DE4023650A1 - Ueberaufloesendes konfokales mikroskop - Google Patents
Ueberaufloesendes konfokales mikroskopInfo
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Description
1. Konfokale Mikroskopie ist dadurch gekennzeichnet, daß
durch zwei Lochblenden im scannenden Betrieb Streulicht effektiv
unterdrückt wird, so daß auch feine Details in der Tiefe dicker
Präparate beobachtet werden können. Das konstruktive Problem ist
hierbei die punktgenaue Abbildung der Lochblenden aufeinander.
Es gibt deshalb noch kein konfokales Durchlichtmikroskop mit
gescanntem Strahlengang. Die im folgenden beschriebene
Konstruktion löst das Problem durch die Verwendung eines
flächenhaften CCD-Detektors, auf dem die 2. Lochblende
gewissermaßen elektronisch erzeugt wird. Beleuchtungsseitig kann
eine langsam rotierende Nipkowscheibe zur gleichzeitigen
Erzeugung von mehreren hundert Leuchtfeldblenden verwendet
werden. Diese kleinen Blenden erzeugen, durch das Objekt
amplitudenmoduliert, Beugungsscheibchen auf dem CCD (Abb. 1a).
Diese Beugungsbilder bestehen aus dem Zentralpeak des
Airyscheibchens mit ringförmigen sekundären etc. Maxima, bei
dickeren Objekten von von Streulicht umgeben. Die elektronische
Bildverarbeitung kann so programmiert werden, daß sie alle
Intensitätswerte unter einer gewissen Schwelle auf Null setzt
und nur Intensitäten über diesem Wert digital abgespeichert
werden. Man läßt nun die Nipkowscheibe langsam rotieren. Diese
Rotation kann eventuell schrittweise erfolgen, oder der
Beleuchtungsstrahlengang wird gechoppt. Alle 20 ms wird Bild auf
Bild im Speicher addiert, sodaß abhängig vom Verhältnis von
Lochbreite zu Lochabstand in der Nipkowscheibe nach einer Zeit
von 100-200 ms aus den addierten Maxima der Beugungsscheibchen
ein konfokales Bild entsteht. Dies könnte durch jumping oder
rolling average ständig angezeigt werden. Hierfür sollte
idealerweise eine modifizierte Nipkowscheibe verwendt werden,
bei der die Löcher stufenförmig gegeneinander versetzt sind
(Abb. 1b), aber auch herkömmliche Scheiben können bei längeren
Integrationszeiten verwendet werden. Außer einer Nipkowscheibe
käme noch eine stufenförmige Beleuchtungsblendenanordnung in
Frage, die von einem Polygonspiegel linear über das Bild ge
scannt würde. Prinzipiell ist es auch möglich einen
CCD-Detektor beim Laserscanmikroskop zu verwenden, allerdings muß
die Programmierung der Ausleseelektronik auf Minimierung der
Auslesezeit eingestellt sein. Das oben beschriebene Verfahren
ist sowohl für Durchlicht- als auch für Auflichtmikroskope
verwendbar.
2. Es konnte mit Laserscanmikroskopen theoretisch und
praktisch gezeigt werden, daß sich die Auflösung durch
Subtraktion von Bildern steigern läßt, die mit verschieden
großem Lochblendendurchmesser aufgenommen wurden. Dies läßt sich
nun besonders einfach mit digitaler Bildverarbeitung
durchführen, indem man die Schwelle, ab der die einzelnen
Zentralpeaks abgespeichert werden, auf zwei verschieden hohe
Werte setzt (Abb. 2). Dies bewirkt, daß man praktisch mit zwei
verschieden großen Blenden ausliest. Die Einzelbilder werden
dann von einander subtrahiert und die resultierenden Bilder
wieder zum konfokalen Gesamtbild im Speicher addiert. Statt
dessen kann man auch einen sharpening Filter auf die
Einzelbilder anwenden und dann das Ergebnis im Speicher
addieren. Diese Verfahren sind im Ergebnis der Verwendung
ringförmiger Detektoren equivalent. Falls bei zu dicken
Präparaten sich die Zentralpeaks der Beugungsscheibchen nicht
mehr deutlich vom Streulicht abheben, kann man auch die
Ausleseorte auf der CCD durch die Beleuchtungsmimik bestimmen
lassen, z. B. durch einen Encoder an der Nipkowscheibe.
3. Bei dünneren Objekten sollte es möglich sein, durch
Fourieranalyse des Beugungsscheibchens die Auflösung weiter zu
steigern. Es konnte gezeigt werden, daß bei finiten Objekten das
Fourierspektrum analytisch ist, somit aus der genauen Kenntnis
eines begrenzten Bereiches dieses Spektrums der Bereich jenseits
der cut-off Frequenz des Mikroskops extrapliert werden kann.
Dieses Verfahren ist im Wesentlichen durch Detektorrauschen
begrenzt. Die Mitte der zu analysierenden Beugungsscheibchen
könnte nötigenfalls durch eine center-of-gravity Funktion
festgelegt werden.
4. Bei Verwendung von Differential-Interferenz-Kontrast
könnten Bilder mit verschieden großer Bildaufspaltung
aufgenommen werden, durch Verwendung verschiedener Nomarski
Prismen, oder durch variablen Interferenzkontrast nach Pluta.
Auch bei Verwendung von Bildaufspaltungen < 0,5 der
Auflösungsgrenze sollten bei doppelten oder periodischen
Strukturen Minima und Maxima der Höhe des Zentralpeaks
des Airyscheibchens auftreten, in Abhängigkeit von der Weite der
Bildaufspaltung. Das Mikroskop würde damit als Interferometer
analog zum Michelsonschen Sterninterferometer eingesetzt. Auch
mit diesem Verfahren sollten sich Präparatstrukturen unterhalb
der Auflösungsgrenze rekonstruieren lassen.
Claims (4)
1. Konfokales Mikroskop, dadurch gekennzeichnet, daß die 1.
Lochblende mechanisch erzeugt wird, z. B. durch eine im
Beleuchtungsstrahlengang rotierende Nipkow-Scheibe. Die 2.
Lochblende wird dagegen elektronisch auf einem CCD-Detektor
durch das Auslese- und Bildverarbeitungsprogramm generiert.
2. Das Bildverarbeitungsprogramm erlaubt die elektronische
Erzeugung beliebiger ringförmiger Ausleseblenden, sodaß die
höhere räumliche Auflösung solcher Blendenkombinationen zur
Darstellung feinster Strukturen (Superresolution) im Präparat
verwendet werden kann.
3. Der flächenhafte CCD-Detektor erlaubt Fourieranalyse des
Beugungsscheibchens, sodaß aus dem Fourierspektrum des Bildes
die vom Mikroskop beschnittenen hohen räumlichen Frequenzen
extrapoliert werden können (Apertursynthese).
4. Das Ausleseprogramm kann insbesondere für die Überauflösung
von mit DIC-Optik erzeugten Bildern verwendet werden. Bei
Verwendung variabler kleinster differentieller Bildaufspaltung
sind mit dem als Interferometer arbeitenden Mikroskop kleinste
laterale Abstände im Objekt meßbar.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19904023650 DE4023650A1 (de) | 1990-07-25 | 1990-07-25 | Ueberaufloesendes konfokales mikroskop |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19904023650 DE4023650A1 (de) | 1990-07-25 | 1990-07-25 | Ueberaufloesendes konfokales mikroskop |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE4023650A1 true DE4023650A1 (de) | 1992-01-30 |
Family
ID=6411000
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19904023650 Withdrawn DE4023650A1 (de) | 1990-07-25 | 1990-07-25 | Ueberaufloesendes konfokales mikroskop |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE4023650A1 (de) |
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- 1990-07-25 DE DE19904023650 patent/DE4023650A1/de not_active Withdrawn
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