JP2023517677A - 蛍光スペクトル顕微鏡法のための高スループットスナップショットスペクトル符号化デバイス - Google Patents

Abstract

マルチスペクトルまたはハイパースペクトル蛍光イメージングのためのシステムおよび方法が提供される。一例においては、スペクトル符号化デバイスが、顕微鏡の検出用対物レンズとイメージングセンサとの間の検出光路中に配置され得る。一例において、スペクトル符号化デバイスは、サイン透過率プロファイルを有する第一のダイクロイックミラーと、コサイン透過率プロファイルを有する第二のダイクロイックミラーとを含む。透過光を集めることに加え、各ダイクロイックミラーからの反射光が集められ、全強度正規化および画像解析に使用される。TIFF2023517677000008.tif120170

Description

関連出願の相互参照
本出願は、内容が参照により本明細書に組み入れられる、HIGH THROUGHPUT SNAPSHOT SPECTRAL ENCODING DEVICE FOR FLUORESCENCE SPECTRAL MICROSCOPYと題する、2020年3月13日に出願された米国特許出願第62/989,493号への優先権を主張する。

連邦政府資金援助を受けた研究開発に関する声明
本発明は、国防省によって付与された助成金第W81XWH-16-1-0253の下、政府支援を受けた成されたものである。政府は本発明において特定の権益を有する。

分野
本明細書は一般に、スペクトル蛍光イメージングのためのシステムおよび方法に関する。

背景
以下の記載は、本発明を理解する際に役立ち得る情報を含む。本明細書に提供される情報のいずれかが請求項に係る発明への先行技術である、もしくはそれに該当するということ、または具体的もしくは暗示的に引用される任意の刊行物が先行技術であるということを認めるものではない。

スペクトル蛍光イメージングは、分子、細胞および組織におけるシグナル超過密状態を解消することができる。マルチまたはハイパースペクトルイメージングによるマルチカラー取得がレーザスキャンまたは広視野構成において存在する。標準的な構成において必要な空間またはスペクトルスキャン機構はイメージング速度および効率を制限する。時間分解能を改善するために、広視野顕微鏡のためのスナップショット法が開発された。しかし、低い光スループットが、依然、マルチカラー蛍光顕微鏡法の未解決の課題として残る。

概要
スペクトル蛍光イメージング（SFI）は、その多重化能力のため、ライフサイエンス分野において人気を博している。この手法においては、画像中の各ピクセルの取得次元がスペクトルドメインへと拡張される。このタイプの検出は、分散格子と検出器アレイとの組み合わせにより、シングルポイントスキャン型顕微鏡として実現され得る。しかし、一般に、ポイントスキャン型検出法は、低い光効率、低いイメージング速度および高い光毒性の欠点を抱えて、感光性試料の多重化ライブイメージングへの応用を困難にする。

蛍光スナップショットイメージングのための他の手法として、選択的平面照明顕微鏡法（SPIM）がある。SPIMは、直交方向に配置された複数の対物レンズを利用して励起経路と検出経路とを切り離して、フルオロフォアの不要な励起、光退色および毒性を減らす薄い光シートを生成する。より高いイメージング効率は、大きな試料を高い分解能で長期間、ボリュメトリックイメージングする能力の改善につながる。しかし、スナップショットライブ顕微鏡法において蛍光シグナルを多重化する能力は、2Dカメラセンサ上で3Dスペクトルデータセット（x、y、波長）を取得する複雑さのせいで制限されている。大部分のSPIMシステムは、帯域フィルタを用いて複数の蛍光シグナルまたは光学的切片を順次に取得する。シーケンシャルイメージングは、追加の色ごとに取得時間および光線量が増すため、時間分解能を制限し、光毒性を増す。

いくつかの手法においては、画像マッピングスペクトル法（IMS）とSPIMの併用が、単一のスナップショットを利用してスペクトルデータセットを捕捉して、時間分解能の難題を解決するが、それでもなお、光スループット効率においては妥協がある。効率の低下は、特徴的に低強度の蛍光シグナルと合わさって、蛍光顕微鏡法におけるスナップショット手法の普及を制限している。

スペクトルフェーザ解析をマルチまたはハイパースペクトル蛍光データセットの処理に使用し得る。スペクトルフェーザは、サインおよびコサインフーリエ変換を使用して、高次元スペクトル情報を2Dフェーザ平面に変換して、高次元多重化の複雑さを効果的に簡素化する。次元削減はまた、ノイズ低減を促進する。

スペクトルフェーザ解析のための1つの例示的な手法が、Grattonらによる米国特許出願第2020/0378830号に示されている。その中で、画像は、2つのサイン／コサインカラーフィルタを使用して順次に取得される。フェーザ解析によるシグナル多重化が、取得されたデータに適用される。

本明細書の発明者らは、フィルタを用いる上述のスキャン手法に伴う数多くの欠点を特定した。一例として、シーケンシャルメカニカルフィルタ切り替えは複数回の露光が必要であり、イメージング速度および時間分解能が制限される。さらに、イメージング速度は、ビデオ高速イメージング用途、たとえばゼブラフィッシュ胚心拍のマルチカラーイメージングの場合または大きなタイル表示されたボリュメトリックイメージング、たとえば組織の単一細胞解像度切片の場合には困難である。さらに、正弦波透過フィルタの使用は、吸収による蛍光シグナル損失を招く。結果として、シグナル多重化に有用であり、高速または低SNR条件で有益であり得る有意な量の情報が失われる。

上記で特定した欠点のいくつかは、第一のダイクロイックミラーと、第二ダイクロイックミラーとを含み、第一のダイクロイックミラーの第一のスペクトル透過率曲線および第一のスペクトル反射率曲線がサイン波プロファイルを有し、第二のダイクロイックミラーの第二のスペクトル透過率曲線および第二のスペクトル反射率曲線がコサイン波プロファイルを有する、イメージングアセンブリによって少なくとも部分的に対処され得る。第一のダイクロイックミラーおよび第二のダイクロイックミラーを利用することにより、スペクトル符号化が取得プロセスと統合され、さらに、ダイクロイックミラーが、透過光と反射光との同時収集を可能にし、それが、フィルタベースの手法ならば失われる、多重化に利用され得るスペクトル情報を提供する。

一例として、2つの正弦波ダイクロイックミラーを含むスペクトル符号化デバイスが符号化デバイスとして利用される。スペクトル符号化デバイスは、単一露光取得で複数のスペクトル符号化されたチャネルを単一のカメラセンサ上に投影する。例えば、各ダイクロイックミラーが、試料からの蛍光シグナルの一部分を透過させ、したがって、スペクトル符号化された透過チャネルを生成する。蛍光シグナルの残りの部分は反射され、これもまた、スペクトル符号化デバイスによって捕捉され、したがって、各ダイクロイックミラーは、スペクトル符号化された反射チャネルをも生成する。したがって、2つのダイクロイックミラーが使用されると、4つのチャネルが生成され、捕捉される。

ダイクロイックミラーは、スペクトル情報を光学的にサインおよびコサインフーリエ係数に変換する。反射されたアンチサインおよびアンチコサイン部分もまた、再利用され、検出され、フェーザ成分（たとえばサインおよびコサイン強度画像）の強度正規化係数として使用される。この手法は、光スループットを増し（たとえば、一般的に利用可能な5つのフルオロフォアの場合、80％超の増加）、それにより、検出効率および時間分解能を高め、光毒性を低下させる。さらに、フィルタの機械的切り替えが不要であり、すべてのスペクトル情報が透過部分および反射部分によって同時に捕捉され、それが、時間分解能を大きく改善し、それにより、細胞動態を捕捉するためのインビボイメージング中、フレーム多重化を容易にする。

本明細書の上記利点および他の利点ならびに特徴は、以下の「詳細な説明」を単独で、または添付図面と併せて読むことにより、容易に明らかになるであろう。上記概要は、詳細な説明においてさらに説明される概念の選択を簡略化形態で導入するために提供されたものであることが理解されるべきである。詳細な説明に続く特許請求の範囲によってのみその範囲が画定される請求項に係る主題の主要または不可欠な特徴を特定することを意図したものではない。さらに、請求項に係る主題は、上記または本開示の任意の部分に記された任意の欠点を解消する実施形態に限定されない。

本明細書に組み入れられ、その一部を構成する添付図面は、本発明の態様を例示し、詳細な説明とともに、本発明の原理を説明し、例示するのに役立つ。図面は、例示的な態様の主要な特徴を図式に示すことを意図したものである。図面は、実際の態様のあらゆる特徴または描写された要素の相対的寸法を描写することを意図したものではなく、一定の拡大縮小率に描かれてはいない。

本開示の態様による、スペクトル符号化デバイスを含む顕微鏡の例示的な概観を示す。 本開示の態様による、図1のスペクトル符号化デバイスの一部分の概略図を示す。 本開示の態様による、スペクトル符号化デバイスの光学部品の概略図を示す。 本開示の態様による、図2Aのスペクトル符号化デバイスの簡略化された光学部品の概略図を示す。 図2Cおよび2Dは、本開示の態様による、スペクトル符号化デバイス中に実現されたサインダイクロイックミラーおよびコサインダイクロイックミラーの透過率曲線および反射率曲線の例示的なグラフを示す。 図2Cの説明を参照のこと。 正弦波フィルタの透過効率と比べた、ダイクロイックミラーを含むスペクトル符号化デバイスの全体透過効率を示す。 図3A、3B、3Cは、本開示の態様による、スペクトル符号化デバイスの例示的な広視野、光シートおよび共焦点顕微鏡法実施形態を示す。 図3Aの説明を参照のこと。 図3Aの説明を参照のこと。 本開示の態様による、スペクトル符号化デバイスを使用するイメージングのための例示的な画像取得、画像前処理および分析パイプラインの高レベルブロック図を示す。 本開示の態様による、画像前処理中の例示的な画像を示す。 図6Aおよび6Bは、それぞれ、本開示の態様による、例示的なフェーザプロットおよび結果として得られたアンミキシングされた画像を示す。 本開示の態様による、スペクトル符号化デバイスを利用してマルチスペクトルまたはハイパースペクトル画像を取得し、生成する例示的な方法を示す高レベルフローチャートを示す。 本開示の態様による、スペクトル符号化デバイスを利用する、例示的なタイル表示されたボリュメトリックインビボイメージング出力を示す。 本開示の態様による、スペクトル符号化デバイスを利用する動的インビボイメージング中に取得された例示的な画像を示す。 本開示の態様による、生きたゼブラフィッシュ心臓の動的インビボイメージング中に取得された例示的な画像を示す。

図中、理解しやすさおよび便宜のために、同じ符番および任意の頭字語は、同じまたは類似の構造または機能を有する要素または行為を特定する。任意の特定の要素または行為の説明を容易に特定するために、符番中の最上位の数字は、その要素が最初に導入された図の番号を指す。

詳細な説明
本明細書中で引用されるすべての参考文献は、全部が記載されているかのごとくに全体として参照により本明細書に組み入れられる。別段の定義がない限り、本明細書中で使用される科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3^rd ed., Revised, J. Wiley & Sons（New York, NY 2006）およびSambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4^th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press（Cold Spring Harbor, NY 2012）が、本出願中で使用される用語の多くへの一般的なガイドを当業者に提供する。

当業者は、本発明の実施に使用することができるであろう、本明細書に記載されたものに類似する、または等しい多くの方法および材料を認識するであろう。実際、本発明は、記載される方法および材料に決して限定されない。

いくつかの態様において、本発明の特定の態様を説明し、特許請求するために使用される、寸法、形状、相対位置などの性質は、「約」という語によって修飾されるものと理解されるべきである。本明細書中で使用される「約」という語は、参照される数値表記と関連して使用されるとき、本明細書中で別段の規定がない限り、参照される数値表記の±5％までを意味する。たとえば、「約50％」という文言は45％～55％の範囲を包含する。様々な態様において、「約」という語は、参照される数値表記と関連して使用されるとき、特許請求の範囲において具体的に規定されるならば、参照される数値表記の±4％、3％、2％または1％までを意味することができる。

次に、本発明の様々な例を説明する。以下の詳細な説明は、これらの例の徹底した理解および実施を可能にする説明のための具体的な詳細を提供する。しかし、当業者は、本発明がこれらの詳細の多くなしででも実施され得ることを理解するであろう。同様に、当業者はまた、本発明が、本明細書中で詳細には記載されない他の多くの明白な特徴を含むことができることを理解するであろう。加えて、関連する説明を不必要にわかりにくくすることを避けるために、以下、いくつかの周知の構造または機能が詳細には示されず、説明されない場合もある。

以下に使用される用語は、本発明の特定の具体例の詳細な説明と関連して使用されるが、最も広い妥当な意味で解釈されるべきである。実際、特定の用語が以下で強調される場合もある。しかし、任意の制限された意味に解釈されることを意図した任意の用語は、この「詳細な説明」部分ではそのようなものとして明白かつ具体的に定義される。

概観
本明細書は、マルチスペクトルおよび／またはハイパースペクトル蛍光イメージングのためのシステムおよび方法に関する。特に、本明細書は、高い光スループットを達成し、生物学的試料からの蛍光シグナルをサインおよびコサインフーリエ係数へと光学的に符号化するために使用されるスペクトル符号化デバイスに関する。一例において、スペクトル符号化デバイスは、サインダイクロイックミラーおよびコサインダイクロイックミラーを含み、各ミラーが、符号化された透過光チャネルおよび符号化された反射光チャネルを生成する。2つのダイクロイックミラーからの4つのチャネルすべてが強度正規化のために使用され、それが光スループットを大きく改善する。さらに、ダイクロイックミラーは高い透過率を有し、それが信号対雑音比を改善する。スペクトル符号化デバイスは、任意の顕微鏡システムと統合されてもよいし、インタフェースされてもよい。スペクトル符号化デバイスが統合され得る顕微鏡システムの非限定的な例が図1Aに示されている。スペクトル符号化デバイスの概略図が図1Bに示されている。さらに、スペクトル符号化デバイスの例示的な光学部品および配設が図2Aおよび2Bに示されている。スペクトル符号化デバイスに含まれるサインダイクロイックミラーおよびコサインダイクロイックミラーの例示的な透過率および反射率プロファイルがそれぞれ図2Cおよび2Dに示されている。図2Eは、公知のフルオロフォアの場合にスペクトル符号化デバイスで達成される高い光スループット効率を示す。図3A～3Cは、様々な顕微鏡システムとのスペクトル符号化デバイスの例示的な実施形態を示す。図4Aおよび4Bは、スペクトル符号化デバイスを含む顕微鏡システムによるイメージング中の高レベル画像取得、画像前処理および画像解析パイプラインを概略的かつ例示的に示す。図5は、画像前処理中の例示的な画像を示す。図6Aおよび6Bは、前処理後の例示的なフェーザプロットおよびアンミキシングされた画像を示す。図7は、スペクトル符号化デバイスによってマルチスペクトルまたはハイパースペクトル画像を取得し、生成するための高レベル法を示す。図8、9および10は、様々なインビボイメージング中にスペクトル符号化デバイスを介して取得された例示的な画像を示す。

スペクトル符号化のためのサインダイクロイックミラーおよびコサインダイクロイックミラーを含むイメージングアセンブリの技術的利点としては、増大した光スループットおよび高分解能スペクトル情報の符号化がある。さらなる技術的利点としては、機械的切り替えが要らず、スペクトル情報が同時に捕捉されるゆえの、短い取得時間による改善された時間および空間分解能がある。さらに、スペクトル符号化によるイメージングは、マルチカラースペクトル画像を生成するために単一のスナップショット取得しか必要としない。さらなる技術的利点としては、非限定的に、既存のリサーチイメージングデバイスとの容易な統合、既存の医療用画像診断デバイスとの容易な統合、独立したイメージングデバイス（広視野）にするための容易な改変、光学的に処理されたスペクトルデータ出力および後処理手順の簡素化がある。総合すると、1つまたは複数のダイクロイックミラーを有するスペクトル符号化デバイスのための本明細書に記載されるシステムおよび方法は、マルチスペクトルまたはハイパースペクトル顕微鏡法において有意な改善を提供する。

例示的な顕微鏡システム
図1は、生物学的試料134（以下、試料134または標本と呼ぶ）の光学イメージングに使用される光シート顕微鏡100の例示的な構成の高レベルブロック図を示す。光シート顕微鏡100は、蛍光シグナルからのスペクトル情報を符号化するためにスペクトル符号化デバイス（本明細書中、代替的にスペクトル取得デバイスとも呼ばれる）が統合され得る、またはインタフェースし得る例示的な顕微鏡システムとして示されている。本開示の範囲を逸脱することなく、スペクトル符号化デバイスは、任意の光学イメージングシステムおよびその関連するイメージングセンサとともに利用されるように適合されてもよいことが理解されよう。たとえば、スペクトル符号化システムは、任意の広視野顕微鏡、共焦点顕微鏡および／または様々なタイプの光シート顕微鏡システムとともに利用されてもよい。

顕微鏡100は、試料を互いに反対の方向から照らすための第一の照明システム110および第二の照明システム112を含むデュアル照明システムを含む。特に、試料134は、第一の照明システム110からの第一の光シート114および第二の照明システム112からの第二の光シート116が試料を透過して、試料134の切片またはスライス（網掛けによって示す）を照らすよう、各側101および102から照らされる。たとえば、切片は、z軸沿いの薄い切片（たとえば幅5～6μm）であり得る。さらに、第一の励起光シート114および第二の励起光シート116は、光シート114と116との間に空間的および時間的オーバーラップが存在するように標本134を照らし得る。たとえば、第一の光シートおよび第二の光シートは、同じ照明面（すなわち、光シートによって照らされる平面）を同時に同じ持続時間だけ照らし得る。本明細書中で使用される光シートとは、試料の平面を透過し、それによって試料の平面を照らすような、照明システムによって生成される光のシートを指す。光シートは、試料を光学的にスライスするために使用される。

第一および第二の照明システム112および114それぞれは、対応する光シート114および116を形成するために使用される光を生成するための光源113および117をそれぞれ含み得る。光源は、少なくとも、光シート顕微鏡法のために提供される励起のタイプ、たとえば線形励起または非線形励起に基づき得る。線形励起が利用される場合、シグナル強度は励起光強度に比例する。線形励起の例示的な実施形態としては、1光子励起蛍光、弾性光散乱および非弾性光散乱（たとえばラマンまたはブリルアン）がある。非線形励起が実現される場合、シグナル強度は励起光強度の二乗（または三乗）に比例し、試料は2つ（または3つ）の光子とほぼ同時に相互作用する。非線形励起の例示的な実施形態としては、2光子励起蛍光、第二高調波発生、3光子励起蛍光および他の高次過程がある。励起光シートは、簡単なシリンドリカルレンズによって生成されてもよいし、低NA対物レンズを介して生成されたガウシアンビームをガルバノメータまたはレゾナントスキャナでスキャンすることによって生成されてもよい。

一例において、光源113および117それぞれは、狭帯域励起波長（たとえば405nm、488nm、561nm、635nm、960nmなど）を発するレーザ光源であり得る。いくつかの例において、狭帯域励起波長は発光ダイオード（LED）によって生成され得る。もう1つの例において、光源113および117は、広域スペクトル光波長を生成する広帯域光源（たとえば白熱光源、アーク光源、広帯域LEDなど）であってもよい。さらに別の例において、励起波長の1つまたは複数の部分が可視範囲の外であってもよい。一例において、各光源113および117は、同じ励起光波長を発する同じタイプの光源であってもよい（たとえば、各光源が、488nmなどの所望の励起波長を発するレーザ光源である場合）。もう1つの例において、各光源113および117は、同じタイプの光源であるが、異なる励起光波長を発してもよい（たとえば、各光源がレーザ光源であるが、488nmと560nmなどの異なる波長を発する場合）。さらに別の例において、光源113と117は異なってもよい（たとえばレーザとLED）。

各照明システム110および112はさらに、対応する光シート114および116を生成するための照明光学系115および119を含む。一例において、光シート114および／または116は静的に形成され得る。したがって、照明システムは、1つまたは複数のシリンドリカルレンズ（図示せず）と、光シートを試料134内の照明面上に集束させるための低開口数照明用対物レンズ（図示せず）とを含み得る。もう1つの例において、光シート114および／または116は、集束した照明ビームを照明面に沿って高速スキャンすることによって形成され得る。したがって、照明光学系115および／または119は、1つまたは複数の光シートを生成するための1つまたは複数のガルバノメータミラー（図示せず）を含み得る。さらに、いくつかの例において、照明光学系115および／または119は、照明面で所望のビームプロファイルを生成するための1つまたは複数のビーム成形光学系、たとえば空間光変調器（SLM）、レンズ、ミラーおよび／または回折格子を含み得る。

図1は2つの照明システムを示すが、いくつかの例においては、単一の照明システムが利用されてもよい。いくつかの例において、照明システム110および／または112は、多方向照明のために、互いからわずかに回転した複数の光シートを生成するように構成されてもよい。

光シート顕微鏡100は、標本134を取り付けるための試料ホルダ132を含むステージ130を含む。ステージ130は、z軸に沿って移動可能な電動ステージであり得る。ステージ130は、標本134内で光シート114および116の位置を調節するために、標本134をz軸に沿って動かすために使用され得る。ステージ130の動きはコントローラ140によって調節され得る。たとえば、コントローラ140は、ステージをz軸に沿って動かすための作動シグナルをステージ130に提供し得る。

光シート顕微鏡100は、標本134からの蛍光シグナルを受け取るためのイメージング用対物レンズ115を含む。イメージング用対物レンズ115は、照明システム110および112のそれぞれの光軸に対して実質的に垂直な光軸を有する。本明細書中で使用される実質的に垂直は、照明システムに対して検出システムを配設する際の誤差および／または製造誤差を考慮し得る。さらに、本明細書中で使用される蛍光シグナルは、標本中の1つまたは複数のフルオロフォアの励起から生じる、標本、たとえば標本134からの放出シグナルである。たとえば、標本134は、光源、すなわち、この例においては光シート114および116によって励起されたとき放出波長に対応する蛍光を発する1つまたは複数の蛍光標識（たとえば、蛍光標識試薬、たとえばAlexa-488、FITCなど、蛍光タンパク質、たとえば緑色標識の場合のGFP、赤色標識の場合のmCherryなどを介する蛍光標識）を含み得る。いくつかの例において、検出システムは、光シート114および116による励起に応答して特定の波長の光を発する、標本134内の天然タンパク質および／または分子を検出し得る。例示的な蛍光標識試薬としては、非限定的に、ヒドロキシクマリン、スクシンイミジルエステル、アミノクマリン、メトキシクマリン、カスケードブルー、ヒドラジド、パシフィックブルー、マレイミド、パシフィックオレンジ、ルシファーイエロー、NBD、NBD-X、R-フィコエリトリン（PE）、PE-Cy5コンジュゲート（Cychrome、R670、Tri-Color、Quantum Red）、PE-Cy7コンジュゲート、Red 613、PE-テキサスレッド、PerCP、ペリジニンクロロフィルタンパク質、TruRed（PerCP-Cy5.5コンジュゲート）、FluorX、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、BODIPY-FL、TRITC、X-ローダミン（XRITC）、リサミンローダミンB、テキサスレッド、アロフィコシアニン（APC）、APC-Cy7コンジュゲート、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5またはCy7がある。

光シート顕微鏡100はさらに、スペクトル符号化デバイス122およびイメージングセンサ150を含む検出システム120を含む。イメージング用対物レンズ115によって捕捉された標本134からの蛍光シグナルは、スペクトル符号化デバイス122を介してイメージングセンサ150に送られる。特に、蛍光シグナルはスペクトル符号化デバイス122によって符号化され、符号化された蛍光シグナル（符号化された放出シグナルとも呼ばれる）はイメージングセンサ150によって捕捉される。一例において、イメージングセンサ150はサイエンティフィック相補型金属酸化膜半導体センサ（sCMOSセンサ）である。他の例において、用途に依存して、イメージングセンサは、電荷結合素子（CCD）または電子増倍型電荷結合素子（EMCCD）または光電子増倍管（PMT）であってもよい。さらに、一例において、検出システム120からの蛍光シグナルは単一のイメージングセンサによって捕捉される。いくつかの例においては、スペクトル符号化デバイス122の1つまたは複数のチャネルから同時に符号化放出シグナルを捕捉するために、1つよりも多いイメージングセンサが使用されてもよい。スペクトル符号化デバイス122の詳細は、以下、図1B、2A～2Eおよび図3A～3Cに関してさらに説明される。

イメージングセンサ250はコントローラ140に通信可能に結合され得（たとえば、有線および／または無線接続を介して）、イメージングセンサ250からの画像データが、コントローラ140を介して処理され、コントローラ140に通信可能に結合されたユーザインタフェース160のディスプレイ部分162を介してリアルタイムまたはほぼリアルタイムで表示され得る。

コントローラ140は、少なくとも1つのプロセッサ（CPU）144と、プロセッサに機能的に結合され得るコンピュータ可読媒体を含む、リードオンリーメモリROM146および／またはランダムアクセスメモリRAM142などのメモリとを含み得る。したがって、ROM146およびRAM142の1つまたは複数は、プロセッサによって実行されると本明細書に記載される動作の1つまたは複数、たとえば、後続の図面のプロセスフローを実行する、システム命令を含み得る。プロセッサ144は、様々な感覚部品から1つまたは複数の入力シグナルを受け取ることができ、1つまたは複数の制御シグナルを、入出力（I/O）インタフェース148を介して、本明細書に記載される様々な制御部品に出力することができる。いくつかの例において、コントローラ144の様々な構成部品の1つまたは複数はデータバスを介して通信することができる。本例はコントローラ140の例示的な構成を示すが、コントローラ140は他の構成で実現されてもよいことが理解されよう。

コントローラ140は、顕微鏡100内のすべての光学機械部品の同期化制御を提供し得る。たとえば、コントローラ140は、標本134上で光シートと対物レンズとの間の光学的整列を速やかに実行し、検出システム120内の複数の検出器（またはカメラ）による同時画像取得を可能にし得る。

コントローラ140は、ROM146およびRAM142などの非一時的メモリに記憶された命令にしたがって画像前処理を実行し得る。たとえば、コントローラ140は、イメージングセンサ150を介して取得された生画像に対して画像位置合わせおよびスティッチングの1つまたは複数を実行し得る。さらに、コントローラ140は、前処理された画像に対して画像解析を実行し得る。たとえば、画像解析は、他の画像解析法の中でも、ハイパースペクトルフェーザ解析プロトコルおよび線形アンミキシングプロトコルの1つまたは複数にしたがって実行され得る。画像前処理および画像解析の詳細は、以下、図4A、4B、5、6および7でさらに説明される。

スペクトル符号化デバイス122は、光シート顕微鏡100のイメージング用対物レンズ115とイメージングセンサ150との間の検出光路中に配置され得る。本例は光シート顕微鏡を示すが、検出システム120は、広視野顕微鏡、共焦点顕微鏡などの任意の顕微鏡システムのイメージング用対物レンズと1つまたは複数のイメージングセンサとの間の検出光路中に配置されてもよい。

スペクトル符号化デバイス122は、1つまたは複数の符号化された光チャネルを生成するための符号化光学系128を含む。特に、符号化デバイス122は、スペクトル符号化された光を出力するように構成されている1つまたは複数のダイクロイックミラーを含み得、スペクトル符号化された光はその後イメージングセンサ150によって収集される。特に、1つまたは複数のダイクロイックミラーそれぞれからの透過光および反射光がイメージングセンサ150によって収集される。スペクトル符号化デバイス122の詳細は以下さらに説明される。符号化光学系128はさらに、1つまたは複数のダイクロイックミラーからの各光チャネルをイメージングセンサ150上のそれぞれの部分に経路制御、集束および／または角度調節するための1つまたは複数のルーティングミラー、1つまたは複数のチューブレンズおよび／または1つまたは複数のジンバルミラーを含み得る。

スペクトル符号化デバイス122はさらに、1つまたは複数のプレフィルタリング光学系124および1つまたは複数のリレー光学系126を含む。1つまたは複数のプレフィルタリング光学系124は、対物レンズ115からの蛍光放出シグナルから範囲外シグナルをフィルタリングするための1つまたは複数のロングパスフィルタおよびショートパスフィルタを含み、範囲外シグナルは、1つまたは複数のダイクロイックミラーのスペクトル範囲の外であるシグナルを含む。たとえば、1つまたは複数のプレフィルタリング光学系は、1、2、3、4またはより多くのロングパスフィルタおよび／または1、2、3、4またはより多くのショートパスフィルタであり得る。一例において、スペクトル範囲は、光の可視スペクトルの波長を含む。さらに、1つまたは複数のプレフィルタリング光学系124は、照明光源から1つまたは複数の励起波長をフィルタリング除去するための1つまたは複数の帯域フィルタを含み得る。たとえば、帯域フィルタの数は励起波長の数に基づき得る。すなわち、励起波長の数が増すとともに、帯域フィルタの数も増す。

1つまたは複数のリレー光学系126は、1つまたは複数のレンズと、イメージングセンサ150の視野を調節するための、絞りによって調節可能な視野絞りとを含む。スペクトル符号化デバイス122の詳細は、以下、図1B、2A～2Cおよび3A～3Cに関してさらに説明される。

スペクトル符号化デバイス
図1Bは、スペクトル符号化デバイス122およびイメージングセンサ150のリレー光学系126および符号化光学系128部分を含む検出システム120の一部分の概略図を示す。リレー光学系126は、第一のリレーレンズハウジング162内に配置された第一のリレーレンズと、第二のリレーレンズハウジング166内に配置された第二のリレーレンズ166とを含む。視野絞りが第一および第二のリレーレンズ対の中間画像面164に配置されている。さらに、中間画像面164は、第一のリレーレンズの背面焦点距離163および第二のリレーレンズの背面焦点距離165にある平面である。

リレー光学系126よりも下流に、試料からリレー光学系126への対物レンズへの光路の方向に符号化光学系128が配置されている。符号化光学系128は、ルーフミラーキューブ176内に配置された1つまたは複数のルーティングミラーと、ビームスプリッタキューブ170内に配置されたビームスプリッタと、サインダイクロイックミラーキューブ174内に配置されたサインダイクロイックミラーと、コサインダイクロイックミラーキューブ172内に配置されたコサインダイクロイックミラーとを含む。様々な態様において、サインおよびコサインダイクロイックミラーそれぞれは、キューブ形状の1つの次元に沿って1～100mm、たとえば1～10mm、10～20、20～30、30～40、40～50または50mm以上である。

ビームスプリッタは、対物レンズ（たとえば対物レンズ115）からの蛍光シグナルを等分割し、蛍光シグナルをサインダイクロイックミラーおよびコサインダイクロイックミラーに向けて送る（いくつかの例においては、少なくとも1つのルーティングミラーがビームスプリッタからのシグナルを適切なダイクロイックミラーに向けて送り得る）。サインおよびコサインダイクロイックミラーはそれぞれ、受け取った蛍光シグナルの一部分を透過させ、受け取った蛍光シグナルの残り部分を反射する。サインおよびコサインダイクロイックミラーそれぞれからの透過および反射シグナルは収集され、画像取得および処理のために利用される。このように、失われる情報の量が大きく最小化される（約1％の損失）。結果として、信号対雑音比（SNR）が大きく改善する。サインおよびコサインミラーの場合の例示的な透過率および反射率曲線が図2Cに示されている。サインダイクロイックミラーは正弦波透過率および反射率曲線を有し、それにより、サイン符号化された透過光チャネルおよびサイン符号化された反射光チャネルを生成する。同様に、コサインダイクロイックミラーはコサイン透過率および反射率曲線を有し、それにより、対応するコサイン符号化された透過光チャネルおよびコサイン符号化された反射光チャネルを生成する。換言するならば、第一のダイクロイックミラーは第一のスペクトル符号化された透過光部分および第一のスペクトル符号化された反射光部分を生成し；第二のダイクロイックミラーは第二のスペクトル符号化された透過光部分および第二のスペクトル符号化された反射光部分を生成する。さらに、サインおよびコサインダイクロイックミラーそれぞれの透過効率および反射効率は高い（たとえば、80％よりも高い）。結果として、4つのチャネルそれぞれから受け取るシグナル強度の量は高く、それが信号対雑音比を大きく改善する。さらに、サインおよびコサインダイクロイックミラーそれぞれからの反射光部分は、強度を正規化するために利用され（以下さらに説明するように）、それがSNRをさらに改善する。

サインおよびコサインミラーはいっしょになって4つの光チャネル（2つの透過光部分および2つの反射光部分）を生成し、それらが、イメージングセンサ150の異なる部分または異なるイメージングセンサで検出される。一例においては、ジンバルミラー180および182が、4つのチャネルそれぞれからの透過光および反射光を、チューブレンズハウジング184中に配置されたそれぞれのチューブレンズに向けて送る。その後、4つのチャネルそれぞれがイメージングセンサのそれぞれの四半分によって検出される。蛍光シグナル光路を示すスペクトル符号化デバイスの例示的な光学配置は図2Aでさらに詳述される。

図2Aを見ると、同図は、スペクトル符号化デバイス222の例示的な光学配置を示す概略図を示す。スペクトル符号化デバイス222は、図1Aおよび1Bに関して説明されたスペクトル符号化デバイス122の例であり得る。したがって、スペクトル符号化デバイス122は、顕微鏡、たとえば顕微鏡100に結合可能であり、顕微鏡のイメージング用対物レンズとイメージングセンサ250との間の顕微鏡の無限遠空間内に配置される。イメージングセンサ250は、図1Aおよび1Bで説明されたイメージングセンサ150の例であり得る。

スペクトル符号化デバイス222は1つまたは複数のプレフィルタリング光学系202を含む。プレフィルタリング光学系202は、図1Aで説明したプレフィルタリング124の例であり得る。1つまたは複数のプレフィルタリング光学系202は、ロングパスフィルタ、ショートパスフィルタおよび1つまたは複数のノッチフィルタの1つまたは複数を含む。ロングパスおよびショートパスフィルタは、スペクトル符号化デバイス222に利用されるダイクロイックミラーのスペクトル範囲の外にあるシグナルをフィルタリング除去するように構成され得る。非限定的な例として、可視スペクトル（たとえば400nm～700nm）中にスペクトル範囲を有するダイクロイックミラーのセットの場合、ダイクロイックミラーのセットのスペクトル範囲の外の光子を除去するために、380nmロングパスフィルタおよび715nmショートパスフィルタが利用され得る。さらに、1つまたは複数のノッチフィルタは、1つまたは複数の励起光源の励起波長を有する光をフィルタリング除去するように構成され得る。非限定的な例として、488nm、561nmおよび／または640nmを中心とする励起レーザ光を除去するためにノッチフィルタのセットが利用されてもよい。

図示するように、イメージング用対物レンズからの放出光（すなわち、蛍光シグナルまたは単に蛍光）（入力として示す）が、プレフィルタリング光学系202を透過し、一対のリレーレンズ204および208ならびに視野絞り206からなるリレー光学系部分を透過する。1つの非限定的な例において、リレー光学系は、第一および第二の50mm径のリレーレンズならびに視野絞りを有するケプラーテレスコープとして構成され得る。リレーレンズ204は、視野絞り206において中間画像面を生成する。一例において、視野絞りはリング作動アイリス絞りであり得る。絞りは、オーバーラップなしでイメージングセンサ250上に形成される最終的な画像を最大化するサイズに調節され得る。次いで、リレーレンズ208は光を無限遠空間に再びコリメートする。

無限遠空間中に配置されたスペクトル符号化デバイス222の符号化光学系部分はリレー光学系部分からの光線を受け取る。特に、リレーレンズ208からの蛍光はビームスプリッタ（BS）210に入射する。1つの非限定的な例において、ビームスプリッタ210は、蛍光放出光を2つの直交経路（一方の経路はサインダイクロイックミラーDMs220に向けられ、もう一方の経路はコサインダイクロイックミラーDMc221に向けられている）へと等分割する50/50ビームスプリッタであり得る。サインおよびコサインダイクロイックミラー220および221は、3つのルーティングミラー（RM）RM211、RM213およびRM215とともに、4つのスペクトル符号化され相関された光路を生成する。

4つのスペクトル符号化された光路は、サインダイクロイックミラー（DM）DMs220からの透過光を含むサイン符号化された透過光経路と、サインダイクロイックミラーDMs220からの反射光を含むサイン符号化された反射光経路と、コサインダイクロイックミラーDMc221からの透過光を含むコサイン符号化された透過光経路と、コサインダイクロイックミラーDMc221からの反射光を含むコサイン符号化された反射光経路とを含み得る。透過光経路は実線の矢じりによって示され、反射光経路は破線の矢じりによって示されている。さらに、チャネル画像をイメージングセンサ250の正しい四半分に形成することができるよう、イメージングセンサ250に対して各チャネルからの入射光の角度を調節するために、チューブレンズ（TL）TL231、233、235および237の前にジンバルミラー（GM）GM229、GM223、GM225およびGM227が使用されている。図示するように、スペクトル符号化デバイス222を生成する4つのチャネルの場合、イメージングセンサ250は、4つの四半分、すなわち、サインダイクロイックミラーDMs220からの透過光を受け取るSIN四半分240、コサインダイクロイックミラーDMc221からの透過光を受け取るCOS四半分242、サインダイクロイックミラーDMs220からの反射光を受け取るA-SIN四半分246およびコサインダイクロイックミラーDMc221からの反射光を受け取るA-COS四半分248に分割され得る。このように、各四半分は、ダイクロイックミラーから透過または反射した符号化された光部分を受け取る。したがって、1つまたは複数のダイクロイックミラーを含み、N個のチャネルを生成する（各ダイクロイックミラーが符号化された透過光チャネルおよび符号化された反射光チャネルを生成する）スペクトル符号化デバイスの場合、イメージングセンサは、それぞれが対応するチャネルからの符号化された光を受け取るN個の非オーバーラップ部分に分割され得る。あるいはまた、N個のチャネルをイメージングするためにN個のイメージングセンサが使用されてもよい。いずれにしても、ダイクロイックミラーからの光を集束させ、Nチャネル最終画像をイメージングセンサ上に形成するためにN個のチューブレンズが使用され得る。いくつかの例において、各チューブレンズの焦点距離は同じであり得る。1つの非限定的な例において、チューブレンズの焦点距離は175mmであり得る。様々な態様において、各チューブレンズは、1～250mm、たとえば1～25、25～50、5～75、75～100および100～250mmの焦点距離を有し得る。さらに、4つのチャネルすべてで同じ倍率を達成するために、チューブレンズは同じ焦点距離を有してもよい。したがって、図2Aに示す例において、チューブレンズTL231、233、235および237はそれぞれ同じ焦点距離を有し得る。

次に、図2Bは、スペクトル符号化デバイス222の光学アセンブリの簡略図を示す。類似の構成部品は類似の符番を付され、類似の符番を付された部品の説明は、簡潔さのため、繰り返さない。

図2Bに示すように、光学アセンブリ260は、焦点距離f1を有する、顕微鏡のイメージング用対物レンズ266（すなわち、検出用対物レンズ）を含む。光学アセンブリはさらに、プレフィルタリング光学系202と、焦点距離f2を有する第一のリレーレンズ204と、視野絞り206と、焦点距離f3を有する第二のリレーレンズ208とを含む。さらに、光学アセンブリ260は、放出光を4つのチャネルへと分割し、スペクトル符号化する、2つのダイクロイックミラーおよびルーティングミラーを含む画像分割部品278を含む。光学アセンブリ260はさらに、焦点距離f4を有するチューブレンズ280（チューブレンズ231、233、235または237のいずれかであってもよい）をチャネルごとに含む。

有効倍率Mを式（1）によって計算することができる。

4つのチャネル間で同じ倍率を達成するために、すべてのチューブが同じ焦点距離を有してもよい。加えて、リレーレンズ204と208との間の距離D（286によって示す）を式（2）にしたがって調節し得る。
D＝BFL₁＋BFL₂ （2）
式中、BFL₁（282によって示す）およびBFL₂（284によって示す）は、それぞれ、リレーレンズ204および208のためのメーカー提供の背面焦点距離である。さらに、口径食を最小化しながらも最大限の光線角度を受け入れるために、クリア直径およびクリア開口が利用されてもよい。たとえば、推定は、検出用対物レンズの背面開口サイズおよび最大視野角を使用して実行され得る。

スペクトル符号化デバイス222は、フェーザ平面と呼ばれる2D平面で表され得る一次フーリエ係数G(k)およびS(k)を光学的に生成する。Nチャネルハイパーまたはマルチスペクトルベクトルのスペクトルフェーザは式（3、4）によって表される。

式中、GおよびSは、k高調波における実数および虚数係数である。λ_nは、n番目のスペクトルチャネルの波長を表す。I(λ_n)は、n番目のチャネルの強度値を示す。Δλは、単一のチャネルの波長帯域幅である。式（3、4）中の分母は、N個のチャネルすべての強度値の積分を表し、異なる強度レベルの影響を排除するための正規化係数である。

スペクトル符号化デバイス222は、取得中にフェーザ符号化および計算を光学的に実行する。上述したように、2つの正弦波ダイクロイックミラーは、蛍光放出スペクトルを透過および反射させることにより、蛍光放出スペクトルを畳み込む。図2Aに示す「SIN」および「COS」透過チャネルは、式（3、4）中のノミネータ（nominator）の部分を表す。「A-SIN」および「A-COS」反射チャネルは、分母の正規化のために「SIN」および「COS」とともに全強度を推定するために使用される。GおよびSは、式（5、6）により計算される。

式中、C_idealおよびS_idealは、それぞれ、式（3、4）中のノミネータを表す。CはCOSチャネルであり、SはSINチャネルであり、ASはA-SINチャネルであり、ACはA-COSである。Iは、4つのチャネル中で検出された全強度の半分を占める、正規化に使用される強度値である。C_idealおよびS_idealは、コサインおよびサインダイクロイックミラーの透過率応答プロファイルに正規化を適用することにより、式（8、9）から計算することができる。c_cおよびc_sは、それぞれ、コサインおよびサイン透過率プロファイルの中心値である。a_cおよびa_sは、それぞれ、コサインおよびサイン透過率プロファイルの振幅である。1つの非限定的な例において、コサインおよびサインダイクロイックミラーの所与のセットの場合、中心値および振幅は、c_c＝0.52、c_s＝0.51、a_c＝0.44およびa_s＝0.40である。

図2Cおよび2Dは、それぞれ、例示的なサインダイクロイックミラー、たとえば図2AのサインダイクロイックミラーDMs220および例示的なコサインダイクロイックミラー、たとえば図2AのコサインダイクロイックミラーDMc221の例示的な透過率および反射率プロファイルを示す例示的なグラフである。グラフは、透過率／反射率パーセンテージ（すなわち、ダイクロイックミラーを透過する／それから反射する光のパーセンテージ）をy軸に示し、400nm～700nmの波長範囲をx軸に示す。

特に、トレース290は、サインダイクロイックミラーの透過率曲線を示し、トレース291は、サインダイクロイックミラーの反射率曲線を示し、トレース292は、コサインダイクロイックミラーの透過率を示し、トレース293は、コサインダイクロイックミラーの反射率曲線を示す。図示するように、サインダイクロイックミラーのスペクトル透過率は、サイン関数（図2C）およびコサイン関数（図2D）の形状に酷似し、最大透過率は、サインの場合で95.8％、コサインの場合で91.1％がピークである。

以下さらに説明するように、光シグナルの反射部分はまた、強度の正規化のために検出され、使用される。サインおよびコサインダイクロイックミラーの高い透過率パーセンテージが、サインおよびコサインダイクロイックミラーによる反射光部分のリサイクルおよび検出と組み合わさることにより、光スループットは、一般的に使用されるフルオロフォアの場合で80％超に増し、それにより、光毒性を減らしながらも検出効率が高まる。

サインダイクロイックミラー、たとえばサインダイクロイックミラーDMs220およびコサインダイクロイックミラー、たとえばコサインダイクロイックミラーDMc221を含むスペクトル符号化デバイスの全透過効率が、2つの正弦波透過フィルタの場合と比べて、図2Eに示されている。具体的には、2つの正弦波フィルタ（一行目、シーケンシャルフィルタ）およびスペクトル符号化デバイス（二行目）を使用して計算された、一般的に利用される5つのフルオロフォア、すなわちシアン蛍光タンパク質（CFP）、強化型緑色蛍光タンパク質（eGFP）、強化型黄色蛍光タンパク質（eYFP）、mCherryおよびiRFP670の場合の透過効率が示されている。スペクトル符号化デバイスが使用されるとき、より高い全体透過効率によって明らかであるように、サインおよびコサインダイクロイックミラーを含むスペクトル符号化デバイスにより、透過部分に加えて反射部分をも取得および正規化に利用することにより、高い光スループットが得られる。

各光学面における現実的な損失を考慮することにより、透過効率を推定した。2フィルタ手法の場合、光学系は、2つの正弦波フィルタと、その後のチューブレンズとを含み、四面アクロマティック複レンズを使用して推定される。透過率プロファイルは、0.5の中心値および0.5の振幅を有する理想的なサインおよびコサイン関数の1つの周期によって推定される。

スペクトル符号化デバイスを用いて試験された各フルオロフォアの場合、全透過効率は80％を超え、シーケンシャルフィルタが適用される場合、効率は28.3％まで低下する（mCherryの場合）。

次に図3A～3Cを参照すると、同図は、それぞれ、広視野顕微鏡、光シート顕微鏡（検出部分のみ示す）および共焦点顕微鏡（第二のピンホールの後の部分のみを示す）において実現されたスペクトル符号化デバイス、たとえば図1Aおよび1Bのスペクトル符号化デバイス122または図2Aのスペクトル符号化デバイス222の概略図を示す。

具体的には、図3Aは、広視野顕微鏡システム300中で照明システム304によって照らされる生物学的試料301を示す。試料301からの蛍光シグナルは、励起ダイクロイックミラー306により、スペクトル符号化デバイス322のビームスプリッタ310に向けて送られる。図示されないが、スペクトル符号化デバイス322は、上述したようなプレフィルタリング光学系およびリレー光学系を含み得る。サインダイクロイックミラー312およびコサインダイクロイックミラー314それぞれは、等しい量の蛍光シグナルを受け取る。サインおよびコサインダイクロイックミラー312および314は、4つのスペクトル符号化された光チャネル（2つの透過光チャネルおよび2つの反射光チャネル）を生成し、その後、それらのチャネルは、それぞれ、ルーティングミラー311、313、315および317によってチューブレンズ331、333、335および337へと送られる。各チューブレンズ331、333、335および337は、各チャネルからの光をイメージングセンサ350のそれぞれのオーバーラップしない四半分に集束させる。イメージングセンサ350は、たとえば、図2Aのイメージングセンサ250の例であり得る。

次に、図3Bは、検出用対物レンズ303を含む光シート顕微鏡システム330と統合されたスペクトル符号化デバイス332を示す。光シート顕微鏡システム330の検出部分が示されている。光シート顕微鏡システム330は、図1Aの光シート顕微鏡100の例であり得る。図3Aと同様に、サインおよびコサインダイクロイックミラー312および314が4つの符号化されたチャネルを生成し、それらのチャネルがイメージングセンサ350によってイメージングされる。

図3Cは、第二のピンホール372の後の共焦点顕微鏡の一部分390を示す。対物レンズからの蛍光シグナルは、コリメータレンズ370を透過したのち、ビームスプリッタ310に送られる。さらに、サインおよびコサインミラー312および314によって生成された4つのチャネルそれぞれが別個の光電子増倍管（PMT）によって検出される。

少なくとも1つのサインダイクロイックミラーおよび少なくとも1つのコサインダイクロイックミラーを含むスペクトル符号化デバイスまたはスペクトル符号化部分は、顕微鏡の対物レンズと顕微鏡の1つまたは複数のイメージングセンサとの間の無限遠空間中に配置され得ることが理解されよう。

取得、画像前処理および解析パイプライン
例示的な取得、画像前処理および解析パイプラインのブロック図が図4Aに示されている。図4Bには、取得、画像前処理および解析パイプラインの例示的な実例が生物学的試料に関して示されている。402で、顕微鏡、たとえば図1の顕微鏡100または任意の共焦点、光シートもしくは広視野顕微鏡を介して、単一のスナップショット取得（404に示す）を使用して画像取得が実行される。取得中、顕微鏡に結合された統合されたスペクトル符号化デバイス、たとえばデバイス122、222または322が、4つのチャネル：サイン（サインダイクロイックミラーからの符号化された透過チャネル）、コサインサイン（コサインダイクロイックミラーからの符号化された透過チャネル）、アンチサインサイン（サインダイクロイックミラーからの符号化された反射チャネル）およびアンチコサイン9サイン（サインダイクロイックミラーからの符号化された反射チャネル）を生成する。チャネル画像それぞれは、イメージングセンサ、たとえばイメージングセンサ150、250または350上の対応する四半分で捕捉される。このように、各チャネルからの生画像が、顕微鏡に結合されたスペクトル符号化デバイスを介して取得される。

次に、406で、前処理画像位置合わせを生画像に適用して、4つの符号化されたチャネルからの生画像を正しく整列させる。一例において、4つのチャネルは、画像位置合わせ法に基づく非剛体ワーピングを使用して整列させる。明視野画像を利用して、1つの参照チャネルおよび3つの位置合わせチャネルのコントロールポイントを手作業で選択し、エクスポートし得る（たとえば、コントロールポイントの画質を評価するために位置合わせされた画像の可視化を提供するFijiのBigWarpプラグイン機能を使用することにより）。これらのコントロールポイントは、4つのチャネルの位置合わせ変換のための基礎として働き得る。この変換のパラメータは、一度計算するだけでよく、光学システムが再整列または変更されるまで変更の必要はない。位置合わせは、事前にMATLAB関数にエクスポートされている生画像およびコントロールポイントをロードすることによって実施される。次いで、位置合わせした画像を、各層がSIN、COS、A-SINおよびA-COSに対応する4チャネルOME-TIFFフェーザキューブとして保存する。

各タイルの最大視野（FOV）は、所定の直径（たとえば120μm）を有するヘクスゴンである。より大きなFOVの場合、取得段階で画像タイル表示を適用し、画像位置合わせ後に画像スティッチング（410）を適用し得る。たとえば、画像スティッチングは、モザイク合成取得の場合に求められる。1つの非限定的な例において、スティッチングソフトウェア（たとえば、Imaris Stitcher 9.6（Bitplane, Switzerland））をスティッチングに利用し得る。他のスティッチングプロトコルを使用してもよく、本開示の範囲内である。いくつかの例において、スティッチング結果の精度を高めるために、タイルが手作業で配置されてもよい。

次に、412で、画像解析を実行する。一例においては、ハイパースペクトルフェーザ解析を実行し得（414）、4つのチャネル画像をフェーザ係数GおよびSに変換したのち、フェーザ平面解析を実施する。これは、4つのSHy-Camチャネルの高速2D行列ピクセルワイズ乗算によってフェーザのGおよびS値を計算することを含む。次いで、2つのフーリエ成分のフィルタリングによってスペクトルシグナルをノイズ除去する。符号化されたスペクトルシグナルのフェーザプロットとしての表現が、マルチカラーデータセットを探査するための関心領域の図式選択を可能にする。この解析は、HySP－Hyperspectral Phasorソフトウェア¹⁶を利用して実行される。

あるいはまた、スペクトル範囲（この例では400nm～700nm）で4チャネル画像をスペクトル相関チャネルとして処理することにより、フェーザ符号化ピクセルワイズ線形アンミキシングを実行する。符号化された4つのチャネルに線形アンミキシング（LU）を直接適用して、各画像ピクセル中のフルオロフォアの相対的寄与を提供することができる。

総合すると、スペクトル符号化デバイスから得られる4つのチャネルを位置合わせして、次元（x、y、チャネル）を有するデータのキューブを生成する（チャネルは、サイン、コサイン、アンチサインおよびアンチコサインである）。次いで、モザイク合成された画像を、より大きなFOVボリュームへとスティッチングしたのち、様々な手法によってアンミキシングする。

図5Aは、4つのチャネルからの生データの画像前処理の例を示す。502で、MATLAB中、明視野画像からの4つのチャネルのクロッピングを整列ごとに1回実行する。画像は、4つのチャネルが4つの四半分中に分散しているカメラ生データを示す。次に、画像504中、（b）は、参照チャネルとして使用された「COS」チャネルのスクリーンショット（たとえば、Fijiの「BigWarp」プラグインからの）を示す。参照チャネルは、手作業で選択されたコントロールポイントを含む。同じく504中、（c）は、3つの移動チャネルの1つである「ASIN」チャネルのスクリーンショットを示し、（d）は、整列ミスが見られる、位置合わせ前の「COS」および「ASIN」チャネルのオーバーレイ画像を示し、（e）は、チャネルどうしが正しく整列している、位置合わせ後の「COS」および「ASIN」チャネルのオーバーレイ画像を示す。さらに、506は、スティッチング前の9つの画像タイルのスクリーンショットである。最後に、508は、回転およびクロップ補正後の、スティッチングされた画像のスクリーンショットである。

光学的整列ごとに一度、4つのチャネルの正しい位置合わせおよび整列が求められる場合がある。上述したように、画像位置合わせは、データ解析の前に生画像に適用される。手作業のクロッピングが標的画像に適用され、クロッピングボックスの座標がエクスポートされ、将来の自動位置合わせのために保存される。1つの参照チャネルとで3つの移動チャネルの間でコントロールポイントを手作業で位置決めするためのスプリットチャネルがロードされる。次いで、コントロールポイントはさらなる使用に備えて保存される。その後、10枚羽根の調節可能なアイリスが、視野を制限するための視野絞りとして使用される。これらの頂点がコントロールポイントとして使用される。位置合わせデータセットを捕捉するために使用されるイメージング標的は、特徴の大きな数により、生物学的試料の1つである。この例においては、ゼブラフィッシュ幼生がイメージングされる。標的画像取得中、レーザが、好ましくは視野全体で明確な形状を有する1つの部分から来る蛍光シグナルを励起する。同時に、コントロールポイントに役立つ他のテクスチャを捕捉するために明視野照明が起動される。図5Aの例示的な標的テクスチャは、kdrk:mCherry、標識血管系およびゼブラフィッシュ幼生の表面テクスチャを含む。コントロールポイントは、整列ミスまたは物理的変化が起きたとき更新されるだけでよい。

モザイク合成取得の場合、位置合わせ後に複数のタイルのスティッチングを実行し得る。画像キューブは4つのチャネル（ASIN、ACOS、SINおよびCOS）を含むため、もっとも明確な特徴を示す1つのチャネルへの配置を実行して、他のチャネルを、おおよその整列の目視確認のために利用する。タイル配置（506）ののち、スティッチングを実行する。

次に、図6Aおよび6Bは、それぞれ、フェーザプロットを使用する例示的な画像解析および結果として得られたアンミキシングされた画像を示す。一例において、スペクトル解析および多重化は、関心領域（ROI）をフェーザ平面に適用することによって達成することができる。あるいはまた、線形アンミキシング（LU）を、自動化レシオメトリックアンミキシング結果のためのピクセルワイズスペクトル解析法として、スペクトル符号化デバイスを介して取得された画像に適用することもできる。

図6Aは、スペクトル符号化デバイス画像のフェーザプロットを示す。試料であるゼブラフィッシュ胚Tg（krt4:lyn-EGFP；kdrl:mCherry；lyz:TagRFP）は、3つのトランスジェニック蛍光タンパク質を含む。フェーザ平面上のポリゴンROI選択が、オリジナル画像の対応するピクセルを選択して、シグネチャの選択的アンミキシングを可能にする。フェーザプロットは、フェーザ係数の母集団分布を表す2Dヒストグラムである。フェーザ平面分布中のより高いピークは、全ピクセル間のより高頻度のスペクトルシグネチャに相当する。各独立したスペクトルシグネチャが、フェーザ平面上で大きな値を有するクラスタに相当する。しかし、空間的にまばらな蛍光シグネチャの場合、クラスタは強い明確さを有しない。様々なシグネチャが空間スパース性の大きな違いを有する場合、フェーザプロットは、より容易な可視化のために対数スケールで見てもよい。

フェーザプロット上で選択された領域は、オリジナルデータ中の対応する空間区域を参照のために飽和色としてリアルタイムで強調表示する（図6B、画像606）。シグナル空間オーバーラップが起こる選択ROI中にさらなるオーバーラップ部分が加えられる。

いくつかの例においては、前処理されたスペクトル符号化デバイス画像に線形アンミキシング（LU）が適用されてもよい。これは、最終実験に使用された同じイメージング条件下で測定された4チャネル参照スペクトル、すなわち、純粋な蛍光シグネチャのスペクトルのセットを必要とする。このステップは、異なるカメラ露光、ゲインおよびレーザ励起パワーにおける強度の実験的非線形性を考慮する。これらの参照スペクトルは、4×nのアレイ（nはシグネチャの数）として提供され、n個の参照スペクトルと、4つのチャネル（ASIN、ACOS、SINおよびCOS）の形状にある前処理画像とを利用してピクセルワイズ線形制約付き最小二乗問題を解く。結果は、各ピクセル中の様々なシグネチャの相対的寄与である。

図7は、スペクトル符号化デバイス、たとえば、図1A、1B、2A～2Eおよび3A～3Cで説明したスペクトル符号化デバイスを介してハイパースペクトルまたはマルチスペクトル画像を取得し、生成する例示的な方法700を示す高レベルフローチャートを示す。方法700は、コントローラ、たとえばコントローラ140により、非一時的メモリ、たとえばメモリ146に記憶された命令にしたがって実現され得る。

702で、方法700は、対物レンズとイメージングセンサとの間に結合されたスペクトル符号化デバイスを使用して単一露光取得によって蛍光画像を取得する工程を含む。取得中、生物学的試料からの蛍光シグナルを、周期的な透過率波形（たとえば正弦波）および周期的な反射率波形（たとえば正弦波）を有する1つまたは複数のダイクロイックミラーによって光学的に分割し、符号化し得る。たとえば、各ダイクロイックミラーは、符号化された透過光チャネルおよび符号化された反射光チャネルを生成する。

704で、方法700は、チャネルごとの反射強度および透過強度を含む、全チャネル中で検出された全強度にしたがって各チャネルを正規化する工程を含む。

706で、方法700は、全チャネルで取得された生画像を前処理する工程を含む。前処理する工程は、視野に依存して、チャネル位置合わせ708およびモザイク合成710を実行することを含み得る。例示的な前処理およびモザイク合成が図5、6Aおよび6Bに関して説明されている。

次に、712で、方法700は、フェーザ解析（ステップ714）または線形アンミキシング（ステップ716）であり得る画像解析を実行する工程を含む。方法700はさらに、アンミキシングされた画像を表示する工程を含む。スペクトル符号化デバイスから生成された画像を使用するフェーザ解析は、異なる波長で放出する異なる種を区別することができる。複数の蛍光シグネチャをイメージングする例が以下に示される。たとえば、4チャネル画像を使用して、いくつかの蛍光シグネチャを取得し得、その場合、蛍光シグネチャの数は、4よりも小さい、4に等しい、または4よりも大きい。たとえば、蛍光シグナルの数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはより多数であり得る。

図8は、スペクトル符号化デバイス、たとえば符号化デバイス122、222または322と統合された光シート顕微鏡を使用する例示的なタイル表示されたボリュメトリックインビボイメージングを示す。802は、200msの露光時間で4dpfトランスジェニックゼブラフィッシュ胚の躯幹部位で取得された、Phasor Hybrid Unmixingを使用してアンミキシングされた5つのシグネチャを示す最大強度投影画像である。ボックス803中のシグナルは、ズームインされると、804のシアン－自家蛍光、806の緑－Tg（krt4:GFP）、808の黄－Tg（lyz:TagRFP）、810のマゼンタ－Tg（kdrl:mCherry）および812の紫－ubi:H2B-iRFP670に対応する。

図9は、SPIM-SHy-Camダイナミックインビボイメージングを示す。画像902～908は、50msの露光時間で連続的なボリュメトリック微速度画像として取得された、ゼブラフィッシュテールクリップ創傷治癒（破線）を示す。胚が、膜（緑）Tg（krt4:GFP）、核（紫）ubi:H2B-iRFP670、好中球（黄）Tg（lyz:TagRFP）中で標識されている。創傷部への好中球移動を組織に関して高解像度3Dで観察し、時間とともに追跡することができる。同じ胚（910～916）の拍動する心臓（破線の円）が、50msの露光時間で毎秒20フレームで捕捉されている。心臓区域を通って流れる好中球を追跡することができる。

画像所得および試料調製
スペクトル符号化デバイスプロトタイプを、Micro-manager²³を取得およびステージ制御ソフトウェアとして使用する自社製光シート顕微鏡に適合させた。機器は、5つのレーザラインと、2560×2160ピクセルの解像度のPCO Edge 5.5カメラ（PCO, Gmbh）とを備える。スペクトル符号化デバイスプロトタイプの試験段階中、蛍光シグナルを効果的に励起するために3つのレーザラインを使用した。画像取得中、信号対雑音比（SNR）改善のために、2×2のビニングを適用した。

マルチカラーインビボイメージング試験のために、トランスジェニック蛍光タンパク質の特異的発現を示したゼブラフィッシュ胚を収集し、確立された手順にしたがって低塩胚培地中、イメージングに適切な時期（4dpf）まで育成した。イメージングの前、胚を1％低融点アガロースの溶液（30％Danieau溶液で作製）に浸漬し、ステンレス鋼プランジャ付きのガラス毛細管（5-000-1025, Drummond Wiretrol）に引き込んだ。アガロースが室温（21～23℃）で固化した（1～2分）のち、毛細管をDanieau溶液充填イメージングチャンバに移し、胚を含むアガロースをマイクロピペットから押し出して、光学アクセスを得た。胚の移動を防ぐために、0.075％トリカインをアガロース溶液とDanieau溶液充填イメージングチャンバの両方に加えた。イメージング中、イメージングチャンバ温度を28.5℃に設定し、維持した。

画像前処理
SHy-Cam画像に2ステップ前処理を適用する。第一のステップは位置合わせである。非剛体ワーピングベースの画像位置合わせ法を使用して4つのチャネルを整列させる。明視野画像を利用して、1つの参照チャネルおよび3つの位置合わせチャネルのコントロールポイントを手作業で選択し、FijiのBigWarpプラグイン機能を使用してエクスポートする。BigWarpは、コントロールポイントの質を評価するために、位置合わせされた画像の可視化を提供する。これらのコントロールポイントは、4つのスペクトル符号化デバイスチャネルの位置合わせ変換のための基礎として働く。この変換のパラメータは、一度計算するだけでよく、光学システムが再整列または変更されるまで変更の必要はない。位置合わせは、事前にMATLAB関数にエクスポートされている生画像およびコントロールポイントをロードすることによって実施される。位置合わせした画像を、各層がSIN、COS、A-SINおよびA-COSに対応する4チャネルOME-TIFFフェーザキューブとして保存する。

第二のステップは、モザイク合成取得の場合（図5）の画像スティッチングである。Imaris Stitcher 9.6（Bitplane, Switzerland）を、そのわかりやすい対話式のユーザインタフェースのため、スティッチングソフトウェアとして使用した。1つ1つの4チャネルフェーザキューブの位置メタデータの欠如により、タイルを手作業で配置してスティッチング結果の精度を高めた。最終的な結果をimsフォーマットで保存した。

フェーザ平面上での幾何学的アンミキシング
Hyperspectral Phasorsソフトウェアを2Dフェーザ平面上での蛍光シグネチャアンミキシングおよび解析のために使用した。関心領域（ROI）をフェーザ平面に適用して複数のシグネチャを分離した（図6A）。単一の蛍光で試料をイメージングすることにより、独立したシグネチャを識別した。対数カウントスケールでフェーザを可視化し、極小値を特定することによって分離位置を特定した。

レシオメトリックスペクトルアンミキシング
GおよびSスペクトルフェーザ係数への変換の前に、スペクトル線形アンミキシングを4チャネルスペクトル符号化デバイス強度画像に直接適用し得る。LUは、ここでは、式（10）によって表すことができる制約付き線形最小二乗（CLS）問題として扱われる。

式中、nは、蛍光シグネチャの数である。R^4×nは、参照スペクトルの4×n行列である。行列の各列は、すべてのシグネチャが存在する実験用試料と同じイメージング条件下、同じレーザパワー、露光時間およびゲインを維持しながらスペクトル符号化デバイスを使用して捕捉された純粋なスペクトルシグネチャの参照4チャネルスペクトルを含む。xⁿは、n個の異なるシグネチャの寄与ベクトルの最適解である。c⁴＝［AC AS S C］Tは、画像からの各ピクセルに対応する4チャネルスペクトルベクトルである。Iⁿは、n-D単位行列である。Jⁿは、n-D全1行列である。0ⁿおよび1ⁿは、n-D全0および全1ベクトルである。問題をより良く定義するために2つの制約が使用される。第一の制約は、すべての寄与の合計が1に等しいことを保証する。第二の制約は、寄与の範囲を0～1に限定する。

ゼブラフィッシュ株
標準的な文献の実施法を踏襲し、かつUniversity of Southern Californiaによって提供されたGuide for the Care and Use of Laboratory Animalsにしたがって株を育成し、維持した。魚試料は、IACUCによって承認されたプロトコルの一部であった（許可番号：12007 USC）。krt4:lyn-egfpおよびkrtt1c19e:lyn-tdtomatoトランスジェニック株は、Thomas J. Carney氏（A*STAR, Singapore）から贈られたものであった。Kdrk:mCherryトランスジェニック株は、Ching-Ling Lien氏（Children's Hospital Los Angeles）から贈られたものであった。TgBAC（sox10:BirA-mCherry）ox104a株を使用した。

mpv17a9/a9；mitfaw2/w2（キャスパー）株は、Zebrafish International Resource Center（ZIRC）から購入したものであり、csf1rj4e1/j4e1（パンサー）株は、David Parichy氏（Univ. Virginia）から贈られたものであった。キャスパーをパンサーと交配させて、三重ヘテロ接合体mpv17a9/+；mitfaw2/+；csf1rj4e1/+F1世代魚を作製し、それを、その後、近交系交配させて、それらの遺伝子の変異状態の27の組み合わせを有するF2世代を作製した。csf1rj4e1表現型は、キャスパー表現型を有するF2成体中で明らかではなかっため、それらの魚をパンサー魚とで異系交配させて、蛍光顕微鏡法により、黄色素胞を有する幼生の頻度（ヘテロ接合体およびホモ接合体は、それぞれ、黄色素胞陽性幼生の50％および0％分を産生した）に基づいてcsf1rj4e1変異の接合性を決定した。キャスパー；csf1rj4e1/j4e1株は生存可能かつ繁殖可能であり；キャスパー；csf1rj4e1/j4e1株またはキャスパー；csf1rj4e1/+株を他の蛍光トランスジェニック株と数世代かけて異系交配させて、黄色素胞の存在または非存在下、キャスパー背景上に複数の導入遺伝子を有する魚を得た。

Tg（PGK1:H2B-chFP）³²のベクターから、プライマ#1および#2を使用して、また、piRFP670-N1（Addgene #45457）のベクターから、プライマ#3および#4を使用して、ヒトヒストン2b領域（H2B）および蛍光タンパク質iRFP670のコード配列を増幅した。PCR産物を融合させてH2B-iRFP670融合フラグメントを生成し、pDONR221（Thermo Fisher Scientific）中にクローニングした。その後、Tol2kitベクターを開発者のマニュアルにしたがって使用してMultiSite Gateway反応を実行した。pENTR5'_ubi（Addgene #27320）、pDONR221-H2B-iRFP670およびpDONR P2R-P3-WPREをpDestTol2pA2（Tol2kit #394）中にアセンブルした。結果として得られたpDestTol2-ubi:H2B-iRFP670をtol2 mRNAとともに1細胞期のキャスパーゼブラフィッシュ胚に注入した。注入を受けたF0を育成し、ファウンダーに関してスクリーニングした。繁殖齢まで成長させた陽性のF1をSplinklette PCR分析に付して、ゲノム組込み部位を決定した。Ensembl Zebrafish GRCz11データベースによって決定された注釈なし領域中に単一コピー組み込みを示す株を選択し、イメージング実験のために、先に記した他のトランスジェニックおよび変異体株と異系交配させた。

図9は、生きたゼブラフィッシュ心臓の例示的なマルチカラースナップショット画像を示す。上皮（緑）、血管系（マゼンタ）および核（赤）で遺伝子標識された4日齢のゼブラフィッシュを、スナップショットマルチスペクトル蛍光中、毎秒33フレームでイメージングした。

1つの実施形態において、本明細書に記載されるものは、2つの特別に設計されたダイクロイックミラー（DM）を含み、第一のDMが、正弦波透過率曲線およびアンチ正弦波反射率曲線の1つの高調波を有し、第二のDMが、コサイン透過率曲線およびアンチコサイン反射率曲線の1つの高調波を有する、イメージングアセンブリである。様々な態様において、2つのDMはそれぞれDMキューブ形状である。様々な態様において、DMキューブは、キューブ形状の1つの次元に沿って1～100mm、たとえば1～10mm、10～20、20～30、30～40、40～50または50mm以上である。様々な態様において、アセンブリはビームスプリッタを含む。様々な態様において、アセンブリは50/50ビームスプリッタキューブを含む。様々な態様において、アセンブリは1つまたは複数のルーティングミラーを含む。様々な態様において、アセンブリは4つのルーティングミラーを含む。様々な態様において、アセンブリは1つまたは複数のチューブレンズを含む。様々な態様において、チューブレンズは、1～250mm、たとえば1～25、25～50、5～75、75～100および100～250mmの焦点距離を含む。様々な態様において、アセンブリは1つまたは複数のリレーレンズを含む。様々な態様において、アセンブリはセンサを含む。様々な態様において、アセンブリはアイリスを含む。様々な態様において、アセンブリはルーフミラーキューブを含む。様々な態様において、アセンブリは2つまたはより多くのジンバルミラーを含む。

同じく本明細書に記載されるものは、前述のイメージングアセンブリを使用する方法である。様々な態様において、方法は連続フーリエ変換（FT）を含む。様々な態様において、FTは、1つの特定の高調波で実行される正規化サインおよびコサインフーリエ変換である。様々な態様において、FTは以下を含む。

N：スペクトルチャネルの数
i：スペクトルチャネル
k：調和数、通常は1、2

様々な態様において、正規化は、画像の全強度を利用することによって達成される。スペクトルイメージングは、空間情報と結合した色情報に依存して、生物の性質を解像する。それは、頂点がスペクトル分解能、時間分解能および空間分解能であるトレードオフ三角形である。

本明細書に記載される高スループットスペクトル符号化デバイスは、高分解能スペクトル情報を符号化することができ、高い光スループットを有し、時間および空間分解能において最小限の妥協しか有さず、単一の画像でスペクトル情報を取得することができる（スナップショット取得）。さらに、高スループットスペクトル符号化デバイスは、既存の研究用イメージングデバイスとの容易な統合、既存の医療用画像診断デバイスとの容易な統合、独立したイメージングデバイス（広視野）にするための容易な改変および光学的に処理されたスペクトルデータの出力をはじめとする相乗効果を有し、それが後処理手順を簡素化する。

ハイパースペクトルフェーザ（HySP）は、ハイパースペクトル／スペクトル画像データのためのフーリエ変換（FT）ベースのコンピュータ後処理法である。これは、高次元スペクトルデータを、GおよびS係数からなる2Dベクトルへと変換する（1）。GおよびSは、それぞれ、オリジナルのスペクトルベクトルの第一または第二高調波フーリエ係数の実数部および虚数部である。

HySP計算を、既存のイメージング法の無限遠空間に組み込むことができる光学デバイスへと変形することにより、連続フーリエ変換ベースのスペクトル符号化を達成することができる。

画像スペクトル情報は2つのダイクロイックミラー（DM）によって符号化される。第一のDMは、関心対象のスペクトル範囲内に正弦波透過率曲線およびアンチ正弦波反射率曲線の1つの高調波を有する。第二のDMは、関心対象のスペクトル範囲内にコサイン透過率曲線およびアンチコサイン反射率曲線の1つの高調波を有する。

2つのDMを透過したのち検出器によって収集された光は、第一高調波連続フーリエ係数として見ることができるスペクトル符号化された情報を含む。

アンチサインおよびアンチコサイン符号化された反射光もまた、センサによって収集される。それらが透過光と合わされて、後に正規化に使用される全放出シグナルが回収される。

WFMおよびLSFM用途の場合、スペクトル符号化された画像を取得するために1つのカメラしか要らない。CFM用途の場合、符号化されたスペクトルシグナルの取得のために4つのPMTが必要である。

WFMおよびLSFM用途においては、4つの分割された光路を経路制御し、同じカメラセンサ上に画像を形成するために、特殊なルーティングミラーアレイおよびチューブレンズアレイが使用される。

事例1：低シグナル試料のハイパースペクトルスナップショットイメージング
現在のスナップショットハイパースペクトル技術は、携帯電話カメラにおいて一般に使用される2×2ピクセルベイヤーフィルタ（RGGB）の延長である、4×4または5×5の正方形パターンでセンサ上に配置された複数のカラーフィルタを利用する。これらのフィルタは、取得された全スペクトル範囲の1/16（4×4の場合）または1/25（5×5の場合）に相当するスペクトル帯域を除くすべての光を拒絶するように設計されている。制限：

このプロセスにおいては、光の15/16（4×4パターン）または24/25（5×5パターンの場合）が拒絶され、失われる。これは、集光における93.7％および96％の損失に換算される。そのような低い効率では、このタイプのスナップショットハイパースペクトルカメラを蛍光試料とで利用することは極めて困難である。理由は、そのようなシグナルは、一般に低い信号対雑音比を特徴とするからである。

本明細書に記載されるスペクトル符号化デバイスは、推定10％の光収集の損失しか被らず、最大9.6倍の低さの光損失および最大22倍の高さのシグナル取得効率を提供する。増大した効率が蛍光シグナルのハイパースペクトルメージングを可能にする。

画像の最終解像度はカメラセンサの解像度の4または5倍の低さである。たとえば、2000×2000ピクセルのカメラは、4×4の場合、500×500ピクセルの画像しか生成せず、5×5の場合、400×400ピクセルの画像しか生成しない。本明細書のスペクトル符号化デバイスは、カメラセンサのピクセル数の1/2で画像を生成し、最終的な画像の解像度を倍増させる。

事例2：蛍光の高速多重化イメージング
2Dまたは3D試料内の複数の蛍光色素またはタンパク質のイメージングおよび分離は難題であり、2つの要因：i）高感度のスナップショットスペクトルイメージャの非存在、およびii）チャネル間ので情報の漏れ込みを招く、蛍光シグナルのスペクトルオーバーラップ（スペクトル類似性）によって制限されてきた。標準的なマルチカラー試料は一般に、順次に切り替わる光放出フィルタのセットとでペアにされた高感度カメラを利用してイメージングされる。3色蛍光試料の場合、これは、3つの画像の取得および3つのフィルタの切り替えを必要とする。スペクトルオーバーラップは、試料中で何種類の蛍光色素を使用することができるか、また、どのタイプの蛍光色素を使用することができるかを制限してきた。通常の色素は、スペクトルオーバーラップ（たとえば青、緑および赤蛍光）を最小限にするために十分にスペクトル分離している。多くの場合、フィルタ切り替えの間に試料が動くため、画像は再整列を要する。1画像あたり30msの露光の場合、30msでフィルタを交換する非常にハイエンドの高価な高速フィルタ切り替え装置を使用しても、3色画像は、30ms＊3色＋30ms＊3フィルタ＝180msを要する、すなわち、フレームレート（fps）は5.5（3色）である。4色フレームならば60ms以上を要し、fpsは4.2に下がる。

本明細書に記載されるスペクトル符号化デバイスは、高感度のスペクトル分解された画像を提供することにより、上述の課題の両方を解決する。可動部品がなく、1つの画像を取得するだけでよい。スペクトル帯域フィルタを使用せず、オーバーラップおよび漏れ込みの課題を解決し、3色またはより多色の画像を高速で取得することを可能にする。上記例と同じ30ms露光を利用すると、3色フレームは30msしか要さず（33fps）、4色フレームも同じく30msしか要さず（33fps）、標準の2＊n倍の速さである取得を可能にする（nは、イメージングされる蛍光色素の数である）。たとえば、3色蛍光ゼブラフィッシュ心臓は33fpsで取得され、これは、帯域シーケンシャルフィルタを使用する場合の6倍の速さである。

事例3：大型試料／高スループット多重化イメージング
複数のスペクトルオーバーラップ標識を用いる試料のイメージングは、イメージングをスペクトル次元に延ばして、（x、y、波長）次元を含むスペクトルキューブを取得することを必要とする。このタイプのイメージングを実行することができる現在の機器は、ポイントまたはラインスキャン型スペクトル分解共焦点蛍光顕微鏡である。ポイントスキャンは、一度に1つの点を取得し、検出器のラインにかけてシグナルをスペクトル拡散させて、スペクトル次元にアクセスする。その後、点を位置の行列に通してラスタスキャンして画像を取得する。ラインスキャナは情報を2Dカメラセンサ上で拡散させる（一方の軸は空間次元（ライン）、他方の軸は波長）。2048×2048×32のスペクトルキューブの場合、ポイントスキャン型スペクトル共焦点顕微鏡は、1ピクセルあたり、ラスタスキャン時間を含め、1.5μsの時間を要するであろう。これは、1スペクトルキューブあたり6.3秒に換算される。文献［DOI: 10.1038/ncomms8990］に報告されているラインスキャン型蛍光イメージングシステムは毎秒1500ラインを収集することができる。同じサイズのスペクトルキューブ（2048×2048×32）の場合、取得に1.36秒を要する。提案される本明細書に記載されるスペクトル符号化デバイスは30ミリ秒しか要さず、ポイントスキャンの210倍、ラインスキャンの45倍の速さである。

本明細書は多くの具体的な実施形態の詳細を含むが、それらは、任意の発明または特許請求され得るものの範囲に対する限定として解釈されるべきではなく、むしろ、特定の発明の特定の実施形態に特有の特徴の記載として解釈されるべきである。また、別々の実施形態に関して本明細書に記載される特定の特徴が単一の実施形態へと組み合わされて実現されることもできる。逆に、単一の実施形態に関して記載される様々な特徴が、別々に、または任意の適当な部分的組み合わせで、複数の実施形態として実現されることもできる。そのうえ、特徴は、特定の組み合わせにおいて作用するものとして先に記載され、そのようなものとしてはじめに特許請求されることもあり得るが、特許請求される組み合わせからの1つまたは複数の特徴が場合によってはその組み合わせから切り離されることができ、特許請求される組み合わせは、部分的組み合わせまたは部分的組み合わせの変形形態に関する場合もある。

同様に、図面には動作が特定の順序で示され得るが、これは、所望の結果を達成するために、そのような動作がその示された特定の順序または順番で実行されること、または図示されるすべての動作が実行されることを要求するものとして理解されるべきではない。特定の状況において、マルチタスキングおよび並列処理が好都合であり得る。そのうえ、上記実施形態における様々なシステム構成部品の分離は、すべての実施形態においてそのような分離を要求するものとして理解されるべきではなく、記載されたプログラムコンポーネントおよびシステムは一般に、単一のソフトウェア製品の中に統合されることもできるし、複数のソフトウェア製品へとパッケージングされることもできることが理解されるべきである。

本開示のコンピュータおよびハードウェア実施形態
本明細書における開示は、任意のタイプのハードウェアおよび／またはソフトウェアによって実現され得、事前にプログラムされた汎用コンピューティングデバイスであり得ることがまず理解されるべきである。たとえば、システムは、サーバ、パーソナルコンピュータ、ポータブルコンピュータ、シンクライアントまたは任意の適当デバイスを使用して実現され得る。本開示および／またはその構成要素は、単一の場所にある単一のデバイスであってもよいし、任意の適切な通信プロトコルを使用して任意の通信媒体、たとえば電気ケーブル、光ファイバケーブルを介して、またはワイヤレスで接続された、単一または複数の場所にある複数のデバイスであってもよい。

また、本開示は、特定の機能を実行する複数のモジュールを有するものとして本明細書に示され、説明されていることに留意すべきである。これらのモジュールは、明確さためにのみ、それらの機能に基づいて概略的に示されただけであり、必ずしも特定のハードウェアまたはソフトウェアを表すものではないことが理解されるべきである。この点に関して、これらのモジュールは、説明された特定の機能を実質的に実行するために実現されたハードウェアおよび／またはソフトウェアであり得る。そのうえ、モジュールは、本開示の範囲内で組み合わされてもよいし、所望の特定の機能に基づいてさらなるモジュールへと分割されてもよい。したがって、本開示は、本発明を限定するものと解釈されるべきではなく、単にその1つの例示的な実施形態を示すものと理解されるべきである。

コンピューティングシステムはクライアントおよびサーバを含むことができる。クライアントとサーバとは一般に互いに遠隔であり、通常、通信ネットワークを通して対話する。クライアントとサーバとの関係は、それぞれのコンピュータ上で稼働し、互いにクライアント・サーバ関係を有するコンピュータプログラムのおかげで生じる。いくつかの実施形態において、サーバは、データ（たとえばHTMLページ）をクライアントデバイスに送信する（たとえば、クライアントデバイスと対話するユーザにデータを表示し、ユーザからユーザ入力を受け取るために)。クライアントデバイスで生成されたデータ（たとえば、ユーザの対話の結果）は、クライアントデバイスからサーバで受け取ることができる。

本明細書に記載される主題の実施形態は、バックエンドコンポーネント、たとえばデータサーバを含む、またはミドルウェアコンポーネント、たとえばアプリケーションサーバを含む、またはフロントエンドコンポーネント、たとえば、ユーザが本明細書に記載される主題の実施形態と対話することができるところのグラフィカルユーザインタフェースまたはウェブブラウザを有するクライアントコンピュータを含む、または1つまたは複数のそのようなバックエンド、ミドルウェアもしくはフロントエンドコンポーネントの任意の組み合わせを含むコンピューティングシステムとして実現されることができる。システムのコンポーネントは、任意の形態または媒体のデジタルデータ通信、たとえば通信ネットワークによって相互接続されることができる。通信ネットワークの例は、ローカルエリアネットワーク（「LAN」）、ワイドエリアネットワーク（「WAN」）、インタネットワーク（たとえばインタネット）およびピアツーピアネットワーク（たとえばアドホックピアツーピアネットワーク）を含む。

本明細書に記載される主題および動作の実施形態は、デジタル電子回路で実現されることもできるし、本明細書に開示される構造およびそれらの構造的均等物を含むコンピュータソフトウェア、ファームウェアまたはハードウェアで実現されることもできるし、それらの1つまたは複数の組み合わせで実現されることもできる。本明細書に記載される主題の実施形態は、1つまたは複数のコンピュータプログラム、すなわち、データ処理装置によって実行される、またはデータ処理装置の動作を制御するための、コンピュータ記憶媒体上にコード化されたコンピュータプログラム命令の1つまたは複数のモジュールとして実現されることができる。代替的または追加的に、プログラム命令は、人工的に生成された伝搬シグナル、たとえば、データ処理装置による実行に備えて適当なレシーバ装置への送信のために情報をコード化するために生成される機械生成電気、光または電磁シグナル上にコード化されることもできる。コンピュータ記憶媒体は、コンピュータ可読記憶デバイス、コンピュータ可読記憶基板、ランダムもしくはシリアルアクセスメモリアレイもしくはデバイスまたはそれらの1つまたは複数の組み合わせである、またはそれらに含まれることができる。そのうえ、コンピュータ記憶媒体は伝搬シグナルではないが、コンピュータ記憶媒体は、人工的に生成された伝搬シグナル中にコード化されたコンピュータプログラム命令のソースまたはデスティネーションであることができる。コンピュータ記憶媒体はまた、1つまたは複数の別々の物理的コンポーネントまたは媒体（たとえば複数のCD、ディスクまたは他の記憶デバイス）である、またはそれらに含まれることができる。

本明細書に記載される動作は、1つまたは複数のコンピュータ可読記憶デバイスに記憶された、または他のソースから受け取ったデータに対して「コントローラ」によって実行される動作として実現されることができる。

「コントローラ」という語は、プログラム可能なプロセッサ、コンピュータ、チップ上のシステムもしくは複数のシステムまたは前記の組み合わせをはじめとする、データを処理するためのあらゆる種類の装置、デバイスおよび機械を包含する。装置は、専用の論理回路、たとえばFPGA（field programmable gate array）またはASIC（application specific integrated circuit）を含むことができる。装置はまた、ハードウェアに加えて、対象のコンピュータプログラムのための実行環境を創出するコード、たとえば、プロセッサファームウェア、プロトコルスタック、データベース管理システム、オペレーティングシステム、クロスプラットフォームランタイム環境、仮想機械またはそれらの1つまたは複数の組み合わせを構成するコードを含むことができる。装置および実行環境は、様々な異なるコンピューティングモデルインフラストラクチャ、たとえばウェブサービス、分散コンピューティングおよびグリッドコンピューティングインフラストラクチャを実現することができる。

コンピュータプログラム（プログラム、ソフトウェア、ソフトウェアアプリケーション、スクリプトまたはコードとも知られる）は、コンパイラ型またはインタプリタ型言語、宣言型または手続き型言語を含む任意の形態のプログラミング言語で書かれることができ、任意の形態で、たとえば独立型プログラムとして、またはコンピューティング環境における使用に適したモジュール、コンポーネント、サブルーチン、オブジェクトもしくは他のユニットとして展開されることができる。コンピュータプログラムは、ファイルシステム中のファイルに相当し得るが、必ずしもそうである必要はない。プログラムは、対象のプログラムに専用の単一のファイルまたは複数の協調されたファイル（たとえば、1つまたは複数のモジュール、サブプログラムまたはコードの部分を記憶するファイル）中に他のプログラムまたはデータ（たとえば、マークアップ言語ドキュメントに記憶された1つまたは複数のスクリプト）を保持するファイルの一部分に記憶されることができる。コンピュータプログラムは、1つのコンピュータ上で実行されるように展開されることもできるし、1つの場所に位置し、または複数の場所に分散し、通信ネットワークによって相互接続された複数のコンピュータ上で実行されるように展開されることもできる。

本明細書に記載されるプロセスおよび論理フローは、入力データに操作を加え、出力を生成することによって動作を実行するための1つまたは複数のコンピュータプログラムを実行する1つまたは複数のプログラマブルプロセッサによって実行されることができる。プロセスおよび論理フローはまた、専用の論理回路、たとえばFPGA（field programmable gate array）またはASIC（application specific integrated circuit）によって実行されることもできるし、装置がそれとして実現されることもできる。

コンピュータプログラムの実行に適したプロセッサとしては、例として、汎用および専用のマイクロプロセッサならびに任意の種類のデジタルコンピュータの任意の1つまたは複数のプロセッサがある。一般に、プロセッサは、リードオンリーメモリまたはランダムアクセスメモリまたは両方から命令およびデータを受け取る。コンピュータの不可欠な要素は、命令にしたがって動作を実行するためのプロセッサならびに命令およびデータを記憶するための1つまたは複数のメモリデバイスである。一般に、コンピュータはまた、データを記憶するための1つまたは複数の大容量記憶デバイス、たとえば磁気、磁気光学ディスクまたは光学ディスクを含む、またはそれからデータを受け取り、それにデータを伝送するためにそれに機能的に結合される。しかし、コンピュータはそのようなデバイスを有する必要はない。そのうえ、コンピュータは、別のデバイス、たとえば、いくつか挙げるならば、携帯電話、パーソナルデジタルアシスタント（PDA）、モバイルオーディオもしくはビデオプレーヤ、ゲームコンソール、グローバルポジショニングシステム（GPS）レシーバまたはポータブルストレージデバイス（たとえばユニバーサルシリアルバス（USB）フラッシュデバイス）に埋め込まれることもできる。コンピュータプログラム命令およびデータを記憶するのに適したデバイスとしては、すべての形態の不揮発性メモリ、媒体およびメモリデバイス、たとえば、実例として、半導体メモリデバイス、たとえばEPROM、EEPROMおよびフラッシュメモリデバイス；磁気ディスク、たとえば内部ハードディスクもしくはリムーバブルディスク；磁気光学ディスク；ならびにCD-ROMおよびDVD-ROMディスクがある。プロセッサおよびメモリは、専用の論理回路によって補完されることもできるし、それに組み込まれることもできる。

本発明のいくつかの局面においては、本明細書に提供される式および計算に関連する演算を実行するためのソフトウェアが提供される。本明細書に提供される命令を実行するソフトウェアは非一時的コンピュータ可読媒体に記憶され得、ソフトウェアは、プロセッサまたは制御装置上で実行されると、本発明のステップのいくつかまたはすべてを実行する。

選択された態様
上記の詳細な説明および添付の特許請求の範囲は本発明のいくつかの態様を開示するが、本発明の他の代替局面が以下のさらなる態様において開示される。

態様１．
第一のダイクロイックミラーと、
第二のダイクロイックミラーと
を含み、
該第一のダイクロイックミラーの第一のスペクトル透過率曲線および第一のスペクトル反射率曲線がサイン波プロファイルを有し、
該第二のダイクロイックミラーの第二のスペクトル透過率曲線および第二のスペクトル反射率曲線がコサイン波プロファイルを有する、
イメージングアセンブリ。
態様２．
第一のダイクロイックミラーが、第一のスペクトル符号化された透過光部分および第一のスペクトル符号化された反射光部分を生成し；第二のダイクロイックミラーが、第二のスペクトル符号化された透過光部分および第二のスペクトル符号化された反射光部分を生成し；該第一のスペクトル符号化された透過光部分、該第一のスペクトル符号化された反射光、該第二のスペクトル符号化された透過光および該第二のスペクトル符号化された反射光がイメージングセンサで検出される、態様1のイメージングアセンブリ。
態様３．
イメージングセンサがcMOSセンサである、態様2のイメージングアセンブリ。
態様４．
第一のダイクロイックミラーが、第一のスペクトル符号化された透過光部分および第一のスペクトル符号化された反射光部分を生成し；第二のダイクロイックミラーが、第二のスペクトル符号化された透過光部分および第二のスペクトル符号化された反射光部分を生成し；該第一のスペクトル符号化された透過光部分が第一の検出器を介して検出され、該第一のスペクトル符号化された反射光が第二の検出器を介して検出され、該第二のスペクトル符号化された透過光が第三の検出器を介して検出され、該第二のスペクトル符号化された反射光が第四の検出器を介して検出される、態様1のイメージングアセンブリ。
態様５．
第一、第二、第三および第四の検出器が光電子増倍管である、態様4のイメージングアセンブリ。
態様６．
第一および第二のダイクロイックミラーそれぞれが顕微鏡のイメージング用対物レンズからの蛍光シグナルを受け取る、態様1のイメージングアセンブリ。
態様７．
顕微鏡が、光シート顕微鏡、広視野蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡のいずれかである、態様1のイメージングアセンブリ。
態様８．
第一のダイクロイックミラーからの第一のスペクトル符号化された透過光または第一のスペクトル符号化された反射光を受け取るように配置された少なくとも1つの第一のルーティングミラーと、第二のダイクロイックミラーからの第二のスペクトル符号化された透過光または第二のスペクトル符号化された反射光部分を受け取るように配置された少なくとも1つの第二のルーティングミラーとをさらに含み、該第一および第二のダイクロイックミラーならびに該少なくとも1つの第一および第二のルーティングミラーが4つのスペクトル符号化された光部分を生成し、該4つのスペクトル符号化された光部分が、該第一のスペクトル符号化された透過光、該第一のスペクトル符号化された反射光、該第二のスペクトル符号化された透過光および該第二のスペクトル符号化された反射光を含む、態様1のイメージングアセンブリ。
態様９．
4つのチューブレンズをさらに含み、各チューブレンズが、4つのスペクトル符号化された光部分の1つを受け取りかつ対応するスペクトル符号化された光部分をイメージングセンサ上に集束させるように配置されている、態様2のイメージングアセンブリ。
態様１０．
4つの調節ミラーをさらに含み、各調節ミラーが、スペクトル符号化された光部分それぞれがイメージングセンサの異なる四半分でイメージングされるよう、該イメージングセンサに対する該スペクトル符号化された光部分それぞれの対応する角度を調節するように配置されている、態様9のイメージングアセンブリ。
態様１１．
顕微鏡のイメージング用対物レンズからの蛍光シグナルを受け取るように配置されたビームスプリッタをさらに含み、該ビームスプリッタが、該蛍光シグナルを第一の蛍光シグナルおよび第二の蛍光シグナルへと等分割するように構成されており；該第一の蛍光シグナルが第一のダイクロイックミラーに向けて送られ、該第二の蛍光シグナルが第二のダイクロイックミラーに向けて送られる、態様1のイメージングアセンブリ。
態様１２．
第一および第二の蛍光シグナルの1つまたは複数をそれぞれ第一および第二のダイクロイックミラーの1つまたは複数に向けて送るための1つまたは複数のさらなるルーティングミラーをさらに含む、態様11のイメージングアセンブリ。
態様１３．
イメージング用対物レンズとビームスプリッタとの間に配置された1つまたは複数のリレーレンズをさらに含む、態様11のイメージングアセンブリ。
態様１４．
1つまたは複数のプレフィルタリング光学系をさらに含み、該1つまたは複数のプレフィルタリング光学系が、第一および第二のダイクロイックミラーのスペクトル範囲の外のシグナルをフィルタリング除去するように構成されている、態様1のイメージングアセンブリ。
態様１５．
第一および第二のダイクロイックミラーのスペクトル範囲の外のシグナルをフィルタリング除去するように構成された1つもしくは複数のプレフィルタリング光学系、および／またはイメージング用対物レンズを介してイメージングされる試料を照らす1つもしくは複数の励起光源に対応する波長をフィルタリング除去するように構成された1つもしくは複数のフィルタをさらに含む、態様12のイメージングアセンブリ。
態様１６．
第一および第二のダイクロイックミラーそれぞれが400nm～700nmのスペクトル範囲を有する、態様1のイメージングアセンブリ。
態様１７．
顕微鏡のイメージング用対物レンズから受け取った放出光を複数の符号化された光チャネルへと符号化するように構成された符号化部分
を含み、
該符号化部分が少なくとも2つのダイクロイックミラーを含み、
該少なくとも2つのダイクロイックミラーそれぞれが、周期的な波形を有する符号化された光を生成する、
顕微鏡と統合するためのスペクトル符号化アセンブリ。
態様１８．
前記スペクトル符号化アセンブリが、顕微鏡の無限遠空間内かつ該顕微鏡のイメージング用対物レンズとイメージングセンサとの間に配置されている、態様17のアセンブリ。
態様１９．
前記符号化部分が、放出光を少なくとも2つのダイクロイックミラーに向けて等しく送るための少なくとも1つのビームスプリッタをさらに含む、態様17のアセンブリ。
態様２０．
顕微鏡が、光シート顕微鏡、広視野蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡のいずれかである、態様17のアセンブリ。
態様２１．
各符号化された光チャネルに対応する1つのチューブレンズをさらに含み、該1つのチューブレンズが、各チャネルからの光をイメージングセンサの別々の部分に集束させる、態様18のアセンブリ。
態様２２．
符号化部分が、チューブレンズそれぞれからの複数の符号化された光チャネルそれぞれをイメージングセンサの別々の部分に向けて送るための1つまたは複数の調節ミラーを含む、態様21のアセンブリ。
態様２３．
イメージングセンサがcMOSセンサである、態様21のアセンブリ。
態様２４．
一対のリレーレンズと、該一対のリレーレンズの中間画像平面にあるリング作動アイリス絞りとをさらに含み、
該リング作動アイリス絞りの開放量が、複数のチャネルそれぞれからのそれぞれの画像がオーバーラップしないように、イメージングセンサ上のイメージング区域に基づく、
態様21のアセンブリ。
態様２５．
少なくとも2つのダイクロイックミラーのスペクトル範囲の外の放出シグナルをフィルタリング除去するように構成された、イメージング用対物レンズと符号化部分との間の1つもしくは複数のプレフィルタリング光学系、および／またはイメージング用対物レンズを介してイメージングされる試料を照らす1つもしくは複数の励起光源に対応する波長をフィルタリング除去するように構成された1つもしくは複数のフィルタをさらに含む、態様17のアセンブリ。
態様２６．
前記イメージング用対物レンズと符号化部分との間にリレー光学系をさらに含む、態様17のアセンブリ。
態様２７．
少なくとも2つのダイクロイックミラーそれぞれが、可視スペクトル中の波長を含むスペクトル範囲を有する、態様17のアセンブリ。
態様２８．
イメージングセンサがイメージングプロセッサに通信可能に結合されている、態様18のアセンブリ。
態様２９．
試料からの蛍光シグナルを取得するイメージング用対物レンズと、
イメージングセンサと、
該イメージング用対物レンズと該イメージングセンサとの間に配置されたスペクトル符号化デバイスと
を含み、
該スペクトル符号化デバイスが第一のダイクロイックミラーおよび第二のダイクロイックミラーを含み、
該スペクトル符号化デバイスが、該第一および第二のダイクロイックミラーを介して、それぞれが周期的な波形を有する4つの符号化された光チャネルを生成する、
イメージングシステム。
態様３０．
前記4つの符号化された光チャネルが、第一のダイクロイックミラーからの第一の透過光チャネルおよび第一の反射光チャネル、ならびに第二のダイクロイックミラーからの第二の透過光チャネルおよび第二の反射光チャネルを含む、態様29のイメージングシステム。
態様３１．
非一時的メモリに記憶された実行可能な命令を含むコントローラをさらに含み、該命令が、実行された場合に該コントローラに、
4つの符号化された光チャネルの強度値の積分を計算することによって正規化強度を決定させ、
4つの符号化された光チャネルそれぞれに関し、イメージングセンサを介して、対応するチャネル画像を取得させ、
該正規化強度にしたがって各対応するチャネル画像を正規化させる、
態様30のイメージングシステム。
態様３２．
前記コントローラが、非一時的メモリに記憶されたさらなる実行可能な命令を含み、該命令が、実行された場合に該コントローラに、
各正規化されたチャネル画像にしたがってハイパースペクトルまたはマルチスペクトル画像を生成させる、
態様31のイメージングシステム。
態様３３．
生物学的試料からの蛍光シグナルをスペクトル符号化デバイスで受け取る工程；
該スペクトル符号化デバイスを介して、少なくとも2つの透過光チャネルおよび少なくとも2つの反射光チャネルを生成する工程；ならびに
該少なくとも2つの透過光チャネルおよび該少なくとも2つの反射光チャネルをイメージングセンサでイメージングする工程
を含み、
該スペクトル符号化デバイスが少なくとも2つのダイクロイックミラーを含み、該2つのダイクロイックミラーそれぞれが、周期的な波形に類似する透過率および反射率プロファイルを有する、
スペクトル蛍光イメージングのための方法。
態様３４．
少なくとも2つの透過光チャネルそれぞれによって形成された画像と、少なくとも2つの反射光チャネルそれぞれによって形成された画像とを位置合わせする工程をさらに含む、態様33の方法。
態様３５．
フェーザプロットを生成するために、位置合わせされた画像に対してフェーザ解析を実行する工程；および
該フェーザプロットにしたがってアンミキシングされた画像を生成する工程
をさらに含む、態様34の方法。

結び
上記様々な方法および技術は、本発明を実施するためのいくつかの方法を提供する。当然、記載されたすべての目的または利点が、必ずしも、本明細書に記載される任意の特定の態様にしたがって達成され得るわけではないことが理解されなければならない。したがって、たとえば、当業者は、本明細書において教示される1つの利点または利点の群を達成または最適化するが、本明細書において教示または示唆される他の目的または利点を必ずしも達成しないやり方で方法を実施し得ることを認識するであろう。本明細書には多様な代替態様が挙げられる。いくつかの態様は1つの、もう1つの、またはいくつかの特徴を具体的に含み、他の態様は1つの、もう1つの、またはいくつかの特徴を具体的に除外し、さらに他の態様は、1つの、もう1つの、またはいくつかの有利な特徴を含めることによって特定の特徴を和らげるということが理解されなければならない。

さらに、当業者は、様々な態様からの様々な特徴の適用可能性を認識するであろう。同様に、上述の様々な要素、特徴およびステップならびにそのような各要素、特徴またはステップの他の既知の均等物が、本明細書に記載される原理にしたがって方法を実施するために、当業者によって様々な組み合わせで用いられることができる。様々な要素、特徴およびステップのうち、いくつかは多様な態様に明確に含まれ、他は明確に除外される。

本出願は、特定の態様および例に関して開示されたが、本出願の態様は、具体的に開示された態様を超えて、他の代替態様および／または使用ならびにそれらの変形および均等物にまで及ぶということが当業者によって理解されよう。

いくつかの態様において、本出願の特定の態様を説明する文脈（特に、以下の特許請求の範囲のいくつかの文脈）において使用される単数形冠詞（「a」、「an」および「the」）および類似の指示は、単数形と複数形の両方を包含するものと解釈されることができる。本明細書における数値範囲の記載は、単に、範囲に入る各個の値を個別に指示する簡潔な方法として働くことを意図したものである。本明細書中で別段の指示がない限り、各個の値は、本明細書で個別に記載されているかのごとくに明細書に組み入れられる。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書中で別段の指示がない限り、または他のやり方で文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適当な順序で実施されることができる。本明細書の特定の態様に関して提供されるすべての例または例示的な文言（たとえば、「～などの」）の使用は、単に、本出願をより良く説明することを意図したものであり、他のやり方で特許請求される本出願の範囲に制限を課すものではない。明細書中のどの文言も、本出願の実施に不可欠な任意の非請求の要素を示すものとして解釈されるべきではない。

本出願の特定の態様が本明細書に記載されている。これらの態様の変形形態が、前述の説明を読むことによって当業者には明らかになるであろう。当業者は、そのような変形形態を適切に用いることができ、本出願は、本明細書に具体的に記載された以外のやり方で実施することができると考えられる。したがって、本出願の多くの態様は、適用法によって許可されるような、本明細書に添付された特許請求の範囲に記載された主題のすべての変形および均等物を含む。そのうえ、上記の要素の、そのすべての可能な変形における任意の組み合わせが、本明細書中で別段の指示がない限り、または他のやり方で文脈と明らかに矛盾しない限り、本出願によって包含される。

主題の特定の実施形態が記載された。他の実施形態が以下の特許請求の範囲内である。場合によっては、特許請求の範囲に記載される動作は、異なる順序で実行されてもなお、所望の結果を達成することができる。加えて、添付図面に示されるプロセスは、所望の結果を達成するために、必ずしも、示された特定の順序または順番を必要としない。

本明細書中で参照されるすべての特許、特許出願、特許出願の公開公報および他の資料、たとえば書籍、仕様書、刊行物、文献、物品などは、関連する任意の出願経過履歴、本文献と合致しない、もしくは衝突するもの、または本文献と現在または今後に関連する特許請求の最も広い範囲に関して限定的効果を有し得るものを除き、あらゆる意図のために、全体として参照により本明細書に組み入れられる。実例として、組み入れられる資料のいずれかと関連するある用語の説明、定義および／または用法と、本文献と関連するその用語の説明、定義および／または用法との間に不一致または衝突があるならば、本文献におけるその用語の説明、定義および／または用法が優先する。

最後に、本明細書に開示される本出願の態様は、本出願の態様の原理を例示するものであることが理解されなければならない。用いることができる他の変形が本出願の範囲に入ることができる。したがって、限定ではなく例として、本出願の態様の代替形態を、本明細書における教示にしたがって利用することができる。したがって、本出願の態様は、図示され、説明されたとおりの態様には限定されない。

Claims (35)

1. 第一のダイクロイックミラーと、
   第二のダイクロイックミラーと
   を含み、
   該第一のダイクロイックミラーの第一のスペクトル透過率曲線および第一のスペクトル反射率曲線がサイン波プロファイルを有し、
   該第二のダイクロイックミラーの第二のスペクトル透過率曲線および第二のスペクトル反射率曲線がコサイン波プロファイルを有する、
   イメージングアセンブリ。
2. 第一のダイクロイックミラーが、第一のスペクトル符号化された透過光部分および第一のスペクトル符号化された反射光部分を生成し；第二のダイクロイックミラーが、第二のスペクトル符号化された透過光部分および第二のスペクトル符号化された反射光部分を生成し；該第一のスペクトル符号化された透過光部分、該第一のスペクトル符号化された反射光、該第二のスペクトル符号化された透過光および該第二のスペクトル符号化された反射光がイメージングセンサで検出される、請求項1記載のイメージングアセンブリ。
3. イメージングセンサがサイエンティフィック相補型金属酸化膜半導体センサ（sCMOSセンサ）である、請求項2記載のイメージングアセンブリ。
4. 第一のダイクロイックミラーが、第一のスペクトル符号化された透過光部分および第一のスペクトル符号化された反射光部分を生成し；第二のダイクロイックミラーが、第二のスペクトル符号化された透過光部分および第二のスペクトル符号化された反射光部分を生成し；該第一のスペクトル符号化された透過光部分が第一の検出器を介して検出され、該第一のスペクトル符号化された反射光が第二の検出器を介して検出され、該第二のスペクトル符号化された透過光が第三の検出器を介して検出され、該第二のスペクトル符号化された反射光が第四の検出器を介して検出される、請求項1記載のイメージングアセンブリ。
5. 第一、第二、第三および第四の検出器が光電子増倍管である、請求項4記載のイメージングアセンブリ。
6. 第一および第二のダイクロイックミラーそれぞれが顕微鏡のイメージング用対物レンズからの蛍光シグナルを受け取る、請求項1記載のイメージングアセンブリ。
7. 顕微鏡が、光シート顕微鏡、広視野蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡のいずれかである、請求項1記載のイメージングアセンブリ。
8. 第一のダイクロイックミラーからの第一のスペクトル符号化された透過光または第一のスペクトル符号化された反射光を受け取るように配置された少なくとも1つの第一のルーティングミラーと、第二のダイクロイックミラーからの第二のスペクトル符号化された透過光または第二のスペクトル符号化された反射光部分を受け取るように配置された少なくとも1つの第二のルーティングミラーとをさらに含み、該第一および第二のダイクロイックミラーならびに該少なくとも1つの第一および第二のルーティングミラーが4つのスペクトル符号化された光部分を生成し、該4つのスペクトル符号化された光部分が、該第一のスペクトル符号化された透過光、該第一のスペクトル符号化された反射光、該第二のスペクトル符号化された透過光および該第二のスペクトル符号化された反射光を含む、請求項1記載のイメージングアセンブリ。
9. 4つのチューブレンズをさらに含み、各チューブレンズが、4つのスペクトル符号化された光部分の1つを受け取りかつ対応するスペクトル符号化された光部分をイメージングセンサ上に集束させるように配置されている、請求項2記載のイメージングアセンブリ。
10. 4つの調節ミラーをさらに含み、各調節ミラーが、スペクトル符号化された光部分それぞれがイメージングセンサの異なる四半分でイメージングされるよう、該イメージングセンサに対する該スペクトル符号化された光部分それぞれの対応する角度を調節するように配置されている、請求項9記載のイメージングアセンブリ。
11. 顕微鏡のイメージング用対物レンズからの蛍光シグナルを受け取るように配置されたビームスプリッタをさらに含み、該ビームスプリッタが、該蛍光シグナルを第一の蛍光シグナルおよび第二の蛍光シグナルへと等分割するように構成されており；該第一の蛍光シグナルが第一のダイクロイックミラーに向けて送られ、該第二の蛍光シグナルが第二のダイクロイックミラーに向けて送られる、請求項1記載のイメージングアセンブリ。
12. 第一および第二の蛍光シグナルの1つまたは複数をそれぞれ第一および第二のダイクロイックミラーの1つまたは複数に向けて送るための1つまたは複数のさらなるルーティングミラーをさらに含む、請求項11記載のイメージングアセンブリ。
13. イメージング用対物レンズとビームスプリッタとの間に配置された1つまたは複数のリレーレンズをさらに含む、請求項11記載のイメージングアセンブリ。
14. 1つまたは複数のプレフィルタリング光学系をさらに含み、該1つまたは複数のプレフィルタリング光学系が、第一および第二のダイクロイックミラーのスペクトル範囲の外のシグナルをフィルタリング除去するように構成されている、請求項1記載のイメージングアセンブリ。
15. 第一および第二のダイクロイックミラーのスペクトル範囲の外のシグナルをフィルタリング除去するように構成された1つもしくは複数のプレフィルタリング光学系、および／またはイメージング用対物レンズを介してイメージングされる試料を照らす1つもしくは複数の励起光源に対応する波長をフィルタリング除去するように構成された1つもしくは複数のフィルタをさらに含む、請求項12記載のイメージングアセンブリ。
16. 第一および第二のダイクロイックミラーそれぞれが400nm～700nmのスペクトル範囲を有する、請求項1記載のイメージングアセンブリ。
17. 顕微鏡のイメージング用対物レンズから受け取った放出光を複数の符号化された光チャネルへと符号化するように構成された符号化部分
    を含み、
    該符号化部分が少なくとも2つのダイクロイックミラーを含み、
    該少なくとも2つのダイクロイックミラーそれぞれが、周期的な波形を有する符号化された光を生成する、
    顕微鏡と統合するためのスペクトル符号化アセンブリ。
18. 前記スペクトル符号化アセンブリが、顕微鏡の無限遠空間内かつ該顕微鏡のイメージング用対物レンズとイメージングセンサとの間に配置されている、請求項17記載のアセンブリ。
19. 前記符号化部分が、放出光を少なくとも2つのダイクロイックミラーに向けて等しく送るための少なくとも1つのビームスプリッタをさらに含む、請求項17記載のアセンブリ。
20. 顕微鏡が、光シート顕微鏡、広視野蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡のいずれかである、請求項17記載のアセンブリ。
21. 各符号化された光チャネルに対応する1つのチューブレンズをさらに含み、該1つのチューブレンズが、各チャネルからの光をイメージングセンサの別々の部分に集束させる、請求項18記載のアセンブリ。
22. 符号化部分が、チューブレンズそれぞれからの複数の符号化された光チャネルそれぞれをイメージングセンサの別々の部分に向けて送るための1つまたは複数の調節ミラーを含む、請求項21記載のアセンブリ。
23. イメージングセンサがcMOSセンサである、請求項21記載のアセンブリ。
24. 一対のリレーレンズと、該一対のリレーレンズの中間画像平面にあるリング作動アイリス絞りとをさらに含み、
    該リング作動アイリス絞りの開放量が、複数のチャネルそれぞれからのそれぞれの画像がオーバーラップしないように、イメージングセンサ上のイメージング区域に基づく、
    請求項21記載のアセンブリ。
25. 少なくとも2つのダイクロイックミラーのスペクトル範囲の外の放出シグナルをフィルタリング除去するように構成された、イメージング用対物レンズと符号化部分との間の1つもしくは複数のプレフィルタリング光学系、および／またはイメージング用対物レンズを介してイメージングされる試料を照らす1つもしくは複数の励起光源に対応する波長をフィルタリング除去するように構成された1つもしくは複数のフィルタをさらに含む、請求項17記載のアセンブリ。
26. 前記イメージング用対物レンズと符号化部分との間にリレー光学系をさらに含む、請求項17記載のアセンブリ。
27. 少なくとも2つのダイクロイックミラーそれぞれが、可視スペクトル中の波長を含むスペクトル範囲を有する、請求項17記載のアセンブリ。
28. イメージングセンサがイメージングプロセッサに通信可能に結合されている、請求項18記載のアセンブリ。
29. 試料からの蛍光シグナルを取得するイメージング用対物レンズと、
    イメージングセンサと、
    該イメージング用対物レンズと該イメージングセンサとの間に配置されたスペクトル符号化デバイスと
    を含み、
    該スペクトル符号化デバイスが第一のダイクロイックミラーおよび第二のダイクロイックミラーを含み、
    該スペクトル符号化デバイスが、該第一および第二のダイクロイックミラーを介して、それぞれが周期的な波形を有する4つの符号化された光チャネルを生成する、
    イメージングシステム。
30. 前記4つの符号化された光チャネルが、第一のダイクロイックミラーからの第一の透過光チャネルおよび第一の反射光チャネル、ならびに第二のダイクロイックミラーからの第二の透過光チャネルおよび第二の反射光チャネルを含む、請求項29記載のイメージングシステム。
31. 非一時的メモリに記憶された実行可能な命令を含むコントローラをさらに含み、該命令が、実行された場合に該コントローラに、
    4つの符号化された光チャネルの強度値の積分を計算することによって正規化強度を決定させ、
    4つの符号化された光チャネルそれぞれに関し、イメージングセンサを介して、対応するチャネル画像を取得させ、
    該正規化強度にしたがって各対応するチャネル画像を正規化させる、
    請求項30記載のイメージングシステム。
32. 前記コントローラが、非一時的メモリに記憶されたさらなる実行可能な命令を含み、該命令が、実行された場合に該コントローラに、
    各正規化されたチャネル画像にしたがってハイパースペクトルまたはマルチスペクトル画像を生成させる、
    請求項31記載のイメージングシステム。
33. 生物学的試料からの蛍光シグナルをスペクトル符号化デバイスで受け取る工程；
    該スペクトル符号化デバイスを介して、少なくとも2つの透過光チャネルおよび少なくとも2つの反射光チャネルを生成する工程；ならびに
    該少なくとも2つの透過光チャネルおよび該少なくとも2つの反射光チャネルをイメージングセンサでイメージングする工程
    を含み、
    該スペクトル符号化デバイスが少なくとも2つのダイクロイックミラーを含み、該2つのダイクロイックミラーそれぞれが、周期的な波形に類似する透過率および反射率プロファイルを有する、
    スペクトル蛍光イメージングのための方法。
34. 少なくとも2つの透過光チャネルそれぞれによって形成された画像と、少なくとも2つの反射光チャネルそれぞれによって形成された画像とを位置合わせする工程をさらに含む、請求項33記載の方法。
35. フェーザプロットを生成するために、位置合わせされた画像に対してフェーザ解析を実行する工程；および
    該フェーザプロットにしたがってアンミキシングされた画像を生成する工程
    をさらに含む、請求項34記載の方法。

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