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Die vorliegende Erfindung bezieht sich in einem ersten Aspekt auf ein Mikroskopieverfahren zum Untersuchen einer mikroskopischen Probe nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.
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In einem zweiten Gesichtspunkt betrifft die Erfindung ein Lichtmikroskop nach dem Oberbegriff des Anspruchs 11.
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Ein Ziel bekannter Lichtmikroskope und Mikroskopieverfahren ist die Höhenermittlung einer Probenoberfläche. Unter der Probenoberfläche kann zum einen die äußere Grenze eines zu untersuchenden Objekts verstanden werden. Es kann aber auch die Oberfläche eines inneren Teils des zu untersuchenden Objekts, beispielsweise von biologischen Zellen oder Zellkomponenten in einer wässrigen Lösung, hierunter verstanden werden. Solche Messungen sind insbesondere zur Charakterisierung technischer Oberflächen und zur Ableitung von Rauheitsmesswerten und Topographien relevant.
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Die vorgenannte Höhenermittlung ist mit einem gattungsgemäßen Mikroskopieverfahren zum Untersuchen einer mikroskopischen Probe möglich. Bei diesem Verfahren ist vorgesehen, dass mit einer Lichtquelleneinrichtung Beleuchtungslicht zur Probe ausgesendet wird, dass mit optischen Abbildungsmitteln von der Probe kommendes Probenlicht zu einer Detektoreinrichtung geleitet wird, dass mit der Detektoreinrichtung das Probenlicht zum Erzeugen mehrerer Probenaufnahmen gemessen wird, dass aus jeder Probenaufnahme Höheninformationen zu jeweils mehreren Lateralbereichen der Probe gewonnen werden, wobei die Höheninformationen jeder Probenaufnahme auf jeweils einen Höhenmessbereich beschränkt sind und die Höhenmessbereiche unterschiedlicher Probenaufnahmen voneinander verschieden sind, und dass aus den Probenaufnahmen ein Gesamtbild berechnet wird, in dem Höheninformationen der verschiedenen Probenaufnahmen zusammengefügt sind.
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Ein gattungsgemäßes Lichtmikroskop zum Untersuchen einer mikroskopischen Probe umfasst eine Lichtquelleneinrichtung zum Aussenden von Beleuchtungslicht zur Probe, optische Abbildungsmittel zum Leiten von Beleuchtungslicht zur Probe und zum Leiten von von der Probe kommendem Probenlicht, eine Detektoreinrichtung zum Messen des Probenlichts zum Erzeugen mehrerer Probenaufnahmen, elektronische Steuer- und Auswertemittel, welche dazu gestaltet sind, aus jeder Probenaufnahme Höheninformationen zu jeweils mehreren Lateralbereichen der Probe zu gewinnen, wobei die Höheninformationen jeder Probenaufnahme auf jeweils einen Höhenmessbereich beschränkt sind und die Höhenmessbereiche unterschiedlicher Probenaufnahmen voneinander verschieden sind, und wobei die elektronischen Steuer- und Auswertemitteln außerdem dazu gestaltet sind, aus den Probenaufnahmen ein Gesamtbild berechnet wird, in dem Höheninformationen der verschiedenen Probenaufnahmen zusammengefügt sind.
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Unter dem Zusammenfügen der Höheninformationen verschiedener Probenaufnahmen kann verstanden werden, dass diese Höheninformationen nicht mehr unabhängig voneinander vorliegen, sondern relativ zu einem gemeinsamen Bezugspunkt ausgedrückt werden. Dadurch kann eine Höheninformation von einer Probenaufnahme sinnvoll mit einer Höheninformation aus einer anderen Probenaufnahme verglichen werden.
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Bekannt sind beispielsweise Höhenuntersuchungen mit konfokalen Mikroskopen. Dabei wird die Probe mit Beleuchtungslicht abgetastet, welches zunächst auf eine bestimmte Höhenebene fokussiert wird. Währenddessen wird als die vorgenannte Probenaufnahme ein Probenbild aufgezeichnet. Dieses kann beispielsweise dahingehend ausgewertet werden, ob ein Probenbereich, das heißt ein bestimmter Lateralbereich der Probe, gerade in der beleuchteten Höhenebene liegt oder von dieser entfernt ist. Sodann wird die Probe mit einem verstellbaren Probentisch in der Höhenrichtung verfahren, das heißt in Richtung der optischen Achse, welche von der Probe zu einem Objektiv des Lichtmikroskops läuft. Es wird sodann ein zweites Probenbild aufgenommen und ausgewertet. Nun soll bestimmt werden, wie die Beziehung der Höhe eines Lateralbereichs, der beim ersten Probenbild in der beleuchteten Höhenebene liegt, zur Höhe eines anderen Lateralbereichs liegt, der sich beim zweiten Probenbild in der beleuchteten Höhenebene befindet. Dazu wird die Verstellhöhe erfasst, um die die Probe zwischen den Aufnahmen der beiden Bilder in der Höhe verschoben wird. Das Zusammenfügen der Höheninformationen von zwei Probenaufnahmen erfolgt sodann durch die Kenntnis der Verstellhöhe. Hieran ist nachteilig, dass zum Messen dieser Höhe mit hoher Präzision kostenintensive Stellelemente erforderlich sind.
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Um mehrere Lateralbereiche gleichzeitig zu untersuchen, kann in der Konfokalmikroskopie das Spinning-Disc-Verfahren mit einer Nipkow-Scheibe genutzt werden. Hierbei wird eine Scheibe mit mehreren Löchern verwendet, durch die mehrere Lateralbereiche beleuchtet werden. Durch Rotieren der Scheibe wird ein Scan in Lateralrichtung durchgeführt. für Probenaufnahmen mit unterschiedlichen Höhenmessbereichen ist hier ebenfalls eine Verschiebung der Probe in Höhenrichtung erforderlich, welche herkömmlicherweise durch eine hochpräzise Aktorik erfasst werden muss.
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Zudem können hier Schwingungen oder Stöße auftreten, durch die eine Höhenposition der Probe während den Messungen variiert. Daher werden meist teure schwingungsdämpfende Tische eingesetzt.
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Die gleichen Probleme treten bei der Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung auf, bei welcher üblicherweise Probenbilder zu verschiedenen Gitterabbildungen erzeugt und zu einem hochaufgelösten Bild verrechnet werden.
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Auch bei einer separaten gleichzeitigen Aufnahme von konfokalen und nicht konfokalen Lichtanteilen muss eine Höhenverschiebung der Probe durchgeführt werden, womit hohe Kosten für präzise Stelleinrichtungen und unerwünschte Schwingungsauswirkungen einhergehen.
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Weiterhin ist zum Gewinnen von Höheninformationen das chromatisch konfokale Prinzip bekannt. Hierbei wird ein chromatisch wirkendes optisches Element verwendet, dessen Brechkraft wellenlängenabhängig ist. Dadurch kann Licht abhängig von seiner Wellenlänge auf verschiedene Höhenebenen fokussiert werden. Es kann eine breitbandige Lichtquelle oder eine durchstimmbare Lichtquelle mit sequentieller konfokaler Detektion verwendet werden. Abhängig von der Intensität von Licht verschiedener Wellenlängen kann auf die Höhe eines Lateralbereichs der Probe geschlossen werden. Durch die unterschiedliche Fokussierung von Licht verschiedener Wellenlängen wird ein Höhenmessbereich definiert. Weist die Probe stark unterschiedliche Höhen auf, die aus diesem Höhenmessbereich herausragen, so muss auch bei diesem Messverfahren die Probe in Höhenrichtung verfahren werden. Herkömmlicherweise muss auch hier diese Verschiebestrecke mit präzisen Stellmitteln erfasst werden. Zudem haben Schwingungen von beispielsweise dem Probentisch große nachteilige Auswirkungen auf das Messergebnis.
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Die gleichen Probleme bestehen auch bei Verfahren der Nanoprofilometrie. Hier wird eine Probe so positioniert, dass sie sich in der Anstiegs- oder Abstiegsflanke der axialen Response-Funktion eines Weitfeld-Konfokal-Mikroskops befindet. Sind durch einen vorherigen Kalibrierschritt die relativen Reflektivitäten der unterschiedlichen Probenlateralbereiche bekannt, so kann direkt das Höhenprofil ermittelt werden. Der Höhenmessbereich ist aber eingeschränkt, so dass oftmals die Probe in Höhenrichtung verschoben und eine weitere Probenaufnahme erforderlich ist. Um die Höheninformationen dieser verschiedenen Aufnahmen zu verknüpfen, ist eine genaue Kenntnis der Höhenverstellung der Probe erforderlich.
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Es existieren zahlreiche weitere Messverfahren, die aber jeweils auf einen Höhenmessbereich beschränkt sind und ein Verschieben der Probe relativ zum Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang erfordern. Bei allen diesen herkömmlichen Verfahren treten die Nachteile auf, dass mit kostenintensiven Stellelementen eine hochpräzise Relativverschiebung der Probe erforderlich ist und dennoch durch Schwingungen die Messergebnisse stark beeinflusst werden können.
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US 2009 / 0 153 878 A1 beschreibt ein Laserscanningmikroskop, mit dem mehrere Probenmessungen zu verschiedenen, lateral überlappenden Probenbereichen erfolgen sollen. Die Probenmessungen werden aneinander gefügt, indem sie für die überlappenden Probenbereiche in Einklang gebracht werden.
DE 10 2011 055 294 A1 beschreibt ein Mikroskop zur drei-dimensionalen Lokalisierung punktförmiger Objekte in einer Probe. Ein konfokaler Abstandsmesser ist aus
DE 102 42 373 A1 bekannt.
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Als eine Aufgabe der Erfindung kann angesehen werden, ein Mikroskopieverfahren und ein Lichtmikroskop anzugeben, mit welchen eine Probe über einen besonders großen Höhenbereich präzise und kostengünstig untersucht werden kann.
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Diese Aufgabe wird durch das Mikroskopieverfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und durch das Lichtmikroskop mit den Merkmalen des Anspruchs 11 gelöst.
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Vorteilhafte Varianten des erfindungsgemäßen Mikroskopieverfahrens und des erfindungsgemäßen Lichtmikroskops sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche und werden außerdem in der folgenden Beschreibung erläutert.
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Bei dem Mikroskopieverfahren der oben genannten Art ist erfindungsgemäß vorgesehen, dass Probenaufnahmen zu solchen Höhen aufgenommen werden, dass sich die Höhenmessbereiche verschiedener Probenaufnahmen überschneiden, dass in jeweils zwei Probenaufnahmen gemeinsame Lateralbereiche identifiziert werden, zu denen in beiden Probenaufnahmen Höheninformationen gewonnen werden konnten, und dass auf Grundlage der Höheninformationen verschiedener Probenaufnahmen zu mindestens einem gemeinsamen Lateralbereich eine Verknüpfung der Höheninformationen verschiedener Probenaufnahmen festgelegt wird.
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Bei dem Lichtmikroskop der oben genannten Art sind erfindungsgemäß die elektronischen Steuer- und Auswertemittel dazu eingerichtet,
- - Probenaufnahmen zu solchen Höhen aufzunehmen, dass sich die Höhenmessbereiche verschiedener Probenaufnahmen überschneiden,
- - in jeweils zwei Probenaufnahmen gemeinsame Lateralbereiche zu identifizieren, zu denen in beiden Probenaufnahmen Höheninformationen gewonnen werden, das heißt, zumindest einen gemeinsamen Lateralbereich zu identifizieren, zu dem in beiden Probenaufnahmen eine Höheninformation gewonnen werden kann, dessen Höhe also innerhalb des Höhenmessbereichs liegt, und
- - auf Grundlage der Höheninformationen verschiedener Probenaufnahmen zu mindestens einem gemeinsamen Lateralbereich eine Verknüpfung der Höheninformationen verschiedener Probenaufnahmen festzulegen.
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Diese Schritte können durch die Steuer- und Auswertemittel vorzugsweise automatisch durchgeführt werden.
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Ein grundlegender Gedanke der Erfindung kann darin gesehen werden, dass für das Gesamtbild die Höheninformationen der verschiedenen Probenaufnahmen zusammengefügt werden, indem in jeweils zwei Probenaufnahmen gemeinsame Lateralbereiche identifiziert werden, zu denen in beiden Probenaufnahmen Höheninformationen gewonnen werden konnten, und indem über diese Höheninformationen gemeinsamer Lateralbereiche eine Beziehung der Höheninformationen von übrigen Lateralbereichen bestimmt wird, zu denen nur in einem der beiden Probenaufnahmen Höheninformationen gewonnen werden konnten.
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Dieser Erfindungsgedanke wird im Folgenden detailliert dargestellt.
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Durch eine Auswertung von jeder Probenaufnahme können Höheninformationen gewonnen werden. Die Höheninformationen sind aber nur Relativangaben, die Höhenverhältnisse verschiedener Lateralbereiche innerhalb einer Probenaufnahme angeben. Wie eine Beziehung von Höheninformationen einer Probenaufnahme zu den Höheninformationen einer anderen Probenaufnahme ist, ist zunächst unbekannt.
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Herkömmlicherweise wird hierzu mit präzisen Stellmitteln erfasst, um welche Höhenstrecke die Probe zwischen zwei Probenaufnahmen verschoben wurde.
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Dies ist bei der Erfindung nicht erforderlich. Eine wesentliche Idee der Erfindung kann darin gesehen werden, eine Verknüpfung der Höheninformationen verschiedener Probenaufnahmen durch Informationen aus den Probenaufnahmen selbst zu bestimmen. Die Probenaufnahmen werden also so ausgewertet, dass eine Höhenverstellung der Probe zwischen verschiedenen Probenaufnahmen berechnet werden kann.
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Dazu müssen in jeweils zwei Probenaufnahmen Informationen enthalten sein, aus denen bestimmt werden kann, welcher Messwert, das heißt welche Höheninformation, dieselbe Höhe eines Probenbereichs kennzeichnet. Um dies zu erreichen, darf eine Relativverschiebung zwischen der Probe und einem Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang von einer zur nächsten Probenaufnahme nicht beliebig hoch sein. Vielmehr ist die Relativverschiebung gerade so groß, dass die Probenaufnahmen zu solchen Höhen erfolgen, dass sich die Höhenmessbereiche von jeweils zwei Probenaufnahmen überschneiden. Dies ist erforderlich, damit in jeweils zwei Probenaufnahmen zumindest ein übereinstimmender Lateralbereich der Probe untersucht wird. Dessen Höhe kann als Referenzhöhe verwendet werden. Es wird also in beiden Probenaufnahmen zu demselben Lateralbereich eine Höheninformation bestimmt. Diese beiden Höheninformationen repräsentieren dieselbe Höhe eines Probenbereichs, so dass ihnen derselbe Absoluthöhenwert zugeordnet werden kann. Die übrigen Höheninformationen der Probenaufnahmen sind Relativinformationen relativ zu diesem Referenz- oder Absoluthöhenwert. Daher können auch die übrigen Höheninformationen zu Absoluthöhenwerten umgerechnet werden. Somit wird eine Verknüpfung zwischen den Höheninformationen von zwei Probenaufnahmen hergestellt.
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Eine gegebenenfalls dritte Probenaufnahme wird wiederum zu einer Höhe aufgenommen, dass ihr Höhenmessbereich mit dem von einer der vorgenannten Probenaufnahmen überlappt. Sodann wird in diesen beiden Probenaufnahmen ein gemeinsamer Lateralbereich bestimmt und dessen Höhe wird als Stütz- oder Referenzwert für die übrigen Höheninformationen der dritten Probenaufnahme verwendet.
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Analog wird mit allen gegebenenfalls durchgeführten weiteren Probenaufnahmen verfahren.
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Bei einer bevorzugten Variante der Erfindung erfolgt die Verknüpfung in folgender Weise: Bei jeder Probenaufnahme wird die Höheninformation von einem der Lateralbereiche als Bezugspunkt für diese Probenaufnahme festgelegt. Alternativ wird ein prinzipiell beliebiger Bezugspunkt aus den Höheninformationen mehrerer Lateralbereiche abgeleitet. Die Höheninformationen, die in einer Probenaufnahme zu den verschiedenen Lateralbereichen gewonnen werden, werden sodann als Relativhöhen relativ zu dem Bezugspunkt dieser Probenaufnahme ausgedrückt. Für mindestens einen der in zwei Probenaufnahmen gemeinsamen Lateralbereiche wird eine Differenz zwischen den beiden Relativhöhen bestimmt, die für diesen Lateralbereich in den zwei Probenaufnahmen ermittelt wurden. Mit der ermittelten Differenz wird darauf ein Höhenversatz ermittelt. Dieser Höhenversatz kann gleich der Differenz sein. Werden zu mehreren gemeinsamen Lateralbereichen jeweils eine Differenz bestimmt, so kann der Höhenversatz als ein Mittelwert dieser Differenz festgelegt werden. Zur Verknüpfung der Höheninformationen der beiden Probenaufnahmen werden schließlich die Relativhöhen von einer dieser Probenaufnahmen um den Höhenversatz geändert. Die so erhaltenen Relativhöhen von beiden Probenaufnahmen beziehen sich dadurch auf denselben Bezugspunkt.
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Vorzugsweise wird die Höheninformation von demjenigen Lateralbereich als Bezugspunkt ausgewählt, bei dem eine Messgenauigkeit am höchsten ist. Wird beispielsweise die Höheninformation durch eine monotone Funktion der Lichtintensität zu dem zugehörigen Lateralbereich ermittelt, so ist die höchste Messgenauigkeit diejenige, bei dem das Signal-zu-Rausch-Verhältnis der Lichtintensität zu einem Lateralbereich am größten ist.
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Die Probenaufnahme kann grundsätzlich in beliebiger Weise erfolgen, solange sie Höheninformationen über einen Höhenmessbereich enthält, das heißt solange in der Probenaufnahme verschiedene Höhen der Probenoberfläche innerhalb eines bestimmten Höhenbereichs auseinandergehalten werden können.
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Eine Probenaufnahme kann durch ein einzelnes oder durch mehrere Probenbilder gebildet sein. Bevorzugt werden zwei Probenbilder aufgenommen, die eine Probenaufnahme darstellen. Für die Aufnahme dieser beiden Probenbilder ist keine Höhenverstellung erforderlich, wie im Späteren näher beschrieben wird. Hierdurch kann ein größerer Höhenmessbereich von einer Probenaufnahme abgedeckt werden.
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Ein Höhenmessbereich kann beispielsweise 1µm umfassen. Weist die Probe größere Höhenunterschiede auf, so kann zu Lateralbereichen der Probe, die aus diesem 1µm-Höhenmessbereich herausragen, keine quantitative Höheninformation oder nur eine sehr ungenaue quantitative Höheninformation erhalten werden.
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Das nachzuweisende Probenlicht kann von der Probe zurückgeworfenes Beleuchtungslicht sein, insbesondere reflektiertes oder gestreutes Beleuchtungslicht. Das Probenlicht kann aber auch Lumineszenzlicht sein, also Fluoreszenz- oder Phosphoreszenzlicht, welches durch Anregung mittels des Beleuchtungslichts entsteht.
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Die verwendete Lichtquelleneinrichtung kann prinzipiell beliebig gestaltet sein, solange sie Beleuchtungslicht, beispielsweise sichtbares, infrarotes oder ultraviolettes Licht, zur Probe aussendet. Sie kann eine oder mehrere Lichtquelleneinheiten, beispielsweise Laser oder LEDs, umfassen. Bevorzugt wird mit der Lichtquelleneinrichtung ein Lichtfleckmuster aus mehreren Lichtflecken auf der Probe erzeugt. Dazu können mehrere Lichtquellen in einem entsprechenden Muster nebeneinander angeordnet sein. Alternativ kann eine Lichtquelle eine Maske beleuchten, durch die das Lichtfleckmuster erzeugt wird. Die Maske kann zum Beispiel durch Lochblenden oder Spiegel gebildet sein. Als Spiegel kann auch ein elektronisch verstellbares Mikrospiegelarray (DMD, englisch: Digital Mirror Device) verwendet werden. Andere elektronisch ansteuerbare Lichtmodulatoren können eingesetzt werden, welche beispielsweise auf schaltbaren Flüssigkristallbereichen beruhen können. Als Maske kann auch ein Gitter eingesetzt werden. Dieses kann quer und/oder in Ausbreitungsrichtung des Lichts verstellbar sein. Dadurch wird die Anzahl an verschiedenen Lateralbereichen erhöht, welche beleuchtet werden können. Zudem kann die Höhenebene verändert werden, in welche das Lichtfleckmuster scharf abgebildet wird. Das Gitter kann eine periodische Struktur mit einer oder zwei Gitterkonstanten aufweisen. Alternativ kann das Gitter auch eine unregelmäßige Struktur haben, wodurch Lichtflecken unterschiedlicher Abmessungen gleichzeitig erzeugt werden.
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Weiterhin können die Lichtquelleneinrichtung oder die optischen Abbildungsmittel auch über einen Scanner verfügen, durch den ein Beleuchtungslichtstrahl nacheinander verschiedene Lateralbereiche beleuchtet und so das Lichtfleckmuster erzeugt.
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Die Lichtflecken beleuchten gleichzeitig voneinander beabstandete Lateralbereiche. Dadurch können in einer einzigen Probenaufnahme mehrere Lateralbereichs der Probe untersucht werden. Da zumindest ein Lateralbereich stets als Referenz zur Verknüpfung der Höheninformationen verschiedener Probenaufnahmen verwendet wird, ist es weiterhin zwingend erforderlich, dass in einer Probenaufnahme mehrere Lateralbereiche untersucht werden.
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Unter einem Lateralbereich kann ein Bereich der Probe quer, insbesondere senkrecht, zur Höhenrichtung aufgefasst werden. Dabei kann als Höhenrichtung die Richtung der optischen Achse von einem Objektiv des Lichtmikroskops zur Probe verstanden werden.
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Das Gesamtbild, welches aus den mehreren Probenaufnahmen berechnet wird, umfasst die Koordinaten in den zwei Lateralrichtungen und in der Höhenrichtung von mehreren Lateralbereichen der Probe. Das Gesamtbild kann demnach als 3D-Bild aufgefasst werden.
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Eine Verknüpfung der Höheninformationen verschiedener Probenaufnahmen ist allgemein so zu verstehen, dass die Höheninformationen verschiedener Probenaufnahmen relativ zu einer gemeinsamen Referenz ausgedrückt werden. Die Probenaufnahmen liefern nämlich zunächst Höheninformationen zu jeweils anderen Bezugspunkten und es ist vorerst nicht bekannt, wie diese verschiedenen Bezugspunkte zueinander stehen.
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Vorzugsweise wird zur Verknüpfung von zwei Probenaufnahmen jedem der in diesen Probenaufnahmen gemeinsamen Lateralbereiche ein und derselbe Höhenwert zugeordnet. Die beiden Probenaufnahmen enthalten jeweils Höheninformationen zu übrigen Lateralbereichen, zu denen nur in einem der beiden Probenaufnahmen eine Höheninformation gewonnen werden konnte. Aus den Probenaufnahmen ist bekannt, wie diese Höheninformationen zu der des gemeinsamen Lateralbereichs stehen. Daher können nun die Höheninformationen der übrigen Lateralbereiche relativ zum vorgenannten Höhenwert ausgedrückt werden.
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Unter gemeinsamen Lateralbereichen sind Lateralbereiche der Probe zu verstehen, die einander zumindest überlappen. Bevorzugt sind sie konzentrisch und haben die gleiche Form. Die Lateralbereiche können durch die jeweils von einem Lichtfleck bestrahlte Probenfläche definiert sein. In diesem Fall kann die Größe des Lichtflecks in Ausbreitungsrichtung des Lichts variieren, so dass für zwei verschiedene Probenaufnahmen der auf der Probenoberfläche erzeugte Lichtfleck unterschiedlich groß ist. Dadurch sind die gemeinsamen Lateralbereiche konzentrisch und formgleich, haben aber unterschiedliche Größen.
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Zur Verknüpfung der Höheninformationen zweier Probenaufnahmen kann auch ein Höhenversatz zwischen den Höhenmessbereichen dieser Probenaufnahmen berechnet werden, indem eine Differenz zwischen den Höheninformationen verschiedener Probenaufnahmen zu einem gemeinsamen Lateralbereich berechnet wird, und die Höheninformationen von einer dieser beiden Probenaufnahmen um den Höhenversatz verschoben werden. Beispielsweise kann eine erste Probenaufnahme ergeben, dass ein Lateralbereich eine Höhe von 0,3µm relativ zu einem willkürlichen Bezugspunkt hat. Eine weitere Probenaufnahme kann nun ergeben, dass derselbe Lateralbereich eine Höhe von 0,8µm relativ zu einem anderen willkürlichen Bezugspunkt hat. Ein Höhenversatz zwischen diesen Probenaufnahmen wird nun als die Differenz 0,8µm-0,3µm=0,5µm bestimmt. Sämtliche Höheninformationen von einer der beiden Probenaufnahmen werden nun um 0,5µm verschoben. Dadurch sind die Höheninformationen beider Probenaufnahmen relativ zu demselben Bezugspunkt ausgedrückt.
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Erfindungsgemäß werden für jede Probenaufnahme diejenigen Lateralbereiche bestimmt und ausgewählt, deren Höhen innerhalb des jeweiligen Höhenmessbereichs liegen. Es werden nur die Höheninformationen von diesen ausgewählten Lateralbereichen für die Berechnung des Gesamtbilds verwendet. Ob ein Lateralbereich, zu dem ein Messwert aufgenommen wird, innerhalb des Höhenmessbereichs liegt, kann beispielsweise dadurch ermittelt werden, ob dieser Messwert eine vorgegebene Signalqualität erfüllt, insbesondere größer als ein Grenzwert ist.
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Somit kann ein Höhenmessbereich dadurch begrenzt sein, dass nur zu Höhen von Lateralbereichen der Probe, die innerhalb des Höhenmessbereichs liegen, eine Signalqualität genügend ist. Eine genügende Signalqualität kann insbesondere dadurch definiert sein, dass das Signal-zu-Rausch-Verhältnis einen vorgegebenen Grenzwert überschreitet.
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In einem Fall, bei dem in zwei Probenaufnahmen mehrere gemeinsame Lateralbereiche identifiziert werden, werden vorzugsweise die Höheninformationen von sämtlichen der gemeinsamen Lateralbereiche verwendet, um die Verknüpfung der Höheninformationen von übrigen Lateralbereichen zu bestimmen, zu denen nur in einem der beiden Probenaufnahmen Höheninformationen gewonnen werden konnten. Hierdurch kann eine höhere Genauigkeit der Verknüpfung erreicht werden.
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Für jeden der gemeinsamen Lateralbereiche kann eine Differenz zwischen den Höhenmessbereichen der beiden Probenaufnahmen berechnet werden, wobei durch Messungenauigkeiten diese Differenzen geringfügig verschiedene Werte haben können. Daher kann aus den Differenzen ein Mittelwert gebildet werden. Dieser wird als Höhenversatz zwischen den Höhenmessbereichen der zwei betrachteten Probenaufnahmen verwendet.
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Bei einer Verwendung der Höheninformationen von mehreren gemeinsamen Lateralbereichen zur Verknüpfung der Höheninformationen kann vorgesehen sein, die Höheninformationen zu den mehreren gemeinsamen Lateralbereichen unterschiedlich zu gewichten. Die Gewichtung einer Höheninformation kann beispielsweise abhängig von der zugehörigen Signalqualität erfolgen. Wird beispielsweise die Höheninformation aus einer Lichtintensität abgeleitet, so sind das Signal-zu-Rausch-Verhältnis und damit die Signalqualität umso besser, je höher die Lichtintensität ist. Wird die Höheninformation eines Lateralbereichs aus einer Bildschärfe bestimmt, so ist die Signalqualität umso besser, je größer die Bildschärfe für Messinformationen des jeweiligen Lateralbereichs ist.
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Um mehrere Probenaufnahmen zu erzeugen, kann ein Höhenscan durchgeführt werden, bei dem für jede Probenaufnahme verstellt wird, aus welchem Höhenbereich der Probe Probenlicht auf die Detektoreinrichtung geleitet wird. Dazu kann beispielsweise die Probe in der Höhe verstellt werden. Es kann auch ein Strahlengang von Beleuchtungs- und/oder Probenlicht relativ zur Probe verstellt werden. Bei Verwendung einer chromatischen Optik, die für verschiedene Lichtwellenlängen unterschiedliche Foki erzeugt, können die verschiedenen Probenaufnahmen auch durch sequentielles Aussenden von Beleuchtungslicht unterschiedlicher Wellenlängen erzeugt werden. Dies wird auch als Lambda-Scan bezeichnet.
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Bei einer weiteren Ausführung der Erfindung sind zum Kodieren einer Höheninformation optische Abbildungsmittel vorgesehen, welche eine Punktabbildungsfunktion bewirken, bei der eine Form, in welcher ein Punkt einer Lichtquelle auf einen Lateralbereich der Probe abgebildet wird oder in welcher ein Lateralbereich der Probe auf die Detektoreinrichtung abgebildet wird, abhängig von der Höhe des jeweiligen Lateralbereichs ist. In mit der Detektoreinrichtung aufgenommenen Probenaufnahmen wird sodann jeweils die Form der mehreren abgebildeten Lateralbereiche bestimmt. Aus der Form wird schließlich eine Höheninformation des jeweiligen Lateralbereichs abgeleitet.
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Solch eine Punktabbildungsfunktion kann beispielsweise durch optische Elemente mit Astigmatismus erreicht werden. Dazu kann insbesondere eine Zylinderlinse im Strahlengang zwischen der Probe und der Detektoreinrichtung vorgesehen sein. Ein punkt- oder kreisförmiger Lateralbereich der Probe wird durch die Zylinderlinse so verzerrt, dass die Breite und Länge der Abbildung auf der Detektoreinrichtung unterschiedlich zueinander sind. Dabei hängen Breite und Länge dieser Abbildung von der Höhe des abgebildeten Lateralbereichs der Probe ab. Somit kann aus Breite und Länge der Abbildung eine Höheninformation abgeleitet werden.
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Alternativ kann die Zylinderlinse auch zwischen der Lichtquelleneinrichtung und der Probe angeordnet sein, womit eine punkt- oder kreisförmige Lichtquelle verzerrt auf die Probe abgebildet wird und die konkrete Form von der Höhe des beleuchteten Lateralbereichs abhängt. Die Form des beleuchteten Bereichs kann sodann mit der Detektoreinrichtung gemessen werden, wobei vor dieser keine weitere Zylinderlinse erforderlich ist. Allgemeiner können bei diesen Ausführungen statt einer Zylinderlinse beliebige optische Elemente mit Astigmatismus verwendet werden.
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Auch können die optischen Abbildungsmittel eine sogenannte Phasenplatte umfassen, welche eine Punktabbildungsfunktion bewirkt, die einen Punkt spiralförmig mit einer Formabhängigkeit in Ausbreitungsrichtung des Probenlichts, das heißt in Höhenrichtung der Probe, abbildet.
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Bei diesen Ausführungen kann jede Probenaufnahme gerade ein Probenbild umfassen.
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Bei bevorzugten Varianten der Erfindung werden die Höheninformationen aus einer Probenaufnahme gewonnen durch:
- - eine Intensitätsbestimmung, wobei eine Höheninformation zu einem Lateralbereich aus einer gemessenen Lichtintensität zu diesem Lateralbereich abgeleitet wird, wie zum Beispiel bei der Nanoprofilometrie, und/oder
- - eine Schärfenbestimmung, wobei eine Höheninformation zu einem Lateralbereich aus einer ermittelten Bildschärfe zu diesem Lateralbereich abgeleitet wird.
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Alternativ kann auch ein Kohärenzkontrast oder Kohärenzgrad ermittelt werden, welcher wie auch die Lichtintensität und Schärfe abhängig von der Höhe des jeweiligen Lateralbereichs ist. Außerdem kann auch die Ankunftszeit von reflektierten Photonen des Beleuchtungslichts erfasst werden, um eine Höheninformation zu gewinnen.
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Höheninformationen können auch aus einer Probenaufnahme über Interferenz von Beleuchtungslicht und Probenlicht bestimmt werden. Dazu wird Beleuchtungslicht auf die Probe geleitet und von der Probe kommendes Probenlicht wird in Richtung der Detektoreinrichtung geleitet. Ein Anteil des Beleuchtungslichts wird auf einen Referenzweg abgezweigt, bevor dieser Anteil die Probe erreichen würde, und wird mit dem Probenlicht auf der Detektoreinrichtung zur Interferenz gebracht. Das Interferenzmuster beziehungsweise eine Lichtintensität an bestimmten Detektorbereichen hängt von der Höhe der Probe ab, so dass eine Höheninformation erhalten werden kann. Auch eine solche Probenaufnahme hat einen beschränkten Höhenmessbereich. Daher ist es sinnvoll, die Probe zu einer zunächst nur ungenau bekannten anderen Höhe zu verschieben und in erfindungsgemäßer Weise eine Verknüpfung der so aufgenommenen Höheninformationen zu berechnen.
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Bei einer weiteren bevorzugten Ausführung wird zum Erzeugen einer Probenaufnahme, aus welcher Höheninformationen gewinnbar sind, eine chromatisch konfokale Probenuntersuchung oder eine Weißlichtinterferometrie durchgeführt. Bei diesen sind Fokusebenen von Beleuchtungslicht wellenlängenabhängig. So können mit einer konfokalen Anordnung mehrere Lichtflecken auf verschiedene Probenbereiche gestrahlt werden. Durch beispielsweise eine Lochblendenscheibe oder digitale Blende wird mit der Detektoreinrichtung nur Probenlicht aus gerade diesen beleuchteten Probenbereichen gemessen. Durch ein chromatisch wirksames optisches Element werden für Licht verschiedener Wellenlängen unterschiedliche Konfokalebenen erzeugt. Es können für jeden beleuchteten Probenbereich wellenlängenabhängig die Intensitäten von Probenlicht ermittelt werden. Indem die Wellenlänge festgestellt wird, bei der die Intensität maximal ist, kann bestimmt werden, mit welcher der mehreren Konfokalebenen die Höhe des beleuchteten Lateralbereichs übereinstimmt.
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Das Beleuchtungslicht kann als Weißlicht, welches einen spektral breiten Bereich abdeckt, ausgesendet werden. In diesem Fall misst die Detektoreinrichtung wellenlängenaufgelöst. Alternativ kann auch nacheinander Beleuchtungslicht verschiedener Wellenlängenbereiche ausgesendet werden. Dadurch kann auf eine Wellenlängenauflösung der Detektoreinrichtung verzichtet werden.
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Bei einer weiteren, besonders bevorzugten Ausgestaltung sind die optischen Abbildungsmittel, die Lichtquelleneinrichtung und die Detektoreinrichtung so gestaltet, dass für jede Probenaufnahme jeweils mindestens zwei Probenbilder ohne mechanisches Bewegen der Probe, der optischen Abbildungsmittel oder der Detektoreinrichtung aufnehmbar sind. Für die Aufnahme der zwei Probenbilder werden
- - mit der Lichtquelleneinrichtung und den optischen Abbildungsmitteln mindestens zwei Lichtfleckmuster in unterschiedliche Proben- oder Höhenebenen fokussiert und/oder es werden
- - mit den optischen Abbildungsmitteln und der Detektoreinrichtung Abbildungen von mindestens zwei verschiedenen Probenebenen erzeugt und getrennt gemessen.
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Bei diesen Ausführungen wird also eine räumlich gleiche Anordnung für die Aufnahme der mindestens zwei Probenbilder verwendet wird. Es wird zwischen den Aufnahmen dieser Bilder keine Scanbewegung in Höhenrichtung durchgeführt. Dadurch wird ein Geschwindigkeitsvorteil erreicht. Außerdem ist eine verbesserte Präzision möglich, da Ungenauigkeiten von mechanischen Bewegungen entfallen und Schwingungen von optischen Komponenten geringere Auswirkungen haben. Zudem ist keine probenabhängige Kalibrierung erforderlich. Ausgestaltungen dieser Ausführungen werden im Folgenden näher beschrieben.
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Die Größe eines beleuchteten Proben- oder Lateralbereichs hängt von der Höhe der Höhenebene, auf welche ein Lichtfleck fokussiert wird, relativ zu diesem Lateralbereich ab. Abhängig vom Oberflächenprofil der Probe werden daher mit einer Höhenebene unterschiedlich große Lichtflecken auf der Probenoberfläche erzeugt.
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Bei einem verhältnismäßig kleinen beleuchteten Lateralbereich wird auf der Detektoreinrichtung ein entsprechend kleiner Bereich mit hoher Probenlichtintensität beleuchtet. Hingegen führt ein größerer beleuchteter Lateralbereich dazu, dass auf der Detektoreinrichtung ein verhältnismäßig großer Bereich mit niedrigerer Probenlichtintensität beleuchtet wird.
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Hieraus kann ermittelt werden, welche beleuchteten Lateralbereiche innerhalb oder außerhalb der Höhenebene liegen, auf welche das Lichtfleckmuster fokussiert wird. Aus einem einzigen Probenbild kann ohne probenspezifische Referenzmessung noch nicht bestimmt werden, ob sich die außerhalb der Höhenebene liegenden Lateralbereiche oberhalb oder unterhalb dieser Höhenebene befinden. Dies wird mit Hilfe des zweiten Probenbilds möglich.
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So können für die Aufnahmen der beiden Probenbilder die Lichtfleckmuster auf unterschiedliche Höhenebenen fokussiert werden. Dabei können sich die Detektorelemente, die die beiden Probenbilder aufzeichnen, für die Aufnahme der beiden Bilder in einer selben Bildebene befinden. Ob ein für das zweite Probenbild beleuchteter Lateralbereich größer oder kleiner ist als der entsprechende Lateralbereich, der für das erste Probenbild beleuchtet wird, hängt davon ob, ob die Höhe dieses Lateralbereichs oberhalb oder unterhalb der ersten Höhenebene liegt, auf welche das Lichtfleckmuster beim ersten Probenbild fokussiert wird. Daher kann aus einem Vergleich der Messinformationen, die zu dem gleichen Lateralbereich in beiden Probenbildern erhalten werden, bestimmt werden, ob die Höhe dieses Lateralbereichs oberhalb oder unterhalb der ersten Höhenebene liegt.
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Müssten hingegen die Messinformationen verschiedener, nicht gleicher, Lateralbereiche miteinander verglichen werden, so würden über die Probe variierende Grade an Reflektivität und/oder Lichtstreuung das Ergebnis verfälschen.
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Alternativ wird für die Aufnahme beider Probenbilder ein identisches Lichtfleckmuster auf der Probenoberfläche erzeugt und es werden verschiedene Höhenebenen auf die Detektoreinrichtung abgebildet und separat gemessen. Die Detektoreinrichtung nimmt demnach mindestens zwei Probenbilder auf, bei denen eine Detektorebene, in welcher sich die Detektorelemente der Detektoreinrichtung befinden, optisch konjugiert zu einer ersten Höhenebene und einer davon verschiedenen zweiten Höhenebene ist. Die Höhenebene, auf welche das Lichtfleckmuster fokussiert wird, kann identisch zur ersten oder zweiten Höhenebene sein oder zu beiden verschieden.
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Die obige Alternative kann auch wie folgt beschrieben werden: Eine bestimmte Höhenebene an der Probe wird auf zwei räumlich versetzte Bildebenen abgebildet. Die beiden Bildebenen sind also jeweils optisch konjugiert zur Höhenebene. Die Bildebenen liegen unterschiedlich bezüglich der Detektorebene der Detektionsrichtung und werden separat gemessen, womit die beiden Probenbilder aufgenommen werden. Die Höhenebene wird somit unterschiedlich scharf auf die Detektorebene abgebildet. Aus einem Vergleich der Messinformationen, die zu dem gleichen Lateralbereich in beiden Probenbildern erhalten werden, wird bestimmt, ob die Höhe dieses Lateralbereichs oberhalb oder unterhalb der ersten Höhenebene liegt.
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Quantitative Aussagen sind mit Hilfe von vorab gespeicherten Referenzdaten möglich. Diese können in einer vorhergehenden Referenzmessung an einem Objekt mit bekanntem Höhenprofil ermittelt worden sein. Durch die Referenzdaten kann bei einem Vergleich von Bildschärfen oder Lichtintensitäten eine Aussage gemacht werden, wie weit die Höhe des untersuchten Lateralbereichs von den beiden Höhenebenen entfernt ist.
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In der Regel ist eine Höhenebene eine flache Fläche, sie kann aber auch eine gekrümmte oder anders geformte Fläche sein. Dies ist beispielsweise bei krümmbaren Bildsensoren der Fall. Allgemeiner kann daher eine Höhenebene als eine Fläche aufgefasst werden, die optisch konjugiert zu einer Detektorfläche der Detektoreinrichtung ist, oder die optisch konjugiert zu einem Lichtfleckmuster der Lichtquelleneinrichtung ist, welches die Höhenebene an der Probe abzubilden ist.
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Vorzugsweise umfasst die Lichtquelleneinrichtung zum Fokussieren der Lichtfleckmuster auf unterschiedliche Höhenebenen eine erste und mindestens eine zweite Lichtquelleneinheit. Dabei ist die erste Lichtquelleneinheit in einer Ebene angeordnet, die optisch konjugiert zu einer ersten Höhenebene an der Probe ist, und die zweite Lichtquelleneinheit ist in einer Ebene angeordnet, die optisch konjugiert zu einer zweiten Höhenebene an der Probe ist. Somit kann eine räumlich starre Anordnung verwendet werden, um Lichtfleckmuster in den verschiedenen Höhenebenen zu erzeugen.
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Für eine einfache Gestaltung können die mindestens zwei Lichtquelleneinheiten nacheinander eingeschaltet werden. Dadurch kann ein und derselbe Detektorbereich der Detektoreinrichtung, also beispielsweise dieselben Kamerasensorelemente, zur Aufnahme der mindestens zwei Probenbilder verwendet werden.
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Sofern das Beleuchtungslicht der beiden Lichtquelleneinheiten voneinander unterscheidbar ist, können die mindestens zwei Probenbilder aber auch gleichzeitig aufgenommen werden.
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Insbesondere hierzu können sich die zwei Lichtfleckmuster, die mit der Lichtquelleneinrichtung und den optischen Abbildungsmitteln in unterschiedliche Probenebenen fokussiert werden, in einer Lichteigenschaft unterscheiden. Mit Strahlteilungsmitteln wird das Probenlicht abhängig von seiner Lichteigenschaft auf unterschiedliche Strahlengänge geleitet, in denen mit der Detektoreinrichtung jeweils ein Probenbild gemessen wird. Die Lichteigenschaft kann beispielsweise eine Polarisation oder Wellenlänge des Beleuchtungs- und Probenlichts sein. Die Strahlteilungsmittel können somit einen Polarisationsstrahlteiler und/oder ein dichroitische Element umfassen, welche abhängig von der Lichtpolarisation beziehungsweise der Lichtwellenlänge Licht reflektieren oder transmittieren.
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Für eine Probenaufnahme können zwei Probenbilder aufgenommen werden, bei denen ein Lichtfleckmuster auf ein und dieselbe Höhenebene fokussiert wird, wobei aber unterschiedliche Höhenebenen auf die Detektoreinrichtung abgebildet werden.
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Hierzu können zwischen der Probe und der Detektoreinrichtung Strahlteilungsmittel vorhanden sein, mit denen Probenlicht auf mindestens zwei räumlich verschiedene Detektionsstrahlengänge aufgeteilt wird. Die Detektoreinrichtung umfasst für jeden der verschiedenen Detektionsstrahlengänge jeweils einen Detektorbereich. Dabei werden auf die verschiedenen Detektorbereiche unterschiedliche Höhenebenen abgebildet.
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In anderen Worten wird in jedem der Detektionsstrahlengänge mit dem Probenlicht eine Abbildung der beleuchteten Höhenebene in jeweils eine Bildebene erzeugt, wobei die Bildebenen der verschiedenen Detektionsstrahlengänge in unterschiedlichen Ebenen relativ zu dem jeweiligen Detektorbereich erzeugt werden.
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Die beiden Detektorbereiche können zum Beispiel durch verschiedene Kameras gebildet sein. Es ist aber besonders bevorzugt, dass die verschiedenen Detektorbereiche unterschiedliche Abschnitte einer gemeinsamen Kamera, das heißt eines gemeinsamen Kamerachips, sind.
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Bei einer bevorzugten Ausgestaltung sind die Strahlteilungsmittel durch ein lichtbeugendes Element gebildet, wobei die beiden Detektionsstrahlengänge durch unterschiedliche Beugungsordnungen des lichtbeugenden Elements erzeugt werden. Hierdurch wird bei besonders geringen Lichtverlusten ein Aufbau mit geringer Komponentenzahl und somit geringen Kosten möglich.
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Weitere Vorteile und Merkmale der Erfindung werden nachstehend mit Bezug auf die beigefügten schematischen Figuren beschrieben.
- 1 zeigt zur Erläuterung des Erfindungsgedankens eine Probenoberfläche mit drei gekennzeichneten Probenpunkten in verschiedenen Höhenebenen.
- 2 zeigt die Probenoberfläche mit den drei gekennzeichneten Probenpunkten aus 1, wobei ein Höhenmessbereich so liegt, dass die Höhen von einem ersten und einem dritten Probenpunkt gemessen werden können.
- 3 zeigt die Probenoberfläche mit den drei gekennzeichneten Probenpunkten aus 1, wobei ein Höhenmessbereich so liegt, dass die Höhen von einem zweiten und dem dritten Probenpunkt gemessen werden können.
- 4 zeigt einen Querschnitt der Probe, wobei diejenigen Probenpunkte gekennzeichnet sind, zu denen eine Höheninformation in einer ersten Probenaufnahme bestimmbar ist.
- 5 zeigt den Querschnitt der Probe aus 4, wobei diejenigen Probenpunkte gekennzeichnet sind, zu denen eine Höheninformation in einer zweiten Probenaufnahme bestimmbar ist.
- 6 zeigt den Querschnitt der Probe aus 4, wobei diejenigen Probenpunkte gekennzeichnet sind, zu denen eine Höheninformation in sowohl der ersten als auch der zweiten Probenaufnahme bestimmbar ist.
- 7 zeigt Komponenten eines Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops, mit denen zwei verschiedene Höhenebenen der Probe ohne mechanisches Bewegen von Komponenten untersucht werden können.
- 8 zeigt Komponenten eines weiteren Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops, mit denen zwei verschiedene Höhenebenen der Probe ohne mechanisches Bewegen von Komponenten untersucht werden können.
- 9 zeigt Komponenten eines wiederum weiteren Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops, mit denen zwei verschiedene Höhenebenen der Probe ohne mechanisches Bewegen von Komponenten untersucht werden können.
- 10 zeigt Komponenten eines weiteren Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops, wobei durch ein lichtbeugendes Element zwei verschiedene Höhenebenen der Probe gleichzeitig untersucht werden können.
- 11 zeigt ein erstes Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemä-ßen Lichtmikroskops.
- 12 zeigt ein zweites Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops.
- 13 zeigt ein drittes Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemä-ßen Lichtmikroskops.
- 14 zeigt ein viertes Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemä-ßen Lichtmikroskops.
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Gleiche und gleich wirkende Bestandteile sind in den Figuren in der Regel mit denselben Bezugszeichen versehen.
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Ein grundlegender Gedanke der Erfindung wird zunächst mit Bezug auf die 1 bis 3 beschrieben.
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1 zeigt einen Querschnitt durch eine Probenoberfläche 50 senkrecht zu einer optischen Achse. Von der Probenoberfläche 50 sind drei Probenpunkte x1, x2 und x3, das heißt drei Lateralbereiche der Probe, gekennzeichnet. Diese drei Probenpunkte weisen unterschiedliche Höhen auf, wobei eine Höhenrichtung in der angegebenen z-Richtung verläuft.
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Für jeden der drei Probenpunkte x1, x2 und x3 ist eine sogenannte Response-Kurve 1, 2 und 3 dargestellt. Die Response- oder Antwort-Kurve gibt an, wie hoch die Signalstärke eines Probenpunkt abhängig von einer untersuchten Höhenebene z1, z2 ist. Dabei ist die Höhe der Signalstärke in x-Richtung aufgetragen. Die Signalstärke ist am höchsten, wenn die untersuchte Höhenebene gerade durch den Probenpunkt verläuft. Es wird aber entsprechend der Antwort-Kurve auch noch ein Signal eines Probenpunkts gemessen, wenn die untersuchte Höhenebene geringfügig beabstandet zu diesem Probenpunkt liegt.
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Welche physikalische Eigenschaft unter der Signalstärke zu verstehen ist, hängt vom Messverfahren ab. Beispielsweise kann die Signalstärke die Lichtintensität, die Bildschärfe oder der Kohärenzkontrast sein.
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Bei einer Probenaufnahme können nur Höheninformationen aus einem beschränkten Höhenmessbereich gewonnen werden. Dieser hängt von der Breite der Response-Kurven ab. 2 zeigt die Probenoberfläche 50 aus 1, wobei ein erster Höhenmessbereich 4 gezeigt wird. Dieser Höhenmessbereich 4 wird für eine erste Probenaufnahme genutzt. Der Höhenmessbereich ergibt sich aus einer Untersuchung der Höhenebene z1, wozu beispielsweise eine Detektorebene der Detektoreinrichtung in einer zu z1 konjugierten Ebene angeordnet sein kann. Der Höhenmessbereich kann gerade der Breite der Response-Kurven entsprechen, wobei die Breite dadurch begrenzt sein kann, ob die Signalstärke ober- oder unterhalb eines vorgegebenen Schwellwerts liegt.
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Die Höhen des ersten und dritten Probenpunkts x1 und x3 liegen innerhalb des Höhenmessbereichs 4. Zu diesen Probenpunkten kann somit aus dieser Probenaufnahme eine Höheninformation gewonnen werden. Hingegen liegt der zweite Probenpunkt x2 außerhalb des Höhenmessbereichs 4, so dass zu diesem keine Höheninformation oder nur eine Höheninformation mit ungenügender Genauigkeit bestimmt werden kann.
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In 3 ist wiederum die Probenoberfläche 50 aus den 1 und 2 gezeigt, wobei für eine zweite Probenaufnahme ein zweiter Höhenmessbereich 5 verwendet wird, bei welchem die Höhenebene z2 untersucht wird. Dieser Höhenmessbereich 5 ist vom ersten Höhenmessbereich 4 verschieden. Um eine Änderung vom ersten zum zweiten Höhenmessbereich zu bewirken, kann beispielsweise die Probe in einer Höhenrichtung verschoben werden. Innerhalb des Höhenmessbereichs 5 liegen die Probenpunkte mit den Werten x2 und x3, nicht aber der Probenpunkt mit dem Wert x1. Daher kann zu x2 und x3 eine Höheninformation gewonnen werden, nicht aber zu x1.
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Die Höheninformationen der beiden Probenaufnahmen sollen nun für das Erstellen eines Gesamtbilds zusammengeführt werden. Es ist aber zunächst keine Beziehung zwischen den zwei Höhenmessbereichen der beiden Probenaufnahmen bekannt.
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So beziehen sich die Höheninformationen verschiedener Probenaufnahmen auf verschiedene Bezugspunkte. Ein solcher Bezugspunkt kann beispielsweise die untere Schranke der in den 2 und 3 dargestellten Höhenmessbereiche sein.
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Es kann beispielsweise mit der ersten Bildaufnahme aus 2 bestimmt werden, dass der Lateralbereich x1 einen Höhenwert z1A von beispielsweise 0,8µm relativ zu einem Bezugspunkt A hat und dass der Lateralbereich x3 einen Höhenwert z3A von beispielsweise 0,2µm relativ zu dem Bezugspunkt A hat. Mit der zweiten Bildaufnahme aus 3 kann entsprechend bestimmt werden, dass der Lateralbereich x2 einen Höhenwert z2B von beispielsweise 0,3µm relativ zu einem Bezugspunkt B hat und dass der Lateralbereich x3 einen Höhenwert z3B von beispielsweise 0,8µm relativ zu dem Bezugspunkt B hat. Unbekannt ist aber, wie die Bezugspunkte A und B zueinander stehen.
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Herkömmlicherweise wird hierzu mit einer präzisen Aktorik oder Stellelementen erfasst, um welche Höhe die Probe für einen Übergang vom ersten zum zweiten Höhenmessbereich verschoben wurde. Diese Höhenverstellung stellt die Differenz zwischen den Bezugspunkten A und B dar und beträgt im obigen Beispiel 0,6µm. Zu den Höhenwerten z2B und z3B kann nun diese Differenz von 0,6µm addiert werden, womit die Höhenwerte beider Probenaufnahmen auf denselben Bezugspunkt bezogen sind.
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An diesem herkömmlichen Verfahren ist nachteilig, dass für genaue Ergebnisse sehr präzise und dadurch teure Stellelemente erforderlich sind. Zudem werden Schwingungen nicht berücksichtigt, durch die eine tatsächliche Höhe der Probe vorübergehend von der durch das Stellelement eingestellten Höhe abweicht.
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Diese Probleme werden durch die Erfindung umgangen.
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So wird aus den Bildaufnahmen selbst ermittelt, wie die Bezugspunkte der beiden Probenaufnahmen zueinander stehen. Das heißt, die Höhendifferenz zwischen den Bezugspunkten A und B wird mit den aufgenommenen Bildinformationen als Verknüpfung der Höheninformationen dieser Probenaufnahmen berechnet.
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Dazu wird genutzt, dass in beiden Probenaufnahmen zu einem gemeinsamen Lateralbereich x3 eine Höheninformation gewonnen werden kann. In dem obigen Beispiel lauten diese Höheninformationen z3A=0,2µm und z3B=0,8µm. Weil diese Höheninformationen sich auf denselben Lateralbereich beziehen, stellen diese Höheninformationen auch denselben Höhenwert dar. Die Höhendifferenz zwischen den Bezugspunkten A und B kann daher durch die Höheninformationen z3A und z3B bestimmt werden, im einfachsten Fall durch die Differenz zwischen diesen Höheninformationen z3B-z3A=0,6µm.
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Der so ermittelte Wert von 0,6µm stellt eine Verknüpfung der Höheninformationen der beiden Probenaufnahmen dar.
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Vorteilhafterweise sind keine hochpräzisen Stellelemente zum Höhenverstellen der Probe erforderlich. Werden beispielsweise weniger präzise Stellelemente genutzt, die für das obige Beispiel eine Höhenverstellung von 0,4µm +/- 0,2µm angeben, so kann ein genauerer Wert durch das oben beschriebene Verfahren der Erfindung ermittelt werden.
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Wird eine eingestellte Höhe durch eine Schwingung von beispielsweise einem Probentisch, der die Probe hält, geändert, so basieren die aufgenommenen Höheninformationen auf der geänderten Höhe. Gegenüber einer Höhenermittlung mittels Stellelementen wird demnach ein störender Einfluss von Schwingungen weitgehend ausgeschlossen.
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Für das Verfahren der Erfindung ist es erforderlich, dass es in zwei Probenaufnahmen stets mindestens einen gemeinsamen Lateralbereich gibt, zu dem in beiden Probenaufnahmen Höheninformationen gewonnen werden können. Hierfür muss eine Änderung des Höhenmessbereichs zwischen den beiden Probenaufnahmen kleiner sein als die Höhenmessbereiche selbst. Dadurch überlappen die Höhenmessbereiche der beiden Probenaufnahmen. Es erfolgt also zwischen zwei Probenaufnahmen eine Änderung des Höhenmessbereichs, welche kleiner als die Höhenmessbereiche ist, wobei der genaue Wert dieser Änderung nicht durch Messsensoren oder Stellelemente erfasst werden muss.
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Für das Verfahren der Erfindung ist es außerdem erforderlich, dass in den zwei Probenaufnahmen gleiche Lateralbereiche und nicht etwa zueinander versetzte Lateralbereiche gemessen werden. Dazu werden für beide Probenaufnahmen Lichtflecke auf den gleichen Lateralbereichen erzeugt, so dass Probenlicht von denselben Lateralbereichen ausgesendet wird.
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Eine weitere Voraussetzung ist, dass mit jeder Probenaufnahme mehrere Lateralbereiche untersucht werden. Nur dadurch können zwei Probenaufnahmen sowohl gemeinsame Lateralbereiche als auch übrige Lateralbereiche umfassen, zu denen nur in einer der beiden Probenaufnahmen Höheninformationen gewonnen werden können.
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Bei dem Beispiel der 1 bis 3 wird nur ein gemeinsamer Lateralbereich x2 identifiziert, zu dem mit den beiden Probenaufnahmen Höheninformationen gewonnen werden können.
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Ein anderes Beispiel ist in den 4 und 5 gezeigt. In 4 sind diejenigen Lateralbereiche der Probe angegeben, für die bei der untersuchten Höhenebene z1 Höheninformationen gewonnen werden können. Dabei entspricht die Papierebene einer Lateralebene, das heißt, die Höhenrichtung steht senkrecht auf die Papierebene. In entsprechender Weise zeigt 5 diejenigen Lateralbereiche der Probe, für die bei der untersuchten Höhenebene z2 Höheninformationen gewonnen werden können. Die gemeinsamen Lateralbereiche, zu denen in beiden Fällen Höheninformationen extrahiert werden können, sind in 6 dargestellt.
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Vorzugsweise werden sämtliche Höheninformationen, die zu den in 6 gezeigten Lateralbereichen gewonnenen werden, zum Verknüpfen der Höheninformationen der beiden Probenaufnahmen verwendet. Dazu kann beispielsweise für jeden dieser Lateralbereiche in der oben beschriebenen Weise eine Höhendifferenz ermittelt werden. Sodann wird aus den mehreren ermittelten Höhendifferenzen ein Mittelwert gebildet und zur Verknüpfung der Höheninformationen der zwei Probenaufnahmen genutzt.
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Für die Berechnung des Mittelwerts können die mehreren Höhendifferenzen unterschiedlich gewichtet werden, etwa abhängig vom Signal-zu-Rausch-Verhältnis der zugehörigen Messung.
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Die Art der Probenaufnahme kann grundsätzlich beliebig sein. Es ist aber vorteilhaft, wenn bereits Höheninformationen über einen großen Höhenbereich gewonnen werden können, ohne dass mit einer Aktorik die Probenhöhe verstellt werden muss. Dies wird bei vorteilhaften Ausführungen der Erfindung möglich, die mit Bezug auf die 7 bis 10 erläutert werden.
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Diese Figuren zeigen verschiedene Aufbauten einer Detektoreinrichtung 30 eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops. Diesen Ausführungen ist gemein, dass zwei verschiedene Probenbilder aufgenommen werden können, ohne dass mechanische Bewegungen von insbesondere der Probe, der Lichtquelleneinrichtung, der Detektoreinrichtung und optischen Elementen zwischen diesen erforderlich sind.
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Dazu umfasst die Detektoreinrichtung zwei räumlich voneinander verschiedene Detektorbereiche, auf welche bei allen dargestellten Ausführungsbeispielen verschiedene Höhenebenen, beispielsweise z1 und z2 aus dem vorherigen Beispiel, abgebildet werden.
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Bei dem Beispiel aus 7 sind die zwei Detektorbereiche durch zwei Kameras 35, 36 gebildet. Die Kamera 35 befindet sich in einer Detektionsebene 37 und die Kamera 36 in einer davon verschiedenen Detektionsebene 38. Nachzuweisendes Probenlicht 55 wird mit Strahlteilungsmitteln 39 auf zwei verschiedene Detektionsstrahlengänge zu den beiden Kameras 35, 36 aufgeteilt. Die Strahlteilungsmittel können beispielsweise ein teildurchlässiger Spiegel sein.
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Bei der Ausführung von 8 wird Beleuchtungslicht verschiedener Wellenlängen genutzt. Das zurückgeworfene Probenlicht kann reflektiertes oder gestreutes Beleuchtungslicht sein und somit die gleichen Wellenlängen wie das Beleuchtungslicht haben. In diesem Fall kann als Strahlteilungsmittel 39 ein Dichroit eingesetzt werden, der Probenlicht wellenlängenabhängig entweder zur Kamera 35 reflektiert oder zur Kamera 36 transmittiert. Die Abbildungsoptiken für beide Kameras sind unterschiedlich oder haben wellenlängenabhängig verschiedene Brennweiten. Auch in dieser Weise können die beiden Kameras 35, 36 zu zwei verschiedenen Probenebenen optisch konjugiert angeordnet sein.
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9 zeigt eine Ausführung, bei welcher ein chromatisch wirksames optisches Element eingesetzt wird (nicht dargestellt). Dieses hat wellenlängenabhängig verschiedene Brennweiten. Dadurch können mit Beleuchtungslicht verschiedener Wellenlängen unterschiedliche Probenebenen untersucht werden. Das zurückgeworfene Probenlicht kann die gleiche Wellenlänge haben. Als Strahlteilungsmittel 39 wird hier ein Dichroit eingesetzt, der Probenlicht wellenlängenabhängig entweder zur Kamera 35 reflektiert oder zur Kamera 36 transmittiert. Die beiden Kameras 35, 36 befinden sich wiederum in Detektionsebenen 37, 38, die für die jeweils gemessene Lichtwellenlänge optisch konjugiert zu zwei verschiedenen Probenebenen sind.
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Eine weitere Ausführung ist in 10 dargestellt, wobei die beiden Detektorbereiche durch nebeneinander liegende Abschnitte derselben Kamera 35 gebildet sind. Zur Strahlaufteilung des Probenlichts 55 wird ein diffraktives Element 39 genutzt, welches abhängig von der Beugungsordnung verschiedene Brennweiten hat. Indem Probenlicht 55 in verschiedene Beugungsordnungen gebeugt und jeweils mit der Kamera 35 nachgewiesen wird, können auch hier gleichzeitig zwei Probenbilder erzeugt werden. Diese entsprechen wegen der unterschiedlichen Brennweiten der Beugungsordnungen wiederum verschiedenen Probenebenen.
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Werden zwei Probenbilder in einer der in den 7 bis 10 abgebildeten Weise aufgenommen, können aus diesen Bildern Höheninformationen gewonnen werden, ohne dass für jede Probe eine neue Kalibriermessung erforderlich ist. Zum Erhalten von Höheninformationen werden die aufgenommenen Daten der Probenbilder verrechnet. Zu den verschiedenen Lateralbereichen kann jeweils eine Lichtintensität pro Probenbild bestimmt werden. Sodann wird jeweils ein Verhältnis der beiden Lichtintensitäten der zwei Probenbilder zu demselben Lateralbereich bestimmt. Diese Verhältnisse stellen eine monotone Abbildung der Höhe dar. Die Verhältnisse können auch durch das Verhältnis, das zu einem bestimmten Lateralbereich bestimmt worden ist, dividiert werden. In prinzipiell gleicher Weise kann anstelle der Lichtintensität auch zu jedem Lateralbereich eine Schärfe des entsprechenden Bildausschnitts ermittelt und verwendet werden.
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Ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops 100 ist in 11 gezeigt. Dieses umfasst als wesentliche Komponenten eine Lichtquelleneinrichtung 10, optische Abbildungsmittel, welche ein Objektiv 40 umfassen, und eine Detektoreinrichtung 30.
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Bei einer einfachen Gestaltung kann auf die im Folgenden beschriebenen Elemente 13, 14, 15, 16, 20 und 21 verzichtet werden.
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Im dargestellten Beispiel wird von der Lichtquelleneinrichtung 10 ausgesandtes Beleuchtungslicht 11 über optische Elemente 12 zu einem Wellenlängenfilter 13 geleitet. Dieser kann beispielsweise akusto-optisch ausgeführt sein und ermöglicht eine Auswahl, welcher Wellenlängenanteil des Beleuchtungslichts 11 weitergeleitet wird.
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Hierauf gelangt das Beleuchtungslicht 11 zu einem optional vorgesehenen Schaltelement 14, durch welches Beleuchtungslicht 11 wahlweise auf einen von zwei Strahlengängen 15, 16 geleitet wird. Auf den beiden Strahlengängen 15, 16 wird das Beleuchtungslicht 11 über beispielsweise optische Fasern und ein optionales Schaltelement 21, welches auch durch einen teildurchlässigen Spiegel ersetzt sein kann, auf unterschiedliche Seiten einer Beleuchtungsstruktur 20 geführt. Die Beleuchtungsstruktur 20 prägt dem Beleuchtungslicht 11 über dessen Querschnitt eine räumliche Struktur auf. Beispielsweise kann die Beleuchtungsstruktur 20 ein Gitter sein.
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Auf einer Seite ist die Beleuchtungsstruktur 20 verspiegelt, so dass Beleuchtungslicht 11 vom Strahlengang 16 an der Beleuchtungsstruktur 20 zumindest teilweise reflektiert wird, während Beleuchtungslicht 11 vom Strahlengang 15 zumindest teilweise an der Beleuchtungsstruktur 20 transmittiert wird. Dadurch werden beide Anteile des Beleuchtungslichts 11 auf einen gemeinsamen Strahlengang zusammengeführt und sodann zu einem Objektiv 40 geleitet. Mit dem Objektiv 40 wird das Beleuchtungslicht 11 auf eine Höhen- oder Probenebene 51 im Bereich der Probe 50 fokussiert. Die Beleuchtungsstruktur befindet sich vorzugsweise in einer zur Probenebene 51 optisch konjugierten Ebene, so dass sie in die Probenebene 51 scharf abgebildet wird.
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Werden mehrere Probenaufnahmen nacheinander aufgenommen, bei denen die Position der Beleuchtungsstruktur 20 in lateraler Richtung verändert wird, kann unter Umständen auch auf die Elemente 14, 16 und 21 sowie auf die Verspiegelung der Beleuchtungsstruktur verzichtet werden.
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Durch die Beleuchtung der Probe 50 sendet diese Probenlicht 55 aus, welches mit dem Objektiv 40 aufgenommen wird. Zwischen dem Objektiv 40 und der Beleuchtungsstruktur 20 sind Strahlteilungsmittel 25 angeordnet, mit denen das Probenlicht 55 nicht zur Beleuchtungsstruktur 20, sondern zur Detektoreinrichtung 30 geführt wird. Diese kann in einer der in den 7 bis 10 dargestellten Weise gestaltet sein und eine Probenaufnahme erzeugen. Nicht dargestellte elektronische Steuer- und Auswertemittel führen die Auswertung der aufgenommenen Probenbilder durch.
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Es ist möglich, mit einer durchstimmbaren Lichtquelleneinrichtung 10 gemäß dem chromatisch konfokalen Prinzip verschiedene Höhenebenen nacheinander zu untersuchen und jeweils ein Probenbild aufzunehmen.
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Die Probe 50 kann für verschiedene Probenaufnahmen auch in Höhenrichtung verstellt werden.
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In 11 sind an der Probe 50 zwei Höhenebenen 51 und 52 eingezeichnet. Diese können zu den Ebenen 37 und 38 der 7 bis 10 konjugierte Ebenen sein.
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Ein weiteres Ausführungsbeispiel ist in 12 dargestellt. Dieses unterscheidet sich von dem oben beschriebenen insbesondere dadurch, dass eine Beleuchtungsstruktur 20 nicht wie in 11 vor den Strahlteilungsmitteln 25 angeordnet ist, sondern zwischen den Strahlteilungsmitteln 25 und dem Objektiv 40. Die Beleuchtungsstruktur 20 weist Weiterleitungsbereiche zum Weiterleiten von Licht zwischen dem Objektiv 40 und den Strahlteilungsmitteln 25 auf. Die Beleuchtungsstruktur kann lateral bewegt werden, insbesondere gedreht werden, so dass die Position der Weiterleitungsbereiche geändert wird.
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Die Weiterleitungsbereiche oder an einem weiteren Element vorgesehene Lichtleitbereiche sind größer als es der optischen Auflösung an dieser Stelle im Strahlengang entspricht. Das heißt ein Punkt der Probenebene wird auf eine Fläche auf der Beleuchtungsstruktur 27 abgebildet, welche kleiner ist als einer der genannten Bereiche. Dies entspricht einer unvollständigen konfokalen Filterung. Dass nicht nur Probenlicht aus konfokalen Probenbereichen zur Detektoreinrichtung 30 geleitet wird, ist für die Bestimmung von Höheninformationen wichtig, wie auch in den 7 bis 10 gezeigt.
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Optional kann die Beleuchtungsstruktur 20 zum Objektiv 40 hin verspiegelt sein, so dass Probenlicht daran teilweise reflektiert und mit einer zweiten Detektoreinrichtung 30 nachgewiesen werden kann. In diesem Fall steht eine verspiegelte Oberfläche der Beleuchtungsstruktur 20 vorzugsweise nicht senkrecht, sondern geneigt zu einer optischen Achse, entlang welcher Probenlicht 55 auf die Beleuchtungsstruktur 20 gelangt.
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Die Beleuchtungsstruktur 20 kann auch so gestaltet sein, dass je nach Drehposition ein freier Bereich der Beleuchtungsstruktur 20 in den Strahlengang gebracht wird. Dadurch wird das Beleuchtungs- und Probenlicht nicht räumlich gefiltert.
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Eine weitere Ausführungsform ist in 13 dargestellt. Bei dieser befindet sich eine Beleuchtungsstruktur 20 zwischen dem Objektiv 40 und den Strahlteilungsmitteln 25 und bewirkt eine echt konfokale Detektion. Die Beleuchtungsstruktur ist lateral bewegbar und kann beispielsweise durch eine drehbare Nipkow-Scheibe ausgeführt sein.
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Eine feststehende Beleuchtungsstruktur 20 kann verwendet werden, wenn eine Scannereinheit 32 zwischen der Beleuchtungsstruktur 20 und der Probe 50 angeordnet ist.
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In 14 ist eine weitere Ausführungsform dargestellt. Bei dieser ist zusätzlich zwischen den Strahlteilungsmitteln 25 und der Detektoreinrichtung 30 ein optisches Element 33 angeordnet, welches eine Punktabbildungsfunktion bewirkt, bei der eine Form, in welcher ein Lateralbereich der Probe auf die Detektoreinrichtung abgebildet wird, abhängig von der Höhe des jeweiligen Lateralbereichs ist.
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Das optische Element 33 kann ein anamorphotisches optisches Element sein. Dieses bricht ein Strahlbündel in zwei senkrecht zueinander stehenden Richtungen verschieden stark. Ein Beispiel hierfür ist eine Zylinderlinse.
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Alternativ kann das optische Element 33 auch eine sogenannte Phasenplatte sein, welche eine helixförmige Punktabbildungsfunktion bewirkt.
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Die Detektoreinrichtung kann hier auch durch eine einzige Kamera gebildet sein.
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Es ist ebenfalls möglich, ein solches optisches Element 33 statt im Detektionsstrahlengang im Beleuchtungsstrahlengang anzuordnen. Damit ist die Punktabbildungsfunktion, mit welcher ein Punkt einer Lichtquelle auf einen Lateralbereich der Probe abgebildet wird, abhängig von der Höhe des jeweiligen Lateralbereichs.
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Die beschriebenen Beleuchtungsstrukturen 20 der 11 bis 14 können auch mindestens zwei verschiedene Arten von Mikrolinsen umfassen, welche unterschiedliche Brennweiten haben. Mit jeder Art von Mikrolinsen wird die Probe 50 abgetastet und es werden somit mindestens zwei Probenbilder zu verschiedenen Höhenebenen aufgenommen. In diesem Fall kann die Detektoreinrichtung 30 eine einzige Kamera umfassen. Die beiden aufgenommenen Probenbilder entsprechen weitgehend den beiden Probenbildern, die bei den Ausführungen der 7 bis 10 aufgenommen werden.
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Weiterhin ist auch möglich, jeweils eine Beleuchtungsstruktur 20 im Beleuchtungsstrahlengang und im Detektionsstrahlengang vorzusehen, wobei diese beiden Beleuchtungsstrukturen 20 voneinander verschieden sind, etwa in Bezug auf die Größe ihrer Weiterleitungsbereiche für Licht.
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Durch jede der beschriebenen Ausführungsformen können mit einfachen Mitteln präzise Probenaufnahmen erzeugt werden, die jeweils einen Höhenmessbereich abdecken. Die Probenaufnahmen können vorteilhafterweise zusammengeführt werden, ohne dass kostenintensive Positionsmessgeräte oder Stellelemente erforderlich sind.
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Bezugszeichenliste
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- 1, 2, 3
- Response-Funktionen verschiedener Probenpunkte
- 4, 5
- Höhenmessbereiche
- 10
- Lichtquelleneinrichtung
- 11
- Beleuchtungslicht
- 12
- optisches Element
- 13
- Wellenlängenfilter
- 14
- Schaltelement
- 15,
- 16verschiedene Strahlengänge
- 20
- Beleuchtungsstruktur
- 21
- Schaltelement zum Leiten von Beleuchtungslicht auf die Beleuchtungsstruktur
- 25
- Strahlteilungsmittel
- 30
- Detektoreinrichtung
- 32
- Scannereinheit
- 33
- anamorphotisches optisches Element
- 35, 36
- Kameras der Detektoreinrichtung
- 37, 38
- Bildebenen
- 39
- Strahlteilungsmittel, diffraktives Element
- 40
- Objektiv
- 50
- Probe, Probenoberfläche
- 51, 52
- Proben- oder Höhenebenen
- 55
- Probenlicht
- 100
- Lichtmikroskop
