JPH07270307A - 走査型コンフォーカル顕微鏡 - Google Patents

走査型コンフォーカル顕微鏡

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JPH07270307A
JPH07270307A JP5068605A JP6860593A JPH07270307A JP H07270307 A JPH07270307 A JP H07270307A JP 5068605 A JP5068605 A JP 5068605A JP 6860593 A JP6860593 A JP 6860593A JP H07270307 A JPH07270307 A JP H07270307A
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JP
Japan
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scanning
sample
confocal microscope
detector
mirror
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JP5068605A
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English (en)
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Roger Y Tsien
ワイ． サイエン ロジャー
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University of California
Original Assignee
University of California
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Publication date
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    • H04N2201/04794—Varying the control or compensation during the scan, e.g. using continuous feedback or from line to line
    • H04N2201/04798—Varying the main-scan control during the main-scan, e.g. facet tracking

Abstract

(57)【要約】 【目的】サンプルを紫外線で励起して発生した蛍光の検
出に適したレーザー走査型コンフォーカル顕微鏡の提
供。 【構成】この顕微鏡では、紫外線照射ビーム(LB)を用い
てパターンに従いサンプル(16)を走査し、蛍光及び可視
光線が発生する。その一部が照射ビームの光学経路をた
どってダイクロイックミラー(8)に戻り、そこで照射ビ
ームと分離されてフォトマルチプライヤー(22、26)で検
出される。フォトマルチプライヤー(22、26)の出力をク
ロッキングするクロック信号は、参照ビーム系によって
提供される。参照ビーム系では、参照ビーム(RB)を照射
ビームと同じ走査ミラー(9)上の同一点に導き、グレー
ティング(44)を通過させ、生じたパルス状の参照ビーム
(RB)が参照ビームの即時の走査速度、即ち走査中の照射
ビームの即時の走査速度を正確に表すクロック信号を発
生させるために第２のフォトマルチプライヤー(46)に入
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、ザ ナショナル サ
イエンス ファウンデーション（the National Science
Foundation）によって奨励金が与えられており、グラ
ントナンバーＢＢ−８７１４２６のもとで政府の支持を
得てなされた発明である。政府はこの発明において確固
たる権利を有する。本発明は走査型コンフォーカル顕微
鏡に関し、特にサンプルを紫外線で励起して発生した蛍
光の検出に適したレーザー走査型（laser-scanning）コ
ンフォーカル顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】生理学および細胞生理学等の学問分野に
おいて、カルシウム、ナトリウム、マグネシウム等の細
胞内イオンの動態を調べることは重要である。その理由
は、これらのイオンが細胞内生理活性機能と密接に結び
付いていると考えられているからである。これら細胞内
イオンの動態研究の方法としては、蛍光色素を細胞内に
注入することが一般的である。このような蛍光色素は、
細胞内で特定のイオンに特異的に結合し、励起光が照射
されることによって蛍光を発する。
【０００３】例えば、カルシウムイオンの検出に用いら
れる蛍光プローブ（probes）として、インド−１（indo
-1）、フラ−２（fura-2）、フルオ−３（fluo-3）及び
ロッド−２（rhod-2）等が知られている。細胞内のカル
シウムイオンの検出のために、これらの蛍光プローブの
いずれか一つが用いられる。例えばindo-1は、波長３５
０ナノメーター（ｎｍ）程度の紫外光による励起に応答
して、カルシウムイオン濃度に応じて４０５ｎｍと４８
５ｎｍとのいずれかの波長にピークを持ったスペクトル
の蛍光を発生する特性を有するプローブである。また、
fura-2は、波長３４０ｎｍ程度の紫外光による励起ある
いは波長３８０ｎｍ程度の紫外光による励起に応答し
て、波長５００ｎｍ近傍にピークを持ったスペクトルの
蛍光を発生する特性を有するプローブである。
【０００４】これらの蛍光プローブがカルシウムイオン
と結合して紫外光によって励起されることによって、カ
ルシウムイオンの濃度の大小に従って、蛍光の発光量あ
るいはスペクトルが変化する。従って蛍光強度を測定す
ることによって、サンプルの局所領域におけるカルシウ
ムイオンの濃度を検出することができる。励起及び蛍光
の検出の操作をサンプル面内を横断させて行うことによ
って、二次元画像が得られる。更に時系列に複数の画像
を得ることによって、イオン動態を詳細に調べることが
可能になる。
【０００５】蛍光プローブであるindo-1の紫外光励起の
もとで、蛍光スペクトルの２つのピークの強度比を検出
するか、あるいは蛍光プローブであるfura-2を使用した
２種類の波長の紫外光照射による交互の励起のもとで、
蛍光スペクトルの１つのピークの強度比を検出すること
により、カルシウムイオンの濃度の定量性の正確な測定
が可能になる。
【０００６】あるレーザーパターンで照射できるレーザ
ービームを用いてドープされているサンプルを走査し、
発生する蛍光から画像フォーマットの標準波を生じさせ
て、そのサンプルの蛍光を画像のディスプレイに映し出
すことが望ましい。サンプルから得られる生の二次元を
表示するために、行われる走査は線形的（リニア）でな
くてはならない。そのような走査を線形化するために
は、照射するレーザービームと同じ速度で走査する参照
ビーム（a reference beam）を発生させたり、参照ビー
ムをロンキーグレーティング（Ronchi grating：ロンキ
ーの回折格子）を通してパルス状のビームを生成し、そ
のクロック波が走査スピードを誘導的に表すことができ
るようにしたりすることが知られている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】しかしこのような手法
は、非−線形的な走査データを大まかに線形化できる点
では効果的ではあるが、参照ビームと照射レーザービー
ムとが互いに正確に軌跡をとって、常に同じ速度で走査
することはできない。
【０００８】従って、レーザーの走査によって得られる
走査データがサンプルの二次元の空間的な大きさを表す
生のデータであるようなレーザー走査パターンでサンプ
ルを走査できる走査型コンフォーカル顕微鏡を開発する
ことが望まれる。本発明は、この要望を解決することを
目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、放射された照
射ビームを用いてサンプルの走査を行い、それによって
生じた蛍光放射を検波して、蛍光のレーザー走査ディス
プレイ、即ちサンプルを実質的に線形表示するディスプ
レイにおいて好適に用いることができるようなデータを
作成するコンフォーカル顕微鏡を提供するものである。
更に特定するならば、レーザー光源から発生するコリメ
ートされた照射ビームを、前記サンプル上に照射するた
めに光学経路手段によって導くものである。この光学経
路手段には、第１のダイクロイックミラーと、その第１
のダイクロイックミラーの光学経路上の後方に位置して
おり、互いに垂直な回転軸の周りに回転することのでき
る第１と第２の走査ミラーが、相互に近接した位置関係
で設置されている。これにより照射ビームはサンプル上
を往復して横切るように走査し、そこから照射ビームの
波長とは異なる第１及び第２の所定の波長を有する蛍光
及び発光線が発生する。発生した発光線の一部は照射ビ
ームの経路をたどって第１のダイクロイックミラーに戻
る蛍光ビームを形成する。第１のダイクロイックミラー
では、その蛍光ビームを照射ビームとが分離される。続
いて蛍光ビーム検波器において、蛍光ビームの強度が検
出され、蛍光に対応する走査信号が発生する。
【００１０】参照ビーム手段は、蛍光走査信号を線形化
するのに用いることが可能なクロック信号を発生させる
ために設けられている。特にこの参照ビーム手段には、
照射ビームの一部分を参照ビームにするようにビームの
方向を変えるためのスプリッターが、レーザー光源と走
査ミラーとの間に設けられている。この参照ビームは、
第１の走査ミラー上において、照射ビームの照射部位と
実質的に同一ポイントに入射するように生成される。生
じた走査している参照ビームは、透明領域と不透明領域
とを一連に交互に設けたグレーティング（格子）を通過
して参照ビーム検波器に導かれ、そこで走査参照ビーム
の位置を表し、即ちそれにより照射ビームの位置を表す
ようなクロック信号を発生する。
【００１１】蛍光ビーム検波器には、所定の第１の波長
及び第２の波長の発光線をそれぞれ含む第１のビーム及
び第２のビームに蛍光ビームを分離するために、第２の
ダイクロイックミラーが設けられている。第１の検波器
は第１のビームの強度を検出し、一方第２の検波器は第
２のビームの強度を検出する。第１の検波器及び第２の
検波器の信号は、参照ビーム検波器によって発生したク
ロック信号に応じてサンプリングされる。そしてそれら
の信号は、連続的なサンプルの実時間の比をコンピュー
タ処理するために用いられる。
【００１２】本発明のもう一つの特徴は、グレーティン
グと参照ビーム検波器との間に設けられてい集光レンズ
にあり、その集光レンズを用いることによって、グレー
ティング上のどの位置から射出されたビームであって
も、検波器の実質的に同一の範囲内にパルス状にされた
参照ビームを入射させることができる。このことは、検
波器の表面を横切る方向に位置的な感度ムラがあって
も、発生するクロック信号に影響を及ぼさないことを確
実にしている。
【００１３】本発明の更にもう一つの特徴は、顕微鏡の
対物レンズが走査ミラーとサンプルとの間に設けられて
いることである。また、スプリッターと第１のダイクロ
イックミラーとの間には絞りが設けられていて、この絞
りは、照射ビームが顕微鏡の対物レンズの周辺部分に入
射するのを制限する機能を有している。これによって走
査照射ビームがサンプル上で小さなスポットを形成し、
分解能を高めることを確実にしている。この絞りは、顕
微鏡の対物レンズの瞳と共役する位置に配設することが
好ましく、また開口度を調節できる機能を持つような絞
りであることが好ましい。
【００１４】本発明の他の特徴及び効果は、次の好適な
実施例の記載から明らかになってくるであろう。ここで
実施例は、例示ではあるが、本発明の趣旨を示している
添付した図面を用いて説明が行われている。
【００１５】
【実施例】次に添付の図面を用いて説明する。特に図１
には、サンプル１６を走査してそのサンプル中に含まれ
るカルシウムイオン濃度を測定するのに用いられる走査
型コンフォーカル顕微鏡が示されている。ここで用いる
サンプルには、例えばindo-1などの蛍光プローブがドー
プされている。レーザー光源１は、波長３５１ナノメー
ター（ｎｍ）の紫外光のコリメートされたビーム（a co
llimated beam）ＬＢを出力する。そのコリメートされ
たレーザービームは、凸レンズ２ａ、２ｂからなるビー
ムエキスパンダー（a beam expander）によって拡張さ
れる。凸レンズ２ａ、２ｂの間に設けられたピンホール
ダイヤフラム（a pinhole diaphragm）３等の空間フィ
ルターを通ったレーザービームは、ビームスプリッター
４、シャッター５、光量減衰器（an optical attenuato
r）６及び絞り（an apperture）７を通過して、第１の
ダイクロイックミラー（a primary dichroic mirror）
８に入射する。ダイクロイックミラー８で反射されたレ
ーザービームＬＢは、水平走査ミラー（a horizontal s
canning mirror）９及び垂直走査ミラー（a vertical s
canning mirror）１０によって二次元的に走査される。
走査されたビームは、凹面ミラー（a concave mirror）
１１、１４及び凸面ミラー（a convex mirror）１３に
よって構成された反射型リレー光学系を通って顕微鏡の
対物レンズ（an objective）１５に導入される。尚、ミ
ラー１１とミラー１３との間には、サンプルの視野領域
を制限するために視野絞り（a view iris）１２が設け
られている。
【００１６】対物レンズ１５は、例えば通常の光学顕微
鏡に用いられるような、可視光に対して収差補正された
結像性能を有する。リレー光学系からのレーザービーム
ＬＢは、該対物レンズ１５によってサンプル１６上に集
光され、２つの走査ミラー９、１０による操作に応答し
てサンプル１６を二次元走査する。
【００１７】カルシウムイオンが存在するサンプル中に
添加された蛍光プローブが、レーザービームによって照
射されると、その蛍光プローブからはレーザービームに
反応して、カルシウムイオン濃度の大小に応じた波長特
性を有する蛍光が発生する。本実施例の場合、蛍光プロ
ーブとして、indo-1が使用されるので、波長４０５ｎｍ
と４８５ｎｍとのどちらかにピークを持ったスペクトル
の蛍光が発生する。
【００１８】この蛍光の一部分は、対物レンズ１５によ
って外側方向に向けられて集光され、照射レーザービー
ムＬＢと同一の経路をたどって第１のダイクロイックミ
ラー８を通過する。続いてその蛍光ビームＦＬは、反射
ミラー１７で反射され、集光レンズシステム１８によっ
てピンホールダイヤフラム（a pinhole diaphragm）１
９に導かれる。ピンホールダイヤフラム１９を通過した
後、蛍光ビームＦＬは、第２のダイクロイックミラー
（a secondary dichroic mirror）２０によって４０５
ｎｍの波長を含む第１の波長成分と、４８５ｎｍの波長
を含む第２の波長成分とに分離される。分離された一方
の蛍光成分はフィルター２１を通過し、フォトマルチプ
ライヤー（a photomultiplier tube (PMT)：光電子増倍
管）２２によって光電変換され、他方の蛍光成分はフィ
ルター２５を通過し、フォトマルチプライヤー２６によ
って光電変換される。それぞれのフォトマルチプライヤ
ー２２、２６からの光電変換出力は、Ａ／Ｄ変換回路２
３、２７において、後述するサンプリングクロックＳＣ
に応答してディジタル化される。ここで得られたディジ
タルデータは、データ制御装置３０内のフレームメモリ
ーに、画像データとしてそれぞれ蓄えられる。メモリー
された画像データは、ＣＲＴディスプレイユニット３１
上に表示される。
【００１９】水平走査ミラー９は、図面の記載された紙
面に平行な回転軸９１を中心にその共振周波数で振動す
る、高速型のガルバノメータースキャナー（a galvanom
eterscanner）である。そのミラー９は、８ｋＨｚ程度
の周波数を有する正弦波状の（sinusoidal）入力信号に
応答して共振する。このような高周波数での共振を可能
にするためには、水平走査ミラー９の質量が小さいこと
が必要である。そのため、水平走査ミラー９の反射面は
顕微鏡の対物レンズ１５の瞳（pupil）とほぼ光学的に
共役な位置に配置される。それによって、ミラー９の径
は、対物レンズ１５の瞳を満たす程度にまで小さくする
ことができる。
【００２０】これに対して垂直走査ミラー１０は、低速
型のガルバノメータースキャナーである。ＮＴＳＣシス
テムの標準である飛び出し走査（interlaced scanning
of the NTSC system）を実現するために、この垂直走査
ミラー１０は、図面の記載された紙面と垂直の回転軸１
０１を中心に、そして標準ＮＴＳＣビデオ信号のフィー
ルドレート（field rate）に等しい周波数である６０Ｈ
ｚを有する鋸歯状波形に応答して振動させられる。垂直
走査ミラー１０の反射面は、水平走査ミラー９の反射面
に近接して配置される。これはミラー１０の小型化を可
能にする。水平走査ミラー９の振れ角（即ち所定の基準
面に対する反射面の最大傾斜角）の２分の１をθ、更に
垂直走査ミラー１０の反射面上における顕微鏡の対物レ
ンズ１５の瞳の像の半径をｒ、そして垂直走査ミラー１
０の長さをｙとした時に、二枚の走査ミラー９、１０の
間の距離ｄは、 ２ｄ ｔａｎθ ＋ ２ｒ ＜ ｙ の条件式を満足することが好ましい。
【００２１】図２に示すように、水平走査ミラー９及び
垂直走査ミラー１０によって反射された照射レーザービ
ームＬＢは、走査線１６１に沿ってサンプル１６の局所
走査領域１６０をラスター−走査（raster-scanning）
する。図２に示された走査パターンは、垂直走査ミラー
１０に従うＹ方向への走査位置のシフトと、水平走査ミ
ラー９に従うＸ方向の走査線に沿う往復走査との組合せ
によって形成される。この走査パターンに従う往復ラス
ター走査（reciprocative raster scanning）に基づい
て、局所走査領域１６０を標準ＮＴＳＣライン周波数で
ある１５．７５ｋＨｚで走査することが可能である。そ
の結果、３０フレーム／秒（frames/sec.）のビデオレ
ートでサンプルの画像を得ることが可能になる。
【００２２】前述のサンプリングクロックＳＣを作成す
るために、水平走査ミラー９の振動をモニターする参照
ビーム（a reference beam）ＲＢが利用される。図１に
おいて、レーザービームＬＢの一部はビームスプリッタ
ー４によって反射してミラー４１に向かう参照ビームＲ
Ｂとなり、その参照ビームＲＢはミラー４１で折り返し
反射して水平走査ミラー９に向かうビームとなる。この
参照ビームＲＢとレーザービームＬＢとは、水平走査ミ
ラー９上の同一ポイントに入射し、それによってミラー
の機械的な歪みを無視して、その二本のビームは等量ず
つ偏光される。そして垂直走査ミラー１０との干渉を避
けるために、参照ビームＲＢは、レーザービームＬＢと
は異なる角度で水平走査ミラー９に入射する。水平走査
ミラー９によって反射した参照ビームＲＢは、ｆθレン
ズ４２によって集光され、ミラー４３で反射して、ロン
キーグレーティング（a Ronchi grating：ロンキー回折
格子）４４上にビームスポットを形成する。
【００２３】図３に示されるように、ロンキーグレーテ
ィング４４には、透明なガラス基板上に透明な領域と不
透明な領域とが交互に設けられている。この透明な領域
と不透明な領域とは等しい幅になっている。または、そ
のグレーティングは、不透明なフィルムで覆われたガラ
ス基板上に、等間隔で設けられた光透過性繰り返しパタ
ーンで形成されていてもよい。参照ビームＲＢのスポッ
トは、水平走査ミラー９の振動に応答して、ロンキーグ
レーティング上をパターンの繰り返し方向に往復走査す
る。
【００２４】ロンキーグレーティング４４を通過した参
照ビームＲＢは、続いて配置された集光レンズ４５によ
って集められて、フォトマルチプライヤー４６に入射す
る。集光レンズ４５は、ロンキーグレーティング４４の
どの位置から射出されたビームであっても、常にフォト
マルチプライヤー４６の同一範囲にそのビームが入射す
るように、ロンキーグレーティング４４から離して設け
られている。そのため、参照ビームＲＢは、フォトマル
チプライヤーの感度ムラの影響を受けることなく検出さ
れる。フォトマルチプライヤー４６による光電変換出力
は、タイミング回路４７に入力し、そこでサンプリング
クロックＳＣが作成される。
【００２５】ここで、Ａ／Ｄ変換回路２３、２７におけ
るデータサンプリング操作のタイミングについての説明
を行う。前述したように、水平走査ミラー９は、正弦波
状の入力信号に応答して駆動される。この正弦波入力信
号と走査ミラー９の走査位置との関係を示す図４から、
単位時間δｔごとの振幅方向のミラー９の位置変化量が
振動の中心付近では大きく、振動の両端付近では小さく
なることがわかる。従って、サンプル１６の表面上を走
査するレーザービームＬＢは、図２に示したそれぞれの
走査線１６１の中央付近で最も速く、それぞれの走査線
１６１の両端付近では最も遅い走査速度になっている。
そのため、歪みのないビデオ画像を得るためには、この
ような走査特性に応じた時間的に不均等な間隔のタイミ
ングでＡ／Ｄ変換回路２３、２７におけるデータサンプ
リング操作を実行することが必要である。
【００２６】前記に述べたように、ロンキーグレーティ
ング４４には、透明な領域と不透明な領域との交互配列
が、等しく均一な幅で設けられている。参照ビームＲＢ
のスポットは、その幅と同一の直径になっている。その
結果、フォトマルチプライヤー４６からの出力信号は、
ビームがその格子の中間点を走査しているときの高い数
値から、ビームがその格子のいずれかの端部にあるとき
の低い数値までの間を変化する周波数を持っているクリ
ップされた正弦波（a clipped sine wave）である。こ
のフォトマルチプライヤー４６の光電変換出力信号の波
形は、図５に示されている。
【００２７】タイミング回路４７（図１参照）では、フ
ォトマルチプライヤー４６からの出力信号が、直流成分
と種々の低周波数の成分とを除去するために、高い透過
性でフィルターがかけられ、そしてその得られた信号が
閾値Ｖthと比較される。そこで、閾値Ｖthを横切ること
を検出するたびに短くて一定の長さを有するパルス状の
クロック信号ＳＣが発生し、２つのフォトマルチプライ
ヤー２２、２６をクロッキング（clocking：計時）する
ために用いられる。こうして２つのクロックパルスがロ
ンキーグレーティングのそれぞれの透明領域により発生
し、クロッキングは相異なる反対側の走査方向について
より一層一致している。
【００２８】クロック信号ＳＣにおけるそれぞれのパル
スは、ロンキーグレーティング４４の不透明領域の配置
に対応した一定量であることによって、走査している参
照ビームＲＢの動きを表わし、従って照射レーザービー
ムの動きを表わすことが理解できる。これによって、フ
ォトマルチプライヤー２２、２６のサンプリングから得
られるデータは、非線形的であって正弦波状で走査する
走査ミラー９を使用していても、サンプル１６の線形走
査を表している。
【００２９】前記に記載したとおり、レーザービームＬ
Ｂの水平走査は、図２に示すように往復走査する。従っ
てデータ制御装置３０（図１参照）内には、２つのＡ／
Ｄ変換回路２３、２７からの画像データを受け入れて、
そのそれぞれのデータを標準ＮＴＳＣ−フォーマットに
変換するために、２種類のラインメモリーが用意され
る。図６に示すように、第１のラインメモリー３０１
は、ファーストイン−ファーストアウト（a first-in,
first-out：ＦＩＦＯ）メモリーであって、ここには奇
数番目の走査線に対応する走査で得られた画像データの
ワード（words）の列が書き込まれる。また第２のライ
ンメモリー３０２は、ラストイン−ファーストアウト
（last-in, first-out：ＬＩＦＯ）メモリーであって、
ここには偶数番目の走査線に対応する走査でえられた画
像データのワードの列が書き込まれる。画像データのワ
ードは、ＦＩＦＯメモリーに入力されたのと同じ順番で
ＦＩＦＯメモリーから読み出され、一方ＬＩＦＯメモリ
ーに入力された画像データのワードは、その入力された
順番とは逆の順番でＬＩＦＯメモリーから読み出され
る。図６は、サンプル１６の走査領域１６０とディスプ
レイユニット３１とでの走査線の方向に対する、２つの
ラインメモリー３０１、３０２の動作を示した概略図で
ある。実際には、２つのラインメモリー３０１、３０２
の入力側及び出力側にフレームメモリーを設けることが
好ましい。
【００３０】前述したように、サンプル１６を走査する
レーザービームＬＢは波長３５０ｎｍ程度の紫外光であ
るのに対して、光学顕微鏡の対物レンズ１５は通常、可
視光に対して収差補正（aberrations correct）された
結像性能を有する。反射光学系１１、１３、１４を通っ
たレーザービームＬＢをこの対物レンズ１５に入射させ
た時の、サンプル１６上における面内光強度分布特性
が、図７Ａに曲線Ｃ１で描かれている。対物レンズ１５
周辺部分での収差の補正が極端に悪いことに起因して、
このような光強度分布特性では、明瞭な光スポットを形
成することはできず、正確なスポット側光を得ることは
できない。
【００３１】図１において、絞り７はレーザー光源１と
走査ミラー９、１０との間に設けられていて、上記の問
題点を解決するためのものである。この絞り７は、顕微
鏡の対物レンズ１５の瞳と共役するように配置され、対
物レンズ１５の周辺部分を通過する部分のビームが結像
に寄与しないように、レーザービームＬＢの周辺部分を
カットする。それによって、図７Ｂに曲線Ｃ２で示すよ
うに、紫外線領域における対物レンズ１５の結像性能は
飛躍的に向上する。一例として、４０倍率／ＮＡ（nume
rical aperture：開口数）＝１．３の対物レンズの場
合、ＮＡ＝０．８程度になるようにビーム径を絞り込む
と、最良の結像スポットが得られる。ただし、この数値
は対物レンズのタイプによって異なるため、絞り７の開
口径を調節可能に構成しておくことが好ましい。
【００３２】このように励起光の周辺部分をカットする
ことによって、顕微鏡の対物レンズ１５の開口数（Ｎ
Ａ）は小さくなる。そのため、対物レンズ１５の本来の
性質を発揮できず、そして対物レンズが本来備えている
開口数（ＮＡ）での回折限界に近いスポットを形成する
ことはできない。
【００３３】図１に示した光学系装置において、絞り７
は第１のダイクロイックミラー８の前方に設けられてい
るため、サンプル１６から放出される蛍光ビームＦＬ
は、絞り７による制限を受けることがなくダイクロイッ
クミラー８を通過し、フォトマルチプライヤー（ＰＭ
Ｔ）２２、２６に導かれて検出される。従って蛍光は、
顕微鏡の対物レンズ１５が本来有している大きな開口数
（ＮＡ）で、可視波長で集光することができる。またこ
のように絞り７を設けたことによって、絞り径を調節す
ることで、サンプルに照射される３次元的な結像スポッ
トの形状を制御することも可能となる。コンフォーカル
顕微鏡は、フォトマルチプライヤー２２、２６の前に配
置されたピンホールダイヤフラム（pinhole diaphrag
m）１９により、例えば光学的なセクショニング機能（s
ectioning function）が得られるという特徴を有する。
しかしながら同時に、蛍光強度をかなり失うことも事実
である。サンプルによっては、信号とノイズの比が良い
蛍光測定では、不十分な光量しか得られない場合があ
る。そのような場合には、励起光の光量を増加させる必
要がある。けれども励起光の光量を増加させると、時と
して蛍光のサチュレーション（saturating）及びブリー
チング（bleaching）を引き起こすことがあり好ましく
ない。そこで励起ビームを絞り込み、開口数（ＮＡ）を
小さくすることによって、サンプル上での３次元的結像
ビームの形状を対物レンズ光学システムの光軸方向に引
き延ばすなどの手段をとれば、検出できる蛍光の光量を
増加させることができる。
【００３４】図８Ａは、絞り７を設けない場合のレーザ
ービームＬＢの３次元的結像スポットＳＰを示してお
り、また、図８Ｂは、絞り７によって絞られた３次元的
結像スポットを示している。サンプル１６の面内方向に
おける結像スポットＳＰの幅ｗは、顕微鏡の対物レンズ
１５の開口数（ＮＡ）に比例しており、これに対して光
学システムの光軸方向における結像スポットＳＰの高さ
ｈは、開口数の二乗に比例している。従って、サンプル
１６の面内における顕微鏡の分解能はそれほど損なわれ
ない。この場合では、セクショニング（sectioning）の
効果は小さくなるが、光量とセクショニング効果のバラ
ンスは、オペレーターが自由に決定することができる。
【００３５】本発明について、ここでは好ましい実施例
のみを参照して詳細に説明したが、当業者には、本発明
を離れることがない範囲内で種々の変形を行うことがで
きることを理解されたい。従って本発明は、特許請求の
範囲によってのみ制限を受ける。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明にかかる走査型コンフォーカル顕微鏡
の全体的概略図である。
【図２】 図１に示したコンフォーカル顕微鏡を用いて
走査されるサンプルの局所走査領域を示す図である。
【図３】 図１に示したコンフォーカル顕微鏡に設けら
れているロンキーグレーティング（ロンキーの回折格
子）の斜視図である。
【図４】 図１に示したコンフォーカル顕微鏡の水平走
査ミラーの駆動正弦波と走査位置との関係のグラフであ
る。
【図５】 ロンキーグレーティングを通った参照ビーム
を検出するために設けられたフォトマルチプライヤー
（a photomultiplier tube (PMT)：光電子増倍管）から
出力された波形を示す図である。
【図６】 画像データを蓄積するためのラインメモリー
のブロック構成概略図である。
【図７】 図７Ａは、対物レンズを通過したレーザービ
ームの、サンプル上における面内光強度分布特性を示す
図であり、図７Ｂは、絞りと対物レンズとを通過したレ
ーザービームの、サンプル上における面内光強度分布特
性を示す図である。
【図８】 図８Ａは、対物レンズを通過したレーザービ
ームの３次元結像スポットを示す図であり、図８Ｂは、
絞りを対物レンズとを通過したレーザービームの３次元
結像スポットを示す図である。
【符号の説明】
１…レーザー光源、２ａ，２ｂ…凸レンズ、３…ピンホ
ールダイヤフラム、４…ビームスプリッター、５…シャ
ッター、６…光量減衰器、７…絞り、８…第１のクロイ
ックミラー、９…水平走査ミラー、１０…垂直走査ミラ
ー、１１，１４…凹面ミラー、１３…凸面ミラー、１５
…対物レンズ、１６…サンプル、１７…反射ミラー、１
８…集光レンズシステム、１９…ピンホールダイヤフラ
ム、２０…第２のダイクロイックミラー、２１，２５…
フィルター、２２，２６…フォトマルチプライヤー（光
電変換器：ＰＭＴ）、２３，２７…Ａ／Ｄ変換回路、３
０…データ制御装置、３１…ディスプレイユニット、４
１，４３…ミラー、４２…ｆθレンズ、４４…ロンキー
グレーティング、４５…集光レンズ、４６…フォトマル
チプライヤー、４７…タイミング回路、ＬＢ…レーザー
ビーム、ＲＢ…参照ビーム、ＦＬ…蛍光ビーム、ＳＣ…
クロック信号。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０２Ｂ 26/10 １０１ (72)発明者 ロジャー ワイ． サイエン アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92037 ラホラ ノッティンガムプレイス 8535

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】以下の構成要素（Ａ〜Ｄ）、即ち： （Ａ）所定の波長を持つコリメートされた照射ビーム
    （a collimated incident beam）を発生するレーザー光
    源； （Ｂ）以下の構成要素（Ｂ−１及びＢ−２）、即ち、
    （Ｂ−１）第１のダイクロイックミラー（a dichroic m
    irror）、及び、（Ｂ−２）この第１のダイクロイック
    ミラーとサンプルとの間に設けられ、前記サンプルを往
    復して横切るように前記照射ビームを走査させるために
    第１の回転軸を中心に回転する第１の走査ミラーであっ
    て、この時前記サンプルが蛍光及び前記照射ビームの波
    長とは異なる波長の第１の所定の波長を有する発光線を
    発生し、そしてこの発生した発光線の一部が前記照射ビ
    ームの経路をたどって前記第１のダイクロイックミラー
    に戻る蛍光ビームを形成するように構成されている第１
    の走査ミラー、を備えた光学経路手段であって、前記第
    １のダイクロイックミラーは照射ビームと蛍光ビームと
    を分離することを特徴とする光学経路手段； （Ｃ）前記蛍光ビームの光強度を検出するため、及び対
    応する蛍光走査信号を発生するための蛍光ビーム検波
    器； そして、 （Ｄ）以下の構成要素（Ｄ−１〜Ｄ−３）、即ち、（Ｄ
    −１）前記第１の走査ミラーに向かう方向に参照ビーム
    を導く手段であって、前記第１の走査ミラー上において
    前記照射ビームと同一のポイントに入射し、走査してい
    る参照ビームを生成することを特徴とする参照ビームを
    導く手段、（Ｄ−２）透明領域と不透明領域とを一連に
    交互にもうけたグレーティング（a grating： 格子）で
    あって、走査している参照ビームを入射するように配設
    されており、走査速度を表すパルス状の参照ビームを生
    成することを特徴とするグレーティング、そして、（Ｄ
    −３）前記パルス状の参照ビームの強度を検出するた
    め、及び前記走査している参照ビームの走査速度を表わ
    し、それにより照射ビームの走査速度を表すように対応
    したクロック信号を発生させるための参照ビーム検波
    器、を備えた参照ビーム手段であって、前記参照ビーム
    検波器によって発生する前記クロック信号が、前記蛍光
    ビーム検波器によって発生する前記蛍光走査信号をサン
    プリングするために用いられうる参照ビーム手段；を備
    えていることを特徴とするサンプルの走査を行うコンフ
    ォーカル顕微鏡。
  2. 【請求項２】請求項１記載のコンフォーカル顕微鏡にお
    いて、 前記サンプルが更に、蛍光及び前記第１の波長とは異な
    る波長である第２の所定の波長を有する発光線を発生
    し、そしてこの更に発生した発光線の一部が前記照射ビ
    ームの経路をたどって前記第１のダイクロイックミラー
    に戻る蛍光ビームの一部であるように構成されており；
    そして、 前記蛍光ビーム検波器が、以下の構成要素（Ａ〜Ｃ）、
    即ち： （Ａ）第１の所定の波長を持つ発光線を含有する第１の
    ビームと、第２の所定の波長を持つ発光線を含有する第
    ２のビームとに、前記蛍光ビームを分離するために設け
    られた第２のダイクロイックミラー、 （Ｂ）前記第１のビームの強度を検出するため、及び第
    １の信号を発生させるための第１の検波器、そして （Ｃ）前記第２のビームの強度を検出するため、及び第
    ２の信号を発生させるための第２の検波器であって、前
    記第１の信号及び第２の信号が共に蛍光走査信号を構成
    することを特徴とする第２の検波器、を備えたことを特
    徴とする走査型コンフォーカル顕微鏡。
  3. 【請求項３】請求項２記載の走査型コンフォーカル顕微
    鏡において、 前記蛍光ビーム検波器が更に、以下の構成要素（Ａ及び
    Ｂ）、即ち： （Ａ）前記参照ビーム検波器によって発生したクロック
    信号に応じて前記第１の信号及び前記第２の信号をサン
    プリングするための手段；そして、 （Ｂ）前記第１の信号及び前記第２の信号の連続的なサ
    ンプルの実時間の比（real time ratio）をコンピュー
    タ処理するための手段、を備えていることを特徴とする
    走査型コンフォーカル顕微鏡。
  4. 【請求項４】請求項１記載の走査型コンフォーカル顕微
    鏡において、 前記光学経路手段には更に、 （ａ）前記第１の走査ミラーのすぐ近くに光学的要素で
    妨害されることなく配設されている第２の走査ミラーで
    あって、 （ｂ）前記第１の回転軸、即ち前記第１の走査ミラーが
    その第１の回転軸を中心に回転して前記照射ビームがレ
    ーザー走査パターンで前記サンプルを走査することがで
    きるように設けられた第１の回転軸に対して実質的に垂
    直である第２の回転軸を中心に回転する第２の走査ミラ
    ー、が設けられていることを特徴とする走査型コンフォ
    ーカル顕微鏡。
  5. 【請求項５】請求項１記載の走査型コンフォーカル顕微
    鏡において、 前記参照ビーム手段には更に、 （ａ）前記グレーティング（格子）と前記参照ビーム検
    波器との間に配設された集光レンズであって、 （ｂ）前記グレーティングのどの位置から射出されたビ
    ームであっても前記検波器の実質的に同一の範囲内にパ
    ルス状にされた参照ビームを入射させることができる集
    光レンズ、が設けられていることを特徴とする走査型コ
    ンフォーカル顕微鏡。
  6. 【請求項６】請求項１記載の走査型コンフォーカル顕微
    鏡において、以下の構成要素（Ａ及びＢ）、即ち： （Ａ）前記参照ビーム手段には更に、（Ａ−ａ）前記レ
    ーザー光源と前記第１のダイクロイックミラーとの間に
    配設されたビームスプリッター（beamsplitter）であっ
    て、（Ａ−ｂ）前記照射ビームの一部の方向を変えて前
    記参照ビームにするためのビームスプリッター、が設け
    られており、また、 （Ｂ）前記光学経路手段には更に、（Ｂ−ａ）前記ビー
    ムスプリッターと前記第１のダイクロイックミラーとの
    間に配設されたシャッターであって、（Ｂ−ｂ）前記参
    照ビームがクロック信号を発生し続けていても前記照射
    ビームが前記サンプルを走査するのを選択的に遮蔽する
    ためのシャッター、が設けられていることを特徴とする
    走査型コンフォーカル顕微鏡。
  7. 【請求項７】請求項１記載の走査型コンフォーカル顕微
    鏡において、 前記光学経路手段には更に、以下の構成要素（Ａ及び
    Ｂ）、即ち： （Ａ）前記第１の走査ミラーと前記サンプルとの間に設
    けられた顕微鏡の対物レンズ；そして、 （Ｂ）前記レーザー光源と前記第１のダイクロイックミ
    ラーとの間に設けられた絞りであって、前記照射ビーム
    が前記顕微鏡の対物レンズの周辺部分に入射するのを制
    限するための絞り、が設けられていることを特徴とする
    走査型コンフォーカル顕微鏡。
  8. 【請求項８】請求項７記載の走査型コンフォーカル顕微
    鏡において、 前記絞りは、前記顕微鏡の対物レンズ上に映像を映すこ
    とのできる位置に配設されていることを特徴とする走査
    型コンフォーカル顕微鏡。
  9. 【請求項９】請求項７記載の走査型コンフォーカル顕微
    鏡において、 前記絞りは、その開口度（opening）が調節可能である
    ことを特徴とする走査型コンフォーカル顕微鏡。
  10. 【請求項１０】以下の構成要素（Ａ〜Ｄ）、即ち： （Ａ）顕微鏡の対物レンズ； （Ｂ）前記顕微鏡の対物レンズを通過して走査が行われ
    るサンプルに入射する第１の波長を持つコリメートされ
    た照射ビーム（ａ ｃｏｌｌｉｍａｔｅｄ ｉｎｃｉｄ
    ｅｎｔ ｂｅａｍ）を発生するレーザー光源； （Ｃ）前記照射ビームが前記サンプルを走査するように
    設けられた前記照射ビームを周期的に偏光させるビーム
    偏光手段であって、この偏光手段によって前記サンプル
    が第２の波長を有する光線を発生し、そしてこの発生し
    た光線の一部が前記顕微鏡の対物レンズを通って戻るよ
    うに構成されている照射ビーム偏光手段； （Ｄ）前記サンプルによって発生して前記顕微鏡の対物
    レンズを通って戻された光線の部分が入射し、続いて前
    記発生した光線の強度を表す信号を生じさせるための検
    波器；そして、 （Ｅ）前記顕微鏡の対物レンズの周辺部分に前記照射ビ
    ームが入るのを制限する位置であって、かつ前記サンプ
    ルから発生する前記光線についてはどの部分も入射する
    ことがない位置に配設された絞り手段、を備えているこ
    とを特徴とするサンプルの走査を行うコンフォーカル顕
    微鏡。
  11. 【請求項１１】請求項１０記載の走査型コンフォーカル
    顕微鏡が更に、以下の構成要件（Ａ〜Ｃ）、即ち： （Ａ）前記照射ビームを、前記レーザー光源から前記顕
    微鏡の対物レンズに導くための第１の光学経路； （Ｂ）前記第１の光学経路内に配設されている光分離手
    段；そして、 （Ｃ）前記サンプルから発生した光線の一部分を、前記
    光分離手段から前記検波器へと導く第２の光学経路、を
    備えた走査型コンフォーカル顕微鏡であって、前記絞り
    手段が、前記第１の光学経路における前記レーザー光源
    と前記光分離手段との間に設けられていることを特徴と
    する走査型コンフォーカル顕微鏡。
  12. 【請求項１２】請求項１０記載の走査型コンフォーカル
    顕微鏡において、 前記絞り手段は、前記顕微鏡の対物レンズ上に映像を映
    すことのできる位置に配設されていることを特徴とする
    走査型コンフォーカル顕微鏡。
  13. 【請求項１３】請求項１０記載の走査型コンフォーカル
    顕微鏡において、 前記絞り手段は、その開口度（opening）が調節可能で
    あることを特徴とする走査型コンフォーカル顕微鏡。
  14. 【請求項１４】請求項１０記載の走査型コンフォーカル
    顕微鏡において、以下の構成要件（Ａ及びＢ）、即ち： （Ａ）前記第１の波長の光は紫外光であり、これに対し
    て第２の波長の光は可視光であること；そして、 （Ｂ）前記光分離手段は、紫外光と可視光とを分離する
    特性を有するダイクロイックミラーを備えた光分離手段
    であること、を特徴とする走査型コンフォーカル顕微
    鏡。
  15. 【請求項１５】以下の構成要素（Ａ〜Ｈ）、即ち： （Ａ）顕微鏡の対物レンズ； （Ｂ）走査が行われるサンプルに隣接して前記顕微鏡の
    対物レンズを位置づけるための手段； （Ｃ）前記顕微鏡の対物レンズを通過して走査が行われ
    るサンプルに入射する所定の波長を有するコリメートさ
    れた照射ビームを発生させるためのレーザー光源； （Ｄ）前記照射ビームが前記サンプルを走査するように
    設けられた前記照射ビームを周期的に偏光させるビーム
    偏光手段であって、この手段によって前記サンプルが第
    １及び第２の所定の波長を有する蛍光及び発光線を発生
    し、そしてこの発生した発光線の一部が前記顕微鏡の対
    物レンズを通って戻る蛍光ビームを形成するように構成
    されたビーム偏光手段； （Ｅ）前記顕微鏡の対物レンズの周辺部分に前記照射ビ
    ームが入るのを制限する位置であって、かつ前記蛍光ビ
    ームについてはどの部分も入射することがない位置に配
    設された絞り手段； （Ｆ）以下の構成要素（Ｆ−１〜Ｆ−６）、即ち：（Ｆ
    −１）第１の所定の波長を持つ発光線を含有する第１の
    ビームと、第２の所定の波長を持つ発光線を含有する第
    ２のビームとに、前記蛍光ビームを分離するために設け
    られたダイクロイックミラー、（Ｆ−２）前記第１のビ
    ームの強度を検出するため、及び第１の信号を発生させ
    るための第１の検波器、（Ｆ−３）前記第２のビームの
    強度を検出するため、及び第２の信号を発生させるため
    の第２の検波器、（Ｆ−４）クロック信号に応じて前記
    第１の信号及び前記第２の信号をサンプリングするため
    の手段、（Ｆ−５）前記第１の信号及び前記第２の信号
    の連続的なサンプルを貯蔵するためのフレームメモリー
    手段、（Ｆ−６）前記第１の信号及び前記第２の信号の
    連続的なサンプルの実時間の比（real time ratio）を
    コンピュータ処理するための手段、を備えた蛍光ビーム
    検波器； （Ｇ）画像ディスプレイ；そして、 （Ｈ）前記画像ディスプレイに表示するために前記フレ
    ームメモリーからデータを選択する手段、を備えている
    ことを特徴とするサンプルの走査を行うコンフォーカル
    顕微鏡。
  16. 【請求項１６】請求項１５記載のコンフォーカル顕微鏡
    において、 前記コンフォーカル顕微鏡が更に、前記照射ビームから
    前記蛍光ビームを分離するための第１のダイクロイック
    ミラーを備えており、そして、 前記ビーム偏光手段が、以下の構成要件（Ａ及びＢ）、
    即ち： （Ａ）前記ダイクロイックミラーと前記サンプルとの間
    に設けられ、第１の回転軸を中心に回転する第１の走査
    ミラーであって、前記サンプルを往復して横切るように
    前記照射ビームを走査させるための第１の走査ミラー；
    そして、 （Ｂ）前記第１の走査ミラーのすぐ近くに光学的要素で
    妨害されることなく配設されている第２の走査ミラーで
    あって、前記第１の回転軸、即ち前記第１の走査ミラー
    がその第１の回転軸を中心に回転し前記照射ビームがレ
    ーザー走査パターンで前記サンプルを走査することがで
    きるように設けられた第１の回転軸に対して実質的に垂
    直である第２の回転軸を中心に回転する第２の走査ミラ
    ー、が設けられていることを特徴とする走査型コンフォ
    ーカル顕微鏡。
  17. 【請求項１７】請求項１６記載の走査型コンフォーカル
    顕微鏡が更に、以下の構成要件（Ａ〜Ｄ）、即ち： （Ａ）第１の走査ミラーに向かって参照ビームを導くた
    めの手段であって、前記第１の走査ミラー上において前
    記照射ビームと同一ポイントに入射し、走査している参
    照ビームを生成することを特徴とする参照ビームを導く
    手段； （Ｂ）透明領域と不透明領域とを一連に交互にもうけた
    グレーティング（a grating： 格子）であって、走査し
    ている参照ビームを入射できるように配設されており、
    走査速度を表すパルス状の参照ビームを生成することを
    特徴とするグレーティング； （Ｃ）前記参照ビームの強度を検出するための、及び前
    記走査している参照ビームの走査速度を表わし、それに
    より照射ビームの走査速度を表すように対応したクロッ
    ク信号を発生させるための参照ビーム検波器であって、
    前記クロック信号は前記第１の信号及び第２の信号をサ
    ンプリングするために用いられるように構成された参照
    ビーム検波器；そして、 （Ｄ）前記グレーティング（格子）と前記参照ビーム検
    波器との間に配設された集光レンズであって、前記グレ
    ーティングのどの位置から射出されたビームであっても
    前記検波器の実質的に同一の範囲内にパルス状にされた
    参照ビームを入射させることができる集光レンズ、が設
    けられていることを特徴とする走査型コンフォーカル顕
    微鏡。
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US07/862,633 US5296703A (en) 1992-04-01 1992-04-01 Scanning confocal microscope using fluorescence detection

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