JP2001356274A - 二重共焦点走査型顕微鏡 - Google Patents
二重共焦点走査型顕微鏡Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】特に多色蛍光用途に関連して、少なくともほぼ
理論的に可能である解像力を実現することができる二重
共焦点走査型顕微鏡を提供する。 【解決手段】本発明は、少なくとも１つの光源（３）の
照射ビーム経路（２）と、少なくとも１つの検出器
（５）の検出ビーム経路（４）と、を有する二重共焦点
走査型顕微鏡に関する。特にビーム経路に配置される素
子（６，１０，１３，１４）の光学特性は、光軸（３
３）および／または試料領域の少なくとも１つの面（１
８，１９，２０）に関して、蓄積収差が少なくとも理論
的に実現可能な解像力の大きさの程度であるように、互
いに調整されている。
理論的に可能である解像力を実現することができる二重
共焦点走査型顕微鏡を提供する。 【解決手段】本発明は、少なくとも１つの光源（３）の
照射ビーム経路（２）と、少なくとも１つの検出器
（５）の検出ビーム経路（４）と、を有する二重共焦点
走査型顕微鏡に関する。特にビーム経路に配置される素
子（６，１０，１３，１４）の光学特性は、光軸（３
３）および／または試料領域の少なくとも１つの面（１
８，１９，２０）に関して、蓄積収差が少なくとも理論
的に実現可能な解像力の大きさの程度であるように、互
いに調整されている。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、少なくとも１つの
光源の照射ビーム経路と、少なくとも１つの検出器の検
出ビーム経路と、を有する二重共焦点走査型顕微鏡に関
する。
光源の照射ビーム経路と、少なくとも１つの検出器の検
出ビーム経路と、を有する二重共焦点走査型顕微鏡に関
する。
【０００２】
【従来の技術】二重共焦点走査型顕微鏡は、欧州特許第
０ ４９１ ２８９号によって公知である。二重共焦点
走査型顕微鏡法において、光源からの光は、２つの部分
ビームに分割され、各部分ビームが対物レンズによって
共通の試料点に集光される。２つの対物レンズは、共通
である試料面の異なる側に配置される。試料点または検
出用ピンホールで、干渉計の照明は、強め合う干渉にな
る状況で、第１の最大値および複数の第２の極大値を示
す干渉パターンを形成する。干渉計の照明のために、二
重共焦点走査型顕微鏡の場合には、従来の走査型顕微鏡
と比較して、軸解像度を増大させることができる。「軸
解像度」なる語は、以下、光軸方向における解像度を表
すために使用される。
０ ４９１ ２８９号によって公知である。二重共焦点
走査型顕微鏡法において、光源からの光は、２つの部分
ビームに分割され、各部分ビームが対物レンズによって
共通の試料点に集光される。２つの対物レンズは、共通
である試料面の異なる側に配置される。試料点または検
出用ピンホールで、干渉計の照明は、強め合う干渉にな
る状況で、第１の最大値および複数の第２の極大値を示
す干渉パターンを形成する。干渉計の照明のために、二
重共焦点走査型顕微鏡の場合には、従来の走査型顕微鏡
と比較して、軸解像度を増大させることができる。「軸
解像度」なる語は、以下、光軸方向における解像度を表
すために使用される。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかし、特に多色蛍光
用途に関連して、一般的な二重共焦点走査型顕微鏡で実
験的に実現することができる軸解像度は、現在まで、理
論的に実現可能な軸解像度より劣っていた。
用途に関連して、一般的な二重共焦点走査型顕微鏡で実
験的に実現することができる軸解像度は、現在まで、理
論的に実現可能な軸解像度より劣っていた。
【０００４】上述した事情に鑑み、本発明の目的は、特
に多色蛍光用途に関連して、少なくともほぼ理論的に可
能である解像力を実現することができるような二重共焦
点走査型顕微鏡を提供することにある。
に多色蛍光用途に関連して、少なくともほぼ理論的に可
能である解像力を実現することができるような二重共焦
点走査型顕微鏡を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上記目的は、請求項１に
記載の特徴を備えた共焦点走査型顕微鏡によって実現さ
れる。
記載の特徴を備えた共焦点走査型顕微鏡によって実現さ
れる。
【０００６】この請求項１に記載の二重共焦点走査型顕
微鏡は、少なくとも１つの光源の照射ビーム経路と、少
なくとも１つの検出器の検出ビーム経路とを有し、前記
照射ビーム経路および前記検出ビーム経路に配置される
素子の光学特性が、光軸および／または試料領域に定義
される少なくとも１つの面に関して、蓄積収差が少なく
とも理論的に実現可能な解像力の大きさの程度であるよ
うに互いに調整されている。
微鏡は、少なくとも１つの光源の照射ビーム経路と、少
なくとも１つの検出器の検出ビーム経路とを有し、前記
照射ビーム経路および前記検出ビーム経路に配置される
素子の光学特性が、光軸および／または試料領域に定義
される少なくとも１つの面に関して、蓄積収差が少なく
とも理論的に実現可能な解像力の大きさの程度であるよ
うに互いに調整されている。
【０００７】
【発明の実施の形態】図１は、レーザ光源３の照射ビー
ム経路２および検出器５の検出ビーム経路４を有する二
重共焦点走査型顕微鏡１を示している。光源３からの照
射光は、レンズ６によって励起用ピンホール７に集光さ
れ、ダイクロイックビームスプリッタ８によって走査装
置９の方向に反射される。照射光は干渉計１０のビーム
スプリッタによって、それぞれミラー１１，１２で反射
される２つの部分ビームに分けられる。照射光は、２つ
の顕微鏡対物レンズ１３，１４を通って、２つの顕微鏡
対物レンズ１３，１４に共通である焦点面１６に位置す
る共通点１５に集光される。２つの顕微鏡対物レンズ１
３，１４の間に配置される試料から干渉計の照明によっ
て励起される蛍光は、試料からの蛍光が照射光とは異な
る波長を有するため、対向する方向に照射ビーム経路２
に沿って進み、ダイクロイックビームスプリッタ８を通
過する。ダイクロイックビームスプリッタ８の後に配置
される検出用ピンホール１７は、励起用ピンホール７に
対して共焦点共役になるように配置されるため、焦点領
域１５からの蛍光のみが検出器５によって検出される。
ム経路２および検出器５の検出ビーム経路４を有する二
重共焦点走査型顕微鏡１を示している。光源３からの照
射光は、レンズ６によって励起用ピンホール７に集光さ
れ、ダイクロイックビームスプリッタ８によって走査装
置９の方向に反射される。照射光は干渉計１０のビーム
スプリッタによって、それぞれミラー１１，１２で反射
される２つの部分ビームに分けられる。照射光は、２つ
の顕微鏡対物レンズ１３，１４を通って、２つの顕微鏡
対物レンズ１３，１４に共通である焦点面１６に位置す
る共通点１５に集光される。２つの顕微鏡対物レンズ１
３，１４の間に配置される試料から干渉計の照明によっ
て励起される蛍光は、試料からの蛍光が照射光とは異な
る波長を有するため、対向する方向に照射ビーム経路２
に沿って進み、ダイクロイックビームスプリッタ８を通
過する。ダイクロイックビームスプリッタ８の後に配置
される検出用ピンホール１７は、励起用ピンホール７に
対して共焦点共役になるように配置されるため、焦点領
域１５からの蛍光のみが検出器５によって検出される。
【０００８】本発明によれば、ビーム経路に配置された
素子６，１０，１３，１４の光学特性は、試料領域にお
ける面１８，１９，２０に関して、蓄積収差が少なくと
も理論的に実現可能な解像力の大きさの程度であるよう
に、互いに調整されている。
素子６，１０，１３，１４の光学特性は、試料領域にお
ける面１８，１９，２０に関して、蓄積収差が少なくと
も理論的に実現可能な解像力の大きさの程度であるよう
に、互いに調整されている。
【０００９】面１９は、対物レンズの視野全体にわたっ
て、２つの顕微鏡対物レンズ１３，１４の焦点面１６と
一致する。２つの面１８，２０は、焦点面１６に対して
対称に配置される。図１に示される二重共焦点走査型顕
微鏡１の具体的な実施形態において、蓄積収差の補正の
ために、干渉計の部分ビーム経路２１，２２の素子が考
慮される。これに関連して、干渉計の個々の部分ビーム
経路２１，２２の蓄積軸収差は、焦点面１６に平行であ
る試料領域の面１８，１９、２０に対して互いに相対す
るように形成される。軸収差は、対物レンズ１３，１４
の縦色収差である。レーザ光源３は、４８８ｎｍ、５６
７ｎｍおよび６４７ｎｍの照射波長で光を放射する。顕
微鏡対物レンズ１３は、レーザ光源３の４８８ｎｍの照
射波長で、光を面１８に位置する点に集光するように補
正される。したがって、レーザ光源３の４８８ｎｍの照
射波長に関する焦点は、対物レンズ１３とその焦点面１
６との間に存在する。（適切な整列を仮定すると）対物
レンズ１４もまた、レーザ光源３の４８８ｎｍで光を面
１８に位置する点に集光するように補正される。したが
って、レーザ光源３の４８８ｎｍ照射波長の光の対物レ
ンズ１４の焦点は、対物レンズ１４の焦点面１６を越え
た場所に位置する。対物レンズ１３は、レーザ光源３の
６４７ｎｍ照射波長で、光を対物レンズ１３の焦点面１
６を越えた位置である試料領域の面２０に位置する点の
上に集光する。レーザ光源３の６４７ｎｍ照射波長にお
ける光は、対物レンズ１４によって、試料領域の面２０
にある点に集光されるため、対物レンズ１４の６４７ｎ
ｍ照射波長における光の集光は、焦点面１６と対物レン
ズ１４との間に存在する。レーザ光源３の５６７ｎｍ照
射波長における光に関して、両方の顕微鏡対物レンズ１
３，１４の焦点１５は、焦点面１６と一致する試料領域
の面１９に存在する。顕微鏡対物レンズ１３，１４は、
個別の面１８，１９，２０が一致する２つの顕微鏡対物
レンズ１３，１４の焦点に対応するように、互いに配置
される。このようにして、レーザ光源３の３つの照射波
長の光を用いた同時照射の結果、試料が走査される３つ
の焦点を生じる。試料領域における３つの面１８，１
９，２０に関する蓄積収差はそれぞれ、理論的に実現可
能な解像力の大きさの程度であり、軸方向に１００ｎｍ
である。
て、２つの顕微鏡対物レンズ１３，１４の焦点面１６と
一致する。２つの面１８，２０は、焦点面１６に対して
対称に配置される。図１に示される二重共焦点走査型顕
微鏡１の具体的な実施形態において、蓄積収差の補正の
ために、干渉計の部分ビーム経路２１，２２の素子が考
慮される。これに関連して、干渉計の個々の部分ビーム
経路２１，２２の蓄積軸収差は、焦点面１６に平行であ
る試料領域の面１８，１９、２０に対して互いに相対す
るように形成される。軸収差は、対物レンズ１３，１４
の縦色収差である。レーザ光源３は、４８８ｎｍ、５６
７ｎｍおよび６４７ｎｍの照射波長で光を放射する。顕
微鏡対物レンズ１３は、レーザ光源３の４８８ｎｍの照
射波長で、光を面１８に位置する点に集光するように補
正される。したがって、レーザ光源３の４８８ｎｍの照
射波長に関する焦点は、対物レンズ１３とその焦点面１
６との間に存在する。（適切な整列を仮定すると）対物
レンズ１４もまた、レーザ光源３の４８８ｎｍで光を面
１８に位置する点に集光するように補正される。したが
って、レーザ光源３の４８８ｎｍ照射波長の光の対物レ
ンズ１４の焦点は、対物レンズ１４の焦点面１６を越え
た場所に位置する。対物レンズ１３は、レーザ光源３の
６４７ｎｍ照射波長で、光を対物レンズ１３の焦点面１
６を越えた位置である試料領域の面２０に位置する点の
上に集光する。レーザ光源３の６４７ｎｍ照射波長にお
ける光は、対物レンズ１４によって、試料領域の面２０
にある点に集光されるため、対物レンズ１４の６４７ｎ
ｍ照射波長における光の集光は、焦点面１６と対物レン
ズ１４との間に存在する。レーザ光源３の５６７ｎｍ照
射波長における光に関して、両方の顕微鏡対物レンズ１
３，１４の焦点１５は、焦点面１６と一致する試料領域
の面１９に存在する。顕微鏡対物レンズ１３，１４は、
個別の面１８，１９，２０が一致する２つの顕微鏡対物
レンズ１３，１４の焦点に対応するように、互いに配置
される。このようにして、レーザ光源３の３つの照射波
長の光を用いた同時照射の結果、試料が走査される３つ
の焦点を生じる。試料領域における３つの面１８，１
９，２０に関する蓄積収差はそれぞれ、理論的に実現可
能な解像力の大きさの程度であり、軸方向に１００ｎｍ
である。
【００１０】図１に示される二重共焦点走査型顕微鏡１
は、検出用ピンホール１７が軸方向に位置調整可能であ
るように構成される。点線が描かれている検出ビーム経
路４の部分に対応する検出用ピンホール１７の別の位置
も点線で描かれ、２３と参照符号がつけられている。点
線で描かれた検出ビーム経路４の部分は、４８８ｎｍ照
射波長に対応する検出光である。検出用ピンホール１７
の位置調整は、横方向のオフセットを生じない。
は、検出用ピンホール１７が軸方向に位置調整可能であ
るように構成される。点線が描かれている検出ビーム経
路４の部分に対応する検出用ピンホール１７の別の位置
も点線で描かれ、２３と参照符号がつけられている。点
線で描かれた検出ビーム経路４の部分は、４８８ｎｍ照
射波長に対応する検出光である。検出用ピンホール１７
の位置調整は、横方向のオフセットを生じない。
【００１１】図２は、二重共焦点走査型顕微鏡の検出ビ
ーム経路４の一部を概略的に示している。検出ビーム経
路４において、２つの検出用ピンホールは、色選択素子
２４，２５として具体化される。色選択素子２４は、４
５０ｎｍ未満であるすべての波長に関して高い透過性を
示し、４５０ｎｍを超える全ての波長に関して低い透過
性を示すようなコーティングを施してある（低域通過特
性）。図２のグラフは、波長λの関数として色選択素子
２４の透過特性２６を示している。色選択素子２４の基
板は点２７でコーティングされていないため、色選択素
子２４は、４５０ｎｍを超える波長を有する光に関し
て、検出用ピンホールとして作用する。
ーム経路４の一部を概略的に示している。検出ビーム経
路４において、２つの検出用ピンホールは、色選択素子
２４，２５として具体化される。色選択素子２４は、４
５０ｎｍ未満であるすべての波長に関して高い透過性を
示し、４５０ｎｍを超える全ての波長に関して低い透過
性を示すようなコーティングを施してある（低域通過特
性）。図２のグラフは、波長λの関数として色選択素子
２４の透過特性２６を示している。色選択素子２４の基
板は点２７でコーティングされていないため、色選択素
子２４は、４５０ｎｍを超える波長を有する光に関し
て、検出用ピンホールとして作用する。
【００１２】色選択素子２５は、高域通過特性を有す
る。すなわち色選択素子２５の基板は、その透過率Ｔが
４５０ｎｍを超える波長における光の場合には高く、４
５０ｎｍ未満の波長の光の場合には低いようにコーティ
ングされる。基板は、アパーチャ開口部２８をコーティ
ングしないため、色選択素子は４５０ｎｍ未満であるす
べての波長の場合には検出用ピンホールとして作用す
る。色選択素子２５の透過特性２９は、図２のもう１つ
のグラフから明白である。
る。すなわち色選択素子２５の基板は、その透過率Ｔが
４５０ｎｍを超える波長における光の場合には高く、４
５０ｎｍ未満の波長の光の場合には低いようにコーティ
ングされる。基板は、アパーチャ開口部２８をコーティ
ングしないため、色選択素子は４５０ｎｍ未満であるす
べての波長の場合には検出用ピンホールとして作用す
る。色選択素子２５の透過特性２９は、図２のもう１つ
のグラフから明白である。
【００１３】色選択素子２４が検出用ピンホールとして
作用する検出光３０および色選択素子２５が検出用ピン
ホールとして作用する検出光３１が、２つの検出用ピン
ホール２７，２８を通過し、マルチバンド検出器３２に
よって同時に検出される。
作用する検出光３０および色選択素子２５が検出用ピン
ホールとして作用する検出光３１が、２つの検出用ピン
ホール２７，２８を通過し、マルチバンド検出器３２に
よって同時に検出される。
【００１４】
【発明の効果】本発明によって第一に認識されているこ
とは、二重共焦点走査型顕微鏡法に関連して、実験的に
実現可能な解像力と理論的に可能な解像力との差を生じ
る原因が、特に、ビーム経路に配置された素子の収差に
あることである。このような収差の最大の一因は、使用
される顕微鏡対物レンズによって主に形成される。顕微
鏡対物レンズは、たとえば４５０ｎｍ〜６５０ｎｍの波
長領域で約１５０ｎｍの縦色収差を有する。この縦色収
差のみで考えてみると、約１００ｎｍの理論的に実現可
能な軸解像力を上回る。
とは、二重共焦点走査型顕微鏡法に関連して、実験的に
実現可能な解像力と理論的に可能な解像力との差を生じ
る原因が、特に、ビーム経路に配置された素子の収差に
あることである。このような収差の最大の一因は、使用
される顕微鏡対物レンズによって主に形成される。顕微
鏡対物レンズは、たとえば４５０ｎｍ〜６５０ｎｍの波
長領域で約１５０ｎｍの縦色収差を有する。この縦色収
差のみで考えてみると、約１００ｎｍの理論的に実現可
能な軸解像力を上回る。
【００１５】したがって、本発明によれば、蓄積収差が
少なくとも理論的に実現可能な解像力の大きさの程度で
あるように、ビーム経路に配置された素子の光学特性が
互いに調整されている。光学的な計算に組み込まれる素
子における１種類の収差の和は、蓄積収差を構成する。
二重共焦点走査型顕微鏡に関連して、理論的に実現可能
な解像力は、従来の顕微鏡の解像力のように、光の波長
および使用される顕微鏡対物レンズの開口数に左右され
る。生体臨床医学の分野における代表的な蛍光用途で
は、共焦点走査型顕微鏡の横解像力は約２００ｎｍであ
り、軸解像力は約６００〜８００ｎｍである。「横解像
力」なる語は、以下、焦点面における解像度を表すため
に使用される。二重共焦点走査型顕微鏡の横解像力は、
共焦点走査型顕微鏡の横解像力と実質的に等しいが、二
重共焦点走査型顕微鏡の軸解像力は、約１００〜２００
ｎｍの範囲にある。したがって、最大の解像力を実現す
るために、ビーム経路に配置される本発明による二重共
焦点走査型顕微鏡の素子の調整範囲の大きさの程度を定
義するのは、二重共焦点走査型顕微鏡の理論的な解像力
の値である。しかし、調整範囲の大きさのこのような程
度は、二重共焦点走査型顕微鏡に求められる要求に応じ
て、１０倍ほどに変動する可能性がある。したがって、
たとえば軸方向において蓄積収差が１０〜１０００ｎｍ
の範囲にあるように、ビーム経路に配置される素子の調
整を行うことができる。
少なくとも理論的に実現可能な解像力の大きさの程度で
あるように、ビーム経路に配置された素子の光学特性が
互いに調整されている。光学的な計算に組み込まれる素
子における１種類の収差の和は、蓄積収差を構成する。
二重共焦点走査型顕微鏡に関連して、理論的に実現可能
な解像力は、従来の顕微鏡の解像力のように、光の波長
および使用される顕微鏡対物レンズの開口数に左右され
る。生体臨床医学の分野における代表的な蛍光用途で
は、共焦点走査型顕微鏡の横解像力は約２００ｎｍであ
り、軸解像力は約６００〜８００ｎｍである。「横解像
力」なる語は、以下、焦点面における解像度を表すため
に使用される。二重共焦点走査型顕微鏡の横解像力は、
共焦点走査型顕微鏡の横解像力と実質的に等しいが、二
重共焦点走査型顕微鏡の軸解像力は、約１００〜２００
ｎｍの範囲にある。したがって、最大の解像力を実現す
るために、ビーム経路に配置される本発明による二重共
焦点走査型顕微鏡の素子の調整範囲の大きさの程度を定
義するのは、二重共焦点走査型顕微鏡の理論的な解像力
の値である。しかし、調整範囲の大きさのこのような程
度は、二重共焦点走査型顕微鏡に求められる要求に応じ
て、１０倍ほどに変動する可能性がある。したがって、
たとえば軸方向において蓄積収差が１０〜１０００ｎｍ
の範囲にあるように、ビーム経路に配置される素子の調
整を行うことができる。
【００１６】蓄積収差の調整は、本願明細書では光軸お
よび／または試料領域の少なくとも１つの面に関して行
われる。光軸に関する蓄積収差の調整の点において、好
ましくは回転対称である方式で横方向の誤差補正が行わ
れる。試料領域の少なくとも１つの面に関する蓄積収差
の調整の点において、軸方向の誤差補正が行われること
が好ましい。
よび／または試料領域の少なくとも１つの面に関して行
われる。光軸に関する蓄積収差の調整の点において、好
ましくは回転対称である方式で横方向の誤差補正が行わ
れる。試料領域の少なくとも１つの面に関する蓄積収差
の調整の点において、軸方向の誤差補正が行われること
が好ましい。
【００１７】きわめて一般的に言えば、試料領域の面
は、算出された基準の大きさである。面は、たとえば、
球形、楕円面、放物面または双曲的放物面のわずかに湾
曲した面などの任意の所望の形状および位置を備えてい
てもよい。面はまた、平面であってもよい。面は、焦点
面にある直線または光軸に対して対称であるように指向
されてもよい。試料領域の異なる面が、異なる種類の収
差のために設けられてもよい。
は、算出された基準の大きさである。面は、たとえば、
球形、楕円面、放物面または双曲的放物面のわずかに湾
曲した面などの任意の所望の形状および位置を備えてい
てもよい。面はまた、平面であってもよい。面は、焦点
面にある直線または光軸に対して対称であるように指向
されてもよい。試料領域の異なる面が、異なる種類の収
差のために設けられてもよい。
【００１８】具体的な実施形態において、平面として具
体化される試料領域の面は、少なくとも部分的に対物レ
ンズの焦点面と一致する。ビーム経路に配置される素子
の蓄積収差は、対物レンズの視野全体に関して補正され
ることが理想的である。対物レンズの焦点面と試料領域
の面の部分的な一致も考えられる。たとえば、光学的な
計算の境界条件の結果、対物レンズの視野の一部に関し
てのみ補正を行うことも可能であろう。
体化される試料領域の面は、少なくとも部分的に対物レ
ンズの焦点面と一致する。ビーム経路に配置される素子
の蓄積収差は、対物レンズの視野全体に関して補正され
ることが理想的である。対物レンズの焦点面と試料領域
の面の部分的な一致も考えられる。たとえば、光学的な
計算の境界条件の結果、対物レンズの視野の一部に関し
てのみ補正を行うことも可能であろう。
【００１９】特に好ましい実施形態において、焦点面に
対して対称に配置された試料領域の少なくとも２つの面
が設けられる。この場合には、１つの特定の種類の収差
が試料領域の一方の面に関して補正されてもよく、別の
種類の収差が試料領域の他方の面に関して補正されても
よい。ビーム経路に配置される素子の光学特性のため
に、試料領域の面の配置は一般に対称である。この実施
形態において、面は焦点面に対して対称に配置されるこ
とが好ましい。
対して対称に配置された試料領域の少なくとも２つの面
が設けられる。この場合には、１つの特定の種類の収差
が試料領域の一方の面に関して補正されてもよく、別の
種類の収差が試料領域の他方の面に関して補正されても
よい。ビーム経路に配置される素子の光学特性のため
に、試料領域の面の配置は一般に対称である。この実施
形態において、面は焦点面に対して対称に配置されるこ
とが好ましい。
【００２０】蓄積収差の補正に関して、ビーム経路全体
の素子を考慮することができる。したがって、これに
は、二重共焦点走査型顕微鏡のビーム経路における光源
と検出器との間に配置される素子が含まれる。光源およ
び／または検出器の誤差特性もまた、補正に関して考慮
することができる。特に、補正のため、たとえば、単純
な横方向および／または軸方向のオフセット誤差を補償
するために、励起用ピンホールおよび／または検出用ピ
ンホールを使用することができる。
の素子を考慮することができる。したがって、これに
は、二重共焦点走査型顕微鏡のビーム経路における光源
と検出器との間に配置される素子が含まれる。光源およ
び／または検出器の誤差特性もまた、補正に関して考慮
することができる。特に、補正のため、たとえば、単純
な横方向および／または軸方向のオフセット誤差を補償
するために、励起用ピンホールおよび／または検出用ピ
ンホールを使用することができる。
【００２１】別の実施形態において、干渉計のビーム経
路の素子が、蓄積収差の補正のために考慮される。この
ような素子には、特に、干渉計の主要なビームスプリッ
タ、偏向ミラーおよび対物レンズが含まれる。また、干
渉計の部分ビーム経路における素子の蓄積収差の補正も
提供される。たとえば、干渉計の部分ビーム経路の光路
長が異なる場合、または１つの光学素子が干渉計の部分
ビーム経路の１つにのみ配置される場合には、このよう
な補正は特に必要である。
路の素子が、蓄積収差の補正のために考慮される。この
ような素子には、特に、干渉計の主要なビームスプリッ
タ、偏向ミラーおよび対物レンズが含まれる。また、干
渉計の部分ビーム経路における素子の蓄積収差の補正も
提供される。たとえば、干渉計の部分ビーム経路の光路
長が異なる場合、または１つの光学素子が干渉計の部分
ビーム経路の１つにのみ配置される場合には、このよう
な補正は特に必要である。
【００２２】特に好都合な方式において、蓄積収差の補
正に関して、試料の容器の構成要素が考慮されてもよ
い。これらの構成要素には、特に、検出される試料をそ
の間に配置するカバーガラスが含まれる。したがって、
カバーガラスの屈折率、分散特性および／または厚さの
適切な選択によって、系全体の蓄積収差の補正を促進す
ることができる。これに関連して、カバーガラスの平坦
さも重要な役割を担っている場合もあり、異なる特性を
有するカバーガラスを使用するための設備が備えらても
よい。
正に関して、試料の容器の構成要素が考慮されてもよ
い。これらの構成要素には、特に、検出される試料をそ
の間に配置するカバーガラスが含まれる。したがって、
カバーガラスの屈折率、分散特性および／または厚さの
適切な選択によって、系全体の蓄積収差の補正を促進す
ることができる。これに関連して、カバーガラスの平坦
さも重要な役割を担っている場合もあり、異なる特性を
有するカバーガラスを使用するための設備が備えらても
よい。
【００２３】蓄積収差の補正のために、液浸媒体を考慮
することができる。「液浸媒体」は、一方では対物レン
ズとカバーガラスとの間に存在する媒体、他方では、検
出される試料を直接包囲する包埋媒体、またはカバーガ
ラスと試料との間に存在し、試料を任意に固定する媒体
として理解することができる。蓄積収差の補正のため
に、２つの液浸媒体に関して異なる光学特性を選択する
ことが好都合である場合がある。しかし、特に処理の簡
便さから、１つの液浸媒体のみが使用される。たとえ
ば、水、グリセリンまたは油など一般的な液浸媒体はす
べて、液浸媒体として適切である。
することができる。「液浸媒体」は、一方では対物レン
ズとカバーガラスとの間に存在する媒体、他方では、検
出される試料を直接包囲する包埋媒体、またはカバーガ
ラスと試料との間に存在し、試料を任意に固定する媒体
として理解することができる。蓄積収差の補正のため
に、２つの液浸媒体に関して異なる光学特性を選択する
ことが好都合である場合がある。しかし、特に処理の簡
便さから、１つの液浸媒体のみが使用される。たとえ
ば、水、グリセリンまたは油など一般的な液浸媒体はす
べて、液浸媒体として適切である。
【００２４】とりわけ好都合な実施形態において、干渉
計の個々の部分ビーム経路の蓄積収差は、互いに相対し
ている。このような場合には、１種類の収差のみに対し
てなされてもよく、干渉計の個々の部分ビーム経路のす
べての蓄積収差の逆補正も考えられる。
計の個々の部分ビーム経路の蓄積収差は、互いに相対し
ている。このような場合には、１種類の収差のみに対し
てなされてもよく、干渉計の個々の部分ビーム経路のす
べての蓄積収差の逆補正も考えられる。
【００２５】特に、干渉計の個々の部分ビーム経路の蓄
積軸収差は、対物レンズの焦点面に平行な試料領域にお
ける少なくとも１つの面に対して、互いに相対するよう
に形成される。縦色収差（異なる色または波長の画像
が、光軸上異なる位置にある）の実施例を用いて、この
種類の補正を示すことができる。本願明細書では、それ
に関連する顕微鏡対物レンズを備えた１つの部分ビーム
経路は、蓄積縦色収差を有し、短波長の照射光に関する
焦点面が顕微鏡対物レンズとその算出された焦点面との
間に存在する。長波長の照射光に関する焦点面は、顕微
鏡対物レンズの算出された焦点面に関して、顕微鏡対物
レンズとは反対側に存在する。他の部分ビーム経路およ
びその部分ビーム経路に関連する他の顕微鏡対物レンズ
の蓄積縦色収差の補正は、正確に逆の方式で実現するこ
とができる。すなわち、長波長の照射光に関する焦点面
は、この部分ビーム経路の場合には、顕微鏡対物レンズ
と顕微鏡対物レンズの算出された焦点面との間に存在す
る。短波長の焦点面は、顕微鏡対物レンズの算出された
焦点面とは反対側に存在する。２つのビーム経路および
顕微鏡対物レンズは、特定の波長の光が、算出された焦
点面の１つの共通の点に集光するように互いに対して指
向しているため、部分ビーム経路の素子の逆の補正の結
果、他方の波長の光はそれぞれの場合の１つの点で２つ
の顕微鏡対物レンズの算出された焦点面を越えて集光す
る。したがって、３つの異なる波長を用いて同時に照射
したとすると、３つの異なる照射焦点が光軸に沿って形
成される。短波長光の照射焦点は、１つの顕微鏡対物レ
ンズにより近い場所に位置すると思われる。中間波長光
の照射焦点は、適切であれば、共通の焦点面に位置し、
長波長照射光の照射焦点は、他の顕微鏡対物レンズによ
り近い場所に位置するであろう。この種の誤差補正に関
して、部分ビーム経路において使用される各照射波長の
個々の焦点は、少なくとも理論的に実現可能な解像力に
関する大きさの程度に一致していなければならない。二
重共焦点走査型顕微鏡の場合には、色の異なる照射焦点
は、検出器側で考慮されるべきである。言い換えれば、
たとえば、検出光の対応する色分割の後、検出用ピンホ
ールは共焦点に対応する点で各照射焦点に関して配置さ
れる。
積軸収差は、対物レンズの焦点面に平行な試料領域にお
ける少なくとも１つの面に対して、互いに相対するよう
に形成される。縦色収差（異なる色または波長の画像
が、光軸上異なる位置にある）の実施例を用いて、この
種類の補正を示すことができる。本願明細書では、それ
に関連する顕微鏡対物レンズを備えた１つの部分ビーム
経路は、蓄積縦色収差を有し、短波長の照射光に関する
焦点面が顕微鏡対物レンズとその算出された焦点面との
間に存在する。長波長の照射光に関する焦点面は、顕微
鏡対物レンズの算出された焦点面に関して、顕微鏡対物
レンズとは反対側に存在する。他の部分ビーム経路およ
びその部分ビーム経路に関連する他の顕微鏡対物レンズ
の蓄積縦色収差の補正は、正確に逆の方式で実現するこ
とができる。すなわち、長波長の照射光に関する焦点面
は、この部分ビーム経路の場合には、顕微鏡対物レンズ
と顕微鏡対物レンズの算出された焦点面との間に存在す
る。短波長の焦点面は、顕微鏡対物レンズの算出された
焦点面とは反対側に存在する。２つのビーム経路および
顕微鏡対物レンズは、特定の波長の光が、算出された焦
点面の１つの共通の点に集光するように互いに対して指
向しているため、部分ビーム経路の素子の逆の補正の結
果、他方の波長の光はそれぞれの場合の１つの点で２つ
の顕微鏡対物レンズの算出された焦点面を越えて集光す
る。したがって、３つの異なる波長を用いて同時に照射
したとすると、３つの異なる照射焦点が光軸に沿って形
成される。短波長光の照射焦点は、１つの顕微鏡対物レ
ンズにより近い場所に位置すると思われる。中間波長光
の照射焦点は、適切であれば、共通の焦点面に位置し、
長波長照射光の照射焦点は、他の顕微鏡対物レンズによ
り近い場所に位置するであろう。この種の誤差補正に関
して、部分ビーム経路において使用される各照射波長の
個々の焦点は、少なくとも理論的に実現可能な解像力に
関する大きさの程度に一致していなければならない。二
重共焦点走査型顕微鏡の場合には、色の異なる照射焦点
は、検出器側で考慮されるべきである。言い換えれば、
たとえば、検出光の対応する色分割の後、検出用ピンホ
ールは共焦点に対応する点で各照射焦点に関して配置さ
れる。
【００２６】同様の方式で、干渉計の個々の部分ビーム
経路の蓄積横収差は、光軸に対して互いに相対するよう
に形成されることができる。ディジタル画像処理法を用
いて、試料検出中および／または試料検出後に、蓄積軸
収差および／または横収差の逆の補正を考慮することが
できる。対応するデコンボリューション演算を使用する
ことができる。
経路の蓄積横収差は、光軸に対して互いに相対するよう
に形成されることができる。ディジタル画像処理法を用
いて、試料検出中および／または試料検出後に、蓄積軸
収差および／または横収差の逆の補正を考慮することが
できる。対応するデコンボリューション演算を使用する
ことができる。
【００２７】別法または追加として、少なくとも１つの
光学適応制御素子が蓄積収差の補正のために設けられ
る。光学適応制御素子は、二重共焦点走査型顕微鏡の照
射ビーム経路、検出ビーム経路または干渉計に配置され
てもよく、反射素子または半透明照明素子のいずれかと
して具体化されてもよい。光学適応制御素子は、位相共
役鏡および／または液晶表示（ＬＣＤ）素子および／ま
たはカラーＬＣＤ素子および／またはディジタルマイク
ロミラーおよび／または回折光弁（ＧＬＶ）および／ま
たは可変形ミラーであってもよい。
光学適応制御素子が蓄積収差の補正のために設けられ
る。光学適応制御素子は、二重共焦点走査型顕微鏡の照
射ビーム経路、検出ビーム経路または干渉計に配置され
てもよく、反射素子または半透明照明素子のいずれかと
して具体化されてもよい。光学適応制御素子は、位相共
役鏡および／または液晶表示（ＬＣＤ）素子および／ま
たはカラーＬＣＤ素子および／またはディジタルマイク
ロミラーおよび／または回折光弁（ＧＬＶ）および／ま
たは可変形ミラーであってもよい。
【００２８】特に好都合な方式において、二重共焦点走
査型顕微鏡のビーム経路に試料と共に検出用として導入
される光ビーム経路の素子、すなわち具体的に言えばカ
バーガラスおよび／または液浸媒体によって、用途に応
じた蓄積収差の補正を実現することができる。たとえ
ば、したがって、特定の種類の収差は干渉計のビーム経
路の素子によって補正されてもよいが、残りの収差の用
途に特有な微調整は、対応するカバーガラスの個別の使
用によって実現されてもよい。とりわけ好都合な方式に
おいて、これによって、この種の二重共焦点走査型顕微
鏡の使用可能性を拡大することができると思われる。追
加または別法として、本発明による光学適応制御素子の
使用によって、共焦点走査型顕微鏡のさまざまな利用を
実現することができる。
査型顕微鏡のビーム経路に試料と共に検出用として導入
される光ビーム経路の素子、すなわち具体的に言えばカ
バーガラスおよび／または液浸媒体によって、用途に応
じた蓄積収差の補正を実現することができる。たとえ
ば、したがって、特定の種類の収差は干渉計のビーム経
路の素子によって補正されてもよいが、残りの収差の用
途に特有な微調整は、対応するカバーガラスの個別の使
用によって実現されてもよい。とりわけ好都合な方式に
おいて、これによって、この種の二重共焦点走査型顕微
鏡の使用可能性を拡大することができると思われる。追
加または別法として、本発明による光学適応制御素子の
使用によって、共焦点走査型顕微鏡のさまざまな利用を
実現することができる。
【００２９】きわめて一般的に言えば、画像の鮮鋭度誤
差および／または画像スケール誤差および／または光学
素子の色収差に関して、対応がなされる。特に、光学素
子の球面収差および／または非点収差および／または像
面湾曲および／または歪曲収差および／またはコマ収差
に関して、補正の対応がなされる。色収差の補正は、特
に、縦色収差および／または横色収差および／または倍
率色収差を含む。色収差の補正は、２００〜２０００ｎ
ｍに拡大することができる波長領域に関して行われる。
差および／または画像スケール誤差および／または光学
素子の色収差に関して、対応がなされる。特に、光学素
子の球面収差および／または非点収差および／または像
面湾曲および／または歪曲収差および／またはコマ収差
に関して、補正の対応がなされる。色収差の補正は、特
に、縦色収差および／または横色収差および／または倍
率色収差を含む。色収差の補正は、２００〜２０００ｎ
ｍに拡大することができる波長領域に関して行われる。
【００３０】ビーム経路に配置される素子の収差補正に
加えて、光学素子の偏光特性の調整も行われる。この調
整によって、照射干渉パターンおよび／または検出干渉
パターンの最適化を実現することができ、これによっ
て、特に二重共焦点走査型顕微鏡の解像力を増大させる
ことができる。たとえば、λ／２波長板およびλ／４波
長板など偏光に影響を及ぼす媒体もまた、ビーム経路に
設けることができる。
加えて、光学素子の偏光特性の調整も行われる。この調
整によって、照射干渉パターンおよび／または検出干渉
パターンの最適化を実現することができ、これによっ
て、特に二重共焦点走査型顕微鏡の解像力を増大させる
ことができる。たとえば、λ／２波長板およびλ／４波
長板など偏光に影響を及ぼす媒体もまた、ビーム経路に
設けることができる。
【００３１】特に好ましい実施形態において、少なくと
も１つの光学素子は、位置調整可能である。これは、検
出用ピンホールであることが好ましい。二重共焦点走査
型顕微鏡のビーム経路にある励起用ピンホールまたは他
の素子の位置調整もまた、考えられる。対応する光学素
子の適切な位置調整によって、蓄積収差補正において残
る残留誤差を補償することができる。
も１つの光学素子は、位置調整可能である。これは、検
出用ピンホールであることが好ましい。二重共焦点走査
型顕微鏡のビーム経路にある励起用ピンホールまたは他
の素子の位置調整もまた、考えられる。対応する光学素
子の適切な位置調整によって、蓄積収差補正において残
る残留誤差を補償することができる。
【００３２】特に、残りの縦色収差を補償するために、
軸方向における検出用ピンホールの位置調整も行うこと
ができる。検出用ピンホールの位置調整において、設計
対策は、検出用ピンホールの軸位置調整中に横方向のオ
フセットが生じないようにするようになされている。検
出用ピンホールの横方向のオフセットは、ある環境では
信号の減少を生じるため、検出用ピンホールの軸位置調
整の結果として望ましくない横方向のオフセットが生じ
る場合には、そのオフセットを補正手段によって補償し
なければならない。その補正手段は、たとえば、光軸に
対して２つの横断方向に沿って、対応する精度または解
像度を備えた検出用ピンホールを位置調整することがで
きる移動ステージを含んでもよい。追加または別法とし
て、ビームスプリッタまたはミラーの傾斜によって、検
出用ピンホールの望ましくない横方向のオフセットを補
償してもよい。
軸方向における検出用ピンホールの位置調整も行うこと
ができる。検出用ピンホールの位置調整において、設計
対策は、検出用ピンホールの軸位置調整中に横方向のオ
フセットが生じないようにするようになされている。検
出用ピンホールの横方向のオフセットは、ある環境では
信号の減少を生じるため、検出用ピンホールの軸位置調
整の結果として望ましくない横方向のオフセットが生じ
る場合には、そのオフセットを補正手段によって補償し
なければならない。その補正手段は、たとえば、光軸に
対して２つの横断方向に沿って、対応する精度または解
像度を備えた検出用ピンホールを位置調整することがで
きる移動ステージを含んでもよい。追加または別法とし
て、ビームスプリッタまたはミラーの傾斜によって、検
出用ピンホールの望ましくない横方向のオフセットを補
償してもよい。
【００３３】特に好都合な実施形態において、検出用ピ
ンホールは、色選択素子として具体化されてもよい。こ
のような素子は、たとえば、ピンホールが効果的である
と思われる波長の光に対してのみ不透明であるコーティ
ングを施した透明基板によって製作されてもよい。検出
用ピンホールの開口部は一般に設けられているが、基板
はコーティングされていない。その点において、検出対
象の光は色選択素子を通過することができ、検出器によ
って検出することができる。
ンホールは、色選択素子として具体化されてもよい。こ
のような素子は、たとえば、ピンホールが効果的である
と思われる波長の光に対してのみ不透明であるコーティ
ングを施した透明基板によって製作されてもよい。検出
用ピンホールの開口部は一般に設けられているが、基板
はコーティングされていない。その点において、検出対
象の光は色選択素子を通過することができ、検出器によ
って検出することができる。
【００３４】好都合なことに、対応する色選択素子は、
各検出波長または各検出波長領域に関して設けられる。
個別の検出波長領域または個別の検出波長に対応する共
焦点を形成する照射焦点が位置する点において、各色選
択素子は、検出ビーム経路に配置される。たとえば、３
つの異なる色選択素子が、光軸に沿って１つの素子の背
後に別の素子を静止方式で配置されてもよく、さまざま
な検出波長領域の連続検出を実現することができる。こ
れは、第１の色選択素子のみが検出用ピンホールとして
作用する第１の照射波長を用いて、まず試料が照射され
ることを意味する。別の２つの色選択素子は、第１の検
出波長領域に対してほぼ透明であるため、第１の照射波
長に対応する検出光が色選択素子の後に配置された検出
器によって検出される。この第１の検出の次に第２の検
出が行われる。すなわち試料が第２の照射波長の照射光
を用いて照射される。第２の検出波長領域に対応する色
選択素子が、今度の検出対象である検出光のための検出
用ピンホールとして作用し、同一の検出器によって検出
される。次に同様の方式で、第３の照射波長による照射
を用いた同一の試料の第３の検出が行われ、第３の色選
択素子は、今度は第３の照射波長に対応する検出光のた
めの検出用ピンホールとして作用する。
各検出波長または各検出波長領域に関して設けられる。
個別の検出波長領域または個別の検出波長に対応する共
焦点を形成する照射焦点が位置する点において、各色選
択素子は、検出ビーム経路に配置される。たとえば、３
つの異なる色選択素子が、光軸に沿って１つの素子の背
後に別の素子を静止方式で配置されてもよく、さまざま
な検出波長領域の連続検出を実現することができる。こ
れは、第１の色選択素子のみが検出用ピンホールとして
作用する第１の照射波長を用いて、まず試料が照射され
ることを意味する。別の２つの色選択素子は、第１の検
出波長領域に対してほぼ透明であるため、第１の照射波
長に対応する検出光が色選択素子の後に配置された検出
器によって検出される。この第１の検出の次に第２の検
出が行われる。すなわち試料が第２の照射波長の照射光
を用いて照射される。第２の検出波長領域に対応する色
選択素子が、今度の検出対象である検出光のための検出
用ピンホールとして作用し、同一の検出器によって検出
される。次に同様の方式で、第３の照射波長による照射
を用いた同一の試料の第３の検出が行われ、第３の色選
択素子は、今度は第３の照射波長に対応する検出光のた
めの検出用ピンホールとして作用する。
【００３５】複数の検出波長領域の同時検出は、色選択
素子の後に配置されるマルチバンド検出器または分光計
を用いて、実現することができる。
素子の後に配置されるマルチバンド検出器または分光計
を用いて、実現することができる。
【００３６】以上で説明したように、この発明により、
特に多色蛍光用途に関連して、少なくともほぼ理論的に
可能である解像力を実現することができる二重共焦点走
査型顕微鏡を提供することができる。
特に多色蛍光用途に関連して、少なくともほぼ理論的に
可能である解像力を実現することができる二重共焦点走
査型顕微鏡を提供することができる。
【００３７】なお、本発明の教示を有利に具体化し、展
開するためのさまざまな方法がある。図面を参照された
い。
開するためのさまざまな方法がある。図面を参照された
い。
【図１】 図１は、本発明による二重共焦点走査型顕微
鏡の具体的な実施形態を概略的に示す図である。
鏡の具体的な実施形態を概略的に示す図である。
【図２】 図２は、二重共焦点走査型顕微鏡の検出され
るビーム経路において、２つの色選択成分を概略的に示
す図である。
るビーム経路において、２つの色選択成分を概略的に示
す図である。
１ 二重共焦点走査型顕微鏡、 ２ 照射ビーム経路、
３ レーザ光源、 ４検出ビーム経路、 ５ 検出
器、 ６ レンズ、 ７ 励起用ピンホール、８ ダイ
クロイックビームスプリッタ、 ９ 走査装置、 １０
干渉計、 １１ ミラー、 １２ ミラー、 １３
顕微鏡対物レンズ１４ 顕微鏡対物レンズ、 １５ 共
通の焦点、 １６ 焦点面、 １７ 検出用ピンホー
ル、 １８試料領域における面、 １９ 試料領域にお
ける面、２０ 試料領域における面、 ２１ 部分ビー
ム経路、 ２２ 部分ビーム経路、 ２３ 検出用ビー
ム経路、 ２４ 色選択素子２５ 色選択素子、 ２６
透過特性、 ２７ 検出用ピンホール、 ２８ 検出
用ピンホール、 ２９ 透過特性、 ３０ 検出光、
３１ 検出光、 ３２ マルチバンド検出器、
３ レーザ光源、 ４検出ビーム経路、 ５ 検出
器、 ６ レンズ、 ７ 励起用ピンホール、８ ダイ
クロイックビームスプリッタ、 ９ 走査装置、 １０
干渉計、 １１ ミラー、 １２ ミラー、 １３
顕微鏡対物レンズ１４ 顕微鏡対物レンズ、 １５ 共
通の焦点、 １６ 焦点面、 １７ 検出用ピンホー
ル、 １８試料領域における面、 １９ 試料領域にお
ける面、２０ 試料領域における面、 ２１ 部分ビー
ム経路、 ２２ 部分ビーム経路、 ２３ 検出用ビー
ム経路、 ２４ 色選択素子２５ 色選択素子、 ２６
透過特性、 ２７ 検出用ピンホール、 ２８ 検出
用ピンホール、 ２９ 透過特性、 ３０ 検出光、
３１ 検出光、 ３２ マルチバンド検出器、
フロントページの続き (72)発明者 ヒルマー、グーゲル ドイツ、ドッセンハイム 69221、コンラ ッドアデナウアーシュトラッセ23ベー (72)発明者 ユーゲン、ホフマン ドイツ、ビスバーデン 65191、ビールシ ュタッター ヘーエ63 Ｆターム(参考） 2G043 AA03 CA05 EA01 FA02 GA04 GB01 HA01 HA09 LA01 2H052 AA08 AB02 AB06 AB24 AB26 AC14 AC27 AC29 AC34 AD34 AD35 AF06 AF25
Claims (5)
- 【請求項１】 少なくとも１つの光源（３）の照射ビー
ム経路（２）と、少なくとも１つの検出器（５）の検出
ビーム経路（４）と、を有し、 前記照射ビーム経路（２）および前記検出ビーム経路
（４）に配置される素子（６，１０，１３，１４）の光
学特性が、光軸（３３）および／または試料領域に定義
される少なくとも１つの面（１８，１９，２０）に関し
て、蓄積収差が少なくとも理論的に実現可能な解像力の
大きさの程度であるように互いに調整されていることを
特徴とする二重共焦点走査型顕微鏡。 - 【請求項２】 前記試料領域の前記面（１９）が、対物
レンズの焦点面（１６）と少なくとも部分的に一致する
ことと、前記試料領域の少なくとも２つの面（１８，２
０）が前記焦点面（１６）に対して対称に配置されるこ
とと、を特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。 - 【請求項３】 前記共焦点走査型顕微鏡（１）が少なく
とも２つの個別の部分ビーム経路（２１，２２）を定義
し、前記個別の部分ビーム経路（２１，２２）におい
て、蓄積収差が互いに相対することを特徴とする請求項
１に記載の走査型顕微鏡。 - 【請求項４】 前記光学素子の画像鮮鋭度誤差および／
または画像スケール誤差および／または色収差が、補正
されることを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微
鏡。 - 【請求項５】 少なくとも１つの光学素子（１７，８）
が、位置調整可能であることを特徴とする請求項１に記
載の走査型顕微鏡。
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