CN104155274B - 一种双光束光片照明显微扫描成像方法及显微镜 - Google Patents

Abstract

本发明属于显微扫描技术领域，公开了一种双光束光片照明显微扫描成像方法，包括：将同一光源输出的扫描激光分为第一方向扫描激光和第二方向扫描激光；两路扫描激光垂直投射在样品上，激发样品荧光，投射方向相反；探测收集样品上激发的荧光并曝光成像；移动样品，重复上述过程直到扫描获取完整的样品图像；其中，两路扫描激光同步扫描，产生光片激发样品，投射方向为x轴方向；扫描方向为y轴方向；样品的荧光采集方向为z轴方向；两路扫描激光的扫描初始位置为扫描阵面的中线处；两路扫描激光的扫描方向相反。本发明通过采用双光束扫描激光对透明样品进行光片照明成像，以期获得更高的成像速率；通过图像频域权重叠加提升成像质量。

Description

一种双光束光片照明显微扫描成像方法及显微镜

技术领域

本发明涉及显微成像技术领域，特别涉及一种双光束光片照明显微扫描成像方法及显微镜。

背景技术

光片照明显微镜是利用微米级的激发光薄片激发样品的荧光，用全场探测的方式实现样品的快速荧光信号探测。光片照明显微成像采用了线状照明取代传统的点扫描成像方式，因此它具有更高的成像速率，更高的信噪比以及更低的光漂白光毒性效应，适用于数小时甚至数天的活体生物成像。

传统共聚焦光片照明显微成像技术受限于成像器件的曝光模式，这种扫描方式无法做到满帧速率的读出，且不能利用回程扫描的光束，因此极大限制了成像速率，进而限制了整体系统的成像速率。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种提升成像速率光片照明显微成像技术。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种双光束光片照明显微扫描成像方法，包括以下步骤：

将同一光源输出的扫描激光分为第一方向扫描激光和第二方向扫描激光；

所述第一方向扫描激光和所述第二方向扫描激光垂直投射在样品上，激发样品荧光；且所述第一方向扫描激光与所述第二方向扫描激光的投射方向相反；

探测收集样品上激发的荧光并曝光成像；

移动样品，重复上述过程直到扫描获取完整的样品图像；

其中，所述第一方向扫描激光与所述第二方向扫描激光同步扫描，且扫描速度一致；

所述第一方向扫描激光与所述第二方向扫描激光的投射方向为x轴方向；所述第一方向扫描激光与所述第二方向扫描激光的扫描方向为y轴方向；样品的荧光采集方向为z轴方向；

所述第一方向扫描激光与所述第二方向扫描激光的扫描初始位置为扫描阵面的中线处；所述第一方向扫描激光与所述第二方向扫描激光的扫描方向相反。

进一步地，所述第一方向扫描激光自扫描阵面中线开始，沿y轴正向扫描，在扫描阵列的y轴正向边缘折返，沿y轴负向扫描，直至完成扫描阵面内的图像扫描；所述第二方向扫描激光自扫描阵面中线开始，沿y轴负向扫描，在扫描阵列的y轴负向边缘折返，沿y轴正向扫描，直至完成扫描阵面内的图像扫描。

进一步地，分别对第一方向扫描激光和第二方向扫描激光激发的样品荧光进行曝光输出的样品图像进行傅立叶变换，获取频域分布；将两个图像进行基于频域分布的权重叠加，输出样品图像。

进一步地，所述第一方向扫描激光自扫描阵面中线开始，沿y轴正向扫描，直至完成扫描阵面中线一侧的图像扫描；所述第二方向扫描激光自扫描阵面中线开始，沿y轴负向扫描，直至完成扫描阵面中线另一侧内的图像扫描。

进一步地，投射在样品上的所述扫描激光呈线状。

一种双光束光片照明显微镜，其特征在于，包括：

照明单元，用于产生基于同光源的两路扫描激光并投射到样品相对的两侧面上；

探测成像单元，用于探测收集扫描激光激发的样品荧光并曝光成像；

控制单元，产生控制时序，控制照明单元进行扫描动作；同时控制探测成像单元进行荧光探测和图像曝光，并将两路扫描激光激发样品荧光产生的两幅图像进行图像叠加，获取完整图像；

其中，所述控制单元设置样品移动结构，用于承载和移动样品。

进一步地，所述照明单元包括：光源；

分光结构，将光源输出的光信号分为两路等光强的两束扫描激光；

光路转换结构，转换光路，将两路扫描光信号垂直投射在样品相对的两侧面上；

其中，所述光路转换结构设置倒像装置，使一路所述扫描激光产生倒像。

进一步地，所述探测成像单元包括：图像传感器；所述图像传感器为两块，分别探测收集两路扫描激光激发的样品荧光，并进行曝光成像，输出图像数据。

进一步地，所述控制单元包括：控制器；所述控制器接收图像数据，进行图像重构；并生成控制时序，控制光源进行扫描动作；同时，驱动样品移动结构动作，移动承载样品；其中，图像重构是先将两路扫描激光激发样品荧光产生的两幅图像进行傅立叶变换，获取频域分布；再将两个图像进行基于频域分布的权重叠加，输出样品图像。

进一步地，所述光源还包括：声光可调滤波器ATOF；所述ATOF连接在所述光源与分光结构之间，控制光源通断。

本发明提供的双光束光片照明显微扫描成像方法通过双光束光片扫描样品相对的两侧获取样品图像信号；再将两路图像信号叠加获得样品的完整图像信号，从而实现满帧速率的数据采集，实现成像速度的倍增，大大提升成像；另一方面通过两侧交替照明，叠加图像信号的方式可以降低图像信号中背景的权重，从而降低背景的干扰大大提升图像成像的质量。

附图说明

图1为本发明实施例提供的双光束光片照明显微扫描成像技术的光路图；

图2为本发明实施例提供的双光束光片扫描示意图；

图3为本发明实施例提供的双光束光片扫描曝光示意图。

具体实施方式

本发明提供了一种双光束光片照明显微扫描成像方法，包括以下步骤：

将同一光源输出的扫描激光分为第一方向扫描激光和第二方向扫描激光；

第一方向扫描激光和第二方向扫描激光垂直投射在样品上，激发样品荧光；且第一方向扫描激光与第二方向扫描激光的投射方向相反；

探测收集样品上激发的荧光并曝光成像；

移动样品，重复上述过程直到扫描获取完整的样品图像；

其中，第一方向扫描激光与第二方向扫描激光同步扫描，且扫描速度一致；

第一方向扫描激光与第二方向扫描激光的投射方向为x轴方向；第一方向扫描激光与第二方向扫描激光的扫描方向为y轴方向；样品的荧光采集方向为z轴方向；

第一方向扫描激光与第二方向扫描激光的扫描初始位置为扫描阵面的中线处；第一方向扫描激光与第二方向扫描激光的扫描方向相反。

本发明实施例提供的光片照明显微扫描成像技术为一种通过两束反向光束扫描产生光片，执行扫描的方法，针对透明样品；将光源投射到样品上，激发荧光，通过图像传感设备收集荧光进行图像曝光和图像重构。

本实施例中，通过一个稳定光源分成两束呈光片的扫描信号：第一方向扫描激光和第二方向扫描激光，保证两路扫描激光属性相同，包括：频率、光强等。

鉴于样品是透明的，通常样品经过前期加工，能够保有一定的厚度，通过光片扫描信号能够完整的获得图像信息；本实施例提供的方法，通过移动样品，调节样品的位置，获得多个局部的图形图像信息，之后重构形成三维立体图形信息。

本实施例中，通过两侧扫描，获得两个独立的图形数据信号，分别独立曝光重构图像；鉴于两侧测量的背景不同，而样品本身结构一致，因此，两个图像信号叠加之后，会增强样品本身的图像信息权重，弱化背景区域的图像信息，从而提升图像质量，更为清晰地反映样品本身的信息。

同时鉴于方法本身的原理要求，两路扫描信号同步扫描，从而基于同一时间坐标系，完整扫描过程，方便图像叠加的信息对应，避免重叠覆盖或者干扰遗漏。扫描激光投射到样品的方向为x轴方向，第一方向扫描激光和第二方向扫描激光垂直投射在样品上，激发样品荧光；且第一方向扫描激光与第二方向扫描激光的投射方向相反；第一方向扫描激光与第二方向扫描激光同步扫描，且扫描速度一致；扫描激光的扫描方向为y轴方向；激发的样品的荧光采集方向为z轴方向；两束扫描光束从图像中线处分别向y轴正负方向执行扫描动作，从而针对两路激发荧光，从而提升扫描速度。通过图像传感器进行同步曝光时，进行滚动式行曝光，从而产生虚拟狭缝，阻挡焦平面以外的杂散光，保证图像质量。

第一方向扫描激光与第二方向扫描激光的扫描初始位置为扫描阵面的中线处；第一方向扫描激光与第二方向扫描激光的扫描方向相反；两路扫描信号投射在样品上的初始位置为扫描阵面的中线处，通过扫描信号对样品进行线状激发，因此收集到的荧光也将获得线状曝光；两路扫描信号的扫描方向相反；即以扫描阵列中线为起点，两路扫描信号分别扫描样品的一半区域，获得样品的一半图形图像信息；然后将两者以坐标以及时间轴为对应标准叠加构成完整的图像信息。第一方向扫描激光自扫描阵面中线开始，沿y轴正向扫描，直至完成扫描阵面中线一侧的图像扫描；第二方向扫描激光自扫描阵面中线开始，沿y轴负向扫描，直至完成扫描阵面中线另一侧内的图像扫描；从而大大提升扫描效率。

或者第一方向扫描激光自扫描阵面中线开始，沿y轴正向扫描，在扫描阵列的y轴正向边缘折返，沿y轴负向扫描，直至完成扫描阵面内的图像扫描；所述第二方向扫描激光自扫描阵面中线开始，沿y轴负向扫描，在扫描阵列的y轴负向边缘折返，沿y轴正向扫描，直至完成扫描阵面内的图像扫描。分别对第一方向扫描激光和第二方向扫描激光激发的样品荧光进行曝光输出的样品图像进行傅立叶变换，获取频域分布；将两个图像进行基于频域分布的权重叠加，输出样品图像。即，当一侧的扫描激光完成中线一侧的样品扫描完成后，折返到中线的另一侧，继续扫描剩下的部分，从而获取完整的图像信息；最后将两路图像获得两侧的像信息叠加，大大削弱图像中的背景权重，提升图像质量。参见图1，本实施例提供的扫描方法的光路图，光源1输出稳定光束，经过光路结构传递，通过分光结构分成两束，在经过光路转换投射到样品6的两侧，激发样品6的荧光；最终荧光收集到图像传感器10内进行曝光和数据输出，得图像数据信息。

参见图2，扫描信号通过物镜13和物镜5投射在样品6上，以中线为界，分别扫描一半样品；或者，通过折返扫描完整图像；即，形成分时交替照明扫描提升扫描效率。

参见图3，扫描曝光方式为线形曝光，最终与扫描同步的曝光图像是线形输出的。

基于上述扫描显微方法，本实施例还提出一种双光束光片照明显微镜，包括：

照明单元，用于产生基于同光源的两路扫描激光并投射到样品相对的两侧面上；

探测成像单元，用于探测收集扫描激光激发的样品荧光并曝光成像；

控制单元，产生控制时序，控制照明单元进行扫描动作；同时控制探测成像单元进行荧光探测和图像曝光，并进行图像叠加；

其中，所述控制单元设置样品移动结构，用于承载和移动样品。

参见图1，本实施例还提供一种具体的显微结构，照明单元包括：光源1，输出稳定扫描光束；在光源1输出端添加声光可调滤波器ATOF14；当振镜回程，即两光束回到扫描阵面中线位置的这段时间中以及样品移动过程中，通过ATOF阻止光照到样品上，减小光毒性及光漂白；同时，声光可调滤波器ATOF14能够滤除杂光，保证扫描光束质量，从而保证成像质量。

光路转换结构，转换光路，将两路扫描光信号投射在样品相对的两侧面上；

其中，光路转换结构设置倒像装置，使一路所述扫描激光产生倒像。即，通过倒像装置使扫描信号产生倒像，保证扫面信号的扫描方向相反，从而扫描样品中线两侧的部分。倒像装置12可以选用中继棱镜或者道威棱镜，改变光路扫描方向。

扫描信号的光强须保持相同，优选的，通过设置衰减片15，降低光强较强的一路扫描信号。

扫描信号的动作须保持同步，以期获得良好的图像同步性；优选的，设置光学元件同时控制两路信号的扫描动作，替代分别控制扫描动作的方式；可以采用振镜3，设置在声光可调滤波器14与分光结构11之间；通过振镜3振动，调整扫描信号的矢量方位，从而完成扫描信号的扫描方向的调整。

分光结构，可以采用常规的分光镜11。

为了应对不同尺寸样品或者使用对象的需求，优选的，在扫描光束进入振镜3前，先经过扩束镜2，扩大光束直径和散发角度。

扫描信号投射到样品前，两路扫描信号可以分别经过物镜5和物镜13聚焦投射到样品的聚焦平面上，保证充分的光强。

图像传感器为两块，分别探测收集两路扫描激光激发的样品荧光，并进行曝光成像，输出图像数据。探测成像单元包括：图像传感器10；图像传感器10探测收集扫描光信号激发的样品荧光，并进行曝光成像，输出图像数据。为了便于图像传感器10收集荧光信号，可以通过光学元件收集，可以通过物镜7、管镜8以及滤光镜9传输给图像传感器10；获得集中，纯净的荧光信号。

控制单元包括：控制器；控制器接收图像数据，进行图像重构；并生成控制时序，控制光源进行扫描动作；同时，驱动样品移动结构动作，移动承载样品。

图像传感器为两块，分别对应收集两路扫描激光激发的样品荧光。两块芯片可以独立在x方向上分别向相反方向同时进行滚动式行曝光从而产生虚拟狭缝，以阻挡焦平面以外的杂散光，图像传感器与扫描光片相互配合，可以两倍的速度对一幅图进行成像。

本实施例可进行快速的三维成像。AOTF通光，振镜开始扫描，左右两个光束从图像中间开始向相反方向扫描，分别进行一半样品的线状激发，被激发的行与图像传感器曝光的行同步，进行成像，图像传感器完成曝光后的行进行数据读出，随后AOTF阻止光源通过，样品移动一个步进，光片交替成像，反复重复以上即可得到三维体积成像。AOTF、振镜、平移台、图像传感器紧密相互配合，振镜仅进行半个周期的扫描即可得到一帧图像，比现有的光片照明显微系统成像速度提高一倍。

本实施例中，物镜根据实验的需要可以选择水镜或干镜，滤光片将会阻挡激发光，仅使样本发出的荧光通过。照明单元就是形成照亮小部分样品的光片的单元。光束首先被扩束，然后经过振镜，最后充满照明物镜后瞳，聚焦在照明物镜焦平面。照明物镜焦平面与探测物镜焦平面垂直。通过控制单元给振镜斜三角波信号，振镜振动，在照明物镜后形成光片，激发一层样品。受激发的样品发出荧光由探测光路收集并在图像传感器上成像。其中，样本被固定在0.5％-1％的琼脂糖胶中，该糖胶适合样本生存，并且糖胶的折射率与水的折射率相近，便于照明与成像。控制单元可以控制移动单元，振镜完成一个振动周期后，平移台移动一个步进，成一帧图像。从而实现了荧光样品的三维层析成像。光片照明显微成像采用了线状照明取代传统的点扫描成像方式，具有更高的成像速率，更高的信噪比以及更低的光漂白光毒性效应。

本发明提供的双光束光片照明显微扫描成像方法通过双光束光片扫描样品相对的两侧获取样品图像信号；再将两路图像信号叠加获得样品的完整图像信号，从而实现满帧速率的数据采集，实现成像速度的倍增，大大提升成像；另一方面通过两侧交替照明，叠加图像信号的方式可以降低图像信号中背景的权重，从而降低背景的干扰大大提升图像成像的质量。

最后所应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种双光束光片照明显微扫描成像方法，其特征在于，包括以下步骤：

将同一光源输出的扫描激光分为第一方向扫描激光和第二方向扫描激光；

所述第一方向扫描激光和所述第二方向扫描激光垂直投射在样品上，激发样品荧光；且所述第一方向扫描激光与所述第二方向扫描激光的投射方向相反；

探测收集样品上激发的荧光并曝光成像；

移动样品，重复上述过程直到扫描获取完整的样品图像；

其中，所述第一方向扫描激光与所述第二方向扫描激光同步扫描，且扫描速度一致；

所述第一方向扫描激光与所述第二方向扫描激光的投射方向为x轴方向；所述第一方向扫描激光与所述第二方向扫描激光的扫描方向为y轴方向；样品的荧光采集方向为z轴方向；

所述第一方向扫描激光与所述第二方向扫描激光的扫描初始位置为扫描阵面的中线处；所述第一方向扫描激光与所述第二方向扫描激光的扫描方向相反。

2.如权利要求1所述的双光束光片照明显微扫描成像方法，其特征在于：所述第一方向扫描激光自扫描阵面中线开始，沿y轴正向扫描，在扫描阵列的y轴正向边缘折返，沿y轴负向扫描，直至完成扫描阵面内的图像扫描；所述第二方向扫描激光自扫描阵面中线开始，沿y轴负向扫描，在扫描阵列的y轴负向边缘折返，沿y轴正向扫描，直至完成扫描阵面内的图像扫描。

3.如权利要求2所述的双光束光片照明显微扫描成像方法，其特征在于：分别对第一方向扫描激光和第二方向扫描激光激发的样品荧光进行曝光输出的样品图像进行傅立叶变换，获取频域分布；将两个图像进行基于频域分布的权重叠加，输出样品图像。

4.如权利要求1所述的双光束光片照明显微扫描成像方法，其特征在于：所述第一方向扫描激光自扫描阵面中线开始，沿y轴正向扫描，直至完成扫描阵面中线一侧的图像扫描；所述第二方向扫描激光自扫描阵面中线开始，沿y轴负向扫描，直至完成扫描阵面中线另一侧内的图像扫描。

5.如权利要求1所述的双光束光片照明显微扫描成像方法，其特征在于：投射在样品上的所述扫描激光呈线状。

6.一种双光束光片照明显微镜，其特征在于，包括：

照明单元，用于产生基于同光源的两路扫描激光并投射到样品相对的两侧面上，从中线开始向相反方向扫描两侧的部分，分别进行一半样品的线状激发；

探测成像单元，用于探测收集扫描激光激发的样品荧光并曝光成像；

控制单元，产生控制时序，控制照明单元进行扫描动作；同时控制探测成像单元进行荧光探测和图像曝光，并将两路扫描激光激发样品荧光产生的两幅图像进行图像叠加，获取完整图像；

其中，所述控制单元设置样品移动结构，用于承载和移动样品。

7.如权利要求6所述的双光束光片照明显微镜，其特征在于，照明单元包括：光源；

分光结构，将光源输出的光信号分为两路等光强的两束扫描激光；

光路转换结构，转换光路，将两路扫描光信号垂直投射在样品相对的两侧面上；

其中，所述光路转换结构设置倒像装置，使一路所述扫描激光产生倒像。

8.如权利要求6所述的双光束光片照明显微镜，其特征在于，所述探测成像单元包括：图像传感器；所述图像传感器为两块，分别探测收集两路扫描激光激发的样品荧光，并进行曝光成像，输出图像数据。

9.如权利要求8所述的双光束光片照明显微镜，其特征在于，所述控制单元包括：控制器；所述控制器接收图像数据，进行图像重构；并生成控制时序，控制光源进行扫描动作；同时，驱动样品移动结构动作，移动承载样品；

其中，图像重构是先将两路扫描激光激发样品荧光产生的两幅图像进行傅立叶变换，获取频域分布；再将两个图像进行基于频域分布的权重叠加，输出样品图像。

10.如权利要求7所述的双光束光片照明显微镜，其特征在于，所述光源还包括：声光可调滤波器ATOF；所述ATOF连接在所述光源与分光结构之间，控制光源通断。