JP4642401B2 - レーザ走査型観察装置 - Google Patents

Description

この発明はレーザ走査型観察装置に関するものである。

従来、生体等の試料にその表面から励起光を照射して、試料の表面下の比較的深い位置から発せられる蛍光を検出することにより、細胞等の機能を観察する装置として、多光子励起型の測定装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
この多光子励起型の測定装置においては、試料から発せられる蛍光を、シングルモードファイバにより接続された外部の光電子増倍管によって検出するように構成されている。
特開２００２−２４３６４１号公報（第３頁等）

しかしながら、シングルモードファイバは、コア径が細く、試料から戻る蛍光を制限してしまうため、効率よく測定することができないという不都合がある。蛍光を効率よく測定する目的からすれば、光電子増倍管は測定ヘッドの対物レンズ直後に配置することが好ましいが、光電子増倍管はその大きさが比較的大きいために測定ヘッドが大型化してしまい、試料の観察対象部位に合わせて種々の姿勢や位置に配置する用途、例えば、実験小動物等を生きたまま(in vivo)観察する場合等には適していない。

一方、コア径が太く試料からの蛍光を制限しない光ファイバとして、マルチモードファイバを使用することが考えられるが、マルチモードファイバは多数の伝送モードで光を伝播する。このため、レーザ光源から極短パルスレーザを入射させた場合に、多モード分散を生じてパルス幅が長くなってしまい、そのまま使用したのでは、効率的に多光子励起効果を発生させることができないという不都合がある。

この発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、レーザ光源から発せられたパルス幅の短い極短パルスレーザを試料に照射しながら、試料から得られる蛍光量の損失を低減して明るい蛍光画像を得ることができ、かつ、測定ヘッドをコンパクトに構成することができるレーザ走査型観察装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は、以下の手段を提供する。
本発明は、極短パルスレーザ光を発生する第１のレーザ光源と、連続発光レーザ光を発生する第２のレーザ光源と、これらレーザ光源からのレーザ光を試料上に走査させる光走査部と、該光走査部により走査されたレーザ光を試料上に結像させる対物光学系とを備える測定ヘッドと、第１のレーザ光源からの極短パルスレーザ光に対する試料からの戻り光を検出する第１の撮像手段と、第２のレーザ光源からの連続発光レーザ光に対する試料からの戻り光を検出する第２の撮像手段とを備え、前記第１のレーザ光源、第２のレーザ光源および前記第２の撮像手段と前記測定ヘッドとが、シングルモードファイバからなる第１の光ファイバにより接続され、前記第１の撮像手段と前記測定ヘッドとが、前記第１の光ファイバよりコア径の大きな第２の光ファイバにより接続されているレーザ走査型観察装置を提供する。

本発明によれば、第１のレーザ光源から発せられた極短パルスレーザ光は、第１の光ファイバにより伝播されて測定ヘッドに入り、光走査部の作動により走査されて対物光学系により試料上に結像される。極短パルスレーザ光が照射されることにより試料から発せられた戻り光は対物光学系および光走査部を介して戻り第２の光ファイバを介して第１の撮像手段により検出される。
この場合において、第２の光ファイバは、第１の光ファイバより大きなコア径を有しているので、測定ヘッドに入射される極短パルスレーザ光は第１の光ファイバ内において多モード分散を生じさせることなく、また、試料からの戻り光を第２の光ファイバにより無駄なく伝播して第１の撮像手段に到達させることができる。

また、測定ヘッドと、光源および撮像手段とを光ファイバによって接続することにより、測定ヘッドを大型化させることなく、しかも、光ファイバを取り回して自由な姿勢および位置に測定ヘッドを配置することができる。

また、本発明は、極短パルスレーザ光を発生する第１のレーザ光源と、連続発光レーザ光を発生する第２のレーザ光源と、これらレーザ光源からのレーザ光を試料上に走査させる光走査部と、該光走査部により走査されたレーザ光を試料上に結像させる対物光学系とを備える測定ヘッドと、第１のレーザ光源からの極短パルスレーザ光に対する試料からの戻り光を検出する第１の撮像手段と、第２のレーザ光源からの連続発光レーザ光に対する試料からの戻り光を検出する第２の撮像手段とを備え、前記第１のレーザ光源、第２のレーザ光源および前記第２の撮像手段と前記測定ヘッドとが、シングルモードファイバと同等の直径を有するコアをクラッドで囲んだ第１の光ファイバ部分により接続され、前記第１の撮像手段と前記測定ヘッドとが、前記第１の光ファイバ部分よりコア径の大きな第２の光ファイバ部分により接続され、前記第２の光ファイバ部分の中心に前記第１の光ファイバ部分を配置したレーザ走査型観察装置を提供する。このようにすることで、光ファイバを単一にまとめてさらにとり回しの自由度を上げることができる。

また、上記発明においては、前記第１の撮像手段と前記第２の撮像手段とが同一の撮像手段により構成され、前記第１の光ファイバと撮像手段とを結ぶ光路と、前記第２の光ファイバと撮像手段とを結ぶ光路とを切り替える光路切替手段を備えることとしてもよい。
光路切替手段の作動により、測定ヘッドから第１の光ファイバを介して戻る戻り光と、第２の光ファイバを介して戻る戻り光とを切り替えることにより、撮像手段を共用することができ、構成の簡易化、コンパクト化を図ることができる。
また、上記発明においては、前記第２の光ファイバが、マルチモードファイバまたはファイババンドルからなっていてもよい。

また、本発明は、極短パルスレーザ光を発生する第１のレーザ光源と、連続発光レーザ光を発生する第２のレーザ光源と、これらレーザ光源からのレーザ光を試料上に走査させる光走査部と、該光走査部により走査されたレーザ光を試料上に結像させる対物光学系とを備える測定ヘッドと、第１のレーザ光源からの極短パルスレーザ光に対する試料からの戻り光を検出する第１の撮像手段と、第２のレーザ光源からの連続発光レーザ光に対する試料からの戻り光を検出する第２の撮像手段とを備え、前記第１のレーザ光源および前記第１の撮像手段と前記測定ヘッドとが、シングルモードファイバからなる第１の光ファイバにより接続され、前記第２のレーザ光源と前記測定ヘッドとが、シングルモードファイバからなる第２の光ファイバにより接続され、前記第２の撮像手段と前記測定ヘッドとが、前記第１の光ファイバおよび第２の光ファイバよりコア径の大きな第３の光ファイバにより接続されているレーザ走査型観察装置を提供する。

本発明によれば、第３の光ファイバは、第１および第２の光ファイバより大きなコア径を有しているので、測定ヘッドに入射される極短パルスレーザ光は第１の光ファイバ内において多モード分散を生じさせることなく、また、試料からの戻り光を第３の光ファイバにより無駄なく伝播して第１の撮像手段に到達させることができる。
また、測定ヘッドと、光源および撮像手段とを光ファイバによって接続することにより、測定ヘッドを大型化させることなく、しかも、光ファイバを取り回して自由な姿勢および位置に測定ヘッドを配置することができる。

上記発明においては、前記第２の光ファイバのカットオフ波長が、前記第１の光ファイバのカットオフ波長より小さく設定されていることが好ましい。
このように構成することで、伝播する光の波長に合わせたカットオフ波長を有するシングルモードファイバを使用することができる。
また、上記発明においては、前記第３の光ファイバが、マルチモードファイバまたはファイババンドルからなっていてもよい。

また、本発明は、極短パルスレーザ光を発生する第１のレーザ光源と、連続発光レーザ光を発生する第２のレーザ光源と、これらレーザ光源からのレーザ光を試料上に走査させる光走査部と、該光走査部により走査されたレーザ光を試料上に結像させる対物光学系とを備える測定ヘッドと、第１のレーザ光源からの極短パルスレーザ光に対する試料からの戻り光を検出する第１の撮像手段と、第２のレーザ光源からの連続発光レーザ光に対する試料からの戻り光を検出する第２の撮像手段とを備え、前記第１のレーザ光源、第２のレーザ光源および前記第１の撮像手段と前記測定ヘッドとが、マルチモードファイバからなる第１の光ファイバにより接続され、前記第２の撮像手段と前記測定ヘッドとが、マルチモードファイバまたはファイババンドルからなる第２の光ファイバにより接続され、前記測定ヘッド内に、前記第１の光ファイバにより伝播されてきた第１、第２のレーザ光源からのレーザ光の中間像を形成する集光レンズと、該中間像位置近傍に配置され、中間像の中央近傍のみの通過を許容するピンホール部材が備えられているレーザ走査型観察装置を提供する。

本発明によれば、第１のレーザ光源から発せられた極短パルスレーザ光は、マルチモードファイバを介して測定ヘッド内に入り集光レンズにより集光された後に中間像位置近傍においてピンホール部材を通過させられる。ピンホール部材は中間像の中央近傍の光のみ、すなわち、マルチモードファイバの中央付近を伝播してきた光のみの通過を許容する。

マルチモードファイバの中央付近においては、最低次モードの極短パルスレーザ光のみが伝播されているため、ピンホール部材により、最低次モードの極短パルスレーザ光のみが通過させられることになる。その結果、マルチモードファイバ内における多モード分散の影響を受けることなく、比較的位相の揃った最低次モードの光を対物光学系から試料に向けて出射させることができ、試料において多光子励起現象を効率よく発生させることができる。

また、試料からの戻り光はマルチモードファイバを介して第１の撮像素子に入射される。マルチモードファイバはコア径が大きいので、戻り光を制限することなく第１の撮像素子に到達させ、無駄なく検出することが可能となる。

また、上記発明においては、前記ピンホール部材の口径が可変であることとしてもよい。このようにすることで、共焦点効果（光軸方向の分解能）を調節可能とすることができ、共焦点効果を高めて鮮明な画像を取得可能としたり、共焦点効果を低減する代わりに、十分な戻り光の光量を確保して明るい画像を得たりすることができる。
また、上記発明においては、前記シングルモードファイバがフォトニッククリスタルファイバからなることとしてもよい。

また、本発明は、極短パルスレーザ光を発生する第１のレーザ光源と、連続発光レーザ光を発生する第２のレーザ光源と、これらレーザ光源からのレーザ光を試料上に走査させる光走査部と、該光走査部により走査されたレーザ光を試料上に結像させる対物光学系とを備える測定ヘッドと、第１および第２のレーザ光源からのレーザ光に対する試料からの戻り光を検出する撮像手段とを備え、前記第１のレーザ光源、第２のレーザ光源および前記撮像手段と前記測定ヘッドとが、マルチモードファイバにより接続され、前記測定ヘッド内に、前記マルチモードファイバにより伝播されてきた第１、第２のレーザ光源からのレーザ光の中間像を形成する集光レンズと、該中間像位置近傍に配置され、中間像の中央近傍のみの通過を許容するピンホール部材とが備えられ、該ピンホール部材が、極短パルスレーザ光および連続発光レーザ光および連続発光レーザ光に対する試料からの戻り光を遮光し、極短パルスレーザ光に対する試料からの戻り光を通過可能な材質により構成されているレーザ走査型観察装置を提供する。

本発明によれば、第１のレーザ光源からの極短パルスレーザ光は、ピンホール部材によって、マルチモードファイバの中央付近において最低次モードの極短パルスレーザ光のみが通過させられ、試料における多光子励起現象を効率よく発生させることができる。一方、試料から戻る戻り光についてはピンホール部材によるピンホール効果によって光量を低減されることなくマルチモードファイバに効率的に入射されて、明るく鮮明な画像を得ることができる。また、第２のレーザ光源からの連続発光レーザ光に対しては、ピンホール部材により共焦点効果が生じ、鮮明な画像を得ることができる。この場合に、２つのレーザ光源と測定ヘッドとを１本のマルチモードファイバにより接続することが可能となり、測定ヘッドの取り回しを容易にすることができる。

本発明によれば、レーザ光源から発せられたパルス幅の短い極短パルスレーザを試料に照射しながら、試料から得られる蛍光量の損失を低減して明るい蛍光画像を得ることができ、かつ、測定ヘッドをコンパクトに構成することができるという効果を奏する。

以下、本発明の一実施形態に係るレーザ走査型観察装置について、図１を参照して説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型観察装置１は、図１に示されるように、実験小動物を始めとする試料Ａに対向配置される対物レンズ２を備える測定ヘッド３と、光学ユニット４と、これらを接続する光ファイバ５，６とを備えている。

測定ヘッド３は、コリメートレンズ７と、レーザ走査部８と、瞳投影レンズ９と、結像レンズ１０とを備えている。コリメートレンズ７は、光ファイバ５により伝播されてきたレーザ光を平行光に変換するようになっている。レーザ走査部８は、例えば、互いに直交する２軸回りにそれぞれ回転可能に設けられた２枚のガルバノミラー（図示略）を備えており、レーザ光の偏向方向を変更して、試料Ａにおいて２次元方向に走査するようになっている。また、瞳投影レンズ９は、レーザ走査部８により２次元方向に走査されたレーザ光を一旦結像して中間像を形成するようになっている。また、結像レンズ１０は中間像を結像したレーザ光を集光して対物レンズ２に入射させるようになっている。
測定ヘッド３は、図示しないアームによって移動自在に支持されている。

前記光学ユニット４は、例えば、パルス幅が１００ｆｓｅｃ（フェムト秒）程度、波長９７６ｎｍ程度の近赤外極短パルスレーザ光を発生する第１のレーザ光源１１と、波長４８８ｎｍ程度の連続発光レーザ光を発生する第２のレーザ光源１２と、第１のレーザ光源１１からの近赤外極短パルスレーザ光に対する蛍光観察用の第１の光検出器１３と、第２のレーザ光源１２からの連続発光レーザ光に対する蛍光観察用の第２の光検出器１４とを備えている。

第１のレーザ光源１１と第２のレーザ光源１２とは、それらの光軸をダイクロイックミラー１５により結合されている。また、結合された２つのレーザ光源の光軸には、第２の光検出器１４の光軸がダイクロイックミラー１６により結合されている。
２つのレーザ光源１１，１２および第２の光検出器１４の結合された光軸は、カップリングレンズ１７を介して第１の光ファイバ５の一端面に一致させられている。カップリングレンズ１７は、レーザ光源１１，１２からのレーザ光を第１の光ファイバ５の一端面に集光させると同時に、第１の光ファイバ５からの蛍光を集光して第２の光検出器１４に導くようになっている。また、第２の光検出器１３の光軸は、コリメートレンズ１８を介して第２の光ファイバ６の一端面に一致させられている。コリメートレンズ１８は、第２の光ファイバ６からの蛍光を集光して第１の光検出器１３に導くようになっている。

第１の光検出器１３および第２の光検出器１４は、例えば、光電子増倍管（Photomultiplier Tube）である。これらの光検出器１３，１４の前段には、各光検出器１３，１４により検出すべき波長の蛍光のみの通過を許容するバリアフィルタ１９，２０が配置されている。符号２１は、ミラーである。

第１の光ファイバ５および第２の光ファイバ６の他端は、測定ヘッド３に接続されている。測定ヘッド３には、前記コリメートレンズ７とレーザ走査部８との間にダイクロイックミラー２２が配置されており、レーザ走査部８から戻る戻り光を第１の光ファイバ５の他端面および第２の光ファイバ６の他端面に分岐させるようになっている。

また、コリメートレンズ７は、第１の光ファイバ５の他端面へのカップリングレンズとして機能し、第２の光ファイバ６の他端面とダイクロイックミラー２２との間には、ダイクロイックミラー２２により分岐された光を第２の光ファイバ６の他端面に集光させるカップリングレンズ２３が配置されている。

本実施形態においては、前記第１の光ファイバ５は、数ミクロン程度のコア径を有するシングルモードファイバまたはフォトニッククリスタルファイバである。一方、第２の光ファイバ６は数ミリのコア径を有するマルチモードファイバまたはファイババンドルである。

このように構成された本実施形態に係るレーザ走査型観察装置１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型観察装置１によれば、第１のレーザ光源１１と第２のレーザ光源１２とが選択的に切り替えられて使用される。

第１のレーザ光源１１から発せられた近赤外極短パルスレーザ光および第２のレーザ光源１２から発せられた連続発光レーザ光は、ダイクロイックミラー１５，１６を介してカップリングレンズ１７により第１の光ファイバ５に入射させられる。そして、第１の光ファイバ５内を伝播して測定ヘッド３内に入り、コリメートレンズ７によって平行光に変換される。

平行光に変換された近赤外極短パルスレーザ光は、レーザ走査部８の作動により２次元的に走査され、瞳投影レンズ９、結像レンズ１０および対物レンズ２を介して試料Ａに照射される。試料Ａにおいては、近赤外極短パルスレーザ光が集光された所定の深さ方向位置において多光子励起効果により蛍光が発せられる。そして、発せられた蛍光は、対物レンズ２、結像レンズ１０、瞳投影レンズ９およびレーザ走査部８を介して同一光路を戻り、ダイクロイックミラー２２によって光路から分岐させられる。

分岐された蛍光は、カップリングレンズ２３によって第２の光ファイバ６の端面に集光され、第２の光ファイバ６内を伝播して光学ユニット４内に戻る。そして、コリメートレンズ１８によって平行光にされた後、バリアフィルタ１９によって不要な波長領域の光を除去されて第１の光検出器１３により検出される。

一方、第２のレーザ光源１２から発せられた連続発光レーザ光は、レーザ走査部８の作動により２次元的に走査され、瞳投影レンズ９、結像レンズ１０および対物レンズ２を介して試料Ａに照射される。試料Ａにおいては、連続発光レーザ光が照射された深さ方向の各位置において、蛍光が発せられる。そして、発せられた蛍光は、対物レンズ２、結像レンズ１０、瞳投影レンズ９、レーザ走査部８、ダイクロイックミラー２２、コリメートレンズ７および第１の光ファイバ５を経て、光学ユニット４内に戻り、カップリングレンズ１７、ダイクロイックミラー１６およびバリアフィルタ２０を通過して第２の光検出器１４に検出される。

このように構成することで、第１のレーザ光源１１からの近赤外極短パルスレーザ光は、単一の伝送モードにより第１の光ファイバ５内を伝播されて測定ヘッド３内に入る。したがって、マルチモードファイバ内を伝播される場合のように極短パルスレーザ光のパルス幅が伸びることを防止し、第１のレーザ光源１１から発せられた元々の短いパルス幅の極短パルスレーザ光を試料Ａに照射することができ、試料Ａにおいて多光子励起効果を効率的に発生させることができる。

さらに、多光子励起効果によって発生した蛍光は、コア径の小さい第１の光ファイバ５を通過することなく、第１の光ファイバ５の前段において分岐され、コア径の大きな第２の光ファイバ６を介して、無駄なく第１の光検出器１３により検出されることになる。
ここで、多光子励起の場合には、それ自体にデフォーカス像をカットする効果があるので、共焦点ピンホールとして機能する第１の光ファイバ５に戻す必要がない。

また、第２のレーザ光源１２からの連続発光レーザ光は、第１の光ファイバ５内を伝播されて測定ヘッド３内に入り、試料Ａにおいて発生した蛍光は、第１の光ファイバ５内を戻されるが、第１の光ファイバ５は、数ミクロン程度のコア径を有しているので、第１の光ファイバ５の先端面が共焦点ピンホールとして機能する。すなわち、第１の光ファイバ５の先端面と、対物レンズ２による試料における結像位置とが共役な位置関係となり、対物レンズ２の結像位置において発生した蛍光のみが第１の光ファイバ５の先端面を通過することができるようになる。その結果、対物レンズ２の結像位置を試料Ａの所定の深さ位置に配置することにより、共焦点効果によって、デフォーカス像をカットして、試料Ａの表面下に薄く広がる組織の画像を非侵襲で取得することが可能となる。

すなわち、本発明によれば、共焦点効果による試料Ａの表面下に薄く広がる組織の撮像、および、多光子励起効果によるさらに深い位置における組織の撮像を切り替えて行うことが可能である。この場合に、多光子励起用の第１のレーザ光源１１と共焦点観察用の第２のレーザ光源１２からのレーザ光を共通の第１の光ファイバ５で伝播するので構成部品が少なくて済む。

また、多光子励起効果により発生した蛍光をコア径の大きな第２の光ファイバ６により伝播するので、蛍光を無駄なく取得して観察精度を向上することができるという効果がある。さらに、光学ユニット４と測定ヘッド３とを光ファイバ５，６によって接続するので、比較的サイズが大きな光検出器１３，１４を測定ヘッド３から切り離し、測定ヘッド３を小型化することができ、また、測定ヘッド３のとり回しを自在にして所望の位置および姿勢による観察を可能にすることができる。

なお、上記実施形態においては、第１のレーザ光源１１および第２のレーザ光源１２からのレーザ光を測定ヘッド３に導く光ファイバとして、シングルモードファイバまたはフォトニッククリスタルファイバからなる第１の光ファイバ５を１本のみ採用した。これに代えて、図２に示されるように、近赤外極短パルスレーザ光を発する第１のレーザ光源１１は、シングルモードファイバまたはフォトニッククリスタルファイバからなる第１の光ファイバ５′によって測定ヘッド３に接続し、第２のレーザ光源１２および第２の光検出器１４と測定ヘッド３とを、別のシングルモードファイバまたはフォトニッククリスタルファイバからなる第２の光ファイバ５によって測定ヘッド３に接続し、第１の光検出器１３と測定ヘッド３とをマルチモードファイバまたはファイババンドルからなる第３の光ファイバ６により接続することにしてもよい。

この場合に、第１の光ファイバ５′と第２の光ファイバ５とは、図３に示されるように、測定ヘッド３に接続するコネクタ部２４において、その出射端に配されるコア５ａ′，５ａどうしを接合された状態でフェルール２５に支持させることが好ましい。このようにすることで、ほぼ同一の光軸上に出射端を配置することができる。

そして、この場合には、第１の光ファイバ５′のカットオフ波長を第１のレーザ光源１１の波長、例えば、９７６ｎｍより若干低く、例えば、９５０ｎｍに設定し、第２の光ファイバ５のカットオフ波長を第２のレーザ光源１２の波長、例えば、４８８ｎｍより若干低く、例えば、４５０ｎｍに設定することが好ましい。このようにすることで、各光源１１，１２からのレーザ光をより確実にシングルモードの状態を保ったまま測定ヘッド３に伝播させることが可能となり、多光子励起効果をより効率的に発生させることができる。

次に、本発明の第２の実施形態に係るレーザ走査型観察装置３０について、図４を参照して以下に説明する。
なお、本実施形態の説明において、図１に示した第１の実施形態に係るレーザ走査型観察装置１と構成を共通とする箇所に同一符号を付して説明を簡略化する。

本実施形態に係るレーザ走査型観察装置３０は、第１の実施形態に係るレーザ走査型観察装置１が、第１の光ファイバ５としてシングルモードファイバまたはフォトニッククリスタルファイバを採用していたのに対し、マルチモードファイバからなる第１の光ファイバ３１を採用している点で相違している。また、測定ヘッド３内には、第１の光ファイバ３１の出射端に対向して、コリメートレンズ７の前段に集光レンズ３２とピンホール部材３３とが配置されている点で相違している。

ピンホール部材３３は、前記集光レンズ３２による結像位置近傍に配置され、該結像位置に現れる第１の光ファイバ３１の出射端の像の中央部分のみを通過させる程度の開口径を有している。また、ピンホール部材３３は、対物レンズ２による試料Ａ上の結像位置と互いに共役な位置に配置されている。

さらに、試料Ａからの戻り光を第２の光ファイバ６の端面に向けて分岐するダイクロイックミラー２２は、コリメートレンズ７とレーザ走査部８との間に配置されている。したがって、レーザ走査部８を介して戻る蛍光は、ピンホール部材３３に入射される前に、波長に応じて、ダイクロイックミラー２２によって分岐されて第２の光ファイバ６に入射される蛍光と、ダイクロイックミラー２２を透過してコリメートレンズ７、ピンホール部材３３および集光レンズ３２を介して第１の光ファイバ３１に入射される蛍光とに分離されるようになっている。

このように構成された本実施形態に係るレーザ走査型観察装置３０の作用について、以下に説明する。
まず、第１のレーザ光源１１から近赤外極短パルスレーザ光を発生する場合について説明する。
第１の光ファイバ３１を構成するマルチモードファイバを通過させられる極短パルスレーザ光は、種々の伝送モードで伝播される。その伝送モードを模式的に示すと図５の通りである。この図５は、第１の光ファイバ３１の出射端における極短パルスレーザ光の光強度分布を示している。図中の斜線部は、光強度がゼロとなる領域である。すなわち、図５（ａ）に示されるように、最低次の伝送モード（すなわち、ＬＰ_０１モード）の極短パルスレーザ光が伝播される場合には、コア内では、光強度分布がゼロになる領域はない。一方、他の伝送モード（ＬＰ_ｎｍモード、但し、ｎ≧１、ｍ≧１）、同図（ｂ）、（ｃ）ではいずれもコアの中心近傍に光強度がゼロになる領域が存在する。

したがって、本実施形態に係るレーザ走査型観察装置３０のように、マルチモードファイバからなる第１の光ファイバ３１の出射端の像を結像する集光レンズ３２の中間像位置にピンホール部材３３を配置しておくことにより、第１の光ファイバ３１内を伝播されてきた種々の伝送モードの極短パルスレーザ光の内、最低次モードの極短パルスレーザ光のみを選択的に通過させ、他の伝送モードのレーザ光の通過を阻止することができる。これにより、シングルモードファイバにより伝播する場合と同様に、極短パルスレーザ光のパルス幅が伸びることを防止できる。したがって、第１のレーザ光源１１から発せられた元々の短いパルス幅の極短パルスレーザ光を試料Ａに照射することができ、多光子励起現象を効率的に発生させることができる。この場合には、試料Ａから発せられた蛍光は、第１実施形態と同様にダイクロイックミラー２２で反射され、第２の光ファイバ６（マルチモードファイバまたはバンドルファイバ）に導かれ、第１の光検出器１３により検出されることになる。

次に、第２のレーザ光源１２から連続発光レーザ光を発生する場合について説明する。
第１の光ファイバ３１がマルチモードファイバにより構成されているので、第１の実施形態とは異なり、その出射端が共焦点ピンホールとして作用することはない。しかしながら、本実施形態では、出射端に対向して集光レンズ３２が配置され、該集光レンズ３２による結像位置近傍にピンホール部材３３が配置されているので、このピンホール部材３３が共焦点ピンホールとして作用し、対物レンズ２の結像位置において発生した光のみを第１の光ファイバ３１内に戻すことができる。

したがって、本実施形態に係るレーザ走査型観察装置３０においても、第１のレーザ光源１１から発せられた近赤外極短パルスレーザによる多光子励起現象を効率的に発生して、得られた蛍光を効率よく検出することができるとともに、第２のレーザ光源１２から発せられた連続発光レーザ光により共焦点観察を行うことができる。

なお、ピンホール部材３３は、その内径を可変にすることにしてもよい。内径を可変にすることで、共焦点効果（光軸方向の分解能）を調節可能にできる。第１の実施形態のように蛍光が入射する第１の光ファイバ５の端面でピンホール効果を持たせている場合には、共焦点効果が固定されているために使い難い側面があるのに対し、このようにすることで、使い易さを向上することができる。

また、上記実施形態においては、ピンホール部材３３の遮光部分は、全てのレーザ光および蛍光を遮光するような、例えば、金属板等で構成されているが、これに代えて、例えば、第１のレーザ光源１１から発振される波長９７６ｎｍ程度の極短パルスレーザ光、第２のレーザ光源１２から発振される波長４８８ｎｍ程度の連続発光レーザ光および第２のレーザ光源１２からの連続発光レーザ光に対して試料Ａから発生する蛍光を遮光し、第１のレーザ光源１１から発振される極短パルスレーザ光に対して試料Ａから発生する蛍光を透過するような干渉膜等によって構成してもよい。この場合には、ダイクロイックミラー２２、カップリングレンズ２３、光ファイバ６、コリメートレンズ１８、バリアフィルタ１９および第１の光検出器１３は不要となる。

このようにすることで、波長９７６ｎｍ程度の極短パルスレーザ光は、前述と同様にピンホール部材３３で最低次モードのみが選択的に透過されて試料Ａに照射され、試料Ａにおいて効率的に多光子励起現象を発生させる。一方、試料Ａから発せられた蛍光は、対物レンズ２，結像レンズ１０、瞳投影レンズ９、レーザ走査部８およびコリメートレンズ７を介してピンホール部材３３に到達し、ピンホール部材３３の遮光部分を透過する。その結果、蛍光はピンホール効果を受けることなく集光レンズ３２で第１の光ファイバ３１（マルチモードファイバ）に導光される。

そして、第１の光ファイバ３１を伝播した蛍光はカップリングレンズ１７、ダイクロイックミラー１６を透過して第２の光検出器１４により検出される。もちろん、ダイクロイックミラー１６は蛍光を透過する波長特性を有するものに設定しておく。蛍光がピンホール部材３３によってピンホール効果を受けないので、ピンホール３３によって遮光されることがなく、効率よく第１の光ファイバ３１に導光される。
これに対して、波長４８８ｎｍ程度の連続発光レーザ光およびこれに対する蛍光は、ピンホール部材３３によって制限されることにより、共焦点効果を生じさせることができる。

これにより、測定ヘッド３と光学ユニット４とを接続する光ファイバとして、第１の光ファイバ３１が１本あれば足りるので、測定ヘッド３の取り回しを容易にすることができるという利点がある。

次に、本発明の第３の実施形態に係るレーザ走査型観察装置４０について、図６および図７を参照して以下に説明する。
なお、本実施形態の説明において、図１に示した第１の実施形態に係るレーザ走査型観察装置１と構成を共通とする箇所に同一符号を付して説明を簡略化する。

本実施形態に係るレーザ走査型観察装置４０は、図６に示されるように、連続発光レーザ光を発生する第２の光源１２が、ダイクロイックミラー４１により光軸を結合された２つのレーザ光源１２ａ，１２ｂを備えている。これらのレーザ光源１２ａ，１２ｂは、波長の異なるものであり、異なる２つの色素によって染色された試料Ａを観察する際に切り替えて、あるいは同時に使用されるようになっている。また、第１の光検出器１３とコリメートレンズ１８との間および第２の光検出器１４とコリメートレンズ１８′との間にも挿脱可能なダイクロイックミラー４２，４２′が配置されている。さらに、第２の光ファイバ６が、第１の光検出器１３または第２の光検出器１４のいずれかに、選択的に対向するように、コネクタ４３によって着脱可能に取り付けられている。

本実施形態に係るレーザ走査型観察装置４０により、多光子励起現象を利用した試料Ａの観察を行うには、まず、試料Ａにおいて発生する蛍光の波長に応じて、使用する光検出器として第１の光検出器１３か第２の光検出器１４かを選択する。例えば、第１の光検出器１３を選択する場合には、図６に実線で示されるように、第１の光検出器１３とコリメートレンズ１８との間のダイクロイックミラー４２を退避させ、そのコリメートレンズ１８を介して第１の光検出器１３に第２の光ファイバ６内を伝播されてきた蛍光を入射させるように、第２の光ファイバ６のコネクタ４３を接続する。また、第２の光検出器１４を選択する場合には、図６に破線で示されるように、第２の光ファイバ６のコネクタ４３を、第２の光検出器１４に対向する位置に接続し、ダイクロイックミラー４２′を実線で示すように退避させる。これにより、蛍光の波長に適したバリアフィルタ１９，２０を有するいずれかの光検出器１３，１４に蛍光を選択的に検出させることができる。

そして、この状態で、第１の光源１１から近赤外極短パルスレーザ光を発すると、ダイクロイックミラー４４，１６およびカップリングレンズ１７を介して第１の光ファイバ５に入射される。第１の光ファイバ５内を伝播して測定ヘッド３に入った極短パルスレーザ光は、コリメートレンズ７、ダイクロイックミラー２２、レーザ走査部８、瞳投影レンズ９、結像レンズ１０および対物レンズ２を介して試料Ａに照射され、多光子励起現象によって蛍光を発生させる。発生した蛍光は、同一の光路を介して戻り、ダイクロイックミラー２２によって反射されてカップリングレンズ２３を介して第２の光ファイバ６により光学ユニット４に戻される。光学ユニット４において、第２の光ファイバ６を伝播してきた蛍光は、対向配置されている第１の光検出器１３または第２の検出器１４のいずれかにより検出されることになる。

また、本実施形態に係るレーザ走査型観察装置４０により、共焦点観察を行うには、図７に実線で示されるように、第１の光検出器１３とコリメートレンズ１８との間および第２の光検出器１４とコリメートレンズ１８′との間にダイクロイックミラー４２，４２′を挿入配置する。そして、第２の光源１２を構成している２つのレーザ光源１２ａ，１２ｂからそれぞれの波長のレーザ光を同時に照射する。レーザ光は、ダイクロイックミラー４１，４４，１６、カップリングレンズ１７、第１の光ファイバ５を経て測定ヘッド３内に入り、コリメートレンズ７、ダイクロイックミラー２２、レーザ走査部８、瞳投影レンズ９、結像レンズ１０および対物レンズ２を介して試料Ａに照射される。試料Ａにおいて発せられた２種類の波長の蛍光は、同じ経路を通って光学ユニット４内に戻り、カップリングレンズ１７、ダイクロイックミラー１６，４２，４２′を介してそれぞれの蛍光の波長に適したバリアフィルタ１９，２０を有する光検出器１３，１４により検出される。

このように、本実施形態に係るレーザ走査型観察装置４０によれば、第１の光源１１により発生した近赤外極短パルスレーザ光による多光子励起現象を利用した観察と、第２の光源１２により発生した２つの波長の連続発光レーザ光による共焦点観察とを、共通の光検出器を切り替えて行うことができる。

なお、波長特性によっては、ダイクロイックミラー４２，４２′を光路に入れた状態で第２の光ファイバ６をコネクタ４３に装着して、光検出器１３，１４で多光子励起による蛍光を観察してもよい。また、第１の光ファイバ５からの蛍光をより効率よく反射させるために、ダイクロイックミラー４２，４２′に加えて、ミラーを選択的に切り替えることができるようにしてもよい。

次に、本発明の第４の実施形態に係るレーザ走査型観察装置５０について、図８を参照して以下に説明する。
なお、本実施形態の説明において、図１に示した第１の実施形態に係るレーザ走査型観察装置５０と構成を共通とする箇所に同一符号を付して説明を簡略化する。

本実施形態に係るレーザ走査型観察装置５０は、単一の光検出器５１を備え、その光検出器５１とコリメートレンズ１８との間に、挿脱可能なミラー５２と、交換可能なバリアフィルタ５３，５４とを配置している。第１の光源１１から近赤外極短パルスレーザ光を出射するときには、ミラー５２を鎖線で示す位置に退避させ、多光子励起現象により発生する波長の蛍光のみを透過可能なバリアフィルタ５３を挿入する。一方、第２の光源１２から連続発光レーザ光を出射するときには、ミラー５２を実線で示す位置に挿入し、連続発光レーザ光の照射により発生する波長の蛍光を透過可能なバリアフィルタ５４を挿入する。

このように構成することで、光検出器５１を共用することが可能となり、構成部品点数を低減してコストを削減できるとともに、コンパクトに構成することができるという利点がある。

次に、本発明の第５の実施形態に係るレーザ走査型観察装置６０について、図９および図１０を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型観察装置６０は、図９に示されるように、光学ユニット４と測定ヘッド３とが単一の光ファイバ６１により接続されている点において、上記各実施形態に係るレーザ走査型観察装置１，３０，４０と相違している。

上記光ファイバ６１は、図１０に示されるように、シングルモードファイバと同等の直径を有する第１のコア６２を中心に、その周囲に配置された第１のクラッド６３を隔てて第２のコア６４が取り囲むように配置され、さらにその周囲に第２のクラッド６５が配置された２重構造を有している。
第１、第２の光源１１，１２から発せられたレーザ光は、ダイクロイックミラー１５，２１，１６およびカップリングレンズ１７を介して中央の第１のコア６２に入射させられて伝播された後に、測定ヘッド３によって試料Ａに照射されるようになっている。また、試料Ａにおいて発せられた蛍光は、測定ヘッド３内のコリメートレンズ７によって第１のコア６２または第２のコア６４に入射されて伝播され、光学ユニット４内のカップリングレンズ１７、ダイクロイックミラー１６，６６，６７およびバリアフィルタ１９，２０を経て第１、第２の光検出器１３，１４により検出されるようになっている。

このように構成された本実施形態に係るレーザ走査型観察装置６０によれば、第１、第２の光源１１，１２からのレーザ光の入射時には、コア径の細い第１のコア６２を通過させることによって、極短パルスレーザ光においてはパルス幅が伸びるのを防止できる。その結果、効率的に多光子励起現象を発生させることができる。
また、測定ヘッド３から戻る蛍光に対しては、第１の光源１１からの極短パルスレーザ光により発生した蛍光は、コア径の大きな第２のコア６４を通して戻すことにより、光量の損失を低減して明るい蛍光画像を得ることを可能とし、第２の光源１２からの連続発光レーザ光により発生した蛍光は、コア径の小さい第１のコア６２を通して戻すことにより、共焦点効果を発生させることができる。

本実施形態に係るレーザ走査型観察装置６０においては、光学ユニット４と測定ヘッド３とを結ぶ光ファイバ６１を１本にまとめたので、測定ヘッド３の位置や姿勢を変化させる際の自由度を向上することができるという効果がある。
なお、本実施形態においては、光ファイバ６１として、図１０に示される２重構造の光ファイバ６１を例に挙げて説明したが、これに代えて、図１１に示されるように、中央の第１のコア６２の周囲に複数の第２のコア６８を束ねて配置したファイババンドルを採用してもよい。これによっても、上記と同様の効果をそうするとともに、光ファイバ６１をより柔軟にして、とり回しを容易にすることができる。

本発明の第１の実施形態に係るレーザ走査型観察装置の全体構成を示す模式図である。 図１のレーザ走査型観察装置の変形例を示す模式図である。 図２のレーザ走査型観察装置における光ファイバの出射端の構造例を示す縦断面図である。 本発明の第２の実施形態に係るレーザ走査型観察装置の全体構成を示す模式図である。 図４のレーザ走査型観察装置の光ファイバ内の極短パルスレーザ光の伝送モードを説明する模式図である。 本発明の第３の実施形態に係るレーザ走査型観察装置の全体構成を示す模式図である。 図６のレーザ走査型観察装置の連続発光レーザ光による観察時の状態を示す模式図である。 本発明の第４の実施形態に係るレーザ走査型観察装置の全体構成を示す模式図である。 本発明の第５の実施形態に係るレーザ走査型観察装置の全体構成を示す模式図である。 図９のレーザ走査型観察装置の光ファイバの構造を示す横断面図である。 図１０の光ファイバの変形例を示す横断面図である。

符号の説明

Ａ 試料
１，３０，４０，５０，６０ レーザ走査型観察装置。
２ 対物レンズ（対物光学系）
３ 測定ヘッド
５，５′ 第１の光ファイバ（第２の光ファイバ）
６ 第２の光ファイバ、第３の光ファイバ
８ レーザ走査部（光走査部）
１１ 第１の光源（第１のレーザ光源）
１２ 第２の光源（第２のレーザ光源）
１３ 第１の光検出器（第１の撮像手段）
１４ 第２の光検出器（第２の撮像手段）
３２ 集光レンズ
３３ ピンホール部材
４２，４２′ ダイクロイックミラー（光路切替手段）
５１ 光検出器（撮像手段）
６２ コア（第１の光ファイバ）
６４ コア（第２の光ファイバ）

Claims (10)

1. 極短パルスレーザ光を発生する第１のレーザ光源と、
   連続発光レーザ光を発生する第２のレーザ光源と、
   これらレーザ光源からのレーザ光を試料上に走査させる光走査部と、該光走査部により走査されたレーザ光を試料上に結像させる対物光学系とを備える測定ヘッドと、
   第１のレーザ光源からの極短パルスレーザ光に対する試料からの戻り光を検出する第１の撮像手段と、
   第２のレーザ光源からの連続発光レーザ光に対する試料からの戻り光を検出する第２の撮像手段とを備え、
   前記第１のレーザ光源、第２のレーザ光源および前記第２の撮像手段と前記測定ヘッドとが、シングルモードファイバからなる第１の光ファイバにより接続され、
   前記第１の撮像手段と前記測定ヘッドとが、前記第１の光ファイバよりコア径の大きな第２の光ファイバにより接続されているレーザ走査型観察装置。
2. 極短パルスレーザ光を発生する第１のレーザ光源と、
   連続発光レーザ光を発生する第２のレーザ光源と、
   これらレーザ光源からのレーザ光を試料上に走査させる光走査部と、該光走査部により走査されたレーザ光を試料上に結像させる対物光学系とを備える測定ヘッドと、
   第１のレーザ光源からの極短パルスレーザ光に対する試料からの戻り光を検出する第１の撮像手段と、
   第２のレーザ光源からの連続発光レーザ光に対する試料からの戻り光を検出する第２の撮像手段とを備え、
   前記第１のレーザ光源、第２のレーザ光源および前記第２の撮像手段と前記測定ヘッドとが、シングルモードファイバと同等の直径を有するコアをクラッドで囲んだ第１の光ファイバ部分により接続され、
   前記第１の撮像手段と前記測定ヘッドとが、前記第１の光ファイバ部分よりコア径の大きな第２の光ファイバ部分により接続され、
   前記第２の光ファイバ部分の中心に前記第１の光ファイバ部分を配置したレーザ走査型観察装置。
3. 前記第１の撮像手段と前記第２の撮像手段とが同一の撮像手段により構成され、
   前記第１の光ファイバと撮像手段とを結ぶ光路と、前記第２の光ファイバと撮像手段とを結ぶ光路とを切り替える光路切替手段を備える請求項１に記載のレーザ走査型観察装置。
4. 前記第２の光ファイバが、マルチモードファイバまたはファイババンドルからなる請求項１に記載のレーザ走査型観察装置。
5. 極短パルスレーザ光を発生する第１のレーザ光源と、
   連続発光レーザ光を発生する第２のレーザ光源と、
   これらレーザ光源からのレーザ光を試料上に走査させる光走査部と、該光走査部により走査されたレーザ光を試料上に結像させる対物光学系とを備える測定ヘッドと、
   第１のレーザ光源からの極短パルスレーザ光に対する試料からの戻り光を検出する第１の撮像手段と、
   第２のレーザ光源からの連続発光レーザ光に対する試料からの戻り光を検出する第２の撮像手段とを備え、
   前記第１のレーザ光源と前記測定ヘッドとが、シングルモードファイバからなる第１の光ファイバにより接続され、
   前記第２のレーザ光源および前記第２の撮像手段と前記測定ヘッドとが、シングルモードファイバからなる第２の光ファイバにより接続され、
   前記第１の撮像手段と前記測定ヘッドとが、前記第１，第２の光ファイバよりコア径の大きな第３の光ファイバにより接続されているレーザ走査型観察装置。
6. 前記第２の光ファイバのカットオフ波長が、前記第１の光ファイバのカットオフ波長より小さく設定されている請求項５に記載のレーザ走査型観察装置。
7. 前記第３の光ファイバが、マルチモードファイバまたはファイババンドルからなる請求項５に記載のレーザ走査型観察装置。
8. 極短パルスレーザ光を発生する第１のレーザ光源と、
   連続発光レーザ光を発生する第２のレーザ光源と、
   これらレーザ光源からのレーザ光を試料上に走査させる光走査部と、該光走査部により走査されたレーザ光を試料上に結像させる対物光学系とを備える測定ヘッドと、
   第１のレーザ光源からの極短パルスレーザ光に対する試料からの戻り光を検出する第１の撮像手段と、
   第２のレーザ光源からの連続発光レーザ光に対する試料からの戻り光を検出する第２の撮像手段とを備え、
   前記第１のレーザ光源、第２のレーザ光源および前記第２の撮像手段と前記測定ヘッドとが、マルチモードファイバからなる第１の光ファイバにより接続され、
   前記第１の撮像手段と前記測定ヘッドとが、マルチモードファイバまたはファイババンドルからなる第２の光ファイバにより接続され、
   前記測定ヘッド内に、前記第１の光ファイバにより伝播されてきた第１、第２のレーザ光源からのレーザ光の中間像を形成する集光レンズと、該中間像位置近傍に配置され、中間像の中央近傍のみの通過を許容するピンホール部材が備えられているレーザ走査型観察装置。
9. 前記ピンホール部材の口径が可変である請求項８に記載のレーザ走査型観察装置。
10. 前記シングルモードファイバがフォトニッククリスタルファイバからなる請求項１から請求項９のいずれかに記載のレーザ走査型観察装置。

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