のため干渉フィルタのみで説明する。
【００３０】
次にＡＯ偏向器を用いてマルチスポット励起光のＤＮＡチップ上の位置を変化させるときの、検出蛍光像の位置の変化と、固定の検出器で検出するために行う必要のある、前記位置変化の補正について説明する。図１の波長分離ビームスプリッタ３０はこの位置変化の補正も行っている。図５は図１の主要な部分を示しており図１と同一番号は同一物を表している。波長分離ビームスプリッタ３０は５〜１０ｋＨｚの高い共振周波数特性を持つピエゾ素子３０１で駆動され、ｙ軸を中心に微小回転する構造になっている。
【００３１】
図６、図７はこの微小回転の役割を示した図であり、図１と同一番号は同一物を表している。制御回路４からＡＯ偏向器１２に入力される偏向信号により、図６（Ｃ）のＤＮＡチップ２上のマルチ励起微小スポット１０１１、１０２１、………、１０Ｍ１のそれぞれの位置が１絵素ずつ１０１２、１０２２、………、１０Ｍ２と順次変化させていく。このとき図６（Ｄ）に示すように波長分離ビームスプリッタ３０が回転しないとすると、ＤＮＡチップと共役な位置にある蛍光検出面ΣＰＨ上のマルチ蛍光点１２１１、１２２１、………、１２Ｍ１はやはり１絵素ずつ１２１２，１２２２、………、１２Ｍ２へ変化する。
【００３２】
蛍光検出面上の蛍光スポット像１２１２は、図に示すように、蛍光検出用マイクロレンズアレー３２１により１２１２点が光ファイバ束３２２の１本のファイバ端に結像し、ファイバに入射する。１本の光ファイバは光が通る芯３２２１とそれを保護する部分３２２２から成り立っている。光が通る芯の径は、蛍光検出面ΣＰＨ上の（マルチ）蛍光点１２１１よりやや大きい。しかし、波長分離ビームスプリッタ３０が回転しないと、１２１１点がＡＯ偏向器の駆動により１２１２，１２１３，１２１４、………と移動し、ファイバ入射端からずれていき、検出できなくなってしまう。そこ高い共振周波数特性を持つピエゾ素子３０１で図７に示すように波長分離ビームスプリッタ３０を微小回転駆動する。
【００３３】
すなわち微小回転しない場合の図６では、蛍光微小スポット像１２１１が異なる場所１２１２，１２１３，１２１４に移動したのに対し、微小回転することにより、図７の点線の枠内に示すようにΣＰＨ上のほぼ同一位置にスポットがくる。
【００３４】
図８は、以上説明したＡＯ偏向器１２のＯＮ−ＯＦＦあるいは強度変調信号ＳＡ１２、同じくＡＯ偏向器の偏向信号ＳＢ１２、波長分離ビームスプリッタ３０を偏向駆動するピエゾ素子３０１の駆動信号Ｓ３０、ファイバ３２を介してｋ番目の１つのフォトマル３３で検出する蛍光検出信号Ｓ３３ｋ、この蛍光検出信号の絵素ごとの画像蓄積（積分）信号Ｓ′３３ｋ、およびこの画像蓄積の各絵素毎の最終結果（画像蓄積していき、励起スポット光が次の絵素の励起に移る前の時刻でＳ′３３ｋをサンプルホルドした値）Ｓ″３３ｋについて各信号の相対的な時間変化を表している。このグラフの実施例ではマルチスポット励起光をＡＯ偏向器により順次１絵素ずつずらして行き、このようにして１つのスポットを１０絵素まで順次ずらしている。
【００３５】
このずらす数は、各絵素の検出のＳＮを向上させるため２以上必要であり、大きいほどＳＮ向上を図る上で望ましいが、装置の構成部品上の制限等により自ずと上限がある。しかし５以上にすると隣接するスポット励起光による光路途中の異物照射に伴う散乱光、あるいは蛍光の影響等が大幅に少なくなる。
【００３６】
図８に示すようにＡＯ偏向器１２の周波数（超音波水晶振動子に与える超音波の周波数、すなわち偏光器の偏向角度）信号ＳＢ１２を順次ステップ的に変え、この間この変化に応じて波長分離ビームスプリッタ３０を偏向駆動するピエゾ素子３０１の駆動信号Ｓ３０、を線形に変化させる。ＡＯ偏向器１２が超音波の伝播による透明媒体の屈折率のごくわずかな変化により、光を回折させているのに対し、ピエゾ素子３０１はビームスプリッタ全体を駆動させるため、周波数応答性が異なるため早いＡＯ偏向器の信号ＳＢ１２はステップ、遅いピエゾ素子の駆動信号Ｓ３０は線形にしている。
【００３７】
図９はこの２つの信号により蛍光検出面ΣＰＨ上できる蛍光スポット像の位置を示した図である。この図の上から下への変化は時間ｔの経過を表している。左の２つのグラフはＳＢ１２、とＳ３０の変化であり、図８ではステップ数が１０であったが、この図ではステップ数が５である。図９のグラフの右側にある実線の丸○、３２１１′、３２２１′、３２３１′………は蛍光検出マルチスポット像が図６で説明したようにピエゾ素子による位置補正をおこなわない場合の像の位置ずれを示している。なお、図の右方向（横方向）はスポットアレイの配列方向ｘＡを表しており実線の丸○、３２１２′、３２２２′、３２３２′………は隣接する蛍光スポット像の位置ずれを示している。点線の丸○はピエゾ素子により位置補正を行った結果である。
【００３８】
すなわち、ＡＯ偏向器でステップ移動し、励起光が停止していても、ピエゾ素子は線形に偏向を駆動しているため励起光が停止している間に蛍光検出面ΣＰＨ上できる蛍光スポット像の位置は３２１１−、３２１１，３２１１＋とわずかではあるが動いてしまう（隣の蛍光スポット像の位置では３２１２−、３２１２，３２１２＋とわずかではあるが動いてしまう）。
【００３９】
励起光がＤＮＡチップ上の次の照射位置にステップ移動し停止している間には、蛍光スポット像の位置は、３２２１−、３２２１，３２２１＋とわずかではあるが動いてしまう（隣の蛍光スポット像の位置では３２２２−、３２２２，３２２２＋とわずかではあるが動いてしまう）。この蛍光スポット像のわずかな動きをカバーして検出するには図９の下の図１０に示すように蛍光検出受光面（あるいは受光面と共役な面）３２０にアレイ方向ｘＡに長い長円開口の配列３２０１，３２０２………３２０Ｍを設ける。上記のファイバでの検出の場合にはファイバの入射端面がこの長円を含めば良い。
【００４０】
図１１は、本発明の実施形態を示す図である。図１と同一番号は同一物もしくは同一機能を有するものを表す。本図では図１の全体装置のうちマルチスポット励起光発生に関わる部分のみを示している。それ以外の構成は基本的には図１と同じである。１４′はマルチスポット発生ホログラムである。
【００４１】
図１２は、このマルチスポット発生ホログラムの作成方法を示す図である。図１２に示すように、マルチスポット励起光の寸法に対応したホール径を有するピンホールアレイ１ｊ１１′、１ｊ１２′………１ｊ１Ｍ′開口を有するマスク１８にレーザ子を照射し、透過光をフーリェー変換レンズ１５でホログラム記録媒体上に集光する。この集光位置に参照光１０００を入射角φ＝φ０で若干斜めから重ねて照射し、上記の集光位置にフーリェ変換ホログラムを作る。
【００４２】
光の利用効率を向上するため、位相変調型の記録媒体を用いる。またフーリェ変換面上の中心位置での０次光（空間周波数が０の位置）の強度が桁違いに大きくなりなり、できたホログラムのＳＮ，回折効率等が悪くなるのを避けるため各開口には互いの位置に無関係なランダムな位相を付加しておく。
【００４３】
このようにして作られたホログラムを図１１のＤＮＡ検査装置のマルチスポット励起光発生系に用いる。
【００４４】
図１１のＡＯ偏向器１２に入射したレーザ光は、レンズ系１３を通った後、上記の方法で作られたホログラム１４′を入射角φ０照射する。ＡＯ偏向器の駆動周波数の中心（偏向角度の中心）ではホログラムに入射するレーザ光の入射角φはφ０となり、図１２の方法でホログラムを作成する時の参照光１０００のホログラム面に対する入射角度φ０に等しくなるようにしておく。このようにしてホログラムにレーザ光を照射すると、図１１に示すように１ｊ１１、１ｊ１２………１ｊ１Ｍに図１２のホログラム作製時のピンホールアレーと同一のスポットアレイを再生する。
【００４５】
次にＡＯ偏向器の周波数を変化させると、ホログラムへの入射角度がわずかに変わるので、マルチスポット再生光の角度もわずかに変わる。この結果、隣の絵素に相当する位置を励起照明することになる。ＡＯ偏向器を順次駆動していけばステップ的にＤＮＡチップを１絵素ピッチで順次位置を変えてマルチスポット励起照明することができる。
【００４６】
図１３は、本発明のＤＮＡ検査装置の実施形態を示す図である。図１と同一番号は同一物を表している。本実施形態では、図１の実施形態と異なり、同時に２次元的な検出を行っている。すなわち、励起照明光は２次元的に広い範囲を同時に照明可能な照明系レンズ１３′を通し、波長選択ビームスプリッタ３０′で反射し、２次元マルチレンズアレー１４′を照明する。１４′の２次元マイクロレンズアレイは、すでに図１〜４を用いて１次元のマイクロレンズアレイを説明したと同じ機能を有し、２次元的なアレイ配列のみが異なっている。従って図１４に示すようにマイクロレンズ１４１′の焦点位置に２次元微小スポット１４１０′を形成する。
【００４７】
本実施形態の場合には、この１４１０′の位置を中心にピンホール開口が明けられている。このようにピンホール開口のみを通過する光がＤＮＡチップを照射する。微小マルチスポット光のスポット１４１０′の径ｄとスポットの配列ピッチｐの比は２以上の整数で、５以上が望ましい。図１３に示すようにピンホール開口を透過した２次元マルチスポット光は高解像レンズ１６′によりＤＮＡチップを同時に励起照射する。励起照射される絵素２ｘ１１ｙ１１、２ｘ１２ｙ１１，２ｘ１１ｙ２１、２ｘ２１ｙ２１、……は４絵素とばして等ピッチ間隔である。
【００４８】
同時に励起照射された上記絵素から発生する蛍光は上記高解像レンズ１６′を通り、マイクロレンズアレイ下面の各ピンホール１４１０′を通過する。ピンポールを通過した光はマイクロレンズを通過することにより、各マイクロレンズ上面（凸面）の大きさに広がる。このマイクロレンズ上面の蛍光強度が波長選択ビームスプリッタ３０′と 結像レンズ３１′を介して画像蓄積型高感度２次元センサ３２′に 結像される。本図では干渉フィルタが描かれていないが、波長分離ビームスプリッタ３０′と２次元センサ３２′の間に干渉フィルタ、または蛍光より長い波長を透過する色フィルタを設置する。
【００４９】
図４及び図１４に示した１次元及び２次元のマイクロレンズアレイでは、各マイクロレンズの隣接するマイクロレンズの中間の領域に入射する光は散乱光になりノイズ光となる危険性がある。そこでこの中間の領域を酸化クロム等の材質からなる遮光部で覆うマスキングを行えば（図示せず）このようなノイズを除去することができる。
【００５０】
以上の実施形態、図１，５，７，及び１３に用いている波長分離ビームスプリッタ３０，３０′と干渉フィルタ３４の分光反射特性と分光透過特性をそれぞれ図１５及び図１６に示す。両方を用いることにより励起光の影響を少なくでき、正確な検出ができるようになる。図でλは励起光の波長であり、通常スポット照射の単位面積当たりの強度を大きくするためレーザ光を用いるため励起波長バンド幅は狭い。λＬは検出しようとする蛍光の中心波長である。
【００５１】
ハイブリダイゼーションしようとするＤＮＡ断片に付加される蛍光体には、何種類かの蛍光物質が用いられる。例えば、良く用いられるＣｙ５（Ｃｙａｎｉｎｅ５）では、蛍光体の吸収のピーク波長は６４９ｎｍ、蛍光のピーク波長は６７０ｎｍである。また、更に短波長側では、Ｃｙ３（Ｃｙａｎｉｎｅ３）では蛍光体の吸収のピーク波長は５５０ｎｍ、蛍光のピーク波長は５７０ｎｍである。吸収体の分光吸収特性はバンド幅を有するため、吸収のピーク波長と励起レーザ光の波長は必ずしも一致させる必要はなく、吸収ピーク波長に近いレーザ光が用いられる。
【００５２】
Ｃｙ５ではＨｅ−Ｎｅレーザの赤の光６３３ｎｍや波長６３５ｎｍの半導体レーザ光を、Ｃｙ３ではＨｅ−Ｎｅレーザの緑の光５４４ｎｍ等を用いる。蛍光のみを取り出す干渉フィルタ、及び波長分離ビームスプリッタは、蛍光のピーク波長に近く、励起光を分離しやすい波長を中心波長に選ぶ。
【００５３】
上述した蛍光検出に際し、励起光を完全に遮光することが特に蛍光が微弱な場合に非常に重要となる。
【００５４】
図１７は、このような励起光の遮光をより完全に行うための本発明の実施形態図である。即ち、上述の干渉フィルタや波長選択ビームスプリッタのみでは不十分な場合、或いは、蛍光検出光強度を大きくするため、干渉フィルタのバンド半値幅を大きくしようとする場合に実施する。図１７で図１と同一番号は同一物もしくは同一機能を有するものである。
【００５５】
マイクロレンズアレイやホログラムでΣｆ面上に形成されたマルチスポットアレイ１１１，……、１１Ｍは、レンズ１５及び対物レンズ１６によりＤＮＡチップ上に励起光として結像される。この際各マルチスポット光が対物レンズの入射瞳ＥＰ０の中心にほぼ半径ＲＮＡσ′の広がりで通過する。対物レンズの開口数をＮＡ，焦点距離をｆとすると励起光のＤＮＡチップ上のスポット径Ｄｓは次式で与えられる。
【００５６】
Ｄｓ＝２ｋ１ｆλ／ＲＮＡσ′ （但し ｋ１＝０．６）
ＤＮＡチップ検出の絵素分解能（絵素ピッチ）をｐとすると、この値はほぼＤｓに等しい。ｐを２μｍ，励起光波長λを６３３ｎｍとすると、ＲＮＡσ′／ｆは０．１９となる。ＲＮＡσ′／ｆは２μｍのスポットを照射するための照明のＮＡ（２μｍスポットを 結像するために必要な対物レンズの最低限のＮＡ）でこれをＮＡ′とすると、
ＮＡ′＝ｓｉｎ（ｔａｎ−１（ＲＮＡσ′／ｆ））≒ＲＮＡσ′／ｆ＝０．１９
となる。対物レンズ１６のＮＡは微弱な蛍光を検出するため０．７以上０．９以下である。
対物レンズの入射瞳を上記のスポット径で通過した各励起スポット光は、対物レンズによりＤＮＡチップ上に約２μｍの励起スポット光を照射する。この対物レンズは両テレセントリックであるため、ＤＮＡチップに垂直に入射した励起光はチップ表面で約４〜８％の励起光が正反射し、対物レンズに戻ってくる。この正反射光は波長分離ビームスプリッタにより、励起光は透過されるが、わずかに反射し蛍光検出系３に向かう。
【００５７】
蛍光検出系には干渉フィルタ３４があり、励起光は遮光されるが、完全な遮光が難しい。即ち、干渉フィルタのバンド幅を広くして蛍光をできるだけ多く検出しようとすると、励起光がわずかに漏れる。そこで蛍光スポット光を蛍光検出面（或いはそれと共役な面）に結像検出するレンズ系３１′を図のようにレンズ系３１１と３１２で構成し、対物レンズの瞳が３１１と３１２の間の位置に結像するようにする。この瞳と共役な位置に空間フィルタ３５を配置する。空間フィルタ３５は図１８に示すような構造を持っている。
【００５８】
レンズ径３１１による対物レンズ瞳面の空間フィルタ３５への 結像倍率を１倍とする。空間フィルタは、遮光部３５３の光軸中心から対物レンズの瞳半径と等しいＲＮＡの半径を有する開口の中心部に、半径ＲＮＡσの円形の遮光部３５１を有する。ＤＮＡチップで正反射したマルチスポット励起光はこの空間フィルタ上でビーム径ＲＮＡσ′になっている。従ってＲＮＡσ＞ＲＮＡσ′であれば正反射光はこの遮光部３５１で遮光される。
【００５９】
一方マルチスポット励起光で励起され発生する蛍光は、ほぼ無指向で対物レンズに入射し、この空間フィルタに入射してくる。遮光部３５１により、蛍光も遮光されるが、遮光される蛍光の空間フィルタ入射蛍光に対する比率は（ＮＡ′／ＮＡ）２となり、上記値を入れると７（ＮＡ＝０．７の時）〜４（ＮＡ＝０．９の時）％になり、このロスは無視できる程度である。
【００６０】
このように、検出すべき蛍光の光量を落とさずに不必要な励起光を大幅に低減しすることができる。空間フィルタを透過した蛍光検出光は、レンズ３４と干渉フィルタ３４を通り、検出面であるファイバの入射端にＤＮＡチップのスポット像を結像し、蛍光検出される。
【００６１】
図１９は、本発明の実施形態を表す図である。励起光を蛍光検出光路に導かないようにする方法を示す。図１と同一番号は同一物を表す。励起光路と蛍光検出光路を分岐するビームスプリッタは本実施形態では偏光ビームスプリッタ３０″を用いている。即ち励起光をこの偏向ビームスプリッタのスプリット面にたいしＰ偏光で照射する。ＤＮＡチップ表面で反射し戻ってくる励起光はＰ偏光を保っているので、偏光ビームスプリッタを通過し、蛍光検出光路には入らない。他方発生する蛍光の偏光は励起光とはずれているので偏光ビームスプリッタ３０″でＳ偏光は反射し蛍光検出光路に導かれる。このようにすれば励起光の蛍光検出光路への入射を防ぐことができる。
【００６２】
図２０は、本発明の実施形態を示す図であり、蛍光検出を光ファイバとマルチチャンネル光電子倍増管を用いて行うものである。図１，５，７，１７，及び１９に示した実施形態における蛍光マルチスポット像の検出具体内容を示している。マルチスポット数がＭ以上の数からなるファイバ系３２の入射端は図２１に示すようにＭ個の１次元配列したマルチレンズアレイ３２１である。
【００６３】
図７で説明したように、蛍光マルチスポット像は、各マイクロレンズによりファイバの光を伝搬する芯（コア）に入射される。マルチチャンネル光電子倍増管３３が図２０に示すように２次元の受光開口配列の場合には、ファイバの出射端が２次元配列になるようにする。各出射端から出てきた蛍光は、図２０の実施形態の場合には 結像レンズ３２４により、ファイバ出射端３２３が光電子倍増管３３の各受光開口３３１に対応して結像するようにする。
【００６４】
図２１の実施形態の場合には、ファイバの出射端に２次元レンズアレイ３２４１が対応して設置されており、各ファイバから出射した蛍光は各レンズを通り、直接マルチチャンネル光電子倍増管の２次元受光開口（光電面）３３１１に集光するようにしている。図２０，２１に示した実施形態では、２次元のマルチチャンネル光電子倍増管であったが、１次元のマルチチャンネル光電子倍増管でも、出射端を１次元配列にすることにより、同じ方法で実現できる。
【００６５】
図２２は、本発明の実施形態を示す図である。本実施形態では、励起光として複数の波長を用いている。光源系１１Ａ、１１Ｂ、及び１１Ｃは、異なる波長λＡ，λＢ，及びλＣの励起光源からの光を成形し、ファイバ束に入射させ、出射端にマルチレンズアレイを配列し、出射後のほぼ集光する位置にピンホールアレイを設けている。ピンホールアレイを出射した励起光は、波長分離ビームスプリッタ３０Ａ，３０Ｂ、３０Ｃを通るように構成されている。図２２に示されているように、１１Ａが蛍光検出の励起光に選ばれている時には、λＡの励起光がレンズ１５を通過して、偏向ミラー３００で反射され、対物レンズ１６を通り、ＤＮＡチップ２をマルチスポット励起照射する。各スポットから発生する蛍光は、対物レンズ１６、偏向ミラー３００、レンズ１５（３１）を通り、波長選択ビームスプリッタ３０Ａで反射し、干渉フィルタ３４Ａを通り、図２０及び２１で説明したような方法で各スポットの蛍光をマルチチャンネル光電子倍増管検出する。
【００６６】
検出する蛍光が異なるタイプの場合には、制御装置４′から図示していない駆動機構により実線矢印の方向に光源系全体を移動し、異なる波長λＢ，及びλＣのいずれかを選択し、この波長で蛍光検出を行う。１つのＤＮＡチップに複数の蛍光を用いている場合には、光源系を順次移動させて、次々に異なる励起光で検出していく。
【００６７】
図２６は、上記の複数の蛍光を用いる場合の異なる実施形態である。図２２と異なり、複数の励起光を同時に照射し、検査時間の短縮を図ったものである。図２６では複数の波長λＡ′，λＢ′，及びλＣ′が例えば赤、緑、青の３色の光源系１１Ａ′、１１Ｂ′、及び１１Ｃ′から出射した光は波長選択合成ミラー５１，５２により、１つの光路に効率よく合成される。即ち波長選択合成ミラー５１は青を透過し、緑を反射する。また波長選択合成ミラー５２は赤を透過し、緑と青を反射する。
【００６８】
合成された３色は、ビームスプリッタ３０′を透過し、レンズ１５、偏向ミラー３００、対物レンズ１６を通過し、ＤＮＡチップ上に３色同時にスポット励起照明する。各波長でそれぞれの蛍光体が励起され、それぞれの蛍光色で発光するが、概ね、励起光よりわずかに長い波長の蛍光であるので、これら３波長の光で励起された３波長の蛍光を、波長分離ビームスプリッタ５３，５４で波長分離することができる。即ち波長分離ビームスプリッタ５３は青の蛍光を反射し、緑と赤を透過し、波長分離ビームスプリッタ５４は緑を反射し、赤を透過する。
【００６９】
このように各３色に分離された光路に、それそれの蛍光のみを純度高く透過させる干渉フィルタ３４Ｃ、３４Ｂ、及び３４Ａを配置し、各蛍光の微小スポット像を上述の方法によりファイバを介して、マルチチャンネル光電子倍増管３３Ｃ′、３３Ｂ′、及び３３Ａ′で同時に検出する。
【００７０】
図２２及び図２６の実施形態では、励起マルチスポット光のアレイ方向の走査を偏向ミラー３００で行う。偏向ミラーはピエゾ駆動方式もしくはガルバノミラータイプのものを用いる。この場合、図１で説明した実施形態とは異なり、マルチスポットはステップ移動ではなく、連続（線形）走査になる。ＤＮＡチップ上でのマルチスポットは走査になるが、検出光路にも同じ（同一の）偏向ミラーが使われているため、蛍光検出のファイバー端には動かないマルチスポットが結像している。このため偏向ミラーの偏向角に基づき画素番地が決定されることになる。
【００７１】
このような画素番地と偏向角の関係に基づき、マルチチャンネル光電子倍増管から並列的に得られる複数の蛍光検出信号は制御回路４′（図２２）や４″（図２６）により整理され、保存される。勿論このようなデータ処理には予め計測、検出の条件を入力しておく必要があり、これら入力情報は端末４１′から入力されるか、或いは上位のコンピュータ４０からこれら情報が入力され、必要に応じて、計測・検査結果のデータがコンピュータに送られる。
【００７２】
図２６の実施形態で、複数の波長の異なる励起光を同時に照射する例を説明したが、例えば、複数の励起光とそれぞれの狙っている蛍光の波長帯が重複しているような場合には、重複するものについては光源に近いところにある図示しないシャッタを用いたり、光源そのもののＯＮ−ＯＦＦにより、時間をずらして蛍光検出することによりこのような問題を回避する。
【００７３】
図２３は、励起光源に複数のほぼ同一波長の半導体レーザ１１１Ａ２，１１１Ａ２……を用いた実施形態である。半導体レーザは容積が小さく比較的高出力で、安価であるため、図に示すように多数の半導体レーザを用いて、マルチスポット光源を作ることにより、強いマルチスポット励起光をＤＮＡチップに照射することが可能になり、高速検出が実現する。各半導体レーザから出射した光をレンズ１１２Ａ１、１１２Ａ２……によりファイバ１２０Ａ１，１２０Ａ２……の入射端に取り込む。
【００７４】
出射端から出射するレーザ光を図２４に示すようにマイクロレンズアレイを介してピンホール配列１１１，１１２……に集光させ、この透過光をマルチスポット励起光として用いる。
【００７５】
励起光として半導体レーザを用いることができない場合には、半導体レーザ励起の高出力固体レーザや、高出力ガスレーザを用いる。このようなレーザ光源では出射ビームを図２５に示すような方法で分割して用いると、ほぼ等しい強度で、ほぼ等しいビーム形状を有するマルチスポット励起光を形成することが可能になる。
【００７６】
即ち、レーザ光源１１１Ａ′から出射したビームをマルチ分割ビームスプリッタ１１１０Ａ′，１１２０Ａ′……で分割する。分割する数をｋとすると、分割の初段から２段、３段……ｋ段目までのビームスプリットの反射率をｒ１，ｒ２，…ｒｊ…ｒｋとする。ｒｋは１であること、各ビームスプリット光は強度が等しいので、１≦ｊ≦ｋの任意のｊに対し、
ｒｊ＝１／（ｋ−ｊ＋１）
を満たすようにすればよい。即ち１１１０Ａ′ではｋが４、即ち４分割であるので、ｒ１は１／４、ｒ２は１／３、ｒ３は１／２、ｒ４は１となる。同様に１１２０Ａ′は３分割であるのでｒ１は１／３、ｒ２は１／２、ｒ３は１となる。 このように等しいビーム強度で、等しいビーム形状のレーザ光がレンズアレイ１１２Ａ１′に入射し、ファイバの芯に入射する。
【００７７】
図２３の実施形態では、複数の半導体レーザをマルチビームスポット発生の光源として用いているが、半導体レーザ以外のガスレーザや第２高調波によるレーザなどを複数用いてマルチスポット励起光を形成することも、入手できるレーザ光のパワーが不足する場合には必要になる。このような場合には図２５に示す系を複数用いて、この複数の系から取り出されるファイバ出射端を１次元上或いは２次元上に配列することにより、励起強度の大きいマルチスポット光を得ることができる。
【００７８】
上記の複数の励起光を用いる場合、励起波長によっては半導体レーザ、ガスレーザ及び半導体励起の第２高調波を用いる固体レーザ等各種タイプの異なるレーザを用いる必要が生じる。このような場合に上記の図２３や図２５の方法でマルチスポット励起光を形成すればよい。
【００７９】
図２７は本発明の実施形態を示す図であり、励起マルチスポット光がＤＮＡチップに混入した異物からの蛍光や散乱光、或いは検出光学系の異物からの散乱光の影響を除去し、精度の高い蛍光検出を実現するものである。１１′は励起光源でファイバを介してピンホール開口アレイ１４′を透過して励起マルチスポット光を作る。マルチスポット光はレンズ１５と対物レンズ１６によりＤＮＡチップ上に結像する。対物レンズの入射瞳の位置には空間フィルタ１６１がある。
【００８０】
励起マルチスポット光はこの瞳の中心からずれた１６３の位置を通過するように設定されている。即ち各マルチスポット光は図２９、図３０に示すように対物レンズの光軸から外れた部分を通り，図３０に斜め斜線で示すＩｉの光束となって、ＤＮＡチップ２に斜め方向θｉの入射角で照射する。この照射収束光の収束角θＩは、先にスポット径とＮＡ′の関係を説明したように、ｓｉｎ（ＮＡ′）＝θＩ／２となる。
【００８１】
また、ＤＮＡチップで正反射した励起光は、対物レンズを通過し、瞳１６１上で１６３とはレンズ光軸を対称の中心として対称な位置（図の１６２に相当する位置）を通る。
【００８２】
そこで、図２８に示すように、ここに正反射光を遮光する部材１６２を形成しておけば、励起正反射光はこの１６２で遮光される。このように瞳の中心から外れた位置を励起光の主光線の光路にし、この主光線の入射角θｉに対し、θｉ＞θＩ／２の条件を満たすようにすれば、励起光を瞳上で遮ることなく、励起正反射光を瞳上で遮光することができる。本実施形態は図１７の実施形態で説明した励起光による雑音除去の効果を有することは云うまでもない。
【００８３】
この効果に加え、図２７の実施形態では、ＤＮＡチップ上或いは中に混入している異物の影響を、以下の様にして取る。即ち、ＤＮＡサンプル作成時に混入した各種蛋白質等の異物があると、これに励起光が照射すると、このような異物の寸法が数μｍと小さいため、励起光が散乱する。また上記の有機物の様な異物の場合には異物から強い蛍光が発せられ、検出すべきＤＮＡに付加している蛍光体より強い蛍光となる。
【００８４】
図３０に示すように、散乱励起光は点で塗った対物レンズのＮＡで決まる領域Ｌ＋Ｓを透過し、対物レンズを通過後、空間フィルタの遮光部１６３以外の部分を通り、蛍光検出系に漏れてくる。この漏れを波長分離ビームスプリッタ６１で励起光だけ取り出し、像検出する。波長分離ビームスプリッタは蛍光を透過し、励起光を反射する。波長分離ビームスプリッタの挿入位置は図２９では波長分離ビームスプリッタ３０″の後ろの光路にあるが、前に置いても良い。このようにすることにより、異物で散乱した励起光が蛍光の画像がマルチチャンネル光電子倍増管等の検出器３３′で撮られるのと同様に、励起光散乱像Ｓ１００が検出器６２により画像として検出される。
【００８５】
図３１は、このように検出された蛍光像信号ＤＬと励起光像信号ＤＳを、各絵素毎の信号レベルで表している。即ち１，２，……、２５は検出絵素番地を表し、（１）、（２）、（３）、（４）、（５）は同じＤＮＡ配列が付いているセルの番地である。即ち例えば１，２，３，４，５番地の絵素は（１）のセルに属する。実際にはセル内の絵素は２次元であり、例えば５×５絵素あるが、図を用いた説明を分かりやすくするため１次元にしている。異物がある絵素にかかっていればその絵素の散乱励起光は閾値ＤＳＴを越える。
【００８６】
図３１で、励起光像信号ＤＳは絵素番地９，１０，１１及び１６，１７，１８，１９，２０で閾値ＤＳＴを越えている。従って、蛍光像検出信号ＤＬの該当する番地の情報は異物の影響を強く受けているため、この番地の情報を除去して各セルの蛍光の平均値を求める。すなわち、セル番号（２）については絵素９，１０番地の情報は用いないで残りの６，７，８番地の情報のみを用いて平均値を算出する。同様にセル（３）については１３，１４，１５のみの情報を用いて平均値を求める。セル（４）は総ての絵素が異物で散乱しているためこのセルは無効とする。このようにして図３１の下のグラフに示すようにセル内の平均強度を求めることにより、異物の影響を大幅に低減し、正確な蛍光検出ができるようになった。
【００８７】
なお、図２７から３０を用いて説明した異物の影響を除去する実施形態の光学系では、励起光が対物レンズを通ってＤＮＡチップを照明する光学系になっているが、対物レンズを通らずに対物レンズとＤＮＡチップの間から斜めに照射し、散乱光を検出する構成でも良い。この場合には、正反射光が対物レンズに入射しないため、空間フィルタ（１６１に相当する）が不要になる。
【００８８】
図３２は、本発明の実施形態を示す図である。１は既に詳細な実施形態を説明したマルチスポット励起光照射系であり、３は同じく詳細を説明したマルチスポット励起光で発生した蛍光を検出する蛍光検出系である。ＤＮＡチップ２の上にハイブリダイゼイションされているＤＮＡに付いている蛍光に数μｍの微小スポット励起光を対物レンズ１６により照射するには、スポットサイズが一定に保たれるよう対物レンズと蛍光面を焦点深度内の一定の間隔に常時維持していなければならない。このため剛性上対物レンズ１６と構造的に一体になった焦点検出系７を用いる。焦点検出系７は斜めビームスポット照射系７１とスポット位置検出系７２から構成されている。斜めビームスポット照射系７１はＤＮＡチップ上の蛍光面に斜めから微小スポットを照射する。
【００８９】
図３３はＤＮＡチップの断面構造の１例である。この実施形態図において蛍光面はΣ２面である。即ちガラス等の平坦な基板２３上に蛍光面Σ２があり、この面とガラス基板２１上の面Σ１の間には蛍光が付加された被検査ＤＮＡを含んだ液体を流し、ハイブリダイゼションさせるための間隙２２がある。ＤＮＡ検査の段階ではこの間隙に液体を満たしておく。しかし場合によってはこの間隙を空にしておくこともある。また蛍光面をΣ１にし、基板２３は不透明な材質や光を吸収する材料にしておくこともある。
【００９０】
斜めスポット照射系７１から蛍光面で収束するように斜めから照射される光ビームｆ０は上部基板２１の上面Σ３と下面Σ１、及び下部基板２３の上面Σ２と下面Σ４の４面で正反射する。斜め照射ビームｆ０の主光線ｆ０Ｍが正反射した光線ｌ３，ｌ１，ｌ２，ｌ４は、 結像レンズ７２１によりポジションセンサ７２２の受光面に等しい面上のＰ３，Ｐ１，Ｐ２，及びＰ４の位置にそれそれ像を結ぶ。蛍光面の位置は予め決まっているので、各面Σ３、Σ１、Σ２とΣ４がある程度離れていれば、検出したい面（この実施形態図ではΣ２）のスポット像位置のみを受光し、それ以外のスポット像は受光開口外となるように受光ポジションセンサ７２２の寸法と、レンズ７２１の 結像倍率を決めておけば、所望の検出面のみの高さ検出ができる。
【００９１】
即ち、この実施形態では、Σ２面からの正反射光のみをポジションセンサで捕らえ、ポジションセンサ上のスポット位置即ちΣ２面の高さ位置を検出することができる。制御回路４により、この検出情報に基づき対物レンズ、及び対物レンズと一体になった焦点検出系７を、駆動装置７３により上下に微動することにより常時合焦点状態で蛍光検出することが可能になる。
【００９２】
図３３の斜め入射フォーカス検出光の入射角がブリュースター角に近いと、Ｐ偏向で入射させると表面での反射が非常に小さくなり、検出困難になる。従ってＳ偏向を用いる。Ｓ偏向にするとどのような入射角でもＰ偏向に比べ表面での反射率が高くなり有利である。
【００９３】
図３４は本発明の実施形態図であり、対物レンズ１６を通して焦点検出するものである。ファイバ７４で図示しない近赤外半導体レーザ光源から導かれてきたレーザ光はファイバ出射後ビームスプリッタ７６を通りレンズ７７、波長分離ビームスプリッタ３００″、対物レンズ１６を通り、ＤＮＡチップ２の蛍光面に斜めから集光照射する。この照射光の入射角度θは対物レンズの開口ＮＡに相当する（ｓｉｎθ＝ＮＡ≒０．８よりやや小さい入射角）大きさである。正反射した光は再び対物レンズを通り、ポジションセンサ７３′上にチップ上の集光点に対応した位置に結像する。このようにすれば、図３３の実施形態同様にして、チップの蛍光面のフォーカス位置を検出できる。本実施形態のように焦点検出に用いる光として、検出蛍光より波長の長い光を用いれば蛍光体を励起することなく、即ち、検出雑音を発生することなく、正確に焦点検出できる。
【００９４】
なお図３４の波長分離ビームスプリッタ３００″は近赤外光を透過し、蛍光検出に用いる励起光及び蛍光は反射する。１次元励起光照射光学系１で形成された１次元励起光スポットアレイがレンズ１５、波長選択ビームスプリッタ３００″及び対物レンズ１６を介してＤＮＡチップ２の蛍光面に照射される。発生した蛍光は蛍光検出光学系３により検出される。励起光スポットアレイ照射位置のアレイ方向の移動は波長選択ビームスプリッタを微回転することにより行う。
【００９５】
以上、実施形態の各例を用いて説明したＤＮＡチップの蛍光検出をＤＮＡチップの全セルに亘り行う方法を、以下に図３５から４０を用いて説明する。
【００９６】
図３５はＤＮＡチップの全体の構造を表している。２０４はＤＮＡチップを実装している全体ケースである。ＤＮＡチップはこのケースにある窓２００の内側のガラス基板であり、ケース２０４に固定されている。窓内側の領域２０２に蛍光物体を添付したＤＮＡ断片がハイブリダイゼションされている。この２０２の領域の外で窓２００の内側に、位置決め用のアライメントマーク２０１が描画されている。
【００９７】
図２で説明したＮ×Ｎ（図５では５×５）の絵素（太い線で示す）分が同一のＤＮＡ情報の断片が植えられている（プロービングされている）セル２０と、このアライメントマーク２０１の相対的な位置が１０分の数μｍの精度で設計、製作されている。
【００９８】
ＤＮＡチップを検査装置に搭載し、既にその実施形態を説明したＤＮＡ検査装置内に実装している（図示せず）アライメント検出光学系で少なくとも２つのアライメントマーク２０１の位置をマーク位置検出２次元ＣＣＤ等でＣＣＤ上の位置として検出する。またこのマーク検出を行ったときのＤＮＡチップの位置は、例えば図３２に示すように、ＤＮＡチップが搭載されているチャックに設置されているｘ及びｙ方向の位置検出用測長器８１及び８２で検出する。
【００９９】
上記のＣＣＤ検出光学系の光軸と、前述の各種蛍光検出光学系における検出光軸との間隔は一定であるので、この間隔と、上記ＣＣＤのアライメントマーク検出位置と、測長器の検出位置から、ＤＮＡチップの各セルを更に細かくセル内を分割した絵素を正しい位置で検出することが可能になる。この際、２つ以上のアライメントマークの位置検出でＤＮＡチップが回転していることが分かったなら、図示しない回転機構でこの回転を補正する。なお、この回転補正後の正しい位置検出は必要に応じて行う。またこの回転の補正を行わなくても回転量が小さければこの回転量を上記方法で検出し、この回転検出量に基づきｘｙ座標を補正していっても良い。また上記のマルチスポット光の方を光学系の微小回転により補正して検出することも可能である。
【０１００】
以上説明したように、ＤＮＡチップ上のセル内の絵素を正確な位置決め精度で検出することが、アライメントマーク検出と、ＤＮＡチャックの測長によりできるので、以下に示す方法でチップ内の全絵素を順次光速に隈無く蛍光検出することができる。図３５の２ＡはＭ個のマルチスポットアレイ励起光を照射し、スポットアレイ方向にＮ絵素分順次走査し、元の操作位置に戻るという動作を繰り返すと共に、チャックをｙ方向に走査することにより、チャックの１走査で検出される領域を表す。即ち、図３６に示すようＤＮＡチップ上の絵素２Ａ１０１，２Ａ１０２，……，２Ａ１０Ｍが先ず同時に励起照明され、次に前述の方法により１絵素ピッチΔＰ分マルチスポットが移動し、これを順次続ける。
【０１０１】
このようにしてＮ（ｋ）絵素分移動すれば、合計ＭＮ（ｋ）絵素分、即ちＮＭΔＰの幅に亘り、１次元アレイ状に検出される。Ｎ（ｋ）絵素分の走査が終われば、マルチスポットアレイを初めの位置に戻す。この間ＤＮＡチップは図３９のｙｓｔの時間ｔ０からｔ１の間のようにｙ方向に１絵素分移動しているので、上記の動作をｙ方向の絵素数分時間ｔ０からｔ１の間繰り返せば、領域２Ａの全絵素に亘る蛍光検出が終了する。
【０１０２】
上記の動作を図１の実施形態のＤＮＡ検査装置で行う場合、ＡＯ偏光器によるマルチスポット励起光の駆動信号、或いはスポットの移動位置は図３８のＳｐｘに示すように変化する。更に詳細に見れば図８のＳＢ１２のようにステップ移動している。また波長選択ビームスプリッタの偏向信号も図３８のＳｐｘ同様に変化させる。時間ｔ０からｔ１までこのような変化を繰り返せば、領域２Ａの全域を検出できる。
【０１０３】
領域２Ａの下の端まで検出されると（時間ｔ１）図４０のｘｓｔに示すようにＤＮＡチップのチャックをｘ方向にＮＭΔＰだけステップ移動する。ステップ移動後、図３９の時間ｔ１後のｙｓｔに示すようにチャックをｙの逆方向に走査する。これと同時に図３８の時間ｔ１後のＳｐｘようにＡＯ偏光器１２及び波長選択偏向ビームスプリッタ３０の偏向信号を領域２Ａ検出時（時間ｔ０〜ｔ１）とは逆方向に走査する。このようにすれば図３７に示すように領域２Ｂを領域２Ａの検出に引き続き継続的に検出できる。以上の動作をＤＮＡチップのｙ方向について−方向と＋方向に交互に繰り返せばＤＮＡチップの２Ａから２Ｊまで全チップを高速に検出することができる。
【０１０４】
本実施形態でＤＮＡチップを総て検出するのに要する時間を説明する。チップ内のセル数Ｌ、各セルをＮ×Ｎ分割することにより、異物等の影響を回避することにする。このようにするとチップ内の全検出絵素数はＬＮ２になる。マルチスポット励起光の同時照射スポット数をＭとするとし、同時にマルチスポットで検出する時間をΔｔとすると、スポットの移動や、チャックのｘ方向の移動による時間が蛍光検出する時間に比べ短いとして無視すると、全蛍光検出時間Ｔは次式で与えられる。
【０１０５】
【０１０６】
蛍光検出に用いる光電子倍増管の量子効率は、蛍光波長が長い６７０ｎｍでは５〜１０％と低くなる。また、励起に用いるレーザ光の出力の限界もある。このような条件を考慮し、できるだけ高速に検出するには、例えばｋ（＝Ｎ）＝１０、Ｍ＝５０、Δｔ＝５０μｓとなり、セル数Ｌ＝１０００×１０００、セル内分割絵素数Ｎ＝５として、Ｔ＝２５ｓとなる。即ちＬＮ２／（６×１０５）秒以下の条件を満たす。ちなみに上記のＬとＮの値をこの条件に入れれば４２秒になり、蛍光検出以外のサンプルチップの装着脱、検査条件の入力、結果の出力を含めて１分以内に検出するという条件を満足する。
【０１０７】
１分で検出可能になれば、多くの検体を検査する場合効果を発揮する。例えば従来５分かかっていた検査が１分で済むため、前処理に少々時間がかかっても、検体数が百近くになると、前処理が通常多数の検体に対し平行してできるようにするため、５，６時間の時間短縮が図れる。
【０１０８】
本発明によりこのような高速・高精度の検出が可能になるのはマルチスポットを同時に励起光に用いているためであり、しかも各スポットの励起光による蛍光検出に際し他の励起スポット光の影響を極力受けないようにスポット間隔を開けて検出しているからである。
【０１０９】
【発明の効果】
以上説明した本発明により、ＤＮＡチップ上の多種、多数のＤＮＡプローブにハイブリダイゼーションされた被検査対象ＤＮＡを高速にかつ正確に蛍光検出することが可能になった。この結果、感染症の診断、遺伝子検査等を多数の検体に対し、高速・高精度に行うことが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施形態を表す図。
【図２】本発明の実施形態図で、マルチスポット照射を表す。
【図３】本発明の実施形態図で、マルチスポット照射の移動を表す。
【図４】本発明の実施形態図で、マイクロレンズアレイによるマルチスポット発生を表す。
【図５】本発明の実施形態図で、図１の実施形態を説明する図。
【図６】波長選択ビームスプリッタ固定時のスポット蛍光像の動きを説明する図。
【図７】波長選択ビームスプリッタ偏向時のスポット蛍光像の動きを説明する図
【図８】本発明の実施形態し、図１の各部品の動作、検出信号等を表す図。
【図９】図１の実施形態で、蛍光像検出面の像の動きを表す図。
【図１０】図１の実施形態で蛍光検出面の受光開口を表す図。
【図１１】本発明の実施形態図で、マルチスポットをホログラムで形成する図。
【図１２】上記のホログラムを作成する方法を示す図。
【図１３】本発明の実施形態を示す図。
【図１４】図１３の実施形態で用いる２次元マルチスポット発生用マイクロレンズアレ。
【図１５】本発明の実施形態で波長分離ビームスプリッタの特性を示す図。
【図１６】本発明の実施形態で干渉フィルタの特性を示す図。
【図１７】本発明の実施形態図で、励起光を空間フィルタで遮光する図。
【図１８】上記空間フィルタの図。
【図１９】本発明の実施形態図で、偏向を利用する励起光遮光法を示す図。
【図２０】本発明の実施形態図で、１次元スポットアレイを２次元マルチチャンネルフォトマルで検出する図。
【図２１】上記図２０の実施形態でファイバの入出射端とスポット像取り込みを示す図。
【図２２】本発明の実施形態図で、励起光を複数の波長にして検出する図。
【図２３】本発明の実施形態図で、複数の半導体レーザを励起光に用いる図。
【図２４】本発明の実施形態図で、ファイバの出射端からマルチスポット光を得る図。
【図２５】本発明の実施形態図で、１本のレーザビームからマルチスポットを得る図。
【図２６】本発明の実施形態図で、励起光を複数の波長にして同時に検出する図。
【図２７】本発明の実施形態図で、マルチスポット光を斜め照射し、正反射励起光を瞳上で遮光する図。
【図２８】上記図２７の瞳上の遮光部を示す図。
【図２９】本発明の実施形態図で、励起散乱光を検出し異物位置を求め、蛍光検出結果を補正する方法を示す図。
【図３０】上記図２９の対物レンズとＤＮＡチップの間の励起正反射光と散乱励起光を示す図。
【図３１】図２９の異物散乱光の検出信号による補正の方法を示す図。
【図３２】本発明の実施形態図で、フォーカス検出と、制御を示す図。
【図３３】図３２のフォーカス検出で、ＤＮＡチップの反射呼応を示す図。
【図３４】本発明の実施形態図で、対物レンズを通してフォーカス検出する図。
【図３５】本発明の実施形態で、ＤＮＡチップの全検査対象域を検出する方法を示す図。
【図３６】図３５の実施形態の拡大説明図
【図３７】図３５の実施形態の拡大説明図
【図３８】図３５の実施形態でマルチスポットの動きを示す図。
【図３９】図３５の実施形態でＤＮＡチップチャックのｘ方向の動きを示す図。
【図４０】図３５の実施形態でＤＮＡチップチャックのｙ方向の動きを示す図。
【符号の説明】
１・・・・励起光照射光学系、１０・・・・マルチスポット形成光学系、１１・・・・光源系、１２・・・・ＡＯ偏向器、１４・・・・マイクロレンズアレイ、１６・・・・対物レンズ、１４′・・・・マルチスポット発生ホログラム、２・・・・ＤＮＡチップ、２０・・・・セル、２０１，２０２，２１２・・・・蛍光検出絵素、３０・・・・波長選択ビームスプリッタ偏向器、３００・・・・ミラー偏向器、３２・・・・光ファイバ、３３・・・・光電子倍増管、４、４′・・・・制御回路、４１′・・・・入力端末、５１，５２，５３，５４・・・・波長選択ビームスプリッタ、７・・・・フォーカス検出系、７３・・・・は対物レンズとフォーカス系の微動機構、８０・・・・ＤＮＡチップチャック、８１，８２・・・・ＤＮＡチップチャック位置測長器、８３・・・・ＤＮＡチップチャック駆動機構である。
Claims (29)
- 複数の種類からなる所望のＤＮＡ断片を予め決められた一定の規則に基づき配列した微小エリアである複数Ｌのセルから構成されているＤＮＡチップに、検査対象であるＤＮＡから前処理により作成したＤＮＡ断片に所望の蛍光体を付加したターゲットをハイブリダイゼーションした被検査ＤＮＡチップに所望の波長からなる励起光を照射し、得られる蛍光を分析するＤＮＡ検査方法であって、上記各セルの寸法Ｄ以下のスポット径ｄである複数Ｍのマルチスポット励起光を互いに異なる位置に蛍光減衰時間以上の時間Δｔに亘り対物レンズを介して同時に照射することを上記複数のマルチスポット励起光とＤＮＡチップの相対位置を上記各セルの寸法Ｄよりも小さいピッチで順次変化させながら行い、該照射により前記被検査ＤＮＡチップから発生した蛍光を前記マルチスポット励起光の反射光と分離して検出し、該検出した蛍光が発生した位置と蛍光強度の情報を用いて被検査ＤＮＡチップの検査を行うことを特徴とするＤＮＡ検査方法。
- 複数Ｍの励起光スポットは、１次元もしくは２次元状に一定ピッチで直線上に配列されていることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ検査方法。
- 上記マルチスポット励起光は、スポット径ｄに対してほぼｋｄ（ｋは２以上の整数）の間隔を持って直線状に上記ＤＮＡチップの複数Ｍの点を同時に照射し、該マルチスポット励起光を上記Δｔ時間照射後、上記ＤＮＡチップ上でほぼｄだけ上記直線方向に移動した位置を、Δｔ時間照射することを順次繰り返すことと、上記ＤＮＡチップと対物レンズを上記直線方向と直角な方向に相対的に移動することにより、上記ＤＮＡチップの所望の２次元領域を検査することを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ検査方法。
- 上記照射により上記被検査ＤＮＡチップから発生した蛍光を上記マルチスポット励起光の反射光と分離することを、波長分離ビームスプリッタを用いて行うことを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ検査方法。
- 上記照射により上記被検査ＤＮＡチップから発生した蛍光を上記マルチスポット励起光の反射光と分離することを、波長分離ビームスプリッタと、光干渉フィルタ及び／又は色フィルタを組合わせて行うことを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ検査方法。
- 所定のピッチで配列した複数のセルのそれぞれに配置したＤＮＡ断片に所望の蛍光体を付加したターゲットをハイブリダイゼーションすることにより形成された被検査ＤＮＡチップに励起光を照射して得られる蛍光を分析するＤＮＡ検査方法であって、光源から発射されたレーザビームを分岐させて直線状に並んだ複数のレーザビームを形成し、該直線状に並んだ複数のレーザビームを上記被検査ＤＮＡチップ上の所定のピッチの２倍以上離れた複数のセルに同時に照射し、該照射により上記被検査ＤＮＡチップ上の所定のピッチの２倍以上離れた複数のセルから発生する蛍光を該被検査ＤＮＡチップからの反射光から分離して同時に検出することを上記被検査ＤＮＡチップ上の上記レーザビームの照射位置を該レーザビームの直線状の並びの方向に所定のピッチ順次変化させながら行い、該レーザビームの照射照射位置を順次変化させて検出した蛍光の情報を用いて上記被検査ＤＮＡチップを検査することを特徴とするＤＮＡ検査方法。
- 上記照射により上記被検査ＤＮＡチップから発生した蛍光を上記複数のレーザビームの反射光から分離することを、波長分離ビームスプリッタを用いて行うことを特徴とする請求項６記載のＤＮＡ検査方法。
- 上記照射により上記被検査ＤＮＡチップから発生した蛍光を上記複数のレーザビームの反射光から分離することを、波長分離ビームスプリッタと、光干渉フィルタ及び／又は色 フィルタを組合わせて行うことを特徴とする請求項６記載のＤＮＡ検査方法。
- 上記照射により上記被検査ＤＮＡチップから発生した蛍光を上記複数のレーザビームの反射光から分離することを、上記反射光を空間フィルタを用いて上記複数のレーザビームの反射光を遮光することにより行うことを特徴とする請求項６記載のＤＮＡ検査方法。
- 上記被検査ＤＮＡチップからの反射光から分離された蛍光を、マルチチャンネル型の光電子増倍管を用いて検出することを特徴とする請求項６記載のＤＮＡ検査方法。
- 上記被検査ＤＮＡチップ上の上記複数のレーザビームの照射位置を該複数のレーザビームの直線状の並びの方向に所定のピッチ順次変化させた後、上記複数のレーザビームの直線状の並びの方向と直角な方向に上記被検査ＤＮＡチップと上記複数のレーザビームの相対的な位置を変化させることを特徴とする請求項６記載のＤＮＡ検査方法。
- 上記励起光は複数の異なる波長を含み、複数の蛍光体を付加した異なるターゲットを分離して検出することを特徴とする請求項１又は６に記載のＤＮＡ検査方法。
- 所定のピッチで配列した複数Ｌのセルのそれぞれに配置したＤＮＡ断片に所望の蛍光体を付加したターゲットをハイブリダイゼーションすることにより形成された被検査ＤＮＡチップを検査するＤＮＡ検査装置であって、上記被検査ＤＮＡチップ上のセルの寸法Ｄ以下のスポット径ｄを有する複数Ｍの励起光を同時に発生せしめるマルチスポット励起光発生手段と、該マルチスポット励起光発生手段で発生させたマルチスポット励起光を上記被検査ＤＮＡチップ上の上記セルの複数Ｍの箇所に同時に照射せしめる照射手段と、該照射手段を介してマルチスポット励起光が照射された上記被検査ＤＮＡチップから発生した蛍光を上記マルチスポット励起光の反射光から分離して検出する蛍光検出手段と、上記マルチスポット励起光の照射位置とＤＮＡチップの位置とをセルの寸法Ｄ以下のピッチで相対的に変化せしめる駆動手段と、該駆動手段並びに蛍光検出手段により検出されたＤＮＡチップの所望領域の蛍光強度と蛍光位置から被検査ＤＮＡチップのＤＮＡ情報を求る制御手段とを備えたことを特徴とするＤＮＡ検査装置。
- 上記マルチスポット励起光発生手段は、一定ピッチで１次元もしくは２次元状に配列された複数Ｍの励起光を同時に発生することを特徴とする請求項１３記載のＤＮＡ検査装置。
- 上記蛍光検出手段は、上記被検査ＤＮＡチップへの複数Ｍの照射スポットと共役な関係にある面上に形成されるスポット像の径とほぼ同程度の有効径を有するＭ個の受光開口を有することを特徴とする請求項１３記載のＤＮＡ検査装置。
- 上記受光開口は光ファイバ受光端であり、上記蛍光検出手段は、上記光ファイバの受光端と反対側にある出射端より出射する光を分離して検出することを特徴とする請求項１５記載のＤＮＡ検査装置。
- 上記照射手段は、上記ＤＮＡチップへの複数Ｍの照射スポットをスポット径ｄ、整数ｋに対しほぼｋｄの間隔を持って直線上に配列し、上記制御手段は、上記スポットアレイを上記Δｔ時間照射後、ほぼｄだけアレイ方向に移動し、Δｔ時間照射することを順次ｋ回繰り返すことにより、アレイ方向にｋＭ個のスポット位置に亘り検査を行い、かつＤＮＡチップと上記対物レンズを少なくともアレイと直角方向に、相対的に移動することによりＤＮＡチップの所望の２次元領域を検査するように制御することを特徴とする請求項１３記載のＤＮＡ検査装置。
- 上記スポットアレイの移動は音響光偏向器を用いて行うことを特徴とする請求項１７記載のＤＮＡ検査装置。
- 上記蛍光検出手段は、上記照射により上記被検査ＤＮＡチップから発生した蛍光を上記マルチスポット光の反射光から分離することを、波長分離ビームスプリッタを用いて行うことを特徴とする請求項１３記載のＤＮＡ検査装置。
- 上記蛍光検出手段は、上記照射により上記被検査ＤＮＡチップから発生した蛍光を上記マルチスポット光の反射光から分離することを、波長分離ビームスプリッタと、光干渉フィルタ及び／又は色フィルタを組合わせて行うことを特徴とする請求項１３記載のＤＮＡ検査装置。
- 上記蛍光検出手段は、上記照射により上記被検査ＤＮＡチップから発生した蛍光を上記マルチスポット光の反射光から分離することを、上記反射光を空間フィルタを用いて上記マルチスポット光の反射光を遮光することにより行うことを特徴とする請求項１３記載のＤＮＡ検査装置。
- 上記蛍光検出手段は、上記被検査ＤＮＡチップからの反射光から分離された蛍光を、マルチチャンネル型の光電子増倍管を用いて検出することを特徴とする請求項１３記載のＤＮＡ検査装置。
- 所定のピッチで配列した複数のセルのそれぞれに配置したＤＮＡ断片に所望の蛍光体を付加したターゲットをハイブリダイゼーションすることにより形成された被検査ＤＮＡチップに励起光を照射して得られる蛍光を分析するＤＮＡ検査装置であって、レーザビームを発射する光源手段と、該光源手段から発射されたレーザビームを分岐させて直線状に並んだ複数のレーザビームを形成するマルチビーム形成手段と、該マルチビーム形成手段により形成された直線状に並んだ複数のレーザビームを上記被検査ＤＮＡチップ上の所定のピッチの２倍以上離れた複数のセルに同時に照射する照射手段と、該照射手段により照射されて上記被検査ＤＮＡチップ上の所定のピッチの２倍以上離れた複数のセルから発生する蛍光を上記照射による上記被検査ＤＮＡチップからの反射光から分離する分離手段と、該分離手段で反射光と分離された上記被検査ＤＮＡチップ上の所定のピッチの２倍以上離れた複数のセルから発生した蛍光を同時に検出する検出手段と、上記被検査ＤＮＡチップ上の上記複数のレーザビームの照射位置を該複数のレーザビームの直線状の並びの方向に所定のピッチづつ順次変化させる照射位置変化手段と、該照射位置変化手段により上記複数のレーザビームの照射位置を順次変化させて検出した蛍光の情報を用いて上記被検査ＤＮＡチップを検査する検査手段とを備えたことを特徴とするＤＮＡ検査装置。
- 上記分離手段は、波長分離ビームスプリッタを用いて上記照射により上記被検査ＤＮＡチップから発生した蛍光を上記複数のレーザビームの反射光から分離することを特徴とする請求項２３記載のＤＮＡ検査装置。
- 上記分離手段は、波長分離ビームスプリッタと、光干渉フィルタ及び／又は色フィルタを組合わせて上記照射により上記被検査ＤＮＡチップから発生した蛍光を上記複数のレーザビームの反射光から分離することを特徴とする請求項２３記載のＤＮＡ検査装置。
- 上記分離手段は、空間フィルタを用いて上記複数のレーザビームの反射光を遮光することにより上記照射により上記被検査ＤＮＡチップから発生した蛍光を上記反射光から分離することを特徴とする請求項２３記載のＤＮＡ検査装置。
- 上記検出手段は、上記分離手段で上記被検査ＤＮＡチップからの反射光から分離された 蛍光を、マルチチャンネル型の光電子増倍管を用いて検出することを特徴とする請求項２３記載のＤＮＡ検査装置。
- 上記照射位置変化手段は、上記被検査ＤＮＡチップ上の上記複数のレーザビームの照射位置を上記被検査ＤＮＡチップのセルの寸法よりも小さいピッチで順次変化させることを特徴とする請求項２３記載のＤＮＡ検査装置。
- 上記被検査ＤＮＡチップを上記複数のレーザビームの直線状の並びの方向と直角な方向に移動させる移動手段を更に備えたことを特徴とする請求項２３記載のＤＮＡ検査装置。
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