JP5289884B2 - レーザ顕微鏡装置 - Google Patents

Description

本発明は、レーザ顕微鏡装置に関するものである。

従来、異なる周波数帯域のレーザ光を導光する２つの光路と、一方の光路のレーザ光を反射し、他方の光路のレーザ光を透過させて２つの光路を合成するダイクロックミラーとを備えるレーザ顕微鏡装置が知られている（例えば、特許文献１参照）。このレーザ顕微鏡装置では、一方の光路を導光されるレーザ光として近赤外パルスレーザ光を用いており、これを標本に照射して、多光子励起効果により発生した蛍光を観察する。合成されたレーザ光の光路には、レーザ波長を反射し標本からの蛍光を透過する励起ダイクロイックミラーが設けられている。
特開２００４−８６００９号公報

上記のようなレーザ顕微鏡装置において、通常、励起ダイクロイックミラーは、レーザ光を反射するとともに標本からの蛍光を透過させるように設計される。このようにすることで、ダイクロイックミラーの反射面に用いる干渉膜の反射率特性が、波長幅の狭いレーザ光だけを反射させて蛍光を含む他の帯域は透過させるようになるため、干渉膜の設計を容易なものとすることができるためである。

しかしながら、ダイクロイックミラーの干渉膜は多層膜で構成されているため、その反射光路では、特定の波長域のみにおいて群速度分散が大きくなる。これは、多層膜の各層における反射によって波長毎の光路長が大きく変化することが影響している。多光子蛍光観察に用いるパルス幅が１００フェムト秒程度の極短パルスレーザ光は、通常１０ｎｍ程度の波長幅を有するので、その波長幅の範囲に群速度分散の大きい波長域が含まれてしまうと、この多層膜で反射された極短パルスレーザ光はチャープが大きくなってパルス幅が広がってしまう。しかも、このチャープは非線形チャープであるため、例えばプリズムペアを用いた線形的なチャープ調節方法では補正することができない。したがってパルス幅の広がりを補正できないので、多光子励起効果を効率的に発生させることができないという不都合があった。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、複雑な干渉膜の構成を要することなく、多光子励起効果を効率的に発生させて明るく鮮明な多光子蛍光画像による観察を行うことができるレーザ顕微鏡装置を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、可視レーザ光を導光する第１の光路と、極短パルスレーザ光を導光する第２の光路と、前記第１の光路を導光されてきた可視レーザ光を反射し、前記第２の光路を導光されてきた極短パルスレーザ光を透過させて、前記第１の光路と前記第２の光路とを合成する第１のダイクロイックミラーと、該第１のダイクロイックミラーからのレーザ光を標本上で２次元走査する走査手段と、該走査手段により走査されたレーザ光を前記標本に照射する一方、前記標本において発生した蛍光を集光する観察光学系と、前記可視レーザ光を反射するとともに、前記標本からの蛍光を透過させる第２のダイクロイックミラーと、該第２のダイクロイックミラーを透過してきた蛍光を検出する検出手段とを備え、前記第１のダイクロイックミラーが、前記走査手段と前記第２のダイクロイックミラーとの間に設けられ、前記標本からの蛍光を前記第２のダイクロイックミラーに向けて反射するレーザ顕微鏡装置を採用する。

本発明によれば、第１の光路を導光されてきた可視レーザ光は、第１のダイクロイックミラーおよび第２のダイクロイックミラーにより反射され、走査手段により走査されて観察光学系により標本に照射される。一方、第２の光路を導光されてきた極短パルスレーザ光は、第１のダイクロイックミラーを透過して、走査手段により走査されて観察光学系により標本に照射される。可視レーザ光および極短パルスレーザ光の照射により、標本において発生した蛍光は、観察光学系により集光され、第２のダイクロイックミラーを透過して検出手段により検出される。

この場合に極短パルスレーザ光は、多層膜により構成された各ダイクロイックミラーにおける反射を伴うことなく標本に照射されるので、反射による波長毎の光路長変動を防止して、極短パルスレーザ光の群速度分散によるパルス幅の広がりを防止することができる。その結果、標本における多光子励起効果を効率的に発生させて明るく鮮明な多光子蛍光画像による観察を行うことが可能となる。

また、第２のダイクロイックミラーにより、可視レーザ光を反射するとともに標本からの蛍光を透過させることで、波長幅の狭い可視レーザ光の反射帯域を狭くするとともに、蛍光の透過帯域を広くすることができ、第２のダイクロイックミラーの干渉膜の設計を容易なものとすることができる。特に、多重染色を行った標本からの蛍光を観察する場合には、各蛍光物質を励起させるために複数の波長域を有する可視レーザ光を使用する必要がある。この場合、第２のダイクロイックミラーは、可視レーザ光の波長のみを反射させ、その他の蛍光波長領域を透過させるように設計すればよいので、その干渉膜の設計を容易なものとすることができる。

上記発明において、前記第２のダイクロイックミラーが、異なる分光透過率特性を有する複数のダイクロイックミラー部と、該複数のダイクロイックミラー部を切り替える切り替え手段とを備えることとしてもよい。
このようにすることで、切り替え手段により、可視レーザ光の波長に応じて異なる分光透過率特性を有する複数のダイクロイックミラー部を切り替えて、観察対象に応じて可視レーザ光の波長を変更し、様々な観察対象を観察することが可能となる。

本発明は、可視レーザ光を導光する第１の光路と、極短パルス励起レーザ光を導光する第２の光路と、前記第１の光路を導光されてきた可視レーザ光を反射し、前記第２の光路を導光されてきた極短パルスレーザ光を透過させて、前記第１の光路と前記第２の光路とを合成する第１のダイクロイックミラーと、該第１のダイクロイックミラーからのレーザ光を標本上で２次元走査する走査手段と、該走査手段により走査されたレーザ光を前記標本に照射する一方、前記標本において発生した蛍光を集光する観察光学系と、前記標本からの蛍光を反射するとともに、前記極短パルスレーザ光を透過させる第２のダイクロイックミラーと、該第２のダイクロイックミラーにより反射された蛍光を検出する検出手段とを備え、前記第１のダイクロイックミラーが、前記走査手段と前記第２のダイクロイックミラーとの間に設けられ、前記標本からの蛍光を透過させるレーザ顕微鏡装置を採用する。

本発明によれば、第１の光路を導光されてきた可視レーザ光は、第１のダイクロイックミラーにより反射され、走査手段により走査されて観察光学系により標本に照射される。一方、第２の光路を導光されてきた極短パルスレーザ光は、第１のダイクロイックミラーおよび第２のダイクロイックミラーを透過して、走査手段により走査されて観察光学系により標本に照射される。可視レーザ光および極短パルスレーザ光の照射により、標本において発生した蛍光は、第１のダイクロイックミラーを透過して、第２のダイクロイックミラーにより反射されて検出手段により検出される。

この場合に極短パルスレーザ光は、多層膜により構成された各ダイクロイックミラーにおける反射を伴うことなく標本に照射されるので、反射による波長毎の光路長変動を防止して、極短パルスレーザ光の群速度分散によるパルス幅の広がりを防止することができる。その結果、標本における多光子励起効果を効率的に発生させて明るく鮮明な多光子蛍光画像による観察を行うことが可能となる。
また、第１のダイクロイックミラーにより、可視レーザ光を反射するとともに標本からの蛍光を透過させることで、波長幅の狭い可視レーザ光の反射帯域を狭くするとともに、蛍光の透過帯域を広くすることができ、第１のダイクロイックミラーの干渉膜の設計を容易なものとすることができる。

上記発明において、前記第1のダイクロイックミラーが、異なる分光透過率特性を有する複数のダイクロイックミラー部と、該複数のダイクロイックミラー部を切り替える切り替え手段とを備えることとしてもよい。
このようにすることで、切り替え手段により、可視レーザ光の波長に応じて異なる分光透過率特性を有する複数のダイクロイックミラー部を切り替えて、観察対象に応じて可視レーザ光の波長を変更し、様々な観察対象を観察することが可能となる。

上記発明において、前記第２の光路の直線状の光路部分に前記第1のダイクロイックミラーおよび前記走査手段が設けられていることとしてもよい。
このようにすることで、第２の光路を導光されてきた極短パルスレーザ光の走査手段に対する光軸調整を容易なものとすることができる。

上記発明において、前記走査手段と前記標本との間に挿脱可能に設けられ、前記標本からの蛍光を反射する一方、前記極短パルスレーザ光を透過させる第３のダイクロイックミラーと、該第３のダイクロイックミラーにより反射された蛍光を検出するノンディスキャン検出部とを備えることとしてもよい。

このようにすることで、極短パルスレーザ光を照射することにより標本において発生した蛍光を走査手段に戻すことなく第３のダイクロイックミラーによって反射してノンディスキャン検出部により検出することができる。この際、第３のダイクロイックミラーにおいて、極短パルスレーザ光を反射させずに標本に照射することで、特定の波長域における極短パルスレーザ光のパルス幅が広がりを防止することができ、多光子励起効果をさらに効率的に発生させることが可能となる。

本発明によれば、複雑な干渉膜の構成を要することなく、多光子励起効果を効率的に発生させて明るく鮮明な多光子蛍光画像による観察を行うことができるという効果を奏する。

〔第１の実施形態〕
本発明の第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１は、図１に示されるように、入力されたレーザ光を走査するスキャンユニット２と、複数のレンズを有しスキャンユニット２からのレーザ光を導光する鏡筒３と、鏡筒３により導光されたレーザ光を標本Ａに照射し標本Ａにおいて発生した蛍光を集光する対物レンズ（観察光学系）５と、鏡筒３と対物レンズ５との間に設けられたノンディスキャン検出部４とを備えている。

スキャンユニット２は、可視レーザ光が入力されるＶＩＳポート１１と、ＶＩＳポート１１に入力された可視レーザ光を導光する第１の光路１２と、ＩＲパルスレーザ光（近赤外超短パルスレーザ光）が入力されるＩＲポート２１と、ＩＲポート２１に入力されたＩＲパルスレーザ光を導光する第２の光路２２とを備えている。ここで、ＩＲパルスレーザ光は、パルス幅が１００フェムト秒程度のパルス光であり、蛍光物質の種類に応じて、例えば７００ｎｍから１０００ｎｍの範囲で波長変更が可能である。

また、スキャンユニット２は、第１の光路１２を導光されてきた可視レーザ光を反射し、第２の光路２２を導光されてきたＩＲパルスレーザ光を透過させて、第１の光路１２と第２の光路２２とを合成する第１のダイクロイックミラー２３と、第１のダイクロイックミラー２３からのレーザ光を標本Ａ上で２次元走査するＸＹガルバノミラー（走査手段）２４とを備えている。

また、スキャンユニット２は、第１の光路１２上に設けられ、第１の光路１２を導光されてきた可視レーザ光を第１のダイクロイックミラー２３に向けて反射するとともに、標本Ａからの蛍光を透過させる第２のダイクロイックミラー１８と、第２のダイクロイックミラー１８を透過してきた蛍光を検出する検出ユニット（検出手段）２５とを備えている。

第１のダイクロイックミラー２３およびＸＹガルバノミラー２４は、第２の光路２２の直線状の光路部分に設けられている。このようにすることで、第２の光路２２を導光されるＩＲパルスレーザ光のＸＹガルバノミラー２４に対する光軸調整を容易なものとすることができる。

第１のダイクロイックミラー２３は、第２のダイクロイックミラー１８とＸＹガルバノミラー２４との間に設けられ、標本Ａからの蛍光を第２のダイクロイックミラー１８に向けて反射するようになっている。

ＸＹガルバノミラー２４は、例えば銀コートされた一対のガルバノミラー（図示略）を有しており、該一対のガルバノミラーの揺動角度を変化させ、ラスタスキャン方式で駆動されるようになっている。これにより、第１のダイクロイックミラー２３からの可視レーザ光またはＩＲパルスレーザ光を標本Ａ上において２次元的に走査させることができるようになっている。

第２のダイクロイックミラー１８は、ターレット２８と、ターレット２８に固定され異なる透過率特性を有する複数のダイクロイックミラー部２７ａ，２７ｂと、ターレット２８を回転させる未図示の回転機構（切り替え手段）とを備えている。回転機構の駆動により、第２のダイクロイックミラー１８は、第１の光路１２を導光されてきた可視レーザ光の波長に応じて複数のダイクロイックミラー部２７ａ，２７ｂを切り替えることができるようになっている。

検出ユニット２５は、第２のダイクロイックミラー１８を透過してきた蛍光を集光する共焦点レンズ１７と、標本Ａの焦点面において発生した蛍光のみを通過させるピンホール１６と、ピンホール１６を通過した光を分光する分光ダイクロックミラー１５と、分光ダイクロイックミラー１５により分光された蛍光から不要な光を遮断する第1のバリアフィルタ１４と、第1のバリアフィルタ１４を透過した蛍光を検出する第１の光検出器１３とを備えている。符号１９は第２のバリアフィルタ、符号２０は第２の光検出器である。第１の光検出器１３、第２の光検出器２０は、例えば、光電子増倍管により構成されている。

鏡筒３は、対物レンズ５により集光された蛍光を結像させる結像レンズ３３と、結像レンズ３３により結像された蛍光を略平行光にする瞳投影レンズ３１と、結像レンズ３３と瞳投影レンズ３１との間に設けられ、標本Ａからの蛍光を偏向する反射ミラー３２とを備えている。

ノンディスキャン検出部４は、対物レンズ５と鏡筒３との間に挿脱可能に設けられた第３のダイクロイックミラー４１と、第３のダイクロイックミラー４１により反射された蛍光を検出する第３の光検出器４５と、第３のダイクロイックミラー４１と第３の光検出器４５との間に設けられた投影レンズ４２，４４およびバリアフィルタ４３とを備えている。ここで、第３のダイクロイックミラー４１は、標本Ａからの蛍光を反射する一方で、ＩＲパルスレーザ光を透過させるようになっている。

上記のように構成された本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１の作用について以下に説明する。
まず、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１を用いて、検出ユニット２５により標本Ａの多光子蛍光観察を行う場合について説明する。
この場合には、図示しないレーザ光源を作動させ、ＩＲポート２１にＩＲパルスレーザ光を入射させる。ＩＲポート２１から第２の光路２２に導光されたＩＲパルスレーザ光は、第１のダイクロイックミラー２３を透過してＸＹガルバノミラー２４に導光される。ＸＹガルバノミラー２４では、ＩＲパルスレーザ光を標本Ａ上において２次元的に走査させる。このように走査されたＩＲパルスレーザ光は、瞳投影レンズ３１を透過して反射ミラー３２により偏向され、結像レンズ３３を透過した後に、対物レンズ５により標本Ａ上に照射される。

標本Ａ上の対物レンズ５の焦点面においては、ＩＲパルスレーザ光の光子密度が高くなり、多光子励起効果が発生して標本Ａ内の蛍光物質が励起され、多光子蛍光が発生する。発生した多光子蛍光は、対物レンズ５により集光され、結像レンズ３３により結像されて反射ミラー３２により偏向される。偏向された多光子蛍光は、瞳投影レンズ３１により略平行光にされ、ＸＹガルバノミラー２４に導光される。ＸＹガルバノミラー２４を透過した多光子蛍光は、第１のダイクロイックミラー２３により反射され、第２のダイクロイックミラー１８を透過して検出ユニット２５に導光される。

検出ユニット２５に導光された多光子蛍光は、共焦点レンズ１７により集光され、標本Ａの焦点面において発生した多光子蛍光のみがピンホール１６を通過する。ピンホール１６を通過した多光子蛍光は、分光ダイクロックミラー１５および第1のバリアフィルタ１４を透過することにより、不要な光が遮断され、第１の光検出器１３により蛍光強度情報として検出される。

このように第１の光検出器１３により検出された多光子蛍光の強度情報とＸＹガルバノミラー２４によるＩＲパルスレーザ光の照射位置とを対応づけて記憶することにより、２次元的な多光子蛍光画像を構築することが可能となる。
なお、標本Ａからの多光子蛍光を分光ダイクロイックミラー１５により反射して、第２の検出器２０により検出することとしてもよい。

また、上記の多光子蛍光観察において、第３の光検出器４５を用いてノンディスキャン検出を行うことも可能である。この場合には、ノンディスキャン検出部４を作動させ、第３のダイクロイックミラー４１をＩＲパルスレーザ光および標本Ａからの蛍光の光路上に移動させる。

鏡筒３を導光されて第３のダイクロイックミラー４１を透過したＩＲパルスレーザ光は、対物レンズ５により標本Ａ上に集光される。これにより標本Ａにおいて発生した多光子蛍光は、対物レンズ５により集光され、第３のダイクロイックミラー４１により第３の光検出器４５に向けて反射される。反射された多光子蛍光は、投影レンズ４２，４４およびバリアフィルタ４３を透過した後に第３の光検出器４５により検出される。

上記のように、標本Ａから発生した蛍光をＸＹガルバノミラー２４に戻さずに第３の光検出器４５により検出することで、各光学部品における信号の減衰を最小限に抑え、多光子蛍光のＳ／Ｎ比を向上させることができる。ここで、ノンディスキャン検出では共焦点ピンホールにより標本Ａの焦点面において発生した多光子蛍光のみを切り出すことはできないが、多光子励起による蛍光はＩＲパルスレーザ光の集光位置（ピント位置）のごく近傍でしか生じないので、共焦点ピンホールがなくても標本Ａの光学的断面画像を取得することができる。

次に、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１を用いて標本Ａの可視光観察を行う場合について説明する。
この場合には、図示しないレーザ光源を作動させ、ＶＩＳポート１１に可視レーザ光を入射させる。ＶＩＳポート１１から第１の光路１２に導光された可視レーザ光は、第２のダイクロイックミラー１８により第１のダイクロイックミラー２３に向けて反射される。反射された可視レーザ光は、第１のダイクロイックミラー２３によりＸＹガルバノミラー２４に向けて反射され、ＸＹガルバノミラー２４に導光される。ＸＹガルバノミラー２４では、可視レーザ光を標本Ａ上において２次元的に走査させる。このように走査された可視レーザ光は、瞳投影レンズ３１を透過して反射ミラー３２により偏向され、結像レンズ３３を透過した後に、対物レンズ５により標本Ａ上に照射される。

標本Ａ上の対物レンズ５の焦点面においては、標本Ａ内の蛍光物質が励起され、蛍光が発生する。発生した蛍光は、対物レンズ５により集光され、結像レンズ３３により結像されて反射ミラー３２により偏向される。偏向された蛍光は、瞳投影レンズ３１により略平行光にされ、ＸＹガルバノミラー２４に導光される。ＸＹガルバノミラー２４を透過した蛍光は、第１のダイクロイックミラー２３により反射され、第２のダイクロイックミラー１８を透過して検出ユニット２５に導光される。

検出ユニット２５に導光された蛍光は、共焦点レンズ１７により集光され、標本Ａの焦点面において発生した蛍光のみがピンホール１６を透過する。ピンホール１６を透過した蛍光は、分光ダイクロックミラー１５および第1のバリアフィルタ１４を透過することにより、不要な光が遮断され、第１の光検出器１３により蛍光強度情報として検出される。

このように第１の光検出器１３により検出された蛍光の強度情報とＸＹガルバノミラー２４による可視レーザ光の照射位置とを対応づけて記憶することにより、２次元的な蛍光画像を構築することが可能となる。
なお、標本Ａからの蛍光を分光ダイクロイックミラー１５により反射して、第２の検出器２０により検出することとしてもよい。

以上のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１によれば、多光子蛍光観察を行う際、ＩＲパルスレーザ光は、多層膜により構成された各ダイクロイックミラーにおいて反射を伴うことなく標本Ａに照射される。これにより、反射による波長毎の光路長変動を防止して、ＩＲパルスレーザ光の群速度分散によるパルス幅の広がりを防止することができる、その結果、標本Ａにおける多光子励起効果を効率的に発生させて明るく鮮明な多光子蛍光画像による観察を行うことが可能となる。

また、可視光観察を行う際、第２のダイクロイックミラー１８により、可視レーザ光を反射するとともに標本Ａからの蛍光を透過させることで、波長幅の狭い可視レーザ光の反射帯域を狭くするとともに蛍光の透過帯域を広くすることができ、第２のダイクロイックミラーの干渉膜の設計を容易なものとすることができる。特に、多重染色を行った標本Ａからの蛍光を観察する場合には、各蛍光物質を励起させるために複数の波長域を有する可視レーザ光を使用する必要がある。この場合、第２のダイクロイックミラー１８は、使用する可視レーザ光の波長のみを反射させて、標本Ａからの蛍光は透過させるように設計すればよいので、その干渉膜の設計を容易なものとすることができる。

また、第２のダイクロイックミラー１８を、異なる透過率特性を有する複数のダイクロイックミラー部２７ａ，２７ｂを切り替え可能な構成とすることで、可視レーザ光の波長に応じて、異なる透過率特性を有する複数のダイクロイックミラー部２７ａ，２７ｂを切り替えることができる。これにより、観察対象に応じて可視レーザ光の波長を変更し、該可視レーザ光を標本Ａに照射して蛍光を発生させることができ、様々な観察対象を観察することが可能となる。

〔第２の実施形態〕
次に、本発明の第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置について図面を参照して説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置５１が第１の実施形態と異なる点は、可視レーザ光とＩＲパルスレーザ光の光路を合成するダイクロイックミラーにおいて、標本Ａからの蛍光を透過させる点である。以下、本実施形態のレーザ顕微鏡装置５１について、第１の実施形態と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。

本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置５１は、図２に示されるように、入力されたレーザ光を走査するスキャンユニット５２と、複数のレンズを有しスキャンユニット５２からのレーザ光を導光する鏡筒３と、鏡筒３により導光されたレーザ光を標本Ａに照射し標本Ａにおいて発生した蛍光を集光する対物レンズ（観察光学系）５と、鏡筒３と対物レンズ５との間に設けられたノンディスキャン検出部４とを備えている。

スキャンユニット５２は、第１の光路１２上に設けられ、第１の光路１２を導光されてきた可視レーザ光を第１のダイクロイックミラー５６に向けて反射する反射ミラー５８と、第２の光路２２に設けられ、第２の光路２２を導光されてきたＩＲパルスレーザ光を透過させる第２のダイクロイックミラー５３とを備えている。

また、スキャンユニット５２は、第１の光路１２を導光されてきた可視レーザ光を反射し、第２の光路２２を導光されてきたＩＲパルスレーザ光を透過させて、第１の光路１２と第２の光路２２とを合成する第１のダイクロイックミラー５６と、第１のダイクロイックミラー５６からのレーザ光を標本Ａ上で２次元走査するＸＹガルバノミラー（走査手段）２４とを備えている。

第１のダイクロイックミラー５６は、第２のダイクロイックミラー５３とＸＹガルバノミラー２４との間に設けられ、標本Ａからの蛍光を透過させるようになっている。第２のダイクロイックミラー５３は、第１のダイクロイックミラー５６を透過してきた蛍光を検出ユニット（検出手段）２５に向けて反射するようになっている。

第１のダイクロイックミラー５６は、ターレット５４と、ターレット５４に固定され異なる透過率特性を有する複数のダイクロイックミラー部５５ａ，５５ｂと、ターレット５４を回転させる未図示の回転機構（切り替え手段）とを備えている。回転機構の駆動により、第１のダイクロイックミラー５６は、第１の光路１２を導光されてきた可視レーザ光の波長に応じて複数のダイクロイックミラー部５５ａ，５５ｂを切り替えることができるようになっている。

上記のように構成された本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置５１の作用について以下に説明する。
まず、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置５１を用いて、検出ユニット２５により標本Ａの多光子蛍光観察を行う場合について説明する。
この場合には、図示しないレーザ光源を作動させ、ＩＲポート２１にＩＲパルスレーザ光を入射させる。ＩＲポート２１から第２の光路２２に導光されたＩＲパルスレーザ光は、第２のダイクロイックミラー５３および第１のダイクロイックミラー５６を透過してＸＹガルバノミラー２４に導光される。ＸＹガルバノミラー２４では、ＩＲパルスレーザ光を標本Ａ上において２次元的に走査させる。このように走査されたＩＲパルスレーザ光は、瞳投影レンズ３１を透過して反射ミラー３２により偏向され、結像レンズ３３を透過した後に、対物レンズ５により標本Ａ上に照射される。

標本Ａ上の対物レンズ５の焦点面においては、ＩＲパルスレーザ光の光子密度が高くなり、多光子励起効果が発生して標本Ａ内の蛍光物質が励起され、多光子蛍光が発生する。発生した多光子蛍光は、対物レンズ５により集光され、結像レンズ３３により結像されて反射ミラー３２により偏向される。偏向された多光子蛍光は、瞳投影レンズ３１により略平行光にされ、ＸＹガルバノミラー２４に導光される。ＸＹガルバノミラー２４を透過した多光子蛍光は、第１のダイクロイックミラー５６を透過して第２のダイクロイックミラー５３により検出ユニット２５に向けて反射される。

検出ユニット２５に導光された多光子蛍光は、共焦点レンズ１７により集光され、標本Ａの焦点面において発生した多光子蛍光のみがピンホール１６を通過する。ピンホール１６を通過した多光子蛍光は、分光ダイクロックミラー１５および第1のバリアフィルタ１４を透過することにより、不要な光が遮断され、第１の光検出器１３により蛍光強度情報として検出される。

このように第１の光検出器１３により検出された多光子蛍光の強度情報とＸＹガルバノミラー２４によるＩＲパルスレーザ光の照射位置とを対応づけて記憶することにより、２次元的な多光子蛍光画像を構築することが可能となる。
また、上記の多光子蛍光観察において、第３の光検出器４５を用いてノンディスキャン検出を行うことも可能である。この場合には、ノンディスキャン検出部４を作動させ、第３のダイクロイックミラー４１をＩＲパルスレーザ光および標本Ａからの蛍光の光路上に移動させる。

次に、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置５１を用いて標本Ａの可視光観察を行う場合について説明する。
この場合には、図示しないレーザ光源を作動させ、ＶＩＳポート１１に可視レーザ光を入射させる。ＶＩＳポート１１から第１の光路１２に導光された可視レーザ光は、反射ミラー５８により第１のダイクロイックミラー５６に向けて反射される。反射された可視レーザ光は、第１のダイクロイックミラー５６によりＸＹガルバノミラー２４に向けて反射され、ＸＹガルバノミラー２４に導光される。ＸＹガルバノミラー２４では、可視レーザ光を標本Ａ上において２次元的に走査させる。このように走査された可視レーザ光は、瞳投影レンズ３１を透過して反射ミラー３２により偏向され、結像レンズ３３を透過した後に、対物レンズ５により標本Ａ上に照射される。

標本Ａ上の対物レンズ５の焦点面においては、標本Ａ内の蛍光物質が励起され、蛍光が発生する。発生した蛍光は、対物レンズ５により集光され、結像レンズ３３により結像されて反射ミラー３２により偏向される。偏向された蛍光は、瞳投影レンズ３１により略平行光にされ、ＸＹガルバノミラー２４に導光される。ＸＹガルバノミラー２４を透過した蛍光は、第１のダイクロイックミラー５６を透過して第２のダイクロイックミラー５３により検出ユニット２５に向けて反射される。

検出ユニット２５に導光された蛍光は、共焦点レンズ１７により集光され、標本Ａの焦点面において発生した蛍光のみがピンホール１６を通過する。ピンホール１６を通過した蛍光は、分光ダイクロックミラー１５および第１のバリアフィルタ１４を透過することにより、不要な光が遮断され、第１の光検出器１３により蛍光強度情報として検出される。

このように第１の光検出器１３により検出された蛍光の強度情報とＸＹガルバノミラー２４による可視レーザ光の照射位置とを対応づけて記憶することにより、２次元的な蛍光画像を構築することが可能となる。

以上のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置５１によれば、第１の実施形態と同様に、多光子蛍光観察を行う際、ＩＲパルスレーザ光は、多層膜により構成された各ダイクロイックミラーにおいて反射を伴うことなく標本Ａに照射されるので、反射による波長毎の光路長変動を防止して、ＩＲパルスレーザ光の群速度分散によるパルス幅の広がりを防止することができる、その結果、標本Ａにおける多光子励起効果を効率的に発生させて明るく鮮明な多光子蛍光画像による観察を行うことが可能となる。

また、第１のダイクロイックミラー５６を、異なる透過率特性を有する複数のダイクロイックミラー部５５ａ，５５ｂを切り替え可能な構成とすることで、可視レーザ光の波長に応じて、異なる透過率特性を有する複数のダイクロイックミラー部５５ａ，５５ｂを切り替えることができる。これにより、観察対象に応じて可視レーザ光の波長を変更し、該可視レーザ光を標本Ａに照射して蛍光を発生させることができ、様々な観察対象を観察することが可能となる。

本発明の第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成を示すブロック図である。 本発明の第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成を示すブロック図である。

符号の説明

Ａ 標本
１，５１ レーザ顕微鏡装置
２，５２ スキャンユニット
３ 鏡筒
４ ノンディスキャン検出部
５ 対物レンズ
１２ 第１の光路
１３，２０，４５ 光検出器
１８，５３ 第２のダイクロイックミラー
２２ 第２の光路
２３，５４ 第１のダイクロイックミラー
２４ ＸＹガルバノミラー
２５ 検出ユニット
２７ａ，２７ｂ ダイクロイックミラー部
４１ 第３のダイクロイックミラー
５５ａ，５５ｂ ダイクロイックミラー部

Claims (6)

1. 可視レーザ光を導光する第１の光路と、
   極短パルスレーザ光を導光する第２の光路と、
   前記第１の光路を導光されてきた可視レーザ光を反射し、前記第２の光路を導光されてきた極短パルスレーザ光を透過させて、前記第１の光路と前記第２の光路とを合成する第１のダイクロイックミラーと、
   該第１のダイクロイックミラーからのレーザ光を標本上で走査する走査手段と、
   該走査手段により走査されたレーザ光を前記標本に照射する一方、前記標本において発生した蛍光を集光する観察光学系と、
   前記可視レーザ光を反射するとともに、前記標本からの蛍光を透過させる第２のダイクロイックミラーと、
   該第２のダイクロイックミラーを透過してきた蛍光を検出する検出手段とを備え、
   前記第１のダイクロイックミラーが、前記走査手段と前記第２のダイクロイックミラーとの間に設けられ、前記標本からの蛍光を前記第２のダイクロイックミラーに向けて反射するレーザ顕微鏡装置。
2. 前記第２のダイクロイックミラーが、
   異なる分光透過率特性を有する複数のダイクロイックミラー部と、
   該複数のダイクロイックミラー部を切り替える切り替え手段とを備える請求項１に記載のレーザ顕微鏡装置。
3. 可視レーザ光を導光する第１の光路と、
   極短パルス励起レーザ光を導光する第２の光路と、
   前記第１の光路を導光されてきた可視レーザ光を反射し、前記第２の光路を導光されてきた極短パルスレーザ光を透過させて、前記第１の光路と前記第２の光路とを合成する第１のダイクロイックミラーと、
   該第１のダイクロイックミラーからのレーザ光を標本上で走査する走査手段と、
   該走査手段により走査されたレーザ光を前記標本に照射する一方、前記標本において発生した蛍光を集光する観察光学系と、
   前記標本からの蛍光を反射するとともに、前記極短パルスレーザ光を透過させる第２のダイクロイックミラーと、
   該第２のダイクロイックミラーにより反射された蛍光を検出する検出手段とを備え、
   前記第１のダイクロイックミラーが、前記走査手段と前記第２のダイクロイックミラーとの間に設けられ、前記標本からの蛍光を透過させるレーザ顕微鏡装置。
4. 前記第1のダイクロイックミラーが、
   異なる分光透過率特性を有する複数のダイクロイックミラー部と、
   該複数のダイクロイックミラー部を切り替える切り替え手段とを備える請求項３に記載のレーザ顕微鏡装置。
5. 前記第２の光路の直線状の光路部分に前記第1のダイクロイックミラーおよび前記走査手段が設けられている請求項１から請求項４のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
6. 前記走査手段と前記標本との間に挿脱可能に設けられ、前記標本からの蛍光を反射する一方、前記極短パルスレーザ光を透過させる第３のダイクロイックミラーと、
   該第３のダイクロイックミラーにより反射された蛍光を検出するノンディスキャン検出部と
   を備える請求項１から請求項５のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
   

Images