JP6231154B2 - 光走査システム - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年１月２０日出願の仮出願第６１／４３４，５５７号の利益を主張する。

本開示は、蛍光顕微鏡検査法に関し、詳細には、標本の焦点面を照らし走査するために顕微鏡器具において使用され得る走査システムに関する。

レーザ走査共焦点顕微鏡法は、光学顕微鏡法において著しく進歩してきているものであり、その主な理由は、この技術は、生体および固定の細胞および組織内深くの視覚化を可能にし、標本の三次元レンダリングがそこから作り出され得るはっきりと画定された光学的断面を収集することができるためである。共焦点顕微鏡法は、従来の広角視野型光学顕微鏡と比べていくつかの利点を提供しており、これらの利点は、被写界深度に対する制御、焦点面からの背景情報の削除または低減、および厚い標本から連続的な光学的断面を収集する能力を含む。共焦点結像は通常、空間的にフィルタ処理された個々の標本点からの光の連続的収集、その後の電子信号処理、最終的には対応する画像点としての視覚的表示に依拠する。一般的な共焦点顕微鏡は、励起光の集束された光線または線を使用して標本内の点または線を照らす。標本焦点面上に集束された励起光線を走査することは、顕微鏡段を集束された励起光線の固定された位置に対して機械的に並進させることによって達成され得る。しかし、この段を機械的に並進させることは時間がかかるプロセスである。あるいは、励起光線は、回転式鏡から光線を反射させることによって焦点面上で走査され得る。しかし、鏡を回転させることにより、枢動軸が作り出され、この枢動軸は、励起光線の一部分が対物レンズの背後に位置する板によって切り取られる（ｃｌｉｐｐｅｄ）という結果をしばしば生み出し、それによって焦点面に到達する励起光線の光輝を低減させる。

技術者および顕微鏡設計者は、さまざまなレンズベースのシステムを設計して励起光線の経路を制御することによってこれらの問題を是正しようと試みている。しかし、レンズは、大きい走査角度に対して許容不可能な収差ならびにかなり増大された経路長さをシステム内にもたらし、レンズはまた、追加の整合自由度を必要とし、これはシステムの複雑性を助長し得る。上記で説明された理由により、技術者、科学者、および顕微鏡製造者は、焦点面の共焦点照明を走査するためのより早いシステムおよび方法を求め続けている。

標本内の焦点面の迅速な線毎の照明を実施するために使用され得るさまざまな光走査システムが、開示される。光走査システムは、共焦点顕微鏡器具内に組み込まれて、対物レンズの裏板にある開口内に存在する励起光線枢動軸を作り出すことができる。光走査システムは、光源から励起光の光線を受け、この励起光線を、集束された励起光線を焦点面上で連続的に走査する間対物レンズの裏板の開口内の枢動点を通り抜けるように方向付ける。光走査システムは、平坦な鏡で実施され、それによって励起光線の収差および減衰を限定する。鏡は、小さくまとめられた配置で装着されて経路長さを限定することができる。光走査システムはレンズを用いて実施されないため、励起光線を整合させるために４自由度のみが使用される。

例となる共焦点顕微鏡器具の概略図である。 蛍光の３つの光線が標本内の焦点面から発せられている、図３に示された共焦点顕微鏡器具を示す図である。 例となる共焦点顕微鏡器具の概略図である。 図３Ａは例となる光走査システムの上面図である。図３Ｂは例となる光走査システムの等角図である。 枢動点を通り抜けるさまざまな経路に沿って光の励起光線を出力する、図３に示された光走査システムを示す図である。 図５Ａは、励起光線が図３に示された光走査システムを通って進行する経路の断片図である。図５Ｂは、励起光線が図３に示された光走査システムを通って進行する経路の断片図である。図５Ｃは、励起光線が図３に示された光走査システムを通って進行する経路の断片図である。

図１Ａは、例となる共焦点顕微鏡器具１００の概略図を示している。共焦点顕微鏡器具および対応する光学経路には数多くのさまざまなタイプが存在する。器具１００は、共焦点顕微鏡器具のさまざまなよく知られている変形形態すべての中の光学経路を表すことは意図されてはおらず、その代わり、一体式光走査システムを含む共焦点顕微鏡器具の一般的な原理を示すことが意図される。器具１００は、光源１０２と、線形成要素１０３と、光走査システム１０４と、ダイクロイック鏡１０６と、裏板１１０付き対物レンズ１０８と、段１１２と、フィルタおよび結像光学素子１１４と、ローリング・ライン・シャッタ・モードの検出器１１６と、制御部１１８とを含む。光源１０２は、励起光１２０の、高輝度で実質的に単色の光線を発するレーザになることができ、この光線は、標本１２２内の特定の材料と結合するように設計された蛍光プローブの蛍光色素分子からの蛍光の発光を刺激するように選択される。光走査システム１０４は、図３〜５を参照して以下でより詳細に説明される、走査鏡３０２および２つの固定式鏡３０４および３０６を含む。励起光線１２０は、線形成要素１０３を通り抜け、線形成要素１０３は、励起光線１２０を、鏡３０４、３０６、および３０８の平面に対してほぼ垂直に方向付けられる線形状の励起光線になるように成形するパウエルレンズになることができる。

制御部１１８は、鏡３０８の位置を制御し、それにより、鏡３０４、３０６および３０８からの６回の反射後の励起光線１２０は、最終的には、「枢動点」と呼ばれる点１２４において交差する多くのさまざまな経路の１つに沿って出力される。たとえば、パターン形成された線１２６〜１２８は、光走査システム１０４が線形状の励起光線をそれに沿って出力する一連の別個の経路の３つだけを表す。経路１２６〜１２８は、枢動点１２４において交差する。光源１０２および光走査システム１０４は、枢動点１２４が裏板１１０の開口１３０にまたはその近くに位置するようダイクロイック鏡１０６が励起光線経路と交差するように器具１００内に配置される。たとえば、図１Ａに示されるように、励起光線が、光走査システム１０４によって経路１２６〜１２８のいずれか１つ上に置かれたとき、線形状の励起光線は、ダイクロイック鏡１０６から反射され、開口１３０内に位置する枢動点１２４を通り抜ける。対物レンズ１０８は、励起光線を、焦点面１３２内に存在する焦線に集束させる。たとえば、光走査システム１０４が励起光線を３つの経路１２６〜１２８のいずれか１つ上に置くとき、対物レンズ１０８は、線形状の励起光線を焦線１３４〜１３６上にそれぞれ集束させ、焦線１３４〜１３６は、焦点面２３６内にあり、鏡３０４、３０６、３０８および１０６を含む平面に対して垂直に向けられる。光走査システム１０４は、枢動点１２４を通り抜ける一連の光線経路にわたって線形状の励起光線を走査することによって焦点面２３６の線走査を実施するために使用される。

焦点面１３２内の各々の焦線に対して、焦線を取り囲む標本１２２内の蛍光色素分子から発せられた蛍光の一部分が、対物レンズ１０８によって捕捉され平行にされる。たとえば図１Ｂは、光の３つの蛍光の光線１３８〜１４０が、焦点１３４〜１３６を取り囲む領域内の標本１２２から発せられている、共焦点顕微鏡器具１００を示している。光線１３８〜１４０は、対物レンズ１０８によって形成され、ダイクロイック鏡１０６を通り抜け、フィルタおよび結像光学素子１１４によってフィルタ処理され検出器１１６の二次元センサ上に集束される。フィルタは励起光が検出器１１６に到達することを遮り、結像光学素子は、線形状の光線の蛍光を検出器１１６のセンサ上に集束させる。検出器１１６は、検出器１１６の二次元センサを形成するピクセルの二次元配置を備えたＣＭＯＳ検出器またはＣＣＤ検出器になることができる。検出器１１６のセンサは、制御部１１８によって焦点面１３２の線走査と同期化されたローリング・ライン・シャッタ・モードで作動される。ローリング・ライン・シャッタ・モードでは、焦点面１３２の画像は、線形状の励起光線を焦点面１３２上で走査することによって作り出され、その間対応する集束されフィルタ処理された線形状の蛍光光線は、検出器１１６の二次元センサ上で走査される。センサの一方の端部から開始して、センサピクセルの列は、光線がセンサ上でセンサの対向する端部まで走査されるときに線形状の蛍光光線の光を読み取る。蛍光光線がセンサ上で走査される間、蛍光光線の前のピクセル列は、取り除かれまたはゼロにされて、ピクセルに蛍光光線を読み取らせる準備をする。蛍光光線がセンサの対向する端部に到達したとき、ピクセルによって読み取られた情報は、焦点面１３２の二次元画像を形成するように処理される。線形状の蛍光の現在位置を読み取るように同期化されたピクセルの１つの列または複数の列の外側のピクセルの列による光の検出は、焦点面１３２の外側から迷光を拒絶するために廃棄される。

図２は、例となる共焦点顕微鏡器具２００の概略図を示している。器具２００は、器具１００のダイクロイック鏡１０６が、全面反射鏡２０２によって置き換えられ、線形成要素１０３から出力された励起光線１２０の経路内に位置するダイクロイック鏡２０４を含む以外は、器具１００に類似するものである。器具２００はまた、線フィルタ２０６および線検出器２０８も含む。ダイクロイック鏡２０４は、図１Ａを参照して上記で説明されたように焦点面１３２上で走査される励起光線１２０が通ることを可能にするように形作られる。蛍光は、励起光線と同じ経路に沿って進行してダイクロイック鏡２０４に戻り、ダイクロイック鏡２０４は、蛍光を、経路２１０に沿ってフィルタおよび結像光学素子１１４、フィルタ２０６内の線細溝２１２を通り抜け、線検出器２０８の線形状のセンサ上に反射する。たとえば、鏡３０８が、励起光線１２０を焦線１３６に至る経路１２６上に反射させるように配置されたとき、焦線１３６周りの蛍光色素分子から発せられた蛍光は、同じ経路１２６に沿って進行して鏡３０８まで戻り、ダイクロイック鏡２０４に反射される。蛍光は、フィルタ処理されて迷走励起波長を除去し、細溝２１２を通り抜ける線形状の光線に集束される。線フィルタ２０６は、焦線１３６の外側に位置する源からの迷光を遮り、それにより、本質的には、焦線１３６の近くまたはこれに沿って位置する蛍光色素分子から発せされた蛍光のみが、線検出器２０８の線形状のセンサに到達するようになる。線検出器２０８は、細溝２１２と整合されたピクセルの一次元または二次元のセンサ配列を備えたＣＭＯＳカメラまたはＣＣＤカメラになることができる。センサ領域のクリアおよび読み取りは、制御部１１８によって焦点面１３２の走査と同期化される。たとえば、鏡３０８が第１の位置から第２の位置に回転され、それによって励起光線を焦点面１３２の第１の焦線から第２の焦線まで移動させるとき、線検出器２０８のセンサは、第２の焦線から発せられた蛍光を読み取るためにクリアされる。励起光線が焦点面１３２を一掃したとき、検出器２０８によって収集された情報は、焦点面１３２の二次元画像を形成するように処理される。

図３Ａ〜３Ｂは、例となる光走査システム２０４の上面図および等角図を示している。システム２０４は、中央に位置する走査鏡３０２と、走査鏡３０２に向かって角度付けされた反射表面を有する第１の平坦な固定式鏡３０４と、走査鏡３０２に向かって角度付けされた反射表面を有する第２の平坦な固定式鏡３０６とを含み、これらは上記の図２に示されている。第１および第２の固定式鏡３０４および３０６はまた、互いに向かって角度付けされる。図３Ａ〜３Ｂの例では、鏡３０４、３０６、および３０８は、３０４、３０６および３０８の鏡の反射表面が、同じｘｙ平面に対してほぼ垂直になるように配向される。走査鏡３０２は、検流計モータ３１０の回転式シャフトに取り付けられた平坦な枢動鏡３０８を含む検流計ミラーになることができる。あるいは、走査鏡は、圧電制御された鏡になることができる。図３Ａ〜３Ｂに示されるように、鏡３０８は、ＸＹ平面内である範囲の角度でモータ３１０によって前後に連続的に回転される。

図４は、光ファイバ４０２を介してシステム２０４に導入された光４００の光線と共に作動する光走査システム２０４を示している。たとえば光の光線は、上記で説明された光源２０２などの光源から出力された励起光線になることができ、この励起光線は、光ファイバ４０２によってシステム３００内に運ばれる。光ファイバ４０２はまた、光線４００を鏡３０８の特定の領域４０６上に集束させるためにファイバ４０２の末端部に配置されたレンズ４０４を含むこともできる。あるいは、光線４００は、レーザから直接的に出力され得、この場合、光ファイバ４０２は省略され得る。図４は、鏡３０８に対する一連の回転位置の３つだけを表す３つの位置１、２、および３に回転する鏡３０８を示している。異なってパターン形成された線４０８〜４１０は、枢動鏡３０８が、３つの位置１、２、および３それぞれの１つに回転されるときに光線がシステム３００内で進行する経路を表している。図４の例で示されるように、固定式鏡３０４および３０６ならびに枢動鏡３０８は、光線４００を経路内に置き、この経路は、ｘｙ平面によって表された同じ平面内に存在する６回の反射を介して枢動点４１２を通り抜ける。実際、鏡３０８は、一連の位置の１つのいずれかに回転させることができ、これらの位置は、光線が、枢動点４１２を通り抜ける経路に沿ってシステム３００から出力されるという結果を生み出す。

光線４００が、枢動点４１２を通る経路に置かれるという結果を生み出す枢動鏡３０８の各々の回転位置では、光線４００は、枢動鏡３０８から３回、第１の固定式鏡３０４から１回、第２の固定式鏡３０６から２回反射され、合計６回の反射となる。図５Ａ〜５Ｃは、枢動鏡３０８が３つの位置１、２、および３それぞれに回転されたときに光線４００がシステム３００内で進行する内部経路の断片を示している。図５Ａでは、枢動鏡３０８は位置１に回転される。光線４００は点５０２において枢動鏡３０８に当たり、鏡３０４、３０６および３０８からの６回の反射を受け、この反射は、１、２、３、４、５、および６と連続的に番号付けされる。点５０２近くの枢動鏡３０８からの６番目の反射は、光線を図４に示される経路４０８内に置く。図５Ｂでは、枢動鏡３０８は、位置２に回転される。光線４００は、点５０４において枢動鏡３０８に当たり、鏡３０４、３０６および３０８からの６回の反射を受け、この反射は、１’、２’、３’、４’、５’、および６’と連続的に番号付けされる。点５０６における枢動鏡３０８からの６’番目の反射は、光線を図４に示される経路４０９内に置く。図５Ｃでは、枢動鏡３０８は、位置３に回転される。光線４００は、点５０８において枢動鏡３０８に当たり、鏡３０４、３０６および３０８からの６回の反射を受け、この反射は、１”、２”、３”、４”、５”、および６”と連続的に番号付けされる。点５１０における枢動鏡３０８からの６”番目の反射は、光線を図４に示される経路４１０上に置く。

鏡３０８から枢動点の距離は、鏡３０４、３０６および３０８が互いからどれだけ遠く離間されるかによって決定され得る。鏡３０４、３０６および３０８が互いから遠くに離間されるほど、枢動点は鏡３０８から遠くになる。他方では、枢動点を鏡３０８により近く配置するために、鏡３０４、３０６および３０８間の距離は縮められる。

下流側の枢動点を生み出す能力の裏にある原理は、枢動鏡からの複数の反射に依存するものである。枢動鏡を含む一般的な光学的配置では、光線は枢動鏡から１回だけ反射する。この配置では、枢動鏡が機械的角度Δθで走査されるとき、出力光線は、角度２・Δθで走査され、このとき出力光線の枢動軸は、ほぼ枢動鏡の反射面に位置している。さらなる固定された鏡がこの配置に追加され、それにより、光線が、枢動鏡からの第２の反射に関して転換される場合、２・Δθのさらなる走査角度が、元の走査角度まで付加されまたは差し引かれる。第１と第２の枢動鏡反射間の固定された鏡反射の回数が奇数である場合、第２の枢動鏡反射からの２・Δθの走査角度が、４・Δθの合計走査角度になるように追加される。第１と第２の枢動鏡反射間の固定された鏡反射の回数が偶数である場合、第２の枢動鏡反射からの２・Δθの走査角度が、０の合計走査角度になるように差し引かれる。この第２の場合、合計走査角度がゼロであるにもかかわらず、第１と第２の枢動鏡反射間の合計光経路長さに比例する非ゼロの横方向光線並進が存在する。この横方向の光線並進が第３の枢動鏡反射に施されるとき、この並進は、光線を、１つまたは複数の固定された鏡の反射を介して枢動鏡上へと再度転換させることによって達成されるものであり、正味の効果は、元の２・Δθに等しいが、並進された光線枢動軸を伴う最終走査角度である。第２と第３の枢動鏡反射間の固定された鏡反射の回数が偶数である場合、枢動軸は事実上の枢動点まで上流に並進されるが、第２と第３の枢動鏡反射間の固定された鏡反射の回数が奇数である場合、枢動軸は実際の枢動点まで下流に並進される。これらの原理に基づき、またさらなる枢動鏡および固定された鏡の反射により、並進される枢動軸を備えた同じ光線走査を生み出す数多くの方法が存在する。本明細書で説明されたシステムは、複数の枢動鏡反射が利用されて、走査された光線の枢動軸内に所望の並進を生み出すことができる、数多くの方法のうちの１つの例だけを表している。

説明の目的のための前述の説明は、本開示の完全な理解をもたらすために特有の用語を使用してきた。しかし、本明細書で説明されたシステムおよび方法を実施するために、特有の詳細が必要とされないことが当業者に明らかになるであろう。特有の例の前述の説明は、例示および説明のために提示される。これらは、包括的であるように、または本開示を説明された正確な形態に限定するようには意図されない。明確なことに、数多くの改変形態および変更が上記の教示に照らして可能である。本例が示され説明されて、本開示の原理および実用的な用途の適用範囲を最適に説明し、それによって当業者が本開示、および企図された特有の用途に適合させたさまざまな改変形態を有するさまざまな例を最適に利用することを可能にする。本開示の範囲は、特許請求の範囲およびその等価物によって定義されることが意図される。

Claims (10)

1. 開口付き裏板を含む対物レンズと、
   鏡と、
   光源から出力された光線を受けるように配置された少なくとも１つの鏡を含む光走査システムであって、前記光線が、前記鏡で反射され前記開口内に位置する枢動点を通る経路を進むように、前記光線の走査を行う光走査システムとを備え、
   少なくとも１つの鏡を含む前記光走査システムが、
   走査鏡と、
   前記走査鏡に向かって角度付けられた反射面を有する少なくとも２つの固定式鏡とを有し、
   前記走査鏡は、
   前記光線が前記走査鏡に当たると、前記光線は少なくとも６回反射し、前記光線は、最後に前記走査鏡で反射して前記枢動点を通る経路を進むように配置される、共焦点顕微鏡器具。
2. 前記走査鏡は、ある範囲の角度にわたって前後に回転する平坦鏡である、請求項１に記載の共焦点顕微鏡器具。
3. 前記走査鏡は検流計ミラーを有する、請求項1又は２に記載の共焦点顕微鏡器具。
4. 前記走査鏡は圧電制御された鏡を有する、請求項1又は２に記載の共焦点顕微鏡器具。
5. 前記少なくとも２つの固定式鏡が、前記走査鏡に向かって角度付けられた反射面を有する第１の固定式鏡と、前記走査鏡および前記第１の固定式鏡に向かって角度付けられた反射面を有する第２の固定式鏡とを備える、請求項１に記載の共焦点顕微鏡器具。
6. 前記少なくとも２つの固定式鏡は第１の固定式鏡および第２の固定式鏡を有し、
   前記走査鏡、前記第１の固定式鏡、および前記第２の固定式鏡は、
   前記光線が、前記走査鏡で第１の反射をし、前記第１の固定式鏡で第２の反射をし、前記第２の固定式鏡で第３の反射をし、前記走査鏡で第４の反射をし、前記第１の固定式鏡で第５の反射をし、前記走査鏡で第６の反射をして、前記枢動点を通る経路を進むように構成されている、請求項１〜５のうちのいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡器具。
7. 前記少なくとも６回の反射が同じ平面内で行われる、請求項１〜６のうちのいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡器具。
8. 前記少なくとも２つの固定式鏡および前記走査鏡が、同じ平面内に存在する、請求項１〜６のうちのいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡器具。
9. 前記鏡は、
   前記光線を反射し、標本の構成要素に取り付けられた蛍光プローブの蛍光体から発せられる蛍光を透過するダイクロイック鏡を有する、請求項１に記載の共焦点顕微鏡器具。
10. 前記鏡は全面反射鏡を備える、請求項１に記載の器具。